Superauflösende Bildgebung und gemeinsames Management: Ein Protokoll für konfokale Mikroskopie mit Multiplex-Detektion

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die fortschrittlichen Bildgebungsanwendungen und das gemeinsame Ressourcenmanagement eines laserabtastenden konfokalen Mikroskopsystems, das mit einem multiplexierten Array-Detektor für hochauflösende zelluläre und subzelluläre Bildgebung integriert ist. Der Workflow ermöglicht multimodale Bildgebung von Konfokal bis Superauflösung (~120 nm) innerhalb einer einzigen Plattform und macht die Visualisierung im Nanomaßstab zugänglicher.

Abstract

Die Superauflösungsmikroskopie (SRM) überwindet die Beugungsgrenze herkömmlicher Lichtmikroskopie und ermöglicht so eine nanoskalige Visualisierung subzellulärer Strukturen. Die weitverbreitete Nutzung von Techniken wie der stimulierten Emissionsdepletionsmikroskopie (STED), der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) / stochastischer optischer Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) und der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM) kann jedoch durch Faktoren wie hohe Phototoxizität, spezialisierte Probenvorbereitung oder komplexen Betrieb behindert werden. Hier präsentieren wir ein umfassendes Protokoll, das eine laser-scannende konfokale Plattform nutzt, die mit einem multiplexierten Superauflösungsdetektor integriert ist. Dieses System, kombiniert mit computergestützter Verarbeitung, ermöglicht einen einfachen Übergang zwischen konfokaler und superauflösender Bildgebung innerhalb desselben Arbeitsablaufs. Das Protokoll bietet einen benutzerfreundlichen Ansatz für schnelle, hochauflösende und phototoxische Bildgebung. Die detaillierte Methode umfasst multimodale Bildgebungsmöglichkeiten, darunter mehrfarbige Fluoreszenz, differentiellen Interferenzkontrast (DIC), dreidimensionale Z-Stack-Rekonstruktion, Zeitraffer-Live-Zell-Bildgebung, großflächige Kachelung und verschiedene Superauflösungsmodi, die vom multiplexierten Array-Detektor angeboten werden. Systematische Vergleiche zeigen, dass die Superauflösungsmodi eine laterale Auflösung von etwa 120 nm erreichen, was etwa eine doppelte Verbesserung gegenüber der Beugungsgrenze der konventionellen Weitfeldmikroskopie und eine signifikante Verbesserung sowohl der Auflösung als auch des Signal-Rausch-Verhältnisses (4–8-fach) im Vergleich zum Standard-Konfokalbetrieb auf derselben Plattform darstellt. Die Diskussion behandelt außerdem zentrale Punkte eines gemeinsamen Ressourcenmanagementmodells, das für die nachhaltige Nutzung dieser Technologie unerlässlich ist. Dieser integrierte Leitfaden dient als wertvolle Ressource für sowohl neue als auch erfahrene Forscher sowie Facility Manager, die das Potenzial dieser zugänglichen Form fortschrittlicher Bildgebung in der Lebenswissenschaften nutzen und maximieren möchten.

Introduction

Die Visualisierung dynamischer subzellulärer Strukturen ist grundlegend für den Fortschritt der lebenswissenschaftlichen Forschung. Die Auflösung der traditionellen optischen Mikroskopie ist jedoch durch die Beugung auf etwa 200 nm lateral begrenzt, was ihre Fähigkeit zur Auflösung dynamischer subzellulärer Prozesse einschränkt. Um diese Hürde zu überwinden, wurden verschiedene Superauflösungstechniken entwickelt. Allerdings stellen Techniken wie STED-Mikroskopie, PALM/STORM und SIM häufig Hürden für eine breite Nutzung in Mehrbenutzerumgebungen dar, darunter hohe Phototoxizität, der Bedarf an spezialisierten Fluorophoren oder Probenvorbereitungen, komplexe Ausrichtungsverfahren oder intensive computergestützte Verarbeitung ^1,2,3.

In diesem Zusammenhang bieten konfokale Mikroskopsysteme mit multiplexiertem Array-Detektor eine überzeugende Alternative, indem sie Superauflösungsbildgebung durch Mehrpixel-Erkennung und rechnerische Neuzuweisung ermöglichen, wodurch die technische Schwelle^{von 4} deutlich gesenkt wird. Dieser Ansatz nutzt ein 32-elementiges Galliumarsenidphosfid-(GaAsP)-Detektorarray, um mehr Photonen von jedem Scanpunkt zu sammeln. Nachfolgende intelligente Dekonvulutionsalgorithmen ordnen diese Informationen neu zu, wodurch das Detektionsvolumen effektiv reduziert wird. Dieser Prozess erreicht räumliche Auflösungen von etwa 120 nm seitlich und 350 nm axial, was eine etwa doppelte Verbesserung gegenüber der Beugungsgrenze der Weitfeldmikroskopie darstellt und eine 4–8-fache Steigerung des Signal-Rausch-Verhältnisses im Vergleich zum Standard-Konfokalmodus auf demselben Instrument ^4,5,6 liefert. Diese einzigartige Kombination aus verbesserter Auflösung, überlegener Signalqualität und Kompatibilität mit gängigen fluoreszierenden Etiketten und Protokollen stellt ihren Hauptvorteil für eine breite Anwendung dar.

Daher hat diese Form der zugänglichen Superauflösungsmikroskopie breite Anwendung in der Lebenswissenschaften gefunden und ermöglichte detaillierte Studien zur Organellenmorphologie, Zytoskelettdynamik, Virus-Wirt-Interaktionen und molekularer Kolokalisierung sowohl in fixierten als auch in lebenden Zellen ^7,8. Seine relative Sanftheit macht sie besonders geeignet für längere Zeitrafferbeobachtungen lebender Proben.

Die Integration solcher fortschrittlichen Systeme in Kernanlagen ist entscheidend für die Demokratisierung des Zugangs, doch ihr nachhaltiger und effektiver Betrieb stellt besondere Herausforderungen dar. In institutionellen Kerneinrichtungen, wie der Zhejiang University School of Medicine, hängen optimale Leistung und Wirkung entscheidend von drei Säulen ab: (1) standardisierten und reproduzierbaren Bildgebungsprotokollen, (2) rigoroser routinemäßiger Wartung und (3) einem effektiven Managementrahmen für gemeinsamen Zugang. Obwohl wertvolle Ressourcen für spezifische Aspekte existieren, wie Bildgebungsmethoden für frühere Systeme⁹oder allgemeine Facility Management^{Principles 10,11}, fehlt derzeit ein umfassender Leitfaden, der detaillierte, reproduzierbare Protokolle für moderne multiplexierte Array-Detektorplattformen mit einem bewährten Modell für das Shared-Resource-Management integriert. Dieser Protokollartikel soll diese Lücke überbrücken.

Das übergeordnete Ziel ist es, eine umfassende Schritt-für-Schritt-Anleitung bereitzustellen, um ein konfokales System mit multiplexiertem Array-Detektor effektiv umzusetzen und zu nutzen, um Super-Resolution-Bildgebung in einem Shared-Resource-Setting zu gewährleisten. It is designed for two primary audiences: researchers requiring resolution beyond conventional confocal limits (~250‬-300 nm) but for whom live-cell compatibility, ease of use, and throughput are also critical; und Facility Manager, die einen solchen Service einrichten oder optimieren. Hier beschreiben wir systematisch die Systemkonfiguration, multimodale Bildgebungsprotokolle (einschließlich Multicolor, 3D, Live-Cell, Tiling und Super-Resolution) sowie ein bewährtes Shared-Management-Modell. Dieser integrierte Leitfaden dient als Ressource, um das Potenzial und die Zugänglichkeit dieser leistungsstarken bildgebenden Methode zu maximieren.

Protocol

Alle Experimente mit biologischen Proben wurden gemäß den Richtlinien und Vorschriften der Core Facilities, Zhejiang University School of Medicine, durchgeführt und vom Institutional Biosafety Committee genehmigt (Genehmigungszertifikat Nr. BSL20235710079).

HINWEIS: Alle Verfahren mit Zellkulturen müssen unter sterilen Bedingungen in einem biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben. Dieses Protokoll setzt voraus, dass das Mikroskopsystem installiert und die Laserleistungen kalibriert sind. Detaillierte Spezifikationen und empfohlene Anbieter für wichtige Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Ausrüstung (z. B. Bildschüsseln, Abdeckglas, Montagemedium) sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Probenvorbereitung

HINWEIS: Eine erfolgreiche Superauflösungsbildgebung beginnt mit optimaler Probenvorbereitung. Der Einsatz hochwertiger, 1,5 dicker (0,17 mm) Glasabdeckplatten ist unerlässlich, um den Korrekturkragen von Hoch-NA-Ölimmersionsobjektiven zu harmonieren und sphärische Aberrationen zu vermeiden. Alle Zentrifugationsschritte sollten bei 300 × g für 5 Minuten durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.

1. Vorbereitung von festen Zellproben für mehrfarbige Superauflösungsbildgebung (z. B. COS7-Zellen)
   HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Immunfärbung für Mikrotubuli (Alexa Fluor 568) und Mitochondrien (Alexa Fluor 488) mit 4',6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) Kern-Gegenfärbung, wie in Abbildung 1 dargestellt.
   1. Kultivieren Sie COS7-Zellen im modifizierten Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) bei 37 °C in einem 5 % CO2-humidifizierten Inkubator.
   2. Plattenzellen auf 35-mm-Glasboden-Bildschüsseln mit einer Dichte von 1,0 × 10⁵ Zellen pro Schüssel. Lassen Sie die Zellen haften und wachsen Sie auf 60–70 % Konfluenz (typischerweise 24 Stunden).
   3. Aspirieren Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit vorgewärmtem (37°C) phosphatgepuffertem Kochsalzlösungslösungsmittel (PBS). Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 1 ml 4%-Paraformaldehyd (PFA) in PBS hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
   4. Saugen Sie die PFA-Lösung ab (behandeln Sie sie als gefährlichen Abfall). Wasche die Zellen dreimal mit 2 ml PBS und inkubiere pro Wasch 5 Minuten mit sanftem Schaukeln.
   5. Permeabilisierung und Blockierung: Inkubieren Sie die Zellen mit 1 ml Permeabilisierungs-/Blockierungspuffer (0,1 % v/v) Triton X-100, 1 % (mit v/v) rindischem Serumalbumin (BSA) in PBS für 30 Minuten bei RT.
   6. Primäre Antikörper-Inkubation: Inkubieren Sie Zellen mit einer Mischung aus primären Antikörpern gegen α-Tubulin (Maus-monoklonal) und TOMM20 (Kaninchen-Polyklonalen) im Antikörper-Verdünnungspuffer (1 % BSA in PBS) bei 4°C über Nacht (oder 1-2 Stunden bei RT). Verwenden Sie 300 μL pro Schale zur Abdeckung der Glasoberfläche.
   7. Waschen: Atmen Sie die primäre Antikörperlösung vorsichtig an. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 2 ml PBS mit 0,05 % Tween-20 (PBST), 5 Minuten pro Wasch.
   8. Sekundäre Antikörper- und Kernfärbung: Bereiten Sie eine Mischung aus fluoreszierenden sekundären Antikörpern und DAPI im Antikörperverdünnungspuffer (1 % BSA/PBS) vor, der vor Licht geschützt ist.
      1. Verwenden Sie Esel-Anti-Maus-IgG, konjugiert zu Alexa Fluor 568 (1:500), und Esel-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert zu Alexa Fluor 488 (1:500).
      2. Verwenden Sie DAPI mit einer Endkonzentration von 1 μg/mL für die Kernfärbung. Trage 300 μL dieser Mischung auf die Zellen auf und inkubiere 1 Stunde bei RT im Dunkeln.
   9. Endwäsche: Aspiriere die Färbungslösung und wasche die Zellen dreimal mit 2 ml PBS, 5 Minuten pro Wasch.
   10. Montagemedium auftragen: Saugen Sie das PBS vorsichtig aus der Bildgebungsschale ab und lassen Sie die Probe leicht feucht. Tragen Sie sofort einen kleinen Tropfen (~20 μL) gehärteten Anti-Fade-Montagemediums (z. B. ProLong Gold) direkt auf den Bereich am Glasboden auf.
   11. Abdecken und aushärten: Senken Sie vorsichtig ein #1,5 hochpräzises Deckglas auf den Tropfen, vermeiden Sie Blasen. Lass den Mountant über Nacht im Dunkeln bei RT aushärten oder bei schnellerer Aushärtung für 2–4 Stunden bei 37 °C.
2. Lebendzellprobenvorbereitung für Zeitrafferbildgebung (z. B. Hep3B-Zellen, die ein fluoreszierendes Protein-Tag exprimieren).
   HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Abbildung von Hep3B-Zellen, die stabil ein fluoreszierendes Protein (z. B. EGFP) exprimieren, das auf Mitochondrien abzielt.
   1. Hep3B-Zellen im minimalen essentiellen Medium (MEM) kultivieren, ergänzt mit 10 % FBS. Plattenzellen auf 35-mm-Glasboden-Bildschüsseln (1,5 Deckglas) mit einer Dichte von 0,8 × 10⁵Zellen/Schale. Lassen Sie die Zellen auf etwa 70–80 % Konfluenz wachsen, um optimale Gesundheit und Bilddichte (typischerweise 18–24 Stunden) zu erreichen.
   2. Vorbereitung für die Bildgebung: Am Tag der Bildgebung wird das Standardkulturmedium vorsichtig durch 2 ml vorausgeglichtes (37°C, mindestens 30 %_CO2), phenol-rotfreies, niedrigfluoreszenzfähiges Bildgebungsmedium ergänzt, ergänzt durch 10 % FBS und, falls erforderlich, 25 mM HEPES-Puffer zur pH-Stabilisierung außerhalb eines CO2-Inkubators. Dies minimiert die Hintergrundfluoreszenz und erhält den physiologischen pH-Wert während der Bildgebung aufrecht.
      HINWEIS: Lassen Sie die Schüssel mindestens 30–45 Minuten auf der vorgeheizten Mikroskopstufe in der Umweltkammer akklimatisieren, bevor mit der Zeitrafferaufnahme beginnt, um Temperatur, Fokus und Zellgesundheit zu stabilisieren.

2. Start, Initialisierung und grundlegende Ausrichtung des Mikroskopsystems.

1. Strom auf die Haupteinheit des Mikroskops, das Laserstartmodul (mit Festkörperlasern bei 405, 488, 561 und 640 nm), der LED-Lichtquelle und dem Steuercomputer.
   1. Lass die Laser mindestens 15–20 Minuten aufwärmen und stabilisieren. Dies ist entscheidend für eine stabile Laserleistung, insbesondere für quantitative oder Zeitrafferexperimente.
2. Startet die Betriebssystemsoftware des Mikroskops.
3. Wählen Sie in der Hauptoberfläche 'Mikroskop' > 'Initialisieren' oder folgen Sie dem Start-Assistenten der Software.
4. In der Software navigieren Sie zum Feld 'Übernahme'. Im Objektiv-Dropdown-Menü wählen Sie 'Plan-Apochromat 63 x/ 1.40 Oil ' oder das passende Objektiv für Ihr Experiment.
5. Tragen Sie einen Tropfen Tauchöl (Brechungsindex = 1,518) direkt auf die Frontlinse des Objektivs auf. Vermeide es, Blasen einzuführen.
6. Für die Live-Cell-Bildgebung aktivieren Sie die Umweltkammer und das aktive Fokusstabilisierungssystem (z. B. 'Definite Focus' >) mindestens 45–60 Minuten vor der Bildgebung. Stelle die Temperatur auf 37 °C, CO2_{auf 5} % und die Luftfeuchtigkeit auf >60 %. Lass das System stabilisieren. Überprüfen Sie die Stabilität mit den Kammersensoren.
7. Das System ist nun bereit zum Laden von Proben und zur Einstellung von Bildparametern.

3. Mehrfarbige Fluoreszenzbildgebung

1. Legen Sie die vorbereitete Probe auf die Mikroskopbühne. Heben Sie die Stufe vorsichtig an, bis das Deckglas das Immersionsöl berührt.
2. In der Akquisitionssoftware navigieren Sie zum Reiter 'Erwerbung' und wählen Sie ein neues Experiment erstellen.
3. Fügen Sie mehrere Bildbahnen (Kanäle) hinzu, die den verwendeten Fluorophoren entsprechen. Für das Beispiel in Abbildung 1 konfigurieren Sie:
   1. Spur 1 (DAPI): Anregung 405 nm, Detektion 410–480 nm.
   2. Spur 2 (Alexa Fluor 488): Anregung 488 nm, Detektion 495-550 nm.
   3. Spur 3 (Alexa Fluor 568): Anregung 561 nm, Detektion 570–620 nm.
4. Für jede Spur stellen Sie den konfokalen Nadellochdurchmesser auf 1 Airy-Einheit (1 AE) ein.
5. Optimieren Sie die Laserleistung und den Detektorverstärkung für jeden Kanal mit folgendem iterativen Prozess:
   1. Wählen Sie den ersten Kanal (z. B. DAPI). Wechsel in den 'Live'-Scan-Modus.
   2. Setze die anfängliche Laserleistung auf einen niedrigen Wert (z. B. 0,1–0,5 %). Stellen Sie die Detektorverstärkung innerhalb ihres linearen Bereichs auf ein moderates Niveau ein (z. B. 700 V für eine GaAsP-PMT).
   3. Steigern Sie die Laserleistung schrittweise, bis die Zielstrukturen im Live-Bild deutlich über dem Hintergrund sichtbar sind.
   4. Öffnen Sie die Histogramm-Anzeige . Stellen Sie sicher, dass keine Pixelsättigung erfolgt (das Histogramm ist nicht am rechten Rand gestapelt). Reduziere die Laserleistung, falls nötig.
   5. Passen Sie die Detektorverstärkung an, um ein helles, rauscharmes Bild zu erzielen. Vermeiden Sie Verstärkungen über 850 V, um übermäßiges Rauschen zu vermeiden.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 3.5.1-3.5.5 für alle verbleibenden Fluoreszenzkanäle.
      HINWEIS: Balancieren Sie Laserleistung, Verstärkung und Pixel-Verweilzeit aus, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren und gleichzeitig Fotoschäden zu minimieren. Bei lebenden Zellen priorisieren Sie geringere Leistung und kürzere Verweilzeiten.
6. Stellen Sie das Bildformat (Anzahl der Pixel) und die Pixel-Verbleihzeit ein.
   1. Stellen Sie die Pixelgröße so ein, dass sie das Nyquist-Kriterium erfüllt: Pixelgröße ≤(Auflösung / 2,3). Für die Standard-Konfokalbildgebung (laterale Auflösung ~250 nm) stellen Sie die Pixelgröße ≤108 nm ein.
   2. Verwenden Sie den 'Nyquist '-Sampling-Button der Software, um dies automatisch zu berechnen, falls verfügbar.
   3. Stelle die Pixel-Verweilzeit ein. Verwenden Sie eine längere Verweilzeit (z. B. 1,0–2,0 μs) für ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis oder eine kürzere Verweilzeit (z. B. 0,5–1,0 μs) für schnellere Bildgebung.
7. Stellen Sie sicher, dass zwischen den Spuren der 'Sequential Scan'-Modus ausgewählt ist, um Übersprechen zu minimieren.
8. Klicken Sie auf 'Start', um ein einzelnes Bild zu erhalten. Speichere das Bild mit relevanten Metadaten.

4. Differentialinterferenzkontrast (DIC) Bildgebung

1. Im Reiter 'Erfassung' der Erfassungssoftware wählen Sie 'Neuen Kanal hinzufügen ' und konfigurieren Sie ihn für die Erkennung von durchgebranntem Licht.
2. Wählen Sie den passenden Signaldetektor aus (oft T-PMT (transmitted-light photomultiplier tube) oder ESID (externer Systemschnittstellendetektor) in der Software genannt).
3. DIC-Prisma- und Polarisationskonfiguration:
   1. Wählen Sie über das Hardware-Bedienfeld oder die Software-Schnittstelle das DIC-Prisma aus, das zu Ihrem Ziel passt (z. B. 'DIC III' für ein 63x-Objektiv).
   2. Fügen Sie das ausgewählte Prisma in den Lichtweg ein.
4. Stellen Sie den Polarisationssensor und den DIC-Schieberegler für optimalen Kontrast ein:
   1. Drehen Sie den Analysator (Polarisationsfilter), bis der Hintergrund im 'Live'-Bild dunkel oder sehr schwach erscheint.
   2. Während Sie das Live-Bild beobachten, passen Sie die Position des DIC-Schiebereglers langsam in kleinen Schritten an.
   3. Optimieren Sie, bis zelluläre Merkmale (z. B. Membranen, Kerne) mit einem deutlichen, schattengeworfenen, pseudodreidimensionalen Relief vor einem neutralgrauen Hintergrund erscheinen.
5. Stellen Sie die Beleuchtungswellenlänge für DIC auf einen Wert im sichtbaren Bereich ein (z. B. 488 nm oder 546 nm).
6. Passen Sie die Übertragungsintensität (Laser- oder Lampenleistung) und die Detektorverstärkung für den durchgebrannten Lichtkanal an, um ein klares Bild ohne Sättigung zu erzielen.
7. Erwerben Sie das DIC-Bild.

5. Z-Stack-Erfassung für dreidimensionale Rekonstruktion

HINWEIS: Vor der Definition des Z-Stacks konfigurieren Sie alle Bildparameter (Laserleistung, Verstärkung, Lochloch, Pixelgröße) auf einer einzigen, optimalen Brennebene, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Dies gewährleistet einheitliche Einstellungen in allen optischen Bereichen.

1. Im Tab 'Erwerbung' wähle den 'Z-Stack'-Modus.
2. Definieren Sie das Volumen von Interesse:
   1. Mit einem schnellen Live-Scan konzentrieren Sie sich auf die oberste Struktur von Interesse.
   2. Klicken Sie auf 'Zuerst setzen' (oder 'Top').
   3. Konzentriere dich sorgfältig auf die unterste Struktur von Interesse.
   4. Klicken Sie auf 'Zuletzt setzen' (oder 'Bottom'). Die Software zeigt die Gesamttiefe an.
3. Stellen Sie die Z-Schrittgröße so ein, dass sie das Nyquist-Abtastkriterium in axialer Richtung erfüllt. (typischerweise d_r/2,3, wobei d_r die axiale Auflösung ist). Für ein 63x/1,4 NA-Ölobjektiv verwenden Sie 0,3–0,4 μm.
4. Alternativ kannst du die Taste 'Optimal' oder 'Nyquist' der Software verwenden, um die Schrittlänge automatisch zu berechnen.
5. Konfigurieren Sie Bildparameter (Laserleistung, Verstärkung, Lochloch = 1 AE) für jeden Kanal, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Für schwache Signale sollten Sie in Erwägung ziehen, die Laserleistung oder -verstärkung im Vergleich zu einem einzelnen 2D-Bild leicht zu erhöhen.
6. Starte die Erwerbung, um den gesamten Bildstapel zu sammeln.
   HINWEIS: Gesamtaufnahmezeit = (Framezeit aus einem einzelnen Schnitt) × (Anzahl der Schnitte)
   Plane entsprechend, besonders bei Live-Proben.
7. 3D-Rekonstruktion und Visualisierung:
   1. Verwenden Sie das 'Processing'-Modul der Software (z. B. 3D-Projektionsfunktion) oder öffnen Sie den Bildstack in spezieller Software wie ImageJ/Fiji.
   2. Erzeugen Sie Maximalintensitätsprojektionen (MIP), um alle scharfen Signale in einem einzigen 2D-Bild anzuzeigen.
   3. Für eine echte 3D-Darstellung wenden Sie Volume-Rendering an. Passen Sie Helligkeit, Deckkraft und Beleuchtung nach Bedarf an.
   4. Erzeugen Sie orthogonale Ansichten (XZ- und YZ-Querschnitte), um axiale Ausdehnung und Registrierung zu untersuchen.

6. Zeitrafferbildgebung für lebende Zellen

1. Bereite lebende Zellen wie in Abschnitt 1.2 beschrieben vor. und die Schüssel auf der vorgewärmten Mikroskopstufe innerhalb der Umweltkammer zu montieren.
2. Lassen Sie die Probe sich mindestens 45–60 Minuten akklimatisieren, wie in Abschnitt 2.6 beschrieben, um die Stabilisierung sicherzustellen.
3. Navigieren Sie zu einem Sichtfeld mit gesunden, gut verteilten Zellen und erhalten Sie einen einzigen hochwertigen Schnappschuss mit Parametern, die gemäß Abschnitt 3.5 optimiert sind.
4. Aktivieren Sie das aktive Fokusstabilisierungssystem (z. B. Definite Focus oder Ähnliches). Dies ist für langfristige Experimente zur Ausgleichung von thermischer Drift nicht verhandelbar.
5. Wählen Sie im Tab 'Erwerbung' den Modus 'Zeitreihen' aus.
6. Wählen Sie den passenden Bildgebungsmodus basierend auf dem erforderlichen Gleichgewicht zwischen Geschwindigkeit, Auflösung und Fototoxizität:
   1. Für maximale räumliche Auflösung bei weniger dynamischen Prozessen wählen Sie den 'SR' (SuperResolution)-Modus.
   2. Für eine für viele Organellendynamiken geeignete Balance wählen Sie 'SR 2 Y ' oder 'SR 4 Y ' (beeilte Superresolutionsmodi).
   3. Für sehr schnelle Bildgebung ohne Superauflösung wählen Sie den Modus 'Confocal' oder 'Co 2 Y'.
7. Definiere den experimentellen Zeitplan: Lege die Gesamtdauer des Experiments und das Zeitintervall (Δt) zwischen aufeinanderfolgenden Frames fest. (z. B. 5-30 s für mitochondriale Beweglichkeit)
8. Optimieren Sie Bildparameter, um Fotoschäden zu minimieren:
   1. Beginnen Sie mit der niedrigsten Laserleistung, die ein detektierbares Signal liefert.
   2. Man stellt den Detektorgewinn innerhalb seines linearen Bereichs (600–850 V) ein, um ein arbeitsfähiges Signalniveau zu erreichen, wobei man den Verstärkungswert gegenüber Laserleistungssteigerungen bevorzugt.
   3. Verwenden Sie die schnellste Scangeschwindigkeit (kürzeste Pixel-Dwell-Zeit), die mit den Bildqualitätsanforderungen kompatibel ist.
9. Starte die Zeitraffer-Aufnahme. Überwachen Sie die ersten paar Frames auf Fokusstabilität und Zellgesundheit.

7. Großflächige Kachelscan-Bildgebung

1. Im Reiter 'Erwerbung' wählt man den Modus 'Kachelscan' aus.
2. Definiere die TilingRegion mit einer von zwei Methoden:
   1. Layout-basiert: Geben Sie die Anzahl der Kacheln in X- und Y-Richtung an (z. B. 3 x 3).
   2. ROI-basiert: Zeichnen Sie manuell ein Rechteck über das 'Live'-Bild, um das Interessengebiet zu definieren. Die Software berechnet automatisch die Anzahl der benötigten Kacheln.
3. Setze die Überlappung zwischen benachbarten Kacheln auf 10–15 %.
   HINWEIS: Diese Überlappung liefert ausreichende Informationen, damit der Stitching-Algorithmus der Software ein nahtloses zusammengesetztes Bild erstellen kann.
4. Konfigurieren Sie Bildparameter (Laserleistung, Verstärkung, Auflösung) für eine einzelne Kachel wie bei einem statischen Bild.
   HINWEIS: Für sehr große geflieste Flächen sollten Sie einen schnelleren Scanmodus (z. B. 'Co 2 Y') verwenden, um die Gesamtaufnahmezeit praktisch zu halten und das Photobleaching zu minimieren.
5. Beginne mit der Fliesenaneignung. Die Software erwirbt und stickt die Kacheln automatisch zusammen.
6. Nach der Erwerbung inspizieren Sie das zusammengestickte Bild, besonders an den Kachelgrenzen, sorgfältig auf Artefakte. Verwenden Sie bei Bedarf die manuellen Nahtanpassungswerkzeuge der Software.

8. Superauflösende Bildgebung mit dem multiplexierten Array-Detektor

1. Im Tab 'Erwerbung' navigieren Sie zum Modusauswahl, klicken Sie auf 'Smart Setup' und wählen Sie 'Airyscan'-Modus. Wählen Sie dann 'SuperResolution' als Betriebsmodus für den multiplexierten Array-Detektor.
2. Wählen Sie den spezifischen Erfassungsmodus basierend auf den experimentellen Prioritäten:
   1. 'SR'-Modus: Für die höchstmögliche räumliche Auflösung (~120 nm lateral). Verwendung für feste Proben.
   2. 'SR 2 Y'-Modus: Bietet ein Gleichgewicht zwischen Auflösung und Geschwindigkeit.
   3. 'SR 4 Y'-Modus: Schnellster Superauflösungsmodus (theoretisch bis zu ~25 fps), optimiert für Live-Zell-Bildgebung zur Minimierung der Lichtdosis.
   4. 'Co 2 Y'-Modus: Bietet konfokalähnliche Bildgeschwindigkeit mit verbessertem Signal-Rausch-Verhältnis, wenn keine Superauflösung erforderlich ist.
      HINWEIS: Die Auflösungswerte (z. B. 120 nm) sind Systemspezifikationen unter idealen Bedingungen¹². Die tatsächliche Auflösung hängt von der Probenvorbereitung, dem Signal-Rausch-Verhältnis und der korrekten Verarbeitung ab.
3. Konfigurieren Sie Bildparameter (Laserleistung, Detektorverstärkung).
   1. Für Livecell-Bildgebung beginnen Sie mit einer geringeren Laserleistung als im Konfokalmodus, um Fotoschäden zu reduzieren.
   2. Für schwache, feste Samples kann eine höhere Laserleistung und/oder Verstärkung erforderlich sein, um ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen.
   3. Finde die minimale Laserleistung, die ein sauberes, kontrastreiches Bild im 'Live'-Modus liefert.
4. Pixelgröße und Verweilzeit einstellen.
   1. Um die verbesserte Auflösung zu erfassen, stellen Sie die Pixelgröße so ein, dass sie das Nyquist-Kriterium erfüllt: Pixelgröße ≤(gewünschte Auflösung / 2,3). Für den SR-Modus (Ziel 120 nm) stellen Sie die Pixelgröße ≤~52 nm ein.
   2. Verwenden Sie die Schaltfläche 'Optimal' oder 'Nyquist' der Software, um dies automatisch zu berechnen, falls verfügbar.
5. Erhalte das Bild. Die Rohdaten enthalten multiplexierte Signale und sind noch nicht superaufgelöst.
6. Verarbeiten Sie die erfassten Daten, um Superresolution zu erreichen:
   1. Navigieren Sie zum Verarbeitungsmodul der Software.
   2. Wählen Sie den Datensatz aus und wählen Sie die Funktion 'SuperResolution Processing'.
   3. Starte mit den 'Auto'-Einstellungen. Für LowSNR-Daten stellen Sie manuell 'Stärke' und 'Rauschfilter' ein, um die Schärfe zu erhöhen, ohne Artefakte einzuführen.
   4. (Optional) Für höchste Genauigkeit, besonders in 3D-Stacks, wenden Sie einen zusätzlichen Schritt der Gelenkdekonvolution (jDCV) an.
   5. Prozesse ausführen. Vergleichen Sie verarbeitete und unverarbeitete Ansichten, um eine Verbesserung realer Details zu überprüfen.
7. (Optional) Für den quantitativen Vergleich des Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) über verschiedene Moden hinweg:
   1. Nehmen Sie Bilder derselben Probe in verschiedenen Modi auf.
   2. In Analysesoftware definiert man ein Interessengebiet (ROI) auf einer einheitlichen Struktur und misst die mittlere Signalintensität.
   3. Definieren Sie eine Hintergrund-ROI und messen Sie die Standardabweichung der Hintergrundintensität.
   4. Berechnen Sie SNR = (mittleres Signal) / (Standardabweichung des Hintergrunds).
8. (Optional) Für empirische Systemauflösungsmessung mit fluoreszierenden Perlen:
   1. Bereiten Sie eine Probe von 100-nm-Fluoreszierenden Perlen vor.
   2. Erhalte einen Zstack einer isolierten Kugel im SR-Modus mit Nyquist-Sampling.
   3. Bearbeiten Sie den Stack mit Superresolution und (optional) jDCV.
   4. Verwenden Sie das Software-Tool 'PSF Measurement', um einen 3D-Gaußschen anzupassen und die volle Breite bei halbmaximalen (FWHM) Werten aufzuzeichnen.

Results

Mehrfarbige Fluoreszenzbildgebung
Die mehrfarbige Fluoreszenzbildgebung fixierter COS7-Zellen wurde wie in Abschnitt 3 beschrieben durchgeführt. Antikörper gegen α-Tubulin (Mikrotubuli) und TOMM20 (Mitochondrien) wurden zusammen mit DAPI-Kern-Gegenfarbung verwendet. Wie in Abbildung 1 dargestellt, wurden Kerne (blau), Mitochondrien (grün, Alexa Fluor 488) und Mikrotubuli (rot, Alexa Fluor 568) klar abgegrenzt mit hoher Spezifität und mini...

Discussion

Das hier vorgestellte integrierte Protokoll bietet eine umfassende Roadmap zur Umsetzung der fortschrittlichen Bildgebungsfähigkeiten eines modernen konfokalen Mikroskopsystems mit einem multiplexierten Array-Superauflösungsdetektor innerhalb eines nachhaltigen Shared-Resources-Frameworks. Dieser Abschnitt fasst die kritischen Aspekte der Methode, die praktische Umsetzung und ihre Position im Bereich der Bioimaging zusammen. Die erfolgreiche Ausführung dieses Protokolls hängt von mehrere...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
COS7-Zellen	ATCC (oder ähnlich)	CRL-1651	Afrikanische grüne Affen-Nieren-Fibroblast-Zelllinie. Verwendet zur Herstellung von Proben mit festen Zellen für mehrfarbige Superauflösungsbildgebung
Esel-Antimaus-IgG, Alexa Fluor 568 konjugiert	Invitrogen (oder ähnlich)	A10037	Sekundärer Antikörper gegen Mikrotubuli-Färbung. Verwendet bei 1:500 Verdünnung
Dulbecco' s modifiziertes Adlermedium (DMEM), hoher Glukosespiegel	Gibco (oder ähnlich)	11965092	Standardkulturmedium für COS7-Zellen, ergänzt mit 10 % FBS.
Fetales Rinderserum (FBS), hitzeinaktiviert	Gibco (oder ähnlich)	10082147	Serumpräparat wird mit 10 % (v/v) in allen Zellkulturmedien verwendet.
Glasboden-Bildbildschüssel (35 mm, µ-Dish, #1,5 Polymer-Deckmantel, 0,17 mm Dicke)	Ibidi (oder ähnlich)	81156	Substrat für Zellbeschichtung und Bildgebung. Entscheidend für die Kompatibilität mit Hoch-NA-Ölimmersionsobjektiven.
Bildverarbeitung & Analysesoftware (ZEN-Module)	Carl Zeiss AG	ZEN 3.5 (blau)	Verwendet für 3D-Rekonstruktion, Superauflösungsverarbeitung (z. B. Airyscan-Verarbeitung), PSF-Messung und SNR-Analyse.
ImageJ / Fiji	Open Source	N/A	Verwendet für zusätzliche 3D-Rekonstruktion, Erzeugung orthogonaler Ansichten und allgemeine Bildanalyse.
Immersionsöl (Brechungsindex = 1,518)	Carl Zeiss (oder ähnlich)	444960-0000-000	Für den Einsatz mit Ölimmersionsobjektiven (z. B. 63x/1,4 NA).
Laser-scannendes konfokales Mikroskopsystem mit Multiplex-Array-Detektor (z. B. ZEISS LSM 900 mit Airyscan 2)	Carl Zeiss AG	LSM 900 (Airyscan 2)	Die primäre Bildverarbeitungsplattform, die für alle im Protokoll beschriebenen Konfokal- und Superauflösungsmodi verwendet wird.
Minimum Essential Medium (MEM) mit Earle' s Salts	Gibco (oder ähnlich)	11095080	Standardkulturmedium für Hep3B-Zellen, ergänzt mit 10 % FBS.
Maus anti-α-tubulin monoklonaler Antikörper (Klon DM1A)	Sigma-Aldrich (oder ähnlich)	T6199	Primärer Antikörper zur Markierung von Mikrotubuli. Verwendet bei 1:500 Verdünnung
Paraformaldehyd (PFA), 4 % in PBS	Jinpan  (oder ähnlich)	TBS5083	Fixativ für Zellen. 15 Minuten bei Zimmertemperatur verwenden. Behandle sie mit angemessenen Vorsichtsmaßnahmen.
Phenol-rotfreies Bildgebungsmedium	Gibco (oder ähnlich)	21063029	Low-Autofluoreszenzmedium, das für die Live-Cell-Bildgebung verwendet wird. Vorausgeglichen mit 5 % CO2 bei 37 °C; C vor der Nutzung.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1X, pH 7,4	CellWorld (oder ähnlich)	C0162-311	Wird während des gesamten Protokolls als Wasch- und Verdünnungspuffer verwendet.
ProLong-Gold-Antifade-Mountant	Invitrogen (oder ähnlich)	P36930	Gehärtetes Montagemedium zur Erhaltung der Fluoreszenz in festen Proben.
Triton X-100	Sigma-Aldrich (oder ähnlich)	T8787	Verwendet mit 0,1 % (v/v) zur Zellpermeabilisierung
Tween-20	Sigma-Aldrich (oder ähnlich)	P9416	Verwendet mit 0,05 % (v/v) in PBS (PBST) für Waschschritte nach Antikörperinkubationen.
Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V	Sigma-Aldrich (oder ähnlich)	A7906	Verwendet mit 1 % (w/v) in PBS zum Blockieren und als Bestandteil des Antikörper-Verdünnungspuffers.
DAPI (4', 6-diamidino-2-Phenylindol)	Sigma-Aldrich (oder ähnlich)	D9542	Nukleare Gegenfärbung. Verwendet in einer Endkonzentration von 1 & Mikro; g/mL.
Esel-Anti-Kaninchen-IgG, Alexa Fluor 488 konjugiert	Invitrogen (oder ähnlich)	A21206	Sekundärer Antikörper gegen mitochondriale Färbung. Verwendet bei 1:500 Verdünnung
Fluoreszierende Mikrosphären (Perlen), 100 nm Durchmesser	Invitrogen (z. B. TetraSpeck&trade) oder ähnliches	T7279	Verwendet für empirische Messungen des Systems' s Punktstreuungsfunktion (PSF) und Auflösung.
Hep3B-Zellen exprimieren stabil EGFP-Mitochondrien	IMMOCELL	IM-H367	Menschliche Hepatomzelllinie, die darauf ausgelegt ist, EGFP stabil auf die mitochondriale Matrix auszudrücken. Verwendet für Live-Zell-Zeitrafferbildgebung.
HEPES-Pufferlösung, 1 M	Gibco (oder ähnlich)	15630080	Verwendet mit einer Endkonzentration von 25 mM im Bildmedium zur pH-Stabilisierung während der Live-Bildgebung außerhalb eines CO2 Inkubators.
Hochpräzises Deckglas (#1,5, 0,17 mm Dicke)	Marienfeld (oder ähnlich)	107052	Verwendet zum Anbringen fester Proben.
Mikroskop-Betriebssystem-Software (z. B. ZEN Blue Edition)	Carl Zeiss AG	ZEN 3.5 (blau)	Verwendet für Systemsteuerung, Bildaufnahme und grundlegende Verarbeitung.
Objektiv: Plan-Apochromat 63x/1,40 NA Oil DIC	Carl Zeiss AG	421462-9900-000	Primäres Ziel für hochauflösende Bildgebung.
Kaninchen-Anti-TOMM20 polyklonaler Antikörper	Abcam (oder ähnlich)	ab186735	Primärer Antikörper zur Markierung der Mitochondrien. Verwendet bei 1:1000 Verdünnung