In vitro Bewertung der potenzierenden Wirkung pflanzlicher Moleküle auf konventionelle Biozide

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet einen systematischen Rahmen, um zu bewerten, wie phytochemische Methoden die bakteriiziden Effekte traditioneller Biozide durch bakteriizide Aktivitätsmodellierung und kombinatorische Interaktionstests verstärken können, die darauf abzielen, synergistische Mischungen zu identifizieren, die die mikrobielle Kontrolle verbessern und den gesamten Biozidverbrauch reduzieren.

Zusammenfassung

Die Entwicklung innovativer und effizienter Ansätze zur Steigerung der antimikrobiellen Wirkung konventioneller Biozide ist eine vielversprechende Strategie zur Verbesserung der mikrobiellen Kontrolle für Desinfektionszwecke im Gesundheitswesen. In diesem Zusammenhang beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Bewertung der potenzierenden Wirkung pflanzlicher Phytochemikalien auf synthetische Biozide. Diese pflanzlichen Produkte sind aufgrund ihrer strukturellen Vielfalt, Bioaktivität und oft geringeren Toxizität attraktive Kandidaten als Biozidadjuvante. Der hier beschriebene Arbeitsablauf ermöglicht die Bestimmung der minimalen bakteriziden Konzentrationen (MBCs) sowie die systematische Generierung sowohl von Dosis-Wirkungs- als auch von Zeit-Antwort-Kurven für jedes einzeln getestete Produkt (Biozide und Phytochemikalien) sowie für deren duale oder dreifache Kombinationen. Die daraus resultierenden Daten ermöglichen fortgeschrittene mathematische Modellierungen, einschließlich der Bestimmung des fraktionierten bakteriziden Konzentrationsindex (FBCI) und der Bewertung der Wechselwirkungen zwischen den getesteten Produkten hinsichtlich synergistischen, additiven oder antagonistischen Effekten mittels der Software Combenefit. In diesem Sinne ist es möglich, vielversprechende Naturprodukte als Biozid-Verstärker zu identifizieren, die antimikrobielle Wirksamkeit zu optimieren und nachhaltigere sowie sicherere Desinfektionsstrategien zu entwickeln, die die Konzentrationen synthetischer Biozide reduzieren können. Dies verbessert die mikrobielle Kontrolle und minimiert Umwelt- und Gesundheitsrisiken, die mit übermäßigem Biozidkonsum verbunden sind.

Einleitung

Gesundheitsassoziierte Infektionen (HAIs) gehören weltweit zu den kritischsten und besorgniserregendsten Herausforderungen der öffentlichen Gesundheit¹. Beunruhigend ist, dass sie stark mit der Ausbreitung von multiresistenten (MDR) Mikroorganismen und dem Fortbestehen bakterieller Biolast auf Krankenhausoberflächen in Verbindung stehen, oft aufgrund unangemessener oder unwirksamer Desinfektionspraktiken ^2,3. Darüber hinaus verstärkt die Kreuzkontamination zwischen Patienten, medizinischem Personal und medizinischer Ausrüstung dieses Problem^{weiter 4,5}. In Europa wird beispielsweise geschätzt, dass fast 80.000 hospitalisierte Patienten an einem beliebigen Tag mindestens einen HAI erleiden, was etwa 16 Millionen zusätzliche Krankenhaustage pro Jahr² bedeutet. Die COVID-19-Pandemie hat dieses Problem weiter verschärft und zu einem Anstieg der MDR-Bakterieninfektionen aufgrund des hohen Einsatzes von antimikrobiellen Substanzen/Desinfektionsmitteln sowie einer erhöhten Krankenhausaufnahme^beigetragen (^6,7). Der Anstieg antibiotikaresistenter Bakterien, darunter Extended-Spectrum β-Laktamase (ESBL)-produzierende Escherichia coli und Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), hat zu einer wachsenden Gesundheits- und Wirtschaftsbelastung weltweit geführt. Tatsächlich unterstreichen diese Stämme die Dringlichkeit, innovative Lösungen zur Infektionsprävention und -kontrolle^{zu entwickeln 1,8,9}.

Vor diesem Hintergrund wurden Biozide zu entscheidenden Werkzeugen zur Kontrolle der Ausbreitung resistenter Bakterien und bakterieller Infektionen, die intensiv zur Desinfektion von Krankenhausoberflächen, zur Sterilisation von Geräten, zur Behandlung von Wassersystemen und zur Verhinderung von Kontaminationen von medizinischen Geräten^{eingesetzt wurden.} Im Gegensatz zu Antibiotika, die auf spezifische mikrobielle Ziele¹² wirken, stören Biozide gleichzeitig mehrere zelluläre Strukturen, darunter Membranen, Enzyme, ribosomale RNA und metabolische Signalwege 13,14,15. Diese breitbandige Wirkung wurde zunächst als Minderung des Widerstandsrisikos angesehen. Allerdings zeigen Hinweise, dass sich Mikroorganismen an Biozid-Exposition anpassen können, was zu Toleranz, Persistenz und sogar Kreuzresistenz gegen Antibiotika^führt. Zum Beispiel die Exposition von Pseudomonas aeruginosa gegenüber Benzalkoniumchlorid, das für Varianten ausgewählt wurde, die resistent gegen Ciprofloxacin und Novobiocin sind, durch die Überexpression von Effluxpumpen¹⁷. Ebenso wurde gezeigt, dass Triclosan Effluxpumpen bei Stenotrophomonas maltophilia aktiviert, während eine Exposition mit Chlorhexidin bei S. aureus¹⁸ mit erhöhter Antibiotikaresistenz assoziiert wurde.

Darüber hinaus wurden quartäre Ammoniumverbindungen (QACs), Chlorhexidin, Diamidine, Acridine und Triclosan als mögliche Ursachen für die Selektion und das Fortbestehen bakterieller Resistenz gegen verschiedene Antibiotika in Verbindung gebracht ^19,20. Resistenzgene wie QACA/B und SMR verleihen nachweislich Toleranz gegenüber QACs, und klinische Versäumnisse wie Bakteriämie in Verbindung mit Kathetern in kontaminierten QAC-Lösungen sowie intrinsische mikrobielle Kontamination von Iodophoren wurden ebenfalls^{berichtet 16,17,21}. Diese Ergebnisse unterstreichen den dringenden Bedarf an optimierter Biozidnutzung, unterstützt durch mechanistische Studien und rationale Desinfektionsstrategien.

Biofilme, also hochzelldichte und gut strukturierte bakterielle Gemeinschaften, eingebettet in eine extrazelluläre Matrix aus Polysacchariden, Proteinen und Nukleinsäuren, stellen ein zusätzliches und bedeutendes Hindernis für die Infektionskontrolle^{dar 22,23}. Sie zeigen eine bemerkenswerte Toleranz gegenüber Antibiotika und Bioziden, was zur Persistenz von Infektionen bei Patienten beiträgt. Darüber hinaus werden Biofilme häufig mit der anhaltenden Kontamination von medizinischen Geräten, chirurgischen Instrumenten und Krankenhausoberflächenⁱⁿ Verbindung gebracht. Trotz ihrer klinischen Bedeutung wurden Biofilme erst in den letzten Jahrzehnten als Hauptverursacher chronischer Infektionen und antimikrobieller Resistenz anerkannt. Ihre Widerstandsfähigkeit ist so stark, dass selbst aggressive Desinfektionsmittel sie oft nicht beseitigen können, sodass persistierende Zellen zurückbleiben, die in der Lage sind, Infektionen^erneut auszusäen^. Daher ist es entscheidend, effektive Antibiofilm-Strategien zu finden, um HAIs zu kontrollieren und die öffentliche Gesundheit sowie die wirtschaftliche Belastung durch MDR-Pathogene^{zu verringern 27,28}.

Als vielversprechende Lösung stellen Phytochemikal, sekundäre Metabolite, die aus Pflanzen gewonnen und gewonnen werden, eine weitgehend ungenutzte Ressource für neuartige antimikrobielle und antibiofilmische Mittel²⁹. Allerdings wird kein Phytochemikalie als Antibiotikum verwendet, da sie im Vergleich zu herkömmlichen Antibiotika nur gering antimikrobiell wirken. Phytochemikalien werden routinemäßig als antimikrobielle Mittel klassifiziert, basierend auf Anfälligkeitstests, die eine minimale inhibitorische Konzentration (MIC) im Bereich von 100 bis 1000 μg/ml erzeugen, was deutlich höhere Werte als konventionelle Antibiotika^30,31 ist. Wichtig ist, dass Phytochemikalien bereits Antibiofilm-Aktivität gezeigt haben, wenn sie allein oder als Potenzieren herkömmlicher Biozide verwendet werden. Zum Beispiel kann Quercetin die Alginatproduktion hemmen, was zu einer verminderten Adhäsion während der Biofilmentwicklung^führt. Emodin hemmte die Entwicklung von Biofilmen durch P. aeruginosa, E. coli und S. aureus durch die Verringerung der Expression von Schlüsselgenen, die an der Biofilmbildung beteiligt sind³⁵. Die Kombination von Phytochemikalien mit konventionell verwendeten, aber zunehmend ineffektiven Bioziden als resistenzmodifizierende Substanzen stellt eine vielversprechende Strategie dar, um die antimikrobielle Wirksamkeit^{zu erhöhen 36}. Solche synergistischen Wechselwirkungen können mikrobielle Resistenzmechanismen beeinträchtigen und die minimal wirksamen Biozidkonzentrationen senken, die für eine zufriedenstellende Desinfektion erforderlich^sind. Dieser Ansatz optimiert die biozidale Leistung, reduziert den Selektionsdruck für die Resistenzentwicklung und reduziert die ökologischen und toxikologischen Auswirkungen einer übermäßigen Biozidanwendung^15,20. Phytochemikalien sind strukturell vielfältig 38,39,40, weit verbreitet 38,39,41, günstig 38,39,42 und oft weniger giftig für Menschen und Umwelt als synthetische Biozide^38,39. Es handelt sich um natürliche Produkte, die oft aus erneuerbaren Pflanzenquellen gewonnen werden und in einigen Fällen eine geringere Umweltbeständigkeit und reduzierte Toxizitätsprofile im Vergleich zu bestimmten synthetischen Bioziden^zeigen 43,44,45. Obwohl ihre Kosten-, Verfügbarkeits- und Toxizitätsprofile je nach Verbindung und Extraktionsprozess variieren, haben mehrere Pflanzenstoffe im Vergleich zu bestimmten konventionellen Bioziden^günstige Sicherheits- und Umwelteigenschaften ^gezeigt.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, das Potenzial von Phytochemikalien einzeln und in Kombination mit herkömmlichen Bioziden für die Desinfektion im Gesundheitswesen zu bewerten. Kurz gesagt bewertet das Protokoll Biozid-phytochemische Interaktionen über breite Konzentrationsbereiche. Biozide wurden zunächst bei 0,1–500 mg/L getestet und Phytochemikalien bei 50–10.000 mg/L, um minimale bakteriizide Konzentrationen (MBCs) zu bestimmen (Tabelle 1). Für duale Kombinationen wurden subbakteriizide Konzentrationen wie folgt ausgewählt: Benzalkoniumchlorid (BAC) mit 0,1, 0,5 und 0,75 mg/L; Peressigsäure (PAA) mit 0,1, 0,3 und 0,5 mg/L; Salicylsäure (SAL) mit 50, 100 und 250 mg/L; und Eugenol (EUG) mit 100, 250 und 750 mg/L (Tabelle 1). Dreifache Kombinationen wurden mit BAC (0,75 mg/L) oder PAA (0,5 mg/L) kombiniert mit SAL (100 oder 250 mg/L) und EUG (250 oder 750 mg/L) durchgeführt (Tabelle 1). Zeitantwort-Assays wurden über 1–90 Minuten durchgeführt, gefolgt von einer 24-stündigen bakteriellen Nachwuchsuntersuchung. Antimikrobielle Interaktionen werden mit dem fraktionierten bakterizidalen Konzentrationsindex (FBCI) quantifiziert und mit der Combenefit-Software analysiert, während Desinfektionskinetiken anhand der Chick-Watson- und Weibull-Modelle modelliert werden, um Konzentrationsabhängigkeit und Inaktivierungsdynamik zu charakterisieren.

Die Innovation liegt in der rationalen Gestaltung stabiler dualer und dreifacher Wechselwirkungen zwischen Phytochemikalien und Bioziden, wobei die Desinfektionsaktivität optimiert wird und gleichzeitig die Toxizität und Umweltbelastungen durch den reduzierten Einsatz konventioneller Biozide minimiert werden. Mathematische Ansätze wie die Berechnung des FBCI und die Synergiebewertung wurden ebenfalls verwendet, um phytochemisch-biozide-Interaktionen in der mikrobiellen Kontrolle zu quantifizieren. Während FBCI eine kategorische Interpretation der Interaktion (Synergie, Antagonismus oder Gleichgültigkeit) bei bestimmten Konzentrationskombinationen bietet, ermöglicht Combenefit eine umfassendere, reaktionsbasierte Bewertung von Interaktionsmustern über einen breiteren Konzentrationsbereich. Dies ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung konzentrationsabhängiger Interaktionseffekte, die von Einzelpunktindizes ^48,49 möglicherweise nicht erfasst werden. Darüber hinaus werden die Desinfektionskinetiken mit den Chick-Watson-Modellen (für Dosis-Antwort) und Weibull (für Zeitantwort) Modell⁵⁰ modelliert. Diese Modelle bieten kinetische Modellierung der mikrobiellen Inaktivierung und stellen quantitative Parameter bereit, die Desinfektionsraten und Überlebenskurvenverhalten⁵⁰ beschreiben. Sie helfen zu charakterisieren, ob das Töten loglinearen oder nichtlinearen Dynamiken folgt, und ermöglichen eine mechanistischere Interpretation der Behandlungseffekte, die über die Beschreibung von FBCI^51,52 hinausgeht.

Dieses Protokoll stellt die systematische Identifizierung vielversprechender phytochemisch-biozidartiger Kombinationen und die Entwicklung einer effizienten, nachhaltigen Strategie für die Desinfektion im Gesundheitswesen sicher. Im Gegensatz zu klassischen MIC- oder Schachbrett-Analysen, die statische Endpunktmessungen liefern, integriert dieses Protokoll dynamische bakteriizide Modellierung und Interaktionsanalysen, um das Ausmaß und die Kinetik der Potenzierung zu erfassen. Während klassische Checkerboard-Assays wertvolle Informationen zu inhibitorischen Interaktionen basierend auf MIC-Endpunkten liefern, sind sie auf Wachstumsmessungen und einzelne Interaktionsindizes beschränkt. Das hier beschriebene Protokoll geht über diesen Rahmen hinaus, indem es bakterizide Aktivität statt Wachstumshemmung quantifiziert, das Nachwuchs nach der Behandlung zur Bewertung anhaltender antimikrobieller Effekte bewertet, sowohl duale als auch dreifache Biozid-Phytochemikalien-Kombinationen bewertet, Desinfektionskinetik mittels Chick-Watson- und Weibull-Ansätzen modelliert und Konzentrations-Antwort-Oberflächenanalysen mit Combenefit anwendet. Diese multidimensionale Strategie ermöglicht eine robustere und vorausschauendere Bewertung der biozid-phytochemischen Potenzierung.

Protokoll

HINWEIS: Die vorgeschlagene Methodik wurde aus dem Europäischen Standard EN 1276⁵³ übernommen.

1. Kulturvorbereitung

1. Kryokonservieren Sie die getesteten Bakterienstämme, Escherichia coli CECT 434 und Staphylococcus aureus CECT 976, indem Sie sie in Kryovials mit Glycerol 30 % (v/v) bei -80 °C lagern.
2. Zur Wiederherstellung werden Bakterien in Platten mit Plattenzähl-Agar (PCA) kultiviert und sie 24 Stunden lang bei 25 °C durch Inkubation der Platten wachsen lassen.
3. Bereiten Sie über Nacht gewachsene Kulturen der untersuchten Stämme vor, indem eine Bakterienkolonie von einer gestreiften Platte in tryptischer Sojabrühe (TSB) geimpft wird, um die exponentielle Wachstumsphase zu erreichen (gemäß der Kalibrierungskurve aus den nächsten Schritten) und auf einem schüttelnden Inkubator bei 100 U/min und 25 °C zu inkubieren.
4. Mit einem Spektrophotometer erhält man eine Kalibrierungskurve der koloniebildenden Einheiten (CFU)/mL als Funktion der optischen Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) für jeden Bakterienstamm unter den zuvor genannten Kultivierungsbedingungen.
   1. Über Nacht eine Bakterienkultur in TSB bei 25 °C mit Rühren (100 U/min) anbauen.
   2. Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen der Kultur in steriler Kochsalzlösung (0,85 % w/v NaCl) vor.
   3. Missen Sie den OD₆₀₀ jeder Verdünnung mit einem Spektrophotometer.
   4. Teller passende Verdünnungen auf PCA. Inkubiere die Platten bei 25 °C für 24 Stunden.
   5. Wählen Sie Platten mit 10 bis 100 Kolonien aus und bestimmen Sie die entsprechenden CFU/mL-Werte.
   6. CFU/mL-Werte werden mit den entsprechenden_{OD-600-Werten} im linearen Bereich (0,04–0,8) dargestellt.
   7. Führen Sie mindestens zwei unabhängige Assays mit mindestens zwei Replikaten durch. Führen Sie lineare Regressionsanalyse durch, um die Kalibrierungsgleichung zu erhalten.
   8. Verwenden Sie die resultierende Gleichung, um Bakterienkonzentrationen in späteren Experimenten zu schätzen.
5. Zentrifugieren Sie das Inokula bei 3772 x g für 10 Minuten und waschen Sie einmal mit Phosphatpuffersalzlösung (PBS) (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,44 g/L Na₂HPO₄ und 0,24 g/L KH₂PO₄).
6. Mit einem Spektrophotometer wird der OD₆₀₀ des Inokulas in PBS auf 1 x 10⁸ Kolonienbildungseinheiten (CFU)/mL eingestellt.

2. Herstellung und Steuerung von Moleküllösungen

1. Betrachten Sie die Auswahl, Untersuchung und Herstellung der getesteten Moleküle wie folgt: Verwenden Sie zwei Biozide – BAC und PAA (15 % (w/v) – und zwei Phytochemikalien – SAL und 99 % EUG.
   HINWEIS: BAC wurde in dieser Studie gewählt, weil es ein weit verbreitetes QAC ist, das gegen Bakterien durch Membranstörung^{wirksam ist.} Peracticsäure ist ein breitspektriges oxidierendes Desinfektionsmittel, das zunehmend zur Sterilisation medizinischer Geräte^{verwendet wird. 56,57}. Salicylsäure ist eine phenolische Verbindung von Interesse, da sie antibakterielle und antibiofilmische Aktivität zeigt und die bakterielle Virulenz sowie Antibiotikaresistenzmechanismen beeinflusst, was auf mögliche Rollen bei Desinfektion und mikrobieller Kontrolle hindeutet^58,59. Eugenol ist eine natürliche terpenoide/phenolische aromatische Verbindung mit anerkannten antimikrobiellen Eigenschaften, die als sicherere, umweltfreundlichere Alternative zu synthetischen Desinfektionsmitteln wirken ^kann.
2. Bereite BAC und PAA frisch in ultrareinem Wasser vor.
3. Gelöste EUG und SAL wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, wodurch sichergestellt wurde, dass die Zellen niemals einer DMSO-Konzentration von mehr als 5 % ausgesetzt waren.
4. Bereiten Sie die getesteten Konzentrationen von BAC, PAA, EUG und SAL gemäß Tabelle 1 vor.
5. Bereiten Sie die getesteten Konzentrationen in 15-mL-Zentrifugenröhren vor, indem Sie das Volumen der Lagerlösung und Zellsuspension anpassen, um die gewünschte Endmolekülkonzentration und Zelldichte zu erhalten.
6. Für alle nachfolgenden Tests werden zwei negative Kontrollgruppen berücksichtigt: (i) Bakterien ohne Behandlung und (ii) Bakterien, die 5 % DMSO ausgesetzt sind (da dies die maximale Konzentration von DMSO ist, der die Zellen während der gesamten Tests ausgesetzt sind).

3. Bakterielle Exposition gegenüber Biozid oder Phytochemikalie

1. Gib 1 ml Zellsuspension zu 1 ml ultrareines Wasser und warte 2 Minuten.
2. Dann gib 8 ml Biozid oder phytochemische Lösung (in ultrareinem Wasser oder 5 % DMSO) hinzu und inkubiere auf einem schüttelnden Inkubator bei 100 U/min und 25 °C für 30 Minuten.
3. Mische die Verbindungen durch Vortex mit den Zellen.

4. Neutralisierung, serielle Verdünnung und Beschichtung

1. Führen Sie die Neutralisierung jedes Biozids oder Phytochemikaliums bei jeder getesteten Konzentration mit der Verdünnungs-Neutralisationsmethode und dem universellen Neutralisator durch: 30 g/L Polysorbat 80, 30 g/L Saponin, 1 g/L L-Histidin, 3 g/L Lecithin und 5 g/L Natriumthiosulfat in 0,0025 m Phosphatpuffer.
2. Fügen Sie 1 ml der zu neutralisierenden Probe 8 ml universellen Neutralisator und 1 ml ultrareines^{Wasser 53} hinzu.
3. Führen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung durch, indem 100 μL einer spezifischen Verdünnung zu 900 μL steriler Kochsalzlösung hinzugefügt werden, um die anschließende Verdünnung herzustellen (wiederhole dies von der Verdünnung ^10-1 bis zur Verdünnung ^10-7), und bestimmen Sie die überlebenden Zellen auf den neutralisierten Proben, indem Sie 10 μL jeder Verdünnung auf PCA auftragen, gemäß der Drop-Plate-Methode⁶².
4. Inkubieren Sie die Platten bei 25 °C ohne Bewegung für 24 Stunden für die Zellzählung.
5. CFU wurden visuell für Platten mit mehr als 10 und weniger als 100 Kolonien gezählt, und die Konzentration, bei der eine vollständige Verringerung der Kultivierbarkeit erfolgt, wird als MBC erfasst. Nach Gleichung (1) berechnet man die CFU/mL, wobei n die Anzahl der gezählten CFUs ist, SV das plattierte Probenvolumen (0,01 mL) und Dil die Verdünnung, bei der die CFU gezählt wurden.
   CFU/mL = n/(SV Dil) (1)
6. Bewerten Sie die logarithmische Reduktion, logaritmische Reduktion, gemäß Gleichung (2), wobei X₀ und X die CFU/mL für die unbehandelten Bakterien (Kontroll) bzw. behandelte Bakterien sind.
   log-Reduktion = log (X₀) - log (X) = log (X₀/X) (2)

5. Bewertung von Doppel- und Dreifachkombinationen

1. Wenden Sie die oben beschriebene Methodik an, um die Aktivität aller möglichen dualen und dreifachen Kombinationen eines Biozids und eines phytochemischen Materials (für duale Kombinationen) oder zweier Phytochemikalien (für dreifache Kombinationen) zu bewerten, um mögliche Potenzierungs- oder Synergistische Effekte zu suchen.
2. Betrachten Sie folgende Auswahl der Konzentrationen: Für die dualen Kombinationen wurden die auf BAC getesteten Konzentrationen 0,1, 0,5 und 0,75 mg/L; für PAA waren 0,1, 0,3 und 0,5 mg/L; für SAL waren 50, 100 und 250 mg/L; und für EUG waren es 100, 250 und 750 mg/L (Tabelle 1). Bezüglich der Dreifachkombination betrug die auf BAC getestete Konzentration 0,75 mg/L; für PAA 0,5 mg/L; für SAL waren 100 und 250 mg/L; und für EUG waren 250 und 750 mg/L (Tabelle 1).
3. Wählen Sie die Konzentrationen aus und wählen Sie diejenigen, die im Dosis-Wirkungs-Test für einzelne Moleküle bewertet werden und zu nicht-bakteriziden Effekten führten.

6. Bewertung des bakteriellen Nachwuchses

1. Um die Fähigkeit des bakteriellen Nachwuchs zu bewerten, lassen Sie die mikrobiellen Zellen nach Behandlung und Neutralisation länger 24 Stunden in flüssigem Medium bei 25 °C und 100 U/min wachsen.
2. Durchführung von zehnfacher serieller Verdünnung, Beschichtung, Inkubation der PCA-Platten und Quantifizierung des CFU/mL unter denselben Techniken und Bedingungen.

7. Interpretation kombinatorischer Ergebnisse – Fraktionierter bakterizider Konzentrationsindex (FBCI)

1. Interpretieren Sie die Ergebnisse der kombinatorischen Analyse wie folgt:
   1. Für duale Kombinationen gilt FBCI = FBC(A) + FBC(B), wobei die fraktionierte bakterizide Konzentration von A, FBC(A), das Verhältnis zwischen dem MBC von A in dualer Kombination und dem MBC von A allein (MBC_{A-Kombination}/MBC_A ^allein) ist, und FBC(B) das Verhältnis zwischen dem MBC von B in der dualen Kombination und dem MBC von B allein (MBC_{B-Kombination}/MBC_B ^allein) (Gleichung 3).
   2. Für dreifache Kombinationen gilt FBCI = FBC(A) + FBC(B) + FBC(C), wobei FBC(A) das Verhältnis zwischen dem MBC von A in dreifacher Kombination und dem MBC von A allein ist (MBC_{A-Kombination}/MBC_A ^allein), FBC(B) das Verhältnis zwischen dem MBC von B in dreifacher Kombination und dem MBC von B allein (MBC_{B-Kombination}/MBC_B ^allein), und FBC(C) ist das Verhältnis des MBC von C in der Dreifachkombination und des MBC von C allein (MBC_{C-Kombination}/MBC_C ^allein) (Gleichung 4).
   3. Unter Anwendung der von Fernandes et ^al.50 vorgeschlagenen Klassifikation entspricht FBCI ≤ 0,5 Synergismus, 0,5 < FBCI ≤ 1 steht für Additivität, 1 < FBCI ≤ 4 als Gleichgültigkeit und FBCI > 4,00 als Antagonismus gilt.
      FBC(A) + FBC(B) = (MBC ^{Doppelkombination}/MBC_A ^allein) + (MBC_B ^{Doppelkombination}/MBC_B ^allein) (3)
      FBC(A) + FBC(B) + FBC(C) = (MBC_A ^{Dreifachkombination}/MBC_A ^allein) + (MBC_B ^{Dreifachkombination}/MBC_B ^allein) + (MBC_C ^{Dreifachkombination}/MBC_C ^allein) (4)

8. Verfahren für den Zeitantwort-Assay

1. Bereiten Sie die Übernachtkulturen von E. coli CECT 434 und S. aureus CECT 976 gemäß den zuvor beschriebenen Wachstumsbedingungen (Abschnitt 1) vor.
2. Gib 1 ml Zellsuspension zu 1 ml ultrareines Wasser und warte 2 Minuten. An diesem Punkt fügen Sie 8 ml biozide/phytochemische Lösung (in ultrareinem Wasser oder 5 % DMSO) hinzu, um die gewünschten Konzentrationen für jedes Molekül zu erreichen: 1/4 x MBC und MBC sowie für die bakterielle Suspension (durch Anpassung des OD) bei 100 U/min und 25 °C. Mische die Moleküle mit den Zellen durch Vortex.
3. Bewerten Sie folgende Belichtungszeiten: 1, 3, 5, 15, 30, 45, 60 und 90 Minuten.
4. Wie in Abschnitt 4 beschrieben, bewerten Sie die antimikrobielle Wirkung, indem Sie die logitmische (CFU/mL)-Reduktion als logitamische (X/X₀) berechnen.
5. Führen Sie die Biozid- oder phytochemische Neutralisation für jedes getestete Konzentrationspaar bzw. zeitweise mit der Verdünnungs-Neutralisationsmethode und dem universellen Neutralisator, der seriellen Verdünnung und Beschichtung, wie zuvor in Abschnitt 4 beschrieben, durch.

9. Analyse kombinatorischer Daten mit der Software Combenefit

1. Öffnen Sie die bereitgestellte Datei 'REPLICATE_TEMPLATE.xls' bei https://sourceforge.net/projects/combenefit/files/, um die richtige Struktur und Formatierung sicherzustellen.
2. Organisieren Sie Ihre Daten in einer Matrix gemäß der Ergänzungstabelle 1, wobei:
   1. Erhöhen Sie die Konzentrationen von Produkt A von oben nach unten (von den niedrigsten zu den höchsten nummerierten Reihen). Fügen Sie mindestens drei verschiedene Konzentrationen für Produkt A hinzu.
   2. Erhöhen Sie die Konzentrationen von Produkt B von links nach rechts (von den niedrigsten zu den höchsten nummerierten Spalten): Fügen Sie mindestens drei verschiedene Konzentrationen für Produkt B hinzu.
   3. Stellen Sie die oberste Reihe (0 mg/L Produkt A) als Einzelagentenprodukt B dar.
   4. Stellen Sie die erste Spalte (0 mg/L Produkt B) des Einzelagentenprodukts A dar.
   5. Darstelle die (0,0)-Zelle wie die unbehandelte Kontrolle.
   6. Normalisieren Sie für jeden Fall die verwendeten Werte mit Gleichung (5), wobei der treat_0h das Logarithmer (CFU/mL) für eine bestimmte Behandlung unmittelbar nach der Exposition ist (0h); treat_24h ist das Log (CFU/mL) für eine spezifische Behandlung, 24 Stunden nach der Exposition (Nachwuchs); control_0h ist das Log (CFU/mL) für die entsprechende Kontrollgruppe (nur Zellen oder Zellen, die 5 % DMSO ausgesetzt sind), unmittelbar nach der Exposition (0 H); und control_24h ist das Log (CFU/mL) für die entsprechende Kontrolle (nur Zellen oder Zellen, die 5 % DMSO ausgesetzt waren), 24 Stunden nach der Exposition (Nachwuchs).
   7. Führen Sie in allen Fällen die CFU-Enumeration nach 24 Stunden Inkubation der verplattenten Proben auf PCA durch.
      (treat_0h - treat_24h)/(control_0h - control_24h) 100 (5)
      HINWEIS: Beziehen Sie Kontrollen/unbehandelte Erkrankungen ein, die die 100%ige Lebensfähigkeit definieren, und eine positive Kontrolle, die maximale Hemmung definiert (optional); Verwenden Sie nur numerische Werte, keine Formeln; Verwenden Sie die gleiche Anzahl von Zeilen und Spalten über Repliken hinweg; Verwenden Sie '.' für Dezimalzahlen.
3. Speichere die Datei als .xls oder .xlsx.
4. Erstelle für jede Replikation eine Excel-Datei, wie zuvor beschrieben und wie in Ergänzungstabelle 1, und füge alle Dateien im selben Ordner hinzu.
5. Öffnen Sie die Software Combenefit (Cancer Research UK Cambridge Institute, Cambridge, Version 2.021, verfügbar unter https://sourceforge.net/projects/combenefit/).
6. Lade diesen Ordner auf Combenefit hoch.
   1. Öffnen Sie die Software Combenefit
   2. Drücke auf "Projektordner auswählen" und wähle den richtigen Ordner aus.
   3. Auswahl des Referenzmodells: Loewe-Additivität, die den exakten Mechanismus für beide Produkte annimmt; Bliss-Unabhängigkeit, die unabhängige Handlung voraussetzt, oder HAS, was ein konservatives Modell ist (vergleicht die Kombination mit dem besten Einzelagenten). Die beste Praxis besteht darin, mindestens zwei Modelle durchzuführen und das beste auszuwählen.
   4. In diesem Fall wurde das Bliss-Modell gewählt, basierend auf der Wirkungsweise der getesteten Moleküle.
   5. Wähle die gewünschten grafischen Ausgaben aus, wohl wissend, dass du mindestens eine weitere für die Synergy-Distribution auswählen musst.
   6. Pressemitteilungsanalyse (ergänzende Abbildung 1). Tipp: Im Fenster "Während Analyse speichern" wählen Sie "Alles", um alle resultierenden grafischen Ausgaben im Originalordner zu speichern.

10. Anwendung der Chick-Watson- und Weibull-Modelle auf Dosis- und Zeitantwortdaten

1. Bereiten Sie Ihre Daten vor, indem Sie den Datensatz vor dem Import in Excel oder CSV formatieren: Für Dosis-Antwort entspricht Spalte A der Dosis (Konzentration, mg/L) und Spalte B dem Log (X/X₀); Für die Zeitantwortdaten entspricht Spalte A der Zeit (Minuten) und Spalte B dem Log (X/X₀).
2. Speichere deine Datei in '.csv' oder kopiere direkt in Prism.
3. Open GraphPad Prism (verwendete Version: 9.0 für Windows 11; La Jolla, Kalifornien, USA).
4. In Neue Tabelle und Graph wählen Sie XY aus, und in Datentabelle wählen Sie Daten eingeben oder in eine neue Tabelle importieren (ergänzende Abbildung 2).
5. In Optionen wählen Sie für X Nummer, für Y wählen Sie Replikationswerte in nebeneinanderfolgende Unterspalten ein und drücken Sie auf Erstellen (Ergänzende Abbildung 2).
6. Geben Sie Dosis-/Zeitdaten in X ein und protokollieren Sie Überlebensdaten in Y.
7. Gehe zu Analysieren, Nichtlineare Regression (Kurvenanpassung), wähle die Datensätze aus, die du analysieren möchtest, und drücke OK (Ergänzende Abbildung 2).
8. Wählen Sie Neu und erstellen Sie dann eine neue Gleichung.
9. In Gleichung wähle für Gleichungstyp die explizite Gleichung: Y = eine Funktion von X und Parametern; für den Namen schreiben Sie Chick-Watson Model/Weibull Model; und in der Definition schreiben Sie Y = -a*x^(n)*30 Chick-Watson-Modell (ergänzende Abbildung 3) und Y = -1/(2,303)*(x/a)^(b) für das Weibull-Modell (ergänzende Abbildung 4).
   HINWEIS: Das Chick-Watson-Modell wird durch Gleichung 6 ausgedrückt, wobei X₀ und X die CFU/mL für die unbehandelten Bakterien (Kontrollbakterien) und behandelten Bakterien sind, C die Konzentration (Dosis), k_dis der Inaktivierungsratekoeffizient, C die Konzentration (Dosis), n der Konzentrationsexponent und t die Belichtungszeit (in diesem Fall, 30 Min)⁵⁰. Das Chick-Watson-Modell wurde angewandt, um die Dosis-Antwort zu beobachten und die Beziehung zwischen Desinfektionsmittelkonzentration und mikrobieller Reduktion zu charakterisieren.
   log (X/X₀) = -k_dis · Cⁿ · t (6)
   HINWEIS: Das Weibull-Modell wird durch Gleichung 7 ausgedrückt, wobei X₀ und X die CFU/mL für die unbehandelten Bakterien (Kontroll-) und behandelten Bakterien sind, t die Zeit, α der Skalenparameter (charakteristische Zeit) und β der Formparameter⁵⁰ ist. Das Weibull-Modell wurde angewandt, um die Zeitantwort zu beobachten und die Form von Überlebenskurven zu charakterisieren. Der Skalenparameter stellt die charakteristische Inaktivierungszeit dar, während der Formparameter Abweichungen vom log-linearen Verhalten beschreibt (β = 1 log-linear; β < 1 Verfolger; β > eine Schulter).
   log (X/X₀) = -1/2,303 (t/α)^β (7)
10. In Rollen für Anfangswerte wählen Sie 0 als Anfangswert für jeden Parameter und (Anfangswert, zu passen) als Regel (Ergänzende Abbildung 5).
11. Behalte den Rest der Einstellungen als Standard und drücke OK.
12. Führen Sie die Anpassung durch und inspizieren Sie die geschätzten Parameter.

11. Biologische Replikation

1. Führen Sie für alle Tests mindestens zwei unabhängige Experimente mit mindestens zwei Replikaten durch.

Ergebnisse

Diese Studie bewertete die bakteriizide Aktivität aller vier getesteten Verbindungen – BAC, PAA, SAL und EUG – anhand von E. coli CECT 434 und S. aureus CECT 976. Wie in Abbildung 1 und Abbildung 2 gezeigt, zeigten BAC, PAA, SAL und EUG einen offensichtlich konzentrationsabhängigen Effekt auf die Kultivierbarkeit. Tabelle 2 zeigt die MBC-Werte für die getesteten Moleküle nach der Exposition und...

Diskussion

Das in dieser Studie vorgestellte Protokoll bietet einen integrierten Rahmen zur Bewertung der bakteriiziden Aktivität zweier häufig verwendeter Biozide – BAC und PAA – sowie zweier vielversprechender Phytochemikalien – EUG und SAL – einzeln und in Kombination (Doppel- und Dreifachkombinationen) im Vergleich zu E. coli und S. aureus. Mehrere Schritte in diesem Protokoll sind besonders entscheidend, um die Reproduzierbarkeit und genaue Interpretation antimikrobieller Interaktionen sicherz...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Benzalkoniumchlorid	Merck, Spanien	8.14363.0100	Biozid
Zentrifugierte Mega Star 600R	VWR, USA	VWR Mega Star 600R	-
Combenefit – Version 2.021	Cancer Research UK Cambridge Institute, Cambridge, Vereinigtes Königreich	-	Software zur Synergismusbewertung
Cuvetten	VWR, Deutschland	VWRI634-0678	1,5-mL-Cuvetten zur optischen Dichteanpassung
Destilliertes Wasser	-	-	Zur Medienvorbereitung
Dimethylsulphoxid (DMSO)	VWR, Frankreich	23500.322	Organisches Lösungsmittel
Wegwerf-Impfschleifen	VWR, Italien	VWRI612-9357	10 & mu; L-Inokulationsschleifen
Eppendorf-Röhren	VWR, China	VWRI525-1164	1,5 mL Eppendorf Safe-Lock-Rohre
Escherichia coli	Spanische Typ-Kultursammlung (CECT)	434	In dieser Studie verwendete Referenzstamm
Ethanol	VWR, Frankreich	83813.36	Für die Verteilung von Arbeitsplatz, Material und Händen
Eugenol 99 %	Sigma-Aldrich, USA	163333	Phytochemisch
Falcon-Röhren	VWR, USA	VWRI525-1085	15-mL Falcon-Röhren
Falcon-Röhren	VWR, Belgien	VWRI525-1109	50-mL-Falcon-Röhren
GraphPad Prism 9.0 für Windows 11	La Jolla, Kalifornien, USA	-	Software für mathematische und statistische Analysen
Lecithin	Alfa Aesar, Deutschland	Q04A010	-
L-Histidin	Merck, USA	1.04351.0025	-
Orbitaler Inkubator	VWR, USA	VWR 5000I Inkubationsschüttler 230V	-
Peracticsäure 15 %	AppliChem, Deutschland	143495-1211	Biozid
Petrischalen	VWR, Italien	VWRI391-0582	-
Pipette 1 - 10 mL	VWR, USA		-
Pipette 100 - 1000 μ L	VWR, USA		-
Pipettenspitzen 100 - 1000 & mu; L	Frilabo, Portugal	1-202-50-0	-
Pippette 20 - 200 & mu; L	VWR, USA		-
Pippette-Spitzen 1 - 10 mL	VWR, Belgien	vwri613-7094	-
Pippette Tipps 2 - 200 & mu; L	VWR, Mexiko	vwri613-6418	-
Plattenzahl Agar	VWR, Belgien	84608-0500	Isolierung und Kultivierung von Mikroorganismen
Polysorbat 80	VWR, USA	20E2756726	-
Kaliumchlorid - KCl	VWR, Belgien	11D110008	-
Kaliumdihydrogenphosphat – KH2PO4	VWR, Deutschland	26931.263	-
Säcilicsäure	Sigma-Aldrich, USA	84210-500G	Phytochemisch
Saponin	VWR, Deutschland	21A124103	-
Natriumchlorid – NaCl	VWR, Belgien	27788.297	-
Natriumwasserstoffphosphat – Na2HPO4	VWR, Belgien	28026.26	-
Natriumthiosulfat – Na2S2O3	VWR, USA	18D2056589	-
Spektrophotometer	VWR, USA	UV-1600PC-Spektrophotometer	Optische Dichteanpassung
Staphylococcus aureus	Spanische Typ-Kultursammlung (CECT)	976	In dieser Studie verwendete Referenzstamm
Tryptische Sojabrühe	Merck, Deutschland	1.05459.0500	Isolierung und Kultivierung von Mikroorganismen
Ultrareines Wasser	-	-	Zur Probenvorbereitung