Reproduzierbarer computergestützter Workflow für die Arzneimittelentdeckung zur Standardisierung der Netzwerkpharmakologie und molekularer Docking-Analysen

Zusammenfassung

Dieses standardisierte Protokoll vereint Netzwerkpharmakologie und molekulares Andocken mit Molekulardynamik (MD)-Simulationen für die Arzneimittelforschung. Es legt quantitative Screening-Kriterien und reproduzierbare Schritte fest, die für Multi-Target-Arzneimittelscreenings mit öffentlichen Datensätzen geeignet sind und die Ergebniszuverlässigkeit verbessern.

Zusammenfassung

Netzwerkpharmakologie und molekulares Andocken werden in der Wirkstoffforschung weit verbreitet eingesetzt, doch fragmentierte Arbeitsabläufe und inkonsistente Abläufe untergraben häufig die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Hier wird ein standardisiertes Protokoll beschrieben, das diese Ansätze in einen reproduzierbaren Rahmen für Arzneimittelscreening und Mechanismusexploration integriert, wobei der Workflow in drei aufeinanderfolgende Phasen gegliedert ist: Datenvorbereitung, Computeranalyse und Validierung. In der Vorbereitungsphase werden Verbindungsbibliotheken aus öffentlichen Datenbanken über Kriterien Absorption, Distribution, Metabolismus, Exkretion und Toxizität (ADMET) gefiltert, einschließlich oraler Bioverfügbarkeit, Arzneimittelähnlichkeit und Toxizitätsvorhersage, während potenzielle therapeutische Ziele durch Zielvorhersage und Integration krankheitsbezogener Datenbanken zur umfassenden Identifizierung von Kandidaten für Arzneimittel-Krankheitsinteraktionen gewonnen werden. In der Phase der computergestützten Analyse werden überlappende Ziele mit Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalysen sowie Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken analysiert, um Kernziele zu identifizieren; Molekulare Andockung ist mit zwei standardisierten optionalen Strategien mit deutlichen Vorteilen konfiguriert. Die zweistufige progressive Strategie nutzt AutoDock Vina für Hochdurchsatz-Screening der Verbindungsbibliothek, gefolgt von präzisem Re-Docking mit YASARA, das Fehlalarme aus Hochdurchsatz-Screening eliminiert und Protein-Liganden-Komplexe erzeugt, die nativ mit nachfolgenden YASARA-Molekulardynamik-(MD)-Simulationen kompatibel sind, um strukturelle Abweichungen durch Software-Formatkonvertierungen zu vermeiden. Die Ein-Schritt-Strategie schließt den vollständigen Andockprozess allein über YASARA ab, vereinfacht den Betriebsablauf, verbessert die experimentelle Effizienz und ist für spezifische Forschungsziele voll anwendbar. In der Validierungsphase bewerten standardisierte MD-Simulationen die Stabilität von Liganden-Protein-Komplexen anhand der Kernmetriken RMSD und der Wurzelmittelquadratschwankung (RMSF). Diese einheitliche, reproduzierbare Pipeline erhöht die Zuverlässigkeit von Netzwerkpharmakologie und Andockungsstudien und erleichtert Querstudienvergleiche bei der rechnergestützten Arzneimittelentwicklung.

Einleitung

Die Netzwerkpharmakologie stellt einen Forschungsansatz dar, der die Wechselwirkungsmuster zwischen Arzneimitteln und Organismus aus einer ganzheitlichen Netzwerkperspektive entschlüsselt¹. Durch die Konstruktion und Analyse des Wechselwirkungsnetzwerks, das den Wirkstoff-Komponente-Ziel-Krankheit-biologischen Weg umfasst, identifiziert sie quantitativ die Schlüsselmoleküle, Kernwege und synergistischen Mechanismen, durch die Medikamente ihre Wirkung entfalten. Dieser analytische Rahmen steht im Einklang mit dem internationalen Standard für Netzwerkpharmakologie, der Multi-Omics-Datenintegration und topologische Netzwerkanalyse betont und letztlich die therapeutischen Gesamtwirkungen von Medikamenten aufklärt, potenzielle Nebenwirkungen vorhersagt oder systematische Leitlinien für die Entwicklung neuer Medikamente bietet. Eine solche Strategie wurde erfolgreich in verschiedenen Bereichen angewandt, darunter die Entschlüsselung von Signalwegen, die mit Zielproteinen nichtsteroidaler Antirheumatika (NSAIDs) gegen COVID-19 verbunden sind, sowie die Untersuchung des Wirkmechanismus bei der Behandlung von Krankheiten wie Osteosarkom und Typ-2-Diabetes^{mellitus 2,3,4}. Dieser Vorteil treibt den Paradigmenwechsel von der Single-Target- zu Multi-Target-Arzneimittelentdeckung in der modernen Pharmakologie voran.

Molecular Docking ist eine rechnergestützte Simulationstechnik, die algorithmische Modellierung verwendet, um die räumliche Kompatibilität und Interaktionsstärke zwischen kleinen Molekülverbindungen und biologischen makromolekularen Zielen zu bewerten und so optimale Bindungskonfigurationen^{vorherzusagen 5,6}. Morris et al. führten AutoDock4 und AutoDockTools4 ein, die automatisiertes Andocken mit selektiver Rezeptorflexibilität ermöglichen; diese Werkzeuge basieren auf molekularer Dynamik und molekularer Geometrie und bewerten Bindungsstabilität und -affinität, indem sie Energieunterschiede zwischen Molekülen^{berechnen 7}. Klassische Werkzeuge wie AutoDock verwenden halbflexible Ligandenrezeptor-Modellierung und sind zu einem Goldstandard für die Bewertung der Bindungsaffinität in solchen Simulationen^geworden.

In der Arzneimittelforschung werden häufig Netzwerkpharmakologie-Screening-Techniken eingesetzt, um Schlüsselkomponenten zu identifizieren, die dann durch molekulare Docking validiert werden, um ihre Bindung an Zielproteine zu bewerten und letztlich die Beziehung zwischen Medikament und Krankheit^{festzustellen}. Aktuelle Anwendungen leiden jedoch häufig unter inkonsistenten experimentellen Designs, nicht standardisierten Betriebsverfahren und fehlenden Validierungsschritten. Eine systematische Auswertung pflanzlicher Pharmakologiestudien hat dieses weit verbreitete Problem dokumentiert und festgestellt, dass Datenheterogenität über Datenbanken hinweg und unzureichende experimentelle Validierung zu irrepduzierbaren Ergebnissen führen⁹. Diese Einschränkungen untergraben nicht nur die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit von Forschungsergebnissen, sondern behindern auch die Übersetzung von rechnergestützten Vorhersagen in experimentelle Validierung. Im Gegensatz zu isolierten Netzwerkpharmakologiestudien, die keine experimentelle Validierung oder fragmentierte Andocking-Workflows mit beliebigen Parametern haben, integriert dieses Protokoll beide Ansätze mit standardisierten Schwellenwerten und Schritt-für-Schritt-Operationen. Dieser Rahmen eliminiert subjektive Parameterauswahl und stellt sicher, dass der Workflow von verschiedenen Operatoren mit konsistenten Ergebnissen repliziert werden kann.

Daher kann die Etablierung standardisierter operativer Verfahren zur Identifizierung potenzieller Arzneimittelziele und -wege durch Netzwerkpharmakologie-Screening, kombiniert mit molekularem Andocken zur Validierung der Bindungsaktivität von Arzneimittelzielen, experimentelle Belege für die Untersuchung der Wirkmechanismen von Arzneimitteln und zur Screening von Kandidaten^liefern. Dieses Protokoll eignet sich besonders für das Multi-Ziel-Screening von Arzneimittelkomponenten und synthetischen kleinen Molekülen unter Verwendung öffentlich zugänglicher Omics-, chemischen und Proteinstrukturdatenbanken; es ist nicht auf Ziele ohne aufgelöste Kristallstrukturen oder auf Einzelziel-Orphan-Screenings ohne bekannte krankheitsbezogene Interaktionsnetzwerke anwendbar.

Protokoll

Dieses Protokoll umfasst ausschließlich computergestützte Analysen öffentlich zugänglicher Datenbanken und beinhaltet nicht den Einsatz von menschlichen Proben, Wirbeltieren oder biologischem Gewebe. Alle in diesem Abschnitt beschriebenen Zusammenfassungs-Workflows sind in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: Zusammenfassung des Arbeitsablaufs. Grüne Rechtecke stellen alternative Arzneimittelkomponenten dar, rote Rechtecke stehen für Krankheiten, gelbe Ellipsen für die verwendeten Websites und Software, orange Rechtecke für die erhaltenen Dateien oder Daten sowie wichtige Schritte, und lila Diamanten stellen die endgültig benötigten Ergebnisse dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

1. Erwerb von Arzneimittelkomponenten und -zielen

1. Durchsuchen Sie die PubChem-Datenbank (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) mit chemischen Namen als Schlüsselwörter, um die entsprechenden SMILES (Simplified Molecular-Input Line-Entry System)-Zeichenketten zu erhalten.
2. Greifen Sie auf die ADMETlab 3.0-Website (https://admetlab3.scbdd.com/) auf, wählen Sie unter dem Reiter Services die Option ADMET Evaluation , geben Sie die SMILES-Zeichenketten ein und klicken Sie auf die Schaltfläche SENDEN .
3. Filtern Sie die ADMET-Ergebnisse basierend auf Indikatoren: Absorption, Verteilung, Stoffwechsel, Ausscheidung, Toxizität, Arzneimittelchemie und Toxikophorenregeln. Behalten Sie nur Verbindungen auf, die alle vordefinierten Schwellenwerte für jeden Indikator erfüllen (Tabelle 1).
4. Greifen Sie auf die ProTox 3.0-Website (https://tox.charite.de/protox3/index.php?site=home) auf, geben Sie die SMILES-Strings der gefilterten Verbindungen ein, wählen Sie das TOX PREDICTION-Modul , aktivieren Sie alle gewünschten Vorhersageoptionen (z. B. Organtoxizität, Karzinogenität) und führen Sie die Vorhersage aus.
5. Filtern Sie Verbindungen mit vorhergesagten Toxizitäten aus, die die vordefinierten Sicherheitsschwellenwerte basierend auf den ProTox 3.0-Ergebnissen überschreiten (Tabelle 2).
6. Stellen Sie die Verbindungen, die sowohl das ADMET- als auch das ProTox 3.0-Screening bestehen, in eine strukturierte Arzneimittelkomponentendatenbank (z. B. Excel- oder CSV-Format) mit Spalten für Verbindungsname, SMILES und Screening-Status zusammen.
7. Greifen Sie auf die Website SwissTargetPrediction (https://swisstargetprediction.ch/) zu, wählen Sie Homo sapiens im Erreger-Dropdown-Menü aus, geben Sie die SMILS-Zeichenketten der Komponenten in die Datenbank der Arzneimittelkomponenten ein, klicken Sie auf die Schaltfläche "Ziele vorhersagen " und sammeln Sie alle vorhergesagten Ziele mit einem Wahrscheinlichkeitswert größer als 0.
8. Greifen Sie auf die SEA (Similarity Ensemble Approach) Website (https://sea.bkslab.org/) auf und geben Sie dieselben SMILS-Strings ein, die oben für die Zielvorhersage verwendet werden, und filtern Sie die Ergebnisse so, dass nur Einträge im Feld Target Key behalten werden, die auf _Human enden und einen p-Wert unter 0,05 haben.
9. Kombinieren Sie die von SwissTargetPrediction und SEA gewonnenen Ziellisten zu einer einzigen Arzneimittel-Aktions-Zielbibliothek. Entfernen Sie doppelte Ziele und standardisieren Sie Zielnamen auf offizielle Gensymbole (z. B. unter Verwendung der HGNC-Richtlinien) mittels Uniprot (https://www.uniprot.org/).
   HINWEIS: Die drug-action target-Bibliothek kann als CSV-Datei für die spätere Verwendung gespeichert werden.

Tabelle 1: ADMETlab 3.0 Schwellenwerte für das Arzneimittelsicherheitsscreening. Die Tabelle fasst die empfohlenen Grenzwerte und Klassifikationsbereiche für wichtige physikochemische Eigenschaften, ADME-Parameter, Wechselwirkungen im Metabolismus, Toxizitätsendpunkte, Toxizitätswege und Toxikophorhregeln zusammen. Vorhersagen werden in drei Risikostufen (niedrig, mittel und hoch) auf Basis von Wahrscheinlichkeitswerten (< 0,3, 0,3 - 0,7, > 0,7) oder quantitativen Bereichen unterteilt, was eine systematische Bewertung der Sicherheitsprofile von Verbindungen während der frühen Arzneimittelentdeckung ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: ProTox-3.0 Schwellenwerte für die Toxizitätsvorhersage bei der Arzneimittelforschung. Die Tabelle fasst die wichtigsten von ProTox 3.0 vorhergesagten Toxizitätsendpunkte zusammen, mit Schwerpunkt auf Parameter, die für die Arzneimittelsicherheit während der frühen Arzneimittelentwicklung entscheidend sind. Jeder Endpunkt liefert eine binäre Klassifikation (Aktiv oder Inaktiv) zusammen mit einem Wahrscheinlichkeitsscore (0-1), wobei Aktiv ein potenzielles Toxizitätsrisiko anzeigt. Priorität sollte Organtoxizitäten (Hepatotoxizität, Kardiotoxizität), Toxizitätsendpunkte (Karzinogenität, Mutagenizität, Immuntoxizität) und Hemmung des CYP-Stoffwechsels liegen, da dies Hauptursachen für klinischen Abfall sind. Mehrere aktive Treffer über Endpunkte deuten auf breites Toxizitätspotenzial hin und rechtfertigen eine Verringerung der Verbindungen. Akute Toxizität wird anhand von vorhergesagten LD50- und GHS-Klassen bewertet, wobei Klasse 1 - 3 (< 300 mg/kg als hoch toxisch gilt. Wahrscheinlichkeitswerte geben für jede Vorhersage Konfidenzniveaus an. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

2. Erfassung von Krankheitszielen

HINWEIS: Beim Screening von Datenbanken sollten Sie die Benennungskonventionen des Zielgens standardisieren, um Auslassungen durch Nomenklaturabweichungen zu vermeiden.

1. Greifen Sie auf fünf krankheitsbezogene Datenbanken zu: OMIM (https://www.omim.org/), Disgenet (https://disgenet.com/), TTD (https://ttd.idrblab.cn/), GeneCards (https://www.genecards.org/) und PharmGkb (https://www.pharmgkb.org/). Wenden Sie folgende datenbankspezifische Screening-Kriterien an: Für GeneCards filtern Sie Einträge mit einem Relevanzwert ≥ 1,0; für DisGeNET wählen Sie Einträge aus, die mit der Zielkrankheit verbunden sind; für PharmGKB beschränken Sie die Ergebnisse auf genbezogene Einträge, indem Sie die Gen-Option wählen; für TTD behalten Sie Einträge, in denen die Spalte Krankheit mit der Zielkrankheit übereinstimmt.
2. Für jede Datenbank verwenden Sie den offiziellen Namen der Zielkrankheit (z. B. Alzheimer) als Suchstichwort, um alle zugehörigen Ziele abzurufen.
3. Fasst die Ziellisten aus allen fünf Datenbanken in einer einzigen Tabelle zusammen. Entfernen Sie doppelte Ziele, indem Sie Gensymbole aus verschiedenen Listen vergleichen.
4. Standardisieren Sie alle verbleibenden Zielnamen mit offiziellen Gensymbolen über Uniprot, um Nomenklaturinkonsistenzen zu beheben. Speichern Sie die standardisierte, deduplizierte Liste als Krankheitszielbibliothek (CSV- oder Excel-Format).
   HINWEIS: Die Krankheitszielbibliothek kann zusammen mit der Arzneimittel-Aktionszielbibliothek (Schritt 1.9) für die spätere Verwendung in Schritt 3 gespeichert werden.

3. Erfassung gemeinsamer Arzneimittel-Krankheitsziele

1. Greifen Sie auf das Venny 2.1.0 Webtool (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/) zu. Importieren Sie die Arzneimittel-Aktionszielbibliothek (Schritt 1.9) und die Krankheitszielbibliothek (Schritt 2.4) in die beiden Eingabefelder von Venny 2.1.0, um ein Venn-Diagramm zu erstellen, das die Überlappung zwischen den beiden Zielsätzen zeigt.
2. Extrahieren Sie die Schnittziele aus den Ergebnissen des Venn-Diagramms. Etikettieren Sie diese als gemeinsame Arzneimittel-Krankheitsziele (potenzielle Interaktionspunkte) und speichern Sie sie als CSV-Datei.

4. Aufbau von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken (PPI) und Analyse des Kernziels

1. Zugriff auf die STRING-Datenbank (https://cn.string-db.org/). Wähle Homo sapiens als Organismus im Dropdown-Menü aus.
2. Importieren Sie die gemeinsamen Arzneimittel-Krankheitsziele (Schritt 3.2) in das STRING-Eingabefeld. Setzen Sie den erforderlichen Mindestparameter für den Interaktionsscore auf hohe Konfidenz (0,700) und klicken Sie auf Suchen , um PPI-Daten zu erzeugen. Exportieren Sie die PPI-Daten als TSV-Datei (tab-separated values).
3. Öffnen Sie die Cytoscape-Software mit dem vorinstallierten CytoNCA-Plugin. Importieren Sie die PPI-TSV-Datei in Cytoscape mit dem Dateimenü Datei > Netzwerk > importieren .
4. Starten Sie das CytoNCA-Plugin, indem Sie auf Apps > CytoNCA > Open klicken. Wählen Sie fünf Referenzmetriken für das Screening von Kernzielen aus: Betweenness, Closeness, Degree, Eigenvector und LAC.
   HINWEIS: Fünf wichtige topologische Kennzahlen sind: Betweenness (Betweenness-Zentralität, die die Frequenz eines Ziels misst, das auf allen kürzesten Pfaden im Netzwerk erscheint), Closeness (Closeness-Zentralität, die die durchschnittliche kürzeste Pfadlänge von einem Ziel zu allen anderen Zielen im Netzwerk widerspiegelt), Grad (lokaler Verbindungsgrad, der die Anzahl direkter Interaktionen zwischen einem Ziel und anderen Zielen quantifiziert), Eigenvektor (Eigenvektorzentralität, die sowohl die eigene Konnektivität des Ziels als auch die Bedeutung seiner verbundenen Ziele gewichtet) und LAC (lokale Durchschnittsverbindung, die die Verbindungsdichte zwischen den direkt benachbarten Knoten eines Ziels bewertet).
5. Starten Sie die Netzwerkanalyse, indem Sie auf das Menü Tools > Netzwerk analysieren klicken und dann auf OK klicken. Exportieren Sie die Analyseergebnisse in eine CSV-Tabelle.
6. Berechnen Sie den Medianwert für alle fünf Kennzahlen und behalten Sie Ziele, die den Median erreichen oder überschreiten. Wiederholen Sie Schritt 4.5 mehrmals, bis 10 bis 20 Ziele übrig sind.
7. Sortiere die verbleibenden Ziele nach der Degree-Metrik (von höchst bis niedrigst) und wähle vorläufig die Top 10 Ziele als Kerngene aus. Speichere die Kerngenliste als CSV-Datei.
   1. Um Fehlalarme zu reduzieren und sicherzustellen, dass nur strukturell geeignete Ziele zum Andocken übergehen, führen Sie weitere Bewertungen auf strukturelle Machbarkeit und Arzneimittelfähigkeit durch: prüfen Sie die PDB-Datenbank auf verfügbare hochauflösende Kristallstrukturen (≤ 2,5 Å) oder bewerten, ob ein zuverlässiges Homologiemodell erstellt werden kann; verwenden Sie Taschenvorhersagewerkzeuge, um das Vorhandensein geeigneter Bindungsstellen zu bestätigen; und vergleichen Sie mit Literatur- oder Funktionsdatenbanken, um dokumentierte Relevanz für den Krankheitsweg zu überprüfen.
   2. Depriorisieren Sie Ziele, die keine strukturelle Verfügbarkeit, keine Medikamententaschen oder keine Krankheitsrelevanz für Andockstudien haben. GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen können weiterhin mit der vollständigen Kernzielliste aus diesem Schritt durchgeführt werden, da keine strukturellen Informationen erforderlich sind.
      HINWEIS: Die Anzahl der Gene in den Schritten 4.6 und 4.7 kann bei Bedarf angepasst werden. Typischerweise bleiben nach Schritt 4.6 10 bis 20 Ziele, und es wird empfohlen, mindestens 10 Kerngene in Schritt 4.7 zu erhalten, um ein ausreichendes Datenvolumen für eine zuverlässige GO- und KEGG-Anreicherungsanalyse sowie konsistente Visualisierungstrends sicherzustellen.

5. Analyse und Visualisierung der GO- und KEGG-Anreicherung

HINWEIS: Dieser Teil klärt die Genfunktionen auf zellulärer Komponente-, funktioneller und intrazellulärer Wegebene.

1. Greifen Sie auf das DAVID-Webtool (https://davidbioinformatics.nih.gov/home.jsp) zu. Wählen Sie Genliste als Eingabetyp aus und importieren Sie die Kerngene in das Eingabefeld.
2. Setzen Sie den Identifikator auf OFFICIAL_GENE_SYMBOL und wählen Sie Homo sapiens unter Arten auswählen. Klicken Sie dann auf Liste absenden , um die Kerngene hochzuladen.
3. Für die GO-Anreicherungsanalyse wählen Sie die Kategorien GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT und GOTERM_MF_DIRECT aus.
4. Für die KEGG-Anreicherungsanalyse wählen Sie die Kategorie KEGG_PATHWAY . Setzen Sie die Signifikanzschwelle für sowohl GO- als auch KEGG-Analysen auf p < 0,05.
5. Klicken Sie auf das funktionale Annotationsdiagramm , um Anreicherungsergebnisse zu generieren. Exportieren Sie die GO- und KEGG-Ergebnisse als CSV-Dateien. Verwenden Sie die R Studio Software mit ggplot2, um Balkendiagramme oder Blasendiagramme für die Top 10 angereicherten Begriffe/Pfade zu erstellen.
   HINWEIS: Die Anzahl der angezeigten Begriffe/Wege kann je nach Anforderungen angepasst werden.

6. Molekulare Andockung mit Autodock Vina

HINWEIS: Schritt 6 und Schritt 7 sind beide molekulare Andockschritte. Schritt 6 verwendet AutoDock Vina 1.1.2 Software, während Schritt 7 YASARA 10.3.16 verwendet. Die Verwendung von YASARA erleichtert die anschließende YASARA-Molekulardynamik-Simulation. Wenn die Andockergebnisse von AutoDock Vina erforderlich sind, sollten die Andockergebnisse in YASARA mit denen von AutoDock Vina konsistent sein. Dies vermeidet Abweichungen durch Software-Switching und gewährleistet zudem die Zuverlässigkeit der Validierungsergebnisse der molekularen Dynamiksimulation mit detaillierter Methode: Öffnen Sie das Ergebnis "result.pdb" von Schritt 6.31 mit LigPlot+ (Version 2.3), um ein 2D-Interaktionsdiagramm zu erstellen, identifizieren Sie die Schlüsselreste, die mit dem Liganden interagieren, wählen Sie dann die Schlüsselreste im Andockungsschritt 7.18 von YASARA aus und stellen Sie die Box so ein, dass sie die Bindungstasche abdeckt, um die Konsistenz der Andockstellen zwischen Vina und YASARA zu maximieren. Anschließend sollte bei der Auswahl der optimalen Andockergebnisse in Schritt 7.19 sichergestellt werden, dass die wichtigsten wechselwirkenden Reste zwischen Ligand und Rezeptor mit denen aus den AutoDock Vina-Ergebnissen konsistent bleiben. Diese Konsistenzanforderung konzentriert sich auf die Erhaltung wesentlicher Interaktionsmuster und nicht auf exakte atomare Entsprechung; geringfügige Variationen der peripheren Residuenkonformationen werden aufgrund von Unterschieden in der Kraftfeldparametrisierung und der Flexibilität der Seitenkette erwartet. Solange die kritischen Wechselwirkungen mit wichtigen aktiven Standortresten erhalten bleiben, können die Andockergebnisse für Kreuzvalidierungszwecke als konsistent angesehen werden. Wenn das AutoDock Vina-Andocken (Schritt 6) nicht erforderlich ist, kann Schritt 7 direkt durchgeführt werden.

1. Erhalten Sie die SDF (Structure Data File) der Arzneimittelverbindungen namens ligand.sdf aus der PubChem-Datenbank, indem Sie nach den entsprechenden MILES-Strings suchen (Schritt 1.1).
2. Öffnen Sie SDF-Dateien mit der Chem3D-Software. Wählen Sie unter der Berechnungsoption MM2 aus und klicken Sie auf Energie minimieren , um die freie Energieminimierung der Verbindungsstruktur durchzuführen.
3. Speichern Sie die minimierte Struktur als ligand.mol2-Datei durch Auswahldatei > Speichern als. Erhalten Sie die PDB-Datei (Protein Data Bank) des Proteinrezeptors des Kerngens aus der RCSB-PDB-Datenbank (https://www.rcsb.org/; Suche nach PDB-ID oder Gennamen) namens receptor.pdb.
   1. Priorisieren Sie Strukturen mit einer Auflösung ≤ 2,5 Å und aufgelösten Bindungsstellen, falls vorhanden. Bei der Auswahl einer Struktur prüfen Sie den Eintrag auf Vollständigkeit (z. B. das Vorhandensein aller erwarteten Domänen, das Fehlen großer ungelöster Schleifen), potenzielle Mutationen, die die Bindung von Liganden beeinflussen könnten, und ob funktionell wichtige Kofaktoren (z. B. Häm, Metallionen) oder kokristallisierte Liganden einbezogen sind.
   2. Für Ziele mit bekannten oligomeren Assemblierungen sollte überlegt werden, ob die monomere oder multimere Form für die Forschungsfrage geeignet ist; die biologische Assemblierung kann heruntergeladen werden, wenn dimerische oder höherordnungige Wechselwirkungen relevant sind. Die gewählte Struktur wird in den folgenden Schritten weiter vorbereitet, sodass die erste Inspektion hilft, nachgelagerte Komplikationen zu vermeiden.
4. Öffnen Sie die receptor.pdb mit der PyMOL-Software. Geben Sie in der Kommandozeile "organisch entfernen" ein und drücken Sie Enter, um kleine Molekül-Liganden aus der Proteinstruktur zu entfernen.
   HINWEIS: Wenn Sie den kokristallisierten Liganden zur Definition der Bindungsstelle verwenden, notieren Sie zunächst die 3D-Zentrumskoordinaten des Liganden, tippen Sie dann remove organic in der PyMOL-Befehlszeile und drücken Sie Enter, um co-kristallisierte kleine Moleküle zu löschen; ansonsten führen Sie direkt den Befehl remove organic aus, um co-kristallisierte kleine Moleküle zu entfernen.
5. Geben Sie in der Befehlszeile Remove Solvent ein und drücken Sie Enter, um freie Wassermoleküle aus der Proteinstruktur zu entfernen; verwenden Sie den Befehl select metal_cofactor, resn [Name des Zielkofaktor-Rückstands], um funktional kritische Metallionen oder Kofaktoren (z. B. HEM, Zn²⁺, Mg²⁺) zu identifizieren und deren Verbleib in der Struktur zu bestätigen.
6. Exportieren Sie den gereinigten Rezeptor aus PyMOL als receptor_clean.pdb, indem Sie auf Datei klicken > Molekül exportieren > speichern.
7. Öffnen Sie receptor_clean.pdb in UCSF Chimera 1.19. Zeigen Sie die Sequenz an, indem Sie auf Werkzeuge > Sequenz > Sequenz klicken, um auf fehlende Schleifen neben der Bindungsstelle zu überprüfen (fehlende Bereiche werden durch rote Umrissfelder angezeigt). Wenn fehlende Schleifen vorhanden sind, bauen Sie sie neu auf, indem Sie Struktur > Modeller (Schleifen/Verfeinerung) im Sequenzfenstermenü auswählen, nicht-terminale fehlende Struktur auswählen, eine passende Anzahl von Modellen (z. B. 5) setzen und mit der Berechnung fortfahren. Nach Abschluss wählen Sie das sinnvollste Modell aus.
8. Optimieren Sie die Struktur in Chimera. Verwenden Sie das Rotamers-Werkzeug (Dunbrack-Bibliothek) auf ausgewählten Resten, um Seitenketten zu optimieren, fügen Sie Clashes und H-Bindings über das Spaltenmenü hinzu, um Konformationen mit minimalen Kollisionen (0 - 1 bevorzugt) und günstigen H-Bindungen auszuwählen. Fügen Sie dann Wasserstoff hinzu und weisen Sie Ladungen mit Dock Prep (AMBER ff14SB) zu. Führen Sie schließlich die Energieminimierung mit dem Werkzeug "Struktur minimieren" durch, fixieren Sie Backbone-Atome durch Auswahl (sel @ca, c, n, o), invertieren Sie die Auswahl und aktivieren Sie feste Atome. Speichern Sie die bearbeitete Struktur als receptor_optimized.pdb, indem Sie Datei > PDB speichern.
   HINWEIS: Side-Chain-Optimierung für gut geordnete Reste überspringen. Dock Prep übernimmt automatisch die Protonation. Die Minimierung sollte mit festem Rückgrat durchgeführt werden.
9. Öffnen Sie receptor_optimized.pdb erneut in PyMOL und definieren Sie die kanonische Bindungsstelle. Wenn ein kokristallisierter Ligand vorhanden ist, verwenden Sie dessen Koordinaten zur Zentrierung des Gitters: Zeichnen Sie das Zentrum des Liganden auf und entfernen Sie es dann mit Entfernen organischer. Ist kein kokristallisierter Ligand verfügbar, definieren Sie die Bindungsstelle anhand bekannter Schlüsselreste aus der Literatur (z. B. select binding_site, resi XXX-XXX) oder indem Sie die vermutete Bindungstasche visuell mit Taschenvorhersagewerkzeugen identifizieren, um die visuelle Bewertung zu validieren. Notieren Sie die 3D-Zentrumskoordinaten (x/y/z) der definierten Stelle für die Gridbox-Einrichtung.
   HINWEIS: Die hier aufgezeichneten Koordinaten dienen zur Zentrierung des AutoDock Vina-Gitters. Für eine residuenbasierte Definition sollte das geometrische Zentrum der ausgewählten Reste berechnet werden; für eine visuell oder mit Vorhersagewerkzeugen identifizierte Tasche wird das Zentrum der Kavitität verwendet. Bei der Definition der Bindungsstelle muss berücksichtigt werden, ob die vorgesehene Andockstrategie die orthosterische (aktive) Stelle oder eine allosterische Stelle anvisiert. Für orthosterisches Targeting sollte die Bindungsstelle auf Basis eines kokristallisierten Liganden oder konservierter aktiver Stellenreste in der Literatur definiert werden. Für allosterisches Targeting können Taschenvorhersagetools eingesetzt werden, um potenzielle allosterische Stellen zu identifizieren, insbesondere bei Zielen mit bekannten allosterischen Regulations. Mangels vorheriger Informationen kann globales Andocken gefolgt von Clustering vorhergesagter Bindungshotspots bei der Identifizierung potenzieller allosterischer Stellen helfen. Diese Flexibilität ermöglicht es dem Protokoll, sowohl orthosterische als auch allosterische Wirkstoffforschungskampagnen zu ermöglichen.
10. Exportieren Sie die endgültig optimierte Struktur aus PyMOL als receptor.pdb, indem Sie auf Datei klicken > Molekül exportieren > speichern.
11. Öffnen Sie receptor.pdb in AutoDock Tools 4.2.6, indem Sie auf Datei > Molekül lesen. Flexible Residuen definieren. Klicken Sie >auf Flexible Residuen bearbeiten > Residuen auswählen und Bindungsstellen-Residuen auswählen, die bei der Bindung von Liganden voraussichtlich Konformationsänderungen durchlaufen (wählen Sie ≤ 10 Residuen).
    HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht es ausgewählten Seitenketten, sich während des Andockens zu bewegen, wobei induzierte Passeffekte berücksichtigt werden.
12. Speichere den Rezeptor mit flexiblen Rückständen als PDB-Datei. Klicke auf Datei > Speichern, wähle im Dropdown-Menü PDB schreiben. Im Fenster Verfügbare PDB-Aufzeichnungen aktivieren Sie ATOM und CONECT, klicken Sie auf ADD und dann OK. Speichern Sie die Datei als receptor.pdb.
    HINWEIS: Diese PDB-Datei enthält Informationen über flexible Reste und wird zur Erstellung der PDBQT-Datei verwendet.
13. Bereiten Sie das Makromolekül für das Andocken vor. Klicken Sie auf Raster > Makromolekül > Auswählen, wählen Sie die Datei receptor.pdb und klicken Sie auf Molekül auswählen. Speichern Sie den Rezeptor als PDBQT-Datei, indem Sie auf Datei > Speichern als klicken und ihn receptor.pdbqt nennen.
    HINWEIS: AutoDock Tools weist Ladungen und Atomtypen zu, speichert den Empfänger im nativen PDBQT-Format von AutoDock, bereit für die Gridbox-Generierung und Andockberechnungen.
14. Klicken Sie auf das Ligandenmenü , wählen Sie Eingabe und klicken Sie dann auf Öffnen. Wählen Sie ligand.mol2 und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf das Ligandenmenü , wählen Sie Torsionen und dann auf Torsionen erkennen. AutoDock Tools identifizieren automatisch rotierbare Bindungen in der Ligandenstruktur (z. B. Einzelbindungen in Alkylketten, Amidbindungen ohne Peptidbindungen).
15. Im Torsionsauswahlfenster überprüfen Sie die erkannten rotierbaren Bindungen (alle gültigen rotierbaren Bindungen behalten, starre Bindungen wie aromatische Ringbindungen ausschließen). Klicken Sie auf Festlegen , um die Torsionsdefinitionen zu bestätigen, und klicken Sie dann auf Schließen.
    HINWEIS: Das Erhalten gültiger rotierbarer Bindungen stellt sicher, dass der Ligand während des Andockens unterschiedliche Konformierungen annehmen kann (flexibler Ligand), während der Rezeptor steif bleibt – das ist der Kern des halbflexiblen Andockens in AutoDock Vina.
16. Klicken Sie erneut auf das Ligandenmenü , wählen Sie Ausgabe und klicken Sie dann auf Als PDBQT speichern. Nennen Sie die Datei ligand.pdbqt und speichern Sie sie im selben Verzeichnis wie receptor.pdbqt.
17. Klicken Sie auf das Menü Anzeigen , wählen Sie Sekundärstruktur. Klicken Sie auf Nur anzeigen, dann auf Linien und Klicken Sie auf Unanzeigen , um die Proteinansicht zu vereinfachen.
18. Klicken Sie auf das Menü Raster , wählen Sie Rasterbox. Passen Sie die Werte x, y, z (Mittelkoordinaten) und Spacing(Å) an, um die Box über der aktiven Stelle des Proteins zu positionieren.
    HINWEIS: Wenn die Bindungsstelle unbekannt ist, verwenden Sie Taschenvorhersagewerkzeuge (z. B. CASTp, DoGSite), um mutmaßliche Bindungstaschen zu identifizieren. Das Abdecken des gesamten Proteins erhöht die Fehlalarme und die Rechenkosten signifikant und wird nicht empfohlen.
19. Klicken Sie auf Datei > Schließen und aktuellen speichern und dann auf Raster > Ausgabe > GPF speichern , um die Gridbox-Einstellungen als Grid.gpf zu speichern.
20. Öffnen Sie Grid.gpf mit einem Texteditor und zeichnen Sie das Gridcenter (x, y, z-Werte) und NPTS (Größe x, y, z) aus der Datei auf.
21. Erstelle eine neue Textdatei mit dem Namen Config.txt und tippe folgenden Inhalt ein:
    rezeptor = receptor.pdbqt
    Ligand = ligand.pdbqt
    center_x = [Gitterzentrum x Wert aus Grid.gpf]
    center_y = [Gitterzentrum y-Wert aus Grid.gpf]
    center_z = [Gitterzentrum z-Wert aus Grid.gpf]
    size_x = [npts x Wert aus Grid.gpf]
    size_y = [npts y-Wert aus Grid.gpf]
    size_z = [npts z-Wert aus Grid.gpf]
    energy_range = 5
    num_modes = 10
    Ersetze den in Klammern eingeklammerten Text durch Werte aus Grid.gpf (Schritt 6.19).
    HINWEIS: Der energy_range-Parameter sollte als maximal zulässige Energiedifferenz relativ zum optimalen kombinierten Modell mit Einheiten in kcal/mol gesetzt werden. Zum Beispiel bedeutet die Einstellung auf 5, dass AutoDock Vina die Berechnungen beendet, sobald der Energieunterschied vom optimalen Modell 5 kcal/mol erreicht. Zusätzlich gibt num_modes die Anzahl der zu erzeugenden Bindungsmodelle an, die typischerweise auf 10 gesetzt wird.
22. Legen Sie die Dateien vina_split.exe und vina.exe im selben Verzeichnis wie receptor.pdbqt, ligand.pdbqt und Config.txt.
23. Öffnen Sie die Windows-Systemkonsole und navigieren Sie mit dem Befehl cd (z. B. cd C:\DockingFiles) zum Verzeichnis.
24. Geben Sie folgenden Befehl ein und drücken Sie Enter: vina.exe --config config.txt --log log.txt --out output.pdbqt
25. Warten Sie, bis das Andocken abgeschlossen ist (Dauer variiert je nach System). Es erscheinen zwei Dateien: log.txt (Andockergebnis) und output.pdbqt (Ligandenstruktur mit niedrigster Energie). Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, werden drei unabhängige Andockläufe mit verschiedenen zufälligen Seeds durchgeführt. Ein RMSD < 1,0 Å unter den Top-Posen bestätigt die Konsistenz.
    HINWEIS: Als empirische Referenz können AutoDock Vina-Bindungsenergien (kcal/mol) wie folgt interpretiert werden: ≤ -7 (hohe Affinität, potenziell aktive Konformationen), -7 bis -5 (moderate Affinität), ≥ -5 (niedrige Affinität). Diese Schwellenwerte sind systemabhängig und sollten mit experimentellen Daten validiert werden.
    1. Zur Bewertung der Andockgenauigkeit und Diskriminierungsfähigkeit für ein bestimmtes Ziel werden zwei komplementäre Validierungsansätze empfohlen. Verwenden Sie Redocking-Validierung mit kristallographischen Liganden, um zu bewerten, ob das Protokoll experimentell beobachtete Bindungsmodi reproduzieren kann, wobei RMSD < 2,0 Å als Standardakzeptanzkriterium dient.
    2. Verwenden Sie Anreicherungsanalysen mit öffentlichen Benchmark-Datensätzen (z. B. DUD-E), um die Fähigkeit des Protokolls zu bewerten, echte aktive Verbindungen von eigenschaftsangepassten Täuschkörpern zu unterscheiden; dies beinhaltet die Berechnung von ROC-Kurven (die eine globale Maßzahl der Klassifikationsleistung liefern) und Anreicherungsfaktoren wie EF1 % (Quantifizierung der Anreicherung aktiver Stoffe im höchstbewerteten Anteil). Zusammen helfen diese Validierungsschritte, geeignete Affinitätsgrenzwerte festzulegen und gewährleisten eine zuverlässige Screening-Leistung für die Zielklasse von Interesse.
26. Öffnen Sie die PyMOL-Software. Importieren Sie output.pdbqt und receptor.pdbqt, indem Sie auf Datei > Öffnen klicken. Speichern Sie die kombinierte Struktur als result.pdb, indem Sie auf Datei > Speichern wie klicken.
27. Löschen Sie den PyMOL-Arbeitsbereich, indem Sie auf Datei > Neue Sitzung klicken, und öffnen Sie dann result.pdb erneut, um den Liganden-Protein-Komplex zu visualisieren.

7. Molekulare Andockung mit YASARA

HINWEIS: Dieser Schritt dient als präzises Redocking und Vorverarbeitung für die nachfolgende Molekulardynamik-(MD)-Simulation und stellt eine progressive Verifikation der Hochdurchsatz-Screening-Ergebnisse aus Schritt 6 dar. Schritt 6 verwendet AutoDock Vina, das Goldstandard-Tool für Hochdurchsatz-Virtualscreening, um Kandidatenmoleküle mit ausgezeichneter Bindungsaffinität aus der Verbindungsbibliothek schnell zu screenen. Dieser Schritt verwendet YASARA für das Andocken, da das Andockmodul vollständig mit der YASARA MD-Simulationsplattform kompatibel ist, die strukturelle Abweichungen durch Dateiformatkonvertierung und Softwarewechsel vermeiden und eine standardisierte komplexe Anfangsstruktur für die spätere MD-Simulation bereitstellen kann. Für alle in Schritt 6 von AutoDock Vina gescreenten Kandidatenmoleküle müssen die Andockergebnisse (einschließlich Bindungspose in der aktiven Tasche und wichtigen Aminosäurewechselwirkungen) mit denen von AutoDock Vina übereinstimmen, und die relative Rangfolge der Bindungsaffinität muss vor der MD-Simulation denselben Trend halten. Die absoluten Andockwerte sind aufgrund unterschiedlicher Berechnungsalgorithmen zwischen den beiden Software nicht direkt vergleichbar. Diese Konsistenzanforderung kann falsch-positive Ergebnisse durch Softwareunterschiede eliminieren, die Stabilität der Bindungseigenschaften von Kandidatenmolekülen gewährleisten und die Zuverlässigkeit sowie logische Kontinuität der anschließenden MD-Simulationsvalidierung gewährleisten.

1. Nutze OpenBabel, um die ligand.sdf-Datei in die ligand.pdb-Datei umzuwandeln.
   HINWEIS: OpenBabel wird hier ausschließlich für die Formatkonvertierung verwendet. Die eigentliche Parametrisierung des Ligands für die Molekulardynamik wird in den folgenden Schritten automatisch von YASARA durchgeführt.
2. Öffnen Sie die YASARA-Software. Klicken Sie auf Datei > Laden und wählen Sie ligand.pdb, um den Liganden zu importieren. Klicken Sie auf Bearbeiten > Reinigen > Alles , um strukturelle Mängel vom Liganden zu entfernen.
   HINWEIS: Dieser Schritt führt eine grundlegende Geometrie-Aufräumung durch. YASARA weist dem Liganden dann automatisch Kraftfeldparameter mit seiner integrierten AutoSMILES-Technologie zu, die die General AMBER Force Field (GAFF) und AM1-BCC-Ladungen anwendet, um die Kompatibilität mit dem AMBER14 Kraftfeld des Proteins sicherzustellen. Diese Parametrisierung ist für genaue Energieberechnungen sowohl in Andock- als auch in MD-Simulationen unerlässlich.
3. Klicken Sie auf Optionen > Standard-pH, wählen Sie den entsprechenden pH-Wert aus (z. B. 7,4 für physiologische Bedingungen) und klicken Sie auf OK.
4. Klicken Sie auf Andocken > Kraftfeld , um das Andockkraftfeld einzustellen und so die Parameterkonsistenz mit nachfolgenden MD-Simulationen sicherzustellen.
   HINWEIS: AMBER14 ist das empfohlene Kraftfeld für diesen Wirkstoffforschungs-Workflow in YASARA 10.3.16, da es eine umfassende Parameterabdeckung für Proteine bietet und vollständig mit Standard-MD-Simulationsprotokollen kompatibel ist. Für Standard-Proteinreste werden die Parameter automatisch aus den eingebauten Vorlagen des Kraftfeldes zugewiesen. Für kleine Molekülliganden führt YASARA automatisch die Parametrisierung mit seiner integrierten AutoSMILES-Technologie durch, die GAFF (General AMBER Force Field) Atomtypen und AM1-BCC-Ladungen zuweist. Dies gewährleistet die Kompatibilität zwischen Protein- und Ligandenparametern und ermöglicht genaue Energieberechnungen sowohl in Andock- als auch in MD-Simulationen. Ein passenderes Kraftfeld kann entsprechend der tatsächlich verwendeten YASARA-Version und den spezifischen Eigenschaften des Systems ausgewählt werden.
5. Klicken Sie auf Simulator > Definieren Sie Simulationszellen> um alle Atome , um die Arbeitsgrenze festzulegen. Klicken Sie auf Simulator > Zellgrenzen > periodisch, um periodische Randbedingungen zu ermöglichen.
6. Klicken Sie auf Optionen > Wählen Sie Experiment > Energieminimierung und klicken Sie dann auf Ausführen , um die Energie des Liganden zu minimieren.
7. Klicken Sie auf Datei > Speichern unter, benennen Sie die Datei ligand.pdb und klicken Sie auf OK , um die ursprüngliche Liganden-PDB-Datei zu überschreiben. Klicken Sie auf Datei > Neu, um den Arbeitsbereich zu löschen, dann klicken Sie auf Datei > Laden und wählen Sie die Datei receptor.pdb.
8. Wiederholen Sie die Schritte 7.2 bis 7.7 für den Proteinrezeptor und speichern Sie die verarbeitete Datei als neue receptor.pdb-Datei.
9. Klicken Sie auf Datei > Neu, dann auf Datei > Laden und wählen Sie sowohl ligand.pdb als auch receptor.pdb aus. Wiederholen Sie die Schritte 7.3 bis 7.5, um den pH-Wert festzulegen, die Simulationszelle zu definieren und periodische Grenzen für den Komplex zu aktivieren.
10. Klicken Sie auf Prozessoren > CPU festlegen und wählen Sie die Anzahl der CPU-Kerne aus. Klicken Sie auf Prozessoren > GPU festlegen und wählen Sie das GPU-Gerät aus, um die Berechnungen zu beschleunigen.
11. Klicken Sie auf Datei > Als > YASARA-Szene speichern, nennen Sie die Datei sce\nesult.sce (erstellen Sie den SCE-Ordner, falls er nicht existiert) und klicken Sie auf OK.
12. Klicken Sie auf Optionen > Makro&Movie > Setzen Sie Ziel, wählen Sie sce\nesult.sce und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf Optionen > Makro&Film > Play-Makro, wählen Sie die Makrodatei dock_run.mcr und klicken Sie auf OK.
13. Klicken Sie auf Simulator > Definieren Sie die Simulationszelle > um ausgewählte Atome und wiederholen Sie 7,5, dann klicken Sie auf Fortsetzen , um das Andocken zu starten.
14. Warte auf Andocken. Dateien mit dem Suffix Yob werden generiert; name.log enthält die Bindungsenergie und die Kontaktrezeptorreste.
    HINWEIS: Um die Rationalität der molekulardynamischen Simulationsvalidierung sicherzustellen, wählen Sie in YASARA das Andockergebnis aus, das mit dem von AutoDock Vina übereinstimmt.

8. Molekulardynamik-Simulation

1. Klicken Sie auf Datei > Neu, um den Arbeitsbereich zu löschen. Klicken Sie dann auf Datei > Laden > YASARA-Objekt und wählen Sie result.yob.
2. Im Panel SZENENINHALT (rechts) erweitern Sie alle Mol-Einträge. Klicken Sie auf Bearbeiten > Teilen > Objekt, wählen Sie alle Mol-Inhalte im Sequenz-Panel aus und klicken Sie auf OK.
3. Klicken Sie auf Bearbeiten > Verbinden Sie > Objekt, wählen Sie alle Mol-Inhalte außer dem ersten und letzten Eintrag (Ligand) und klicken Sie auf OK. Wählen Sie den ersten Mol-Eintrag und klicken Sie erneut auf OK , um das Protein wieder zu verbinden.
4. Fahren Sie fort, die Komponenten neu zu nummerieren. Wählen Sie unter Bearbeiten Neunummerierung und klicken Sie auf Objekte. Dies erzeugt zwei Teile: Der erste Teil ist der Protein-Rezeptor-Komplex, der zweite Teil ist der Kleinmolekülligand.
5. Klicken Sie auf Bearbeiten > Übertragen und dann auf die Option Objekte in der Dropdown-Liste. Im Sequenz-Panel wählen Sie zuerst den Inhalt des kleinen Molekülliganden, indem Sie den entsprechenden Eintrag anklicken. Wählen Sie dann den Inhalt des Proteinrezeptors aus, indem Sie auf den Eintrag klicken, und klicken Sie auf OK , um das Auswahlpaar zu bestätigen.
6. Im nächsten Pop-up-Fenster aktivieren Sie die Option, beginnend mit Atome fixieren, während des Transfers auf dem Bildschirm und klicken Sie auf OK.
7. Wiederhole Schritte 7.2 bis 7.5, klicke dann auf Simulator > Temperatur und wähle 298K. Klicke auf Datei > Speichere als > YASARA-Szene, nenne die Datei sce\nesultrun.sce und klicke OK.
8. Klicken Sie auf Datei > Neu, um den Arbeitsbereich zu löschen. Klicken Sie dann auf Optionen > Makro&Film > Ziel setzen, wählen Sie sce\nesultrun.sce und klicken Sie auf OK.
9. Stellen Sie sicher, dass das in Schritt 7.4 ausgewählte Kraftfeld auch für die MD-Simulation verwendet wird; das md_run.mcr-Makro übernimmt typischerweise die aktuellen Kraftfeldeinstellungen. Klicken Sie auf Optionen > Makro&Film > Play-Makro, wählen Sie die Makrodatei md_run.mcr aus und klicken Sie auf OK , um die Molekulardynamik-Simulation zu starten.
10. Führen Sie drei unabhängige MD-Simulationen (3 x 100 ns) mit unterschiedlichen Anfangsgeschwindigkeiten für den Protein-Liganden-Komplex durch und führen Sie eine statistische Analyse der drei Trajektorien durch, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse sicherzustellen. Während des Betriebs werden Dateien im Sim-Format generiert. Wenn beispielsweise die Trajektorie alle 100 ps gespeichert wird, erzeugt eine 100-ns-Simulation 1000 Dateien mit dem Sim-Suffix.
11. Sobald Schritt 8.10 abgeschlossen ist, klicke auf Optionen > Makro&Film > Ziel setzen, wähle die Datei sce\nesultrun.sce aus und klicke auf OK.
12. Klicken Sie auf Optionen > Makro&Film > Makro abspielen, wählen Sie md_analyze.mcr, md_analyzebindenergy.mcr und md_analyzeres.mcr und klicken Sie auf OK.
13. Nachdem alle drei Analysen abgeschlossen sind, werden die entsprechenden Datendateien result_run_analysis.tab, result_run_bindenergy.tab und result_run_analysisres.tab generiert.
14. Analysieren Sie zunächst result_run_analysis.tab, der 10 Kernparameter bereitstellt: Energie (Gesamtenergie), Bindung (Bindungsenergie), Winkel (Bindungswinkelenergie), Dihedral (dihedrale Winkelenergie), Planarität (Ebenenenergie), Coulomb (elektrostatische Energie), VdW (van der Waals-Energie), CA (Cα RMSD des Proteins RMSD), Rückgrat (Protein-Rückgrat RMSD) und Schweratome (Schweratom-RMSD).
15. Extrahieren Sie die Zeit-(ns)-Spalte und die entsprechenden Parameterspalten, um zu beurteilen, ob das System ein energetisches Gleichgewicht erreicht. Bestätigen Sie die Systemstabilität durch die Stabilisierung der potenziellen Energie innerhalb eines engen Fluktuationsbereichs nach den anfänglichen 10 bis 20 ns. Bewerten Sie die Konformationsstabilität durch Überwachung der Wurzelmittel-Quadrat-Abweichung (RMSD) von Cα-Atomen, Proteinrückgrat und schweren Atomen. Die Simulation wurde als strukturell stabil eingestuft, sobald diese RMSD-Werte ein Plateau erreichten.
16. Als empirische Referenzpunkte für typische Protein-Liganden-Komplexe können Cα- und Rückgrat-RMSD-Werte, die unter 2,5 Å stagnieren, zusammen mit Schweratom-RMSD unter 3,5 Å als unterstützende Indikatoren für die Konformationsstabilität betrachtet werden. Entscheidend ist, das primäre und obligatorische Kriterium sowie das Vorhandensein einer klaren Plateauphase in der RMSD-Trajektorie zu verwenden, anstatt strikt nur diese numerischen Werte einzuhalten.
    HINWEIS: Diese Schwellenwerte sind empirisch und sollten im Kontext der spezifischen Proteingröße und Flexibilität interpretiert werden. Der entscheidende Indikator für Konvergenz ist ein anhaltendes Plateau, was darauf hinweist, dass sich die Struktur um ein konsistentes konformationelles Ensemble stabilisiert hat.
17. Anschließend analysieren Sie result_run_bindenergy.tab, das die Bindungsenergie zwischen Ligand und Ziel über die Simulationsbahn angibt. Berechnen Sie die durchschnittliche Bindungsenergie über den gesamten Simulationszeitraum. In YASARAS MM-PBSA-Implementierung deuten mehr positive Werte auf eine stärkere Bindung hin. Eine mäßig starke und stabile Wechselwirkung wird typischerweise durch eine mittlere Bindungsenergie angezeigt, die positiv und ausreichend groß ist (der spezifische numerische Wert ist systemabhängig, kann aber gegen bekannte Binder oder experimentelle Daten kalibriert werden), zusammen mit einer Standardabweichung, die relativ zum Mittelwert klein ist (z. B. Variationskoeffizient < 50 - 60 %), was eine begrenzte Fluktuation während der Simulation widerspiegelt.
    HINWEIS: Die in diesem Schritt angegebene Bindungsenergie wird mit der rigorosen MM-PBSA-Methode berechnet, im Gegensatz zum Standard-YASARA-Bindungsenergie-Makro, das eine schnellere Näherung (BoundaryFast) verwendet. Die Standardnäherung eignet sich für schnelle Screenings oder relative Vergleiche, während die MM-PBSA-Methode empfohlen wird, um genauere absolute Bindungs-freie Energien zu erhalten. Wie der Autor ausdrücklich im YASARA-Makro-Header erwähnt: Mehr positive Energien bedeuten bessere Bindung, negative Energien BEDEUTEN KEINE Bindung. Daher sollten Nutzer positive Werte als Hinweis auf eine stärkere Bindung interpretieren, wobei die numerische Größe vom spezifischen Protein-Liganden-System abhängt.
18. Analysieren Sie schließlich die Datei result_run_analysisres.tab, die pro Residue Daten liefert, darunter Residue ID, RMSD, Backbone RMSD, HeavyAtoms RMSD und RMSF. Konzentrieren Sie die Analyse auf die identifizierte stabile Produktionsphase. Zuerst identifizieren Sie Residuen innerhalb der aktiven Stelle des Ziels (z. B. jene innerhalb von 5 Å vom Liganden). Anschließend werden die Daten verwendet, um die Konformationsstabilität dieser einzelnen aktiven Standortreste während der Simulation zu bewerten.
    HINWEIS: Als empirische Referenzpunkte für stabile aktive Stellenreste in Protein-Liganden-Komplexen gelten RMSF-Werte unter 1,0 Å und RMSD-Schwankungen innerhalb von 1 bis 1,5 Å während der stabilen Phase im Allgemeinen als Hinweis auf gut erhaltene lokale Konformationen. Residuen mit RMSF über 2,0 Å können auf größere Flexibilität hinweisen; solche Residuen sollten auf die dreidimensionale Struktur abgebildet werden, um festzustellen, ob sie funktional relevanten flexiblen Bereichen (z. B. Schleifen oder Oberflächenflächen) entsprechen oder potenzielle Instabilität innerhalb der Bindungstasche anzeigen. Diese numerischen Richtlinien sind keine absoluten Regeln; das primäre Kriterium ist das Fehlen großer Konformationsdrift, was in Verbindung mit der insgesamt festgelegten Systemkonvergenz bewertet werden sollte.
19. Sobald die Datendateien organisiert sind, importieren Sie die organisierten Daten in Prism, um entsprechende Diagramme zu erstellen.

Ergebnisse

Nach der Netzwerkpharmakologischen Analyse von Loratin gegen allergische Rhinitis (AR) wurde die Interaktion zwischen Loratin und PTGS2 als repräsentative Fallstudie ausgewählt, um die schrittweise Anwendung des molekularen Andockings und MD-Simulationsprotokolls zu veranschaulichen. Dieses Beispiel soll die Workflow-Ausführung und Dateninterpretation demonstrieren, anstatt eine biologische Validierung der spezifischen Interaktion zu liefern. Für die quantitative Bewertung anhand experim...

Diskussion

Bedeutung und entscheidende Schritte
Dieses Protokoll kombiniert Netzwerkpharmakologie, molekulares Andocken und molekulare Dynamiksimulation, was deutliche Vorteile gegenüber eigenständigen Methoden oder Dual-Kombinations-Workflows bietet und dazu beitragen kann, wichtige Ineffizienzen und Zuverlässigkeitslücken in der aktuellen Arzneimittelentwicklung zu schließen. Der gesamte Prozess basiert auf drei kritischen Schritten, die seine Zuverlässigkeit gewährleisten und...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ADMETlab 3.0	Shanghai Institut für Materia Medica (SIMM), Chinesische Akademie der Wissenschaften	N/A	Online-Plattform zur Vorhersage von ADMET-Eigenschaften (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, Toxicity); verwendet zur Bewertung der pharmakokinetischen und toxikologischen Profile von Liganden (URL:  https://admetlab3.scbdd.com/)
AutoDock Tools (AutoDock 4)	Das Scripps Forschungsinstitut	AutoDock 4.2.6	Softwarepaket für molekulare Andocksimulationen; beinhaltet AutoDock 4 für das Andocken und AutoDockTools (ADT) zur Erstellung von Protein- und Ligandeneingabedateien (Wasserstoff hinzufügen, Ladungen zuweisen, rotierbare Bindungen setzen), Andockgitter definieren und Andockergebnisse analysieren.
AutoDock Vina	Das Scripps Forschungsinstitut	AutoDock Vina 1.1.2	Open-Source-Molekulardocking-Software; Verwendet zur Vorhersage von Bindungsaffinitäten und -posen zwischen kleinen Molekülliganden und Proteinrezeptoren
Chem3D	PerkinElmer Informatik	Chem3D 2024	Molekularmodellierungssoftware; verwendet zur Konstruktion, Optimierung und Visualisierung von 3D-Strukturen von kleinmolekülischen Liganden
Zytoscape	Cytoscape-Konsortium (Institut für Systembiologie)	Zytoscape 3.10.3	Open-Source-Software zur Visualisierung und Analyse biologischer Netzwerke; Verwendet zum Aufbau und Bearbeiten von Gen-/Protein-Interaktionsnetzwerken
DAVID (Datenbank für Annotation, Visualisierung und integrierte Entdeckung)	Nationales Institut für Allergien und Infektionskrankheiten (NIAID), USA	N/A	Online-Tool für funktionale Annotation und Anreicherungsanalyse; verwendet für die Durchführung von GO (Gen-Ontologie) und KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Pathway-Anreicherungsanalysen von Zielgenen (URL:  https://david.ncifcrf.gov/)
DisGeNET-Datenbank	Barcelona Supercomputing-Zentrum (BSC)	N/A	Datenbank der Gen-Krankheits-Assoziationen; verwendet zur Identifizierung von Genen, die mit bestimmten Krankheiten verbunden sind (URL:  https://disgenet.com/)
GeneCards-Datenbank	Weizmann-Institut für Wissenschaften	N/A	Integrative Datenbank menschlicher Gene; verwendet zum Abruf umfassender Geninformationen (z. B. Expression, Funktion, Krankheitsassoziationen) (URL:  https://www.genecards.org/)
LigPlus	Europäisches Labor für Molekularbiologie – Europäisches Institut für Bioinformatik (EMBL-EBI)	LigPlus 2.3	Software zur automatischen Erstellung von 2D-Protein-Ligand-Interaktionsdiagrammen aus 3D-Koordinatendateien. Er stellt schematisch Wasserstoffbrücken, hydrophobe Kontakte und die Bindungsstellenreste dar. Verfügbar nach Registrierung über eine akademische E-Mail at  https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/LigPlus/ .
OMIT-Datenbank	Johns Hopkins University School of Medicine (in Zusammenarbeit mit NCBI)	N/A	Online-Mendelsche Vererbung beim Menschen; verwendet zur Abrufung von Informationen über genetische Erkrankungen und deren zugehörige Gene (URL:  https://www.omim.org/)
OpenBabel	OpenBabel Entwicklungsteam	N/A	Open-Source-Chemikalien-Werkzeugkasten; Verwendet zur Konvertierung von molekularen Dateiformaten (z. B. von .mol2 zu .pdb) zwischen verschiedenen Softwareplattformen
PharmGKB-Datenbank	Stanford Universität	N/A	Wissensdatenbank für Pharmakogenomik; verwendet zur Abrufung von Informationen über Gen-Arzneimittel-Wechselwirkungen und pharmakogenomische Varianten (URL:  https://www.pharmgkb.org/)
Prisma	GraphPad-Software	Prisma 9	Verwendet für wissenschaftliche Grafiken, Datenanalyse (z. B. Darstellung von Bindungsenergieverteilungskurven, Analyse von Fehlerbalken) und zur Erstellung von Publikationsqualitätszahlen.
ProTox 3.0	Charit&eakut; - Universitä tsmedizin Berlin, Deutschland	N/A	Online-Tool zur Vorhersage von toxikologischen Endpunkten kleiner Moleküle; zur Beurteilung der potenziellen Toxizität von Kandidatenliganden verwendet wird (URL:  https://tox.charite.de/protox3/index.php?site=home)
PubChem-Datenbank	Nationales Zentrum für Biotechnologische Information (NCBI), USA	N/A	Öffentliche Datenbank chemischer Informationen; verwendet zur Abrufung von 2D/3D-Strukturen und physikalisch-chemischen Eigenschaften von Liganden kleiner Moleküle (URL:  https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
PyMOL	Schrö dinger, LLC	PyMOL 2.6.1	Molekulare Visualisierungssoftware; verwendet zum Betrachten, Bearbeiten und Erstellen hochwertiger Bilder von Protein-Ligand-Komplexen
R Studio	Posit, PBC	Rstudio 2025.09.1+401	Integrierte Entwicklungsumgebung (IDE) für R-Programmierung; zur statistischen Analyse biologischer Daten und zur Erstellung von GO/KEGG-Diagrammen verwendet
RCSB PDB-Datenbank	Forschungskollaboration für Strukturelle Bioinformatik (RCSB)	N/A	Datenbank der Proteinstrukturen; verwendet zur Abrufung von 3D-Strukturen von Proteinrezeptoren im PDB-Format (URL:  https://www.rcsb.org/)
SEA (Similarity Ensemble Approach)	Das Scripps Forschungsinstitut	N/A	Online-Tool zur Zielvorhersage basierend auf chemischer Ähnlichkeit; zur Ergänzung von SwissTargetPrediction zur Bestätigung von Ligandenzielen verwendet wird (URL:  https://sea.bkslab.org/)
STRING	STRING-Konsortium (EBI, SIB usw.)	N/A	Datenbank bekannter und vorhergesagter Protein-Protein-Interaktionen; verwendet zum Aufbau von Gen-/Protein-Interaktionsnetzwerken (URL:  https://string-db.org/)
SwissTargetPrediction	Schweizerisches Institut für Bioinformatik (SIB)	N/A	Online-Server zur Vorhersage potenzieller Proteinziele kleiner Moleküle; verwendet zur Identifizierung von Kandidatrezeptoren für Liganden (URL:  http://swisstargetprediction.ch/)
TTD-Datenbank	Institut für Arzneimittelforschung und -entwicklung (IDRBL), Sun Yat-sen Universität	N/A	Therapeutische Zieldatenbank; verwendet zur Abrufung von Informationen über validierte und potenzielle Arzneimittelziele (URL:  https://db.idrblab.net/ttd/)
UCSF Chimera	Ressource für Biocomputing, Visualisierung und Informatik (RBVI), University of California, San Francisco	UCSF Chimera 1.19	Molekulare Visualisierungs- und Analysesoftware; verwendet zur Proteinstrukturpräparation, einschließlich der Rekonstruktion von fehlenden Schleifen (über Modeller-Schnittstelle), Seitenkettenoptimierung (Dunbrack-Rotamer-Bibliothek), Protonationszustandsanpassung und Energieminimierung mit AMBER ff14SB-Kraftfeld. Version 1.19 (veröffentlicht im März 2025) behebt die PDB-Struktur-Abruffähigkeiten . Kostenlos für nicht-kommerzielle Nutzung bei   verfügbar; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ .
UniProt-Datenbank	UniProt-Konsortium (EBI, SIB, PIR)	N/A	Umfassende Datenbank der Proteinsequenz und -funktion; verwendet zum Abruf von Proteinsequenzen, Strukturen und funktionalen Annotationen (URL:  https://www.uniprot.org/)
Venny 2.1.0	Centro Nacional de Biotecnologí a (CNB-CSIC), Spanien	N/A	Online-Tool zur Erstellung von Venn-Diagrammen; verwendet zur Visualisierung von Überschneidungen zwischen Gensätzen (z. B. Zielgene aus verschiedenen Datenbanken) (URL:  https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)
YASARA	YASARA Biosciences	YASARA 10.3.16	Molekularmodellierungs- und Simulationssoftware; verwendet für molekulare Andockungen (Schritt 3.7) und anschließende Molekulardynamik-Simulationen zur Validierung von Andockergebnissen