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Methodenartikel

Drahtmyographie für dorsale Aorta und Mesenteriale Resistenzarterien von Mäusen und Ratten

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DOI:

10.3791/70186

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27. Februar 2026

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1Department of Physiology and Pharmacology, Center for Hypertension and Personalized Medicine, University of Toledo, College of Medicine and Life Sciences

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die nebeneinanderliegende Drahtmyographie zur Bewertung der vaskulären Reaktivität in Kanal- versus Resistenzarterien, die von Mäusen und Ratten isoliert wurden.

Zusammenfassung

Die Drahtmyographie ist eine weit verbreitete ex-vivo-Technik zur quantitativen Beurteilung der Gefäßfunktion isolierter Arterien. Da sich große Leitungs- und kleine Resistenzarterien grundlegend in Struktur und physiologischer Rolle unterscheiden, ermöglicht die parallele Analyse beider Gefäßklassen mit Arterien, die von derselben Maus oder Ratte entnommen wurden, paarweise Vergleiche, die die Variabilität zwischen Tieren verringern und gefäßspezifische funktionelle Veränderungen aufzeigen. Dieser Artikel stellt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Bewertung der vaskulären Reaktivität in isolierten Maus-Kanal- und Widerstandslagern mittels isometrischer Drahtmyographie vor. Wir beschreiben die Herstellung eines frischen, sauerstoffreichen physiologischen Puffers; sorgfältige Sektion, Reinigung und Montage von arteriellen Segmenten; und Normalisierung, um Schiffe nahe ihrer optimalen Länge für die aktive Krafterzeugung zu bringen. Ein Leitfaden zur Fehlersuche und eine beispielhafte experimentelle Sequenz zur Generierung kumulativer Konzentrations-Antwortkurven für Standard-Vasokonstriktoren und Vasodilatatoren werden bereitgestellt. Dieses Protokoll ermöglicht die quantitative Messung sowohl der Funktion der Endothel- als auch der glatten Muskulatur und erleichtert die Erkennung gefäßspezifischer Veränderungen der vaskulären Reaktivität, die mit Gefäßerkrankungen wie Bluthochdruck verbunden sind.

Einleitung

Hypertonie ist durch veränderte vaskuläre Reaktivität gekennzeichnet, wie etwa eine Endotheldysfunktion und eine Hyperreaktivität der glatten Muskulatur gegenüber Vasokonstriktoren1. Diese funktionellen Veränderungen, zusammen mit der mikrovaskulären Remodellierung und Verdünnung, tragen zu einer beeinträchtigten Gewebeperfusion und einer Dysregulation des Blutdrucksbei 2,3,4. Ex-vivo-Tests isolierter Gefäße sind mächtige Werkzeuge zur Analyse der zellulären und molekularen Mechanismen, die den Gefäßtonus bei Gesundheit und Krankheit steuern, da sie eine präzise Kontrolle der vaskulären Mikroumgebung und eine selektive pharmakologische Manipulation glatter Muskulatur und endothelialer Signalwege ermöglichen.

Die vaskuläre Reaktivität in isolierten Arterien wird üblicherweise mit zwei komplementären ex-vivo-Techniken bewertet: Drahtmyographie und Druckmyographie 5,6. In der Drahtmyographie werden Gefäßringe oder -segmente auf Stiften oder Drähten montiert, und die isometrische Kraft wird 7,8 erfasst. Bei der Druckmyographie werden intakte Gefäßsegmente kanüliert und auf einen definierten intraluminalen Druck gesetzt, und der Gefäßdurchmesser wird mittels Videomikroskopie9 erfasst. Im Gegensatz zur Drahtmyographie ermöglicht die Druckmyographie die Kontrolle des transmuralen Drucks und des intraluminalen Flusses. Daher rekapituliert es die hämodynamische Umgebung der Resistenzarterien in vivo genauer und wird häufig verwendet, um myogenen Tonus, flussvermittelte Reaktionen sowie vaskuläre strukturelle oder mechanische Eigenschaften zu untersuchen 9,10. Umgekehrt ist die Drahtmyographie technisch leichter umzusetzen (ohne Kanulierung oder Videomikroskopie), unterstützt einen höheren Durchsatz mit kommerziellen Mehrkammersystemen und eignet sich gut zur Erzeugung reproduzierbarer pharmakologischer Konzentrations-Reaktionskurven in kleinen bis mittleren Arterien mit Durchmessern im Bereich von zig bis mehreren hundert Mikrometern 5,6. Dementsprechend wird die Drahtmyographie häufig bevorzugt, um die pharmakologische Profilierung der vaskulären Reaktivität in von Mäusen oder Ratten isolierten Kanal- und Resistenzarterien zu untersuchen.

Rohrarterien (große elastische) und Widerstandsarterien (kleine Muskulaturen) unterscheiden sich grundlegend in Struktur und Funktion, und diese Unterschiede bestimmen unterschiedliche experimentelle Überlegungen und Endpunkte. Leitungsarterien (z. B. absteigende thorakale Aorta) enthalten große Mengen elastisches Gewebe und eine beträchtliche glatte Muskelmasse; Widerstandsarterien (z. B. mesenterische Arterien) haben relativ höhere glatte Muskel-zu-Lumen-Verhältnisse und sind wesentliche Determinanten für periphere Resistenz und lokale Autoregulation11,12. Da derselbe Agonist unterschiedliche molekulare Reaktionen in diesen Gefäßbetten aktivieren kann, liefert der nebeneinanderfolgende Vergleich von Rohr- und Widerstandsgefäßen desselben Tieres nützliche ergänzende Informationen. So ist beispielsweise in Leitungsarterien die Freisetzung von Endotheloxid der vorherrschende Entspannungsweg, durch den Acetylcholin (ACh) Vasorelaxation13,14 induziert. Im Gegensatz dazu induziert ACh in kleinen Resistenzarterien eine Relaxation durch Stickstoffmonoxid, Prostacyclin und, wichtig, endothel-abgeleitete hyperpolarisierende Faktoren (EDHF)15,16. Dementsprechend ermöglicht eine nebeneinanderfolgende Drahtmyographie von Leitungs- und Widerstandslagern, die von derselben Maus oder Ratte entnommen wurden, paarweise Vergleiche, die die Erkennung gefäßspezifischer funktionsbedingter Veränderungen erleichtern und gleichzeitig die Variabilität zwischen Tieren verringern.

Eine genaue Interpretation der Drahtmyographiedaten hängt von sorgfältiger Aufmerksamkeit für eine Reihe technischer Variablen ab: Zusammensetzung und Oxygenierung der physiologischen Salzlösung (PSS), Gewebehandhabung und -dissektion, Montagetechnik, optimale Ruhepretension (Normalisierung), Badetemperatur und Auswahl geeigneter pharmakologischer Kontrollen6. Normalisierung bezeichnet das technische Verfahren, bei dem der mechanische Betriebspunkt des Schiffes so eingestellt wird, dass die Entwicklung der aktiven Kraft optimiert wird und physiologische Betriebsbedingungenannähernd entspricht. Praktisch ist es bei Aortenringen üblich, eine feste Prätention zu verwenden, die oft empirisch bestimmt wird, um Überdehnung zu vermeiden und stabile Reaktionen zu erzeugen. Bei kleinen Widerstandsarterien wird die Normalisierung durchgeführt, indem zunächst der innere Umfang bestimmt wird, der einem äquivalenten transmuralen Druck von 100 mmHg (IC100) entspricht. Das Gefäß wird dann auf einen definierten Anteil dieses Wertes gesetzt, um den normalisierten inneren Umfang (IC1) zu bestimmen. In der Praxis setzen viele Protokolle IC1 bei etwa 0,9 × IC100 für Ratten-MRA und etwa 1,0 × IC100 für Maus-MRA, obwohl diese Werte je nach Gefäßtyp, Art und experimentellen Zielen 5,17 angepasst werden können.

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Protokoll

Das folgende Protokoll folgt den festgelegten Richtlinien und wurde vom Health Science Campus Animal Care and Use Committee der University of Toledo genehmigt.

VORSICHT Bevor Sie beginnen, befolgen Sie bitte jederzeit die Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und des Institutional Biosafety Committee (IBC); geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) verwenden; Bewegungsvorsicht beim Einsatz von chirurgischen oder anderen scharfen Instrumenten; Konsultation und Einhaltung der relevanten Sicherheitsdatenblätter (SDS) beim Umgang mit Chemikalien und biologischem Gewebe; Carbogen als Druckgasflasche mit zugelassenen Reglern und sicherer Lagerung zu handhaben; und die Entsorgung biologischer und chemischer Abfälle gemäß institutionellen Verfahren.

1. Herstellung eines PSS/modifizierten Krebs-Bicarbonat-(Krebs-)Puffers

HINWEIS: Krebspufferzusammensetzung (Endkonzentrationen, pH 7,4): 130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,17 mM MgSO4, 1,18 mM KH2PO4, 1,6 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, 5,5 mM Glukose und 0,03 mM EDTA.

  1. Bereiten Sie große Brühe vor: Lösen Sie alle Bestandteile außer NaHCO3, Glukose und CaCl2 in doppelt destilliertem Wasser auf, um eine Brühe herzustellen. Lagere diesen Fond bei 4 °C.
  2. Am Tag des Experiments wird das erforderliche Lagervolumen (z. B. 1 L) aliquotiert, sequentiell NaHCO3, Glukose und CaCl2 hinzugefügt und kontinuierlich mit Carbogen (95 % O2/5 % CO2) oxygeniert.
    HINWEIS: Um die Niederschlagung von Kalziumsalz zu minimieren, bereiten und lagern Sie einen 1 M CaCl2-Fond bei 4 °C und geben Sie das benötigte Volumen erst langsam nach vollständiger Auflösung von NaHCO3 in den Puffer und während kontinuierlichem Rühren. Halte die Carbogen-Blasen während derCaCl-2-Addition (siehe Schritt 1.3) aufrecht, um die Bildung von Calciumcarbonat zu reduzieren. Wenn sichtbare Niederschläge auftreten, entsorgen Sie und bereiten Sie einen frischen Puffer vor.
  3. Für das pH-Gleichgewicht lassen Sie den Puffer mindestens 20 Minuten mit Carbogen blasen, messen Sie dann den pH-Wert und stellen Sie bei Bedarf auf pH 7,4 ein.
    HINWEIS: Typischer pH-Wert des Präbubbels ≈ 7,7; Kontinuierliches Blasen senkt den pH-Wert auf physiologisch ≈7,4.
  4. Bereiten Sie Myographenkammern vor, indem Sie sie mit frisch vorbereitetem Krebspuffer füllen und mit dem sanften Blasen mit Carbogen beginnen. Passen Sie die Blasenrate an, um einen ausreichenden Gasaustausch ohne starke Umrührung sicherzustellen.
  5. Reservieren Sie einen Aliquot frisch zubereiteten, sauerstoffreichen Krebspuffers und kühlen Sie ihn auf Eis für die Gewebedissektion. Erwärmen Sie den verbleibenden sauerstoffhaltigen Puffer auf 37 °C (mit kontinuierlichem Carbogen-Blasen) für die Verwendung während der Experimente.

2. Dissektion der absteigenden thorakalen Aorta und der mesenterischen Arkade

  1. Lassen Sie das Tier gemäß den IACUC-Richtlinien einschläfern. Standardisiert den Zeitpunkt der Tiereuthanasie und Gewebeentnahme innerhalb eines 2-Stunden-Fensters, um mögliche zirkadiane Effekte zu minimieren.
  2. Öffnen Sie sofort die Brust- und Bauchhöhlen über einen Mittellinienschnitt und reflektieren Sie die Brustwand seitlich, um das Herz und die großen Gefäße freizulegen.
    HINWEIS: Führen Sie unter Standardbedingungen keine systemische Perfusion durch, da dies unbeabsichtigt Endothelschäden verursachen kann. Darüber hinaus verbessert das zurückgehaltene Blut in den mesenterischen Gefäßen die visuelle Unterscheidung zwischen Arterien und Venen und erleichtert die Bewertung der arteriellen Integrität. In einigen pathologischen Modellen (z. B. thrombotischen Erkrankungen) kann jedoch eine sanfte, niedrigdruckige Perfusion mit heparinisiertem, eiskalten physiologischen Puffer ratsam sein, um blockierende Thromben zu beseitigen und gleichzeitig die Endothelverletzung zu minimieren.
  3. Entfernen Sie die absteigende thorakale Aorta. Um die Dissektion zu erleichtern, entfernen Sie Lunge und Speiseröhre, um die Sichtbarkeit zu verbessern. Greifen Sie nicht direkt die absteigende thorakale Aorta; Stattdessen halten Sie vorsichtig den Aortenbogen oder das periadventitielle Fett fest, heben Sie leicht an und trennen Sie vorsichtig die Interkostalastgefässe unterhalb der Aorta. Entfernen Sie die absteigende thorakale Aorta, indem Sie sie kurz vor dem Durchgang des Zwerchfells schneiden und in eine mit Sylgard beschichtete Petrischale mit eiskältisem sauerstoffhaltigem Krebspuffer legen.
    HINWEIS: Halten Sie eine kalte Temperatur, um spontanen Klang zu minimieren und die Lebensfähigkeit zu erhalten. Black Sylgard erhöht den Kontrast bei der Gefäßdissektion.
  4. Streiche die gesamte Mesenteric-Arcade. Hebe die mesenterische Arkade vorsichtig an, um die arterie superior mesenteria zu finden, die von der abdominalen Aorta caudal zum Zwerchfell verzweigt. Schneiden Sie die arterie superior mesenteris proximal durch und befreien Sie die mesenterische Arkade vom umliegenden Bindegewebe ohne direkte Gefäßmanipulation. Platziere die Mesenteri-Arkade in eine separate, mit Sylgard beschichtete Petrischale mit eiskaltem, sauerstoffhaltigem Krebspuffer.

3. Isolierung und Montage von Aortenringen auf Pin-Myographen

  1. Stecken Sie die proximalen und distalen Enden der absteigenden thorakalen Aorta mit Dissektionsstiften an, um das Gefäß zu begradigen. Vermeiden Sie Überstreckung, um mechanische Schäden zu vermeiden.
    HINWEIS: Setze Stifte in das periadventitiale Fett statt durch die Gefäßwand, um Schäden zu minimieren.
  2. Unter einem Stereomikroskop mit externer Lichtquelle entfernen Sie vorsichtig periadventitisches Fett und Bindegewebe mit feinen Vannas-Scheren und -Pinzetten. Vermeiden Sie Beschädigungen an der Schiffswand.
    HINWEIS: Es ist gängige Praxis, das periadventitielle Fett zu entfernen, es sei denn, das Ziel ist es, die Rolle perivaskulärer adventitialer Gewebe bei der Regulation des vaskulären Tonus zu untersuchen.
  3. Schneide 2-mm-Aortenringe und mache saubere, senkrechte Schnitte. Entsorge Ringe, die durchstochen oder sichtbar beschädigt sind. Wann immer möglich, beproben Sie vergleichbare Standorte über Tiere hinweg, um die Variabilität zu minimieren.
  4. Trennen Sie eine Kammer mit sauerstoffhaltigem Krebs-Puffer vom Myographiegerät und transportieren Sie sie vorsichtig zum Stereomikroskop.
    HINWEIS: Das Rütteln der Kammer kann den Wandler beeinflussen und das Ergebnis verändern, halte die Kammer also vorsichtig und stell sie vorsichtig ab.
  5. Unter dem Stereomikroskop verwenden Sie das Mikrometer, um die Myographenstifte zusammenzubringen und den Aortenring auf die Stifte zu schieben, wodurch die Manipulation der Luminaloberfläche minimiert wird.
  6. Beachten Sie die Mikrometeranzeige mit vollständig entspanntem Ring; Trage eine leichte Dehnung auf, um das Gewebe für den Transport zu sichern.
  7. Schließen Sie die Kammer mit dem Instrument an und stellen Sie das Gefäß wieder auf den ursprünglichen Mikrometerwert zurück.
  8. Nachdem alle Ringe montiert sind, erhitze die Kammern auf 37 °C und überwache die Temperatur mit der mitgelieferten Sonde (typischerweise 20–30 Minuten bis 37 °C).
  9. Nullstellen Sie die Kraftanzeigen in der Benutzeroberfläche, starten Sie die Datenerfassungssoftware und beginnen Sie mit der Aufnahme.
  10. Wenden Sie schrittweise Prätension auf Aortenringe auf einen gefäßpassenden festen Wert mit dem Mikrometer an.
    HINWEIS: Ein typischer Prätentionswert für Aortenringe der Maus beträgt 5 MilliNewton (mN)5. Obwohl die berichteten Prätentionswerte für Rattenaortenringe zwischen den Studien variieren, unterstützt die vorherige Optimierung eine Prätention von 10 mN in diesemProtokoll 18.
  11. Aortenringe werden 45–60 Minuten bei der gewählten Prätension ausgeglichen, mit wiederholten Pufferwechseln unter Verwendung von 37 °C Krebs.
    HINWEIS: Es ist üblich, dass Aortenringe teilweise an Spannung verlieren und daher eine feine Nachjustierung der Vorspannung mehrmals mit dem Mikrometer erfordern, bevor sich die Spannung stabilisiert.
  12. Nullstellen Sie die Kraftmessungen in der Benutzeroberfläche, bevor Sie mit experimentellen Protokollen beginnen.

4. Isolierung und Montage von MRA auf Drahtmyographen

  1. Stecken Sie die mesenterische Arkade im Uhrzeigersinn an, um die mesenterischen Äste zu begradigen. Beginnen Sie damit, das Blinddarm zu sichern, und stecken Sie dann aufeinanderfolgende Dehnungen des Dünndarms im Uhrzeigersinn an, um die mesenteriale Gefäße sanft zu spannen, ohne zu überdehnen. Ersetzen Sie den Puffer bei Bedarf durch frischen Krebs, um Blut oder Ablagerungen zu entfernen.
  2. Identifizieren Sie die arterie superior mesenteria im Zentrum der Schale, wo die Arkaden ausstrahlen.
  3. Wählen Sie ein geeignetes MRA für die Isolierung aus; Typische Ziele: Innendurchmesser 200–250 μm (später während der Normalisierung bestimmt).
    HINWEIS: Bei erwachsenen Versuchstieren entspricht dies im Allgemeinen 2Äste der nd. Ordnung bei Mäusen und 3Rd-4 th-ordnungsartigen Ästen bei Ratten. Die Verzweigungsordnung wird durch aufeinanderfolgende Bifurkationen von der arteria superior mesenteria definiert. Äste 1.Ordnung entspringen direkt der oberen Mesenterienarterie, 2Äste N. Ordnung stammen von Ästen 1. Ordnung und so weiter.
  4. Unter einem Stereomikroskop wird die begleitende Vene entfernt und periadventitisches Fett sowie Bindegewebe mit Vannas-Schere und feiner Pinzette entfernt.
    HINWEIS: MRAs lassen sich von Venen an ihren dickeren Wänden und kleineren Lumen unterscheiden, die sich leicht durch das Vorhandensein von intraluminalem Blut sichtbar machen.
  5. Entspannen Sie die nahegelegenen Darmstifte, die die Darmwand neben dem ausgewählten Gefäß dehnen, bevor Sie die Arterie entfernen, um einen Gefäßrückstoß zu verhindern.
  6. Entfernen Sie die gesamte Länge der ausgewählten MRA (sollte >2 mm lang sein) und machen Sie saubere, senkrechte Schnitte. Mit feiner Pinzette greifen Sie ein Ende der Arterie und übertragen sie in eine saubere Petrischale mit eiskalten Krebspuffern (normale, nicht Sylgard-beschichtete Schalen erleichtern das anschließende Aufsetzen). Untersuchen Sie die Arterie auf Schäden; Das Vorhandensein von intraluminalem Blut erleichtert die visuelle Beurteilung der Integrität.
  7. Entfernen Sie ein etwa 2 mm breites Stück aus einem unversehrten Bereich. Entsorgen Sie alle Bereiche, die während des Transports behandelt wurden, oder zeigen sichtbare Schäden.
    HINWEIS: Die Verwendung transparenter, nicht mit Sylgard beschichteter Schalen ermöglicht es, ein Lineal unter der Schale zu platzieren, um die Gefäßlänge genau zu messen.
  8. Bereiten Sie zwei 2,5 cm lange 40 μm Edelstahldraht für die Montage vor.
  9. Mit feiner Pinzette fädeln Sie die Drähte vorsichtig einzeln durch das Lumen, sodass von beiden Enden genügend Draht herausragt, um sie zu montieren. Endotheltrauma minimieren. Nach dem Einsetzen beider Drähte notieren Sie die genaue Länge mit einem Lineal für die Verwendung im Normalisierungsverfahren (siehe Schritt 5.2).
    HINWEIS: Dies ist einer der technisch anspruchsvollsten und zeitaufwändigsten Schritte des Protokolls und erfordert Geduld sowie wiederholtes Üben, um Endothelschäden zu minimieren. Nach dem Einführen des ersten Drahts ist es oft einfacher, beide Drähte zusammenzuklemmen und durch das Gefäß zu führen.
  10. Trennen Sie eine Kammer mit sauerstoffhaltigem Krebs-Puffer vom Myographiegerät und transportieren Sie sie vorsichtig zum Stereomikroskop.
  11. Unter dem Stereomikroskop wird das MRA (Haltekabel an beiden Enden) in die Myographenkammer übertragen. Mit dem Mikrometer bringen Sie die Myographenkiefer zusammen, um die Drahtenden zwischen den Kiefern zu klemmen, sodass die Arterie frei zwischen ihnen hängt.
    HINWEIS: In diesem Stadium ist es ratsam, die Drähte so abzuklemmen, dass sie übereinander liegen. Das sichert die Drähte und verhindert, dass sie sich verdrehen.
  12. Sichern Sie das obere Kabel unter den Befestigungsschrauben an der nahe mikrometergegenüberliegenden Seite, indem Sie die Enden im Uhrzeigersinn umwickeln; Wiederhole das für den zweiten Draht auf der Wandlerseite.
    HINWEIS: Ziehen Sie die Schrauben vorsichtig, aber fest an. Sind die Schrauben zu locker, kann das Gefäß rutschen; bei zu starkem Anziehen kann das Kabel oder der Wandler beschädigt werden. Nach dem Befestigen des ersten Endes öffnen Sie die Lücke zwischen den Myographenkiefern leicht, bevor Sie das gegenüberliegende Ende anschließen, um eine gleichmäßige Drahtspannung zu gewährleisten.
  13. Bewege die Kiefer leicht auseinander und richte die Drähte so aus, dass sie parallel und koplanar liegen, fast berührend.
    HINWEIS: Alle Drahtanpassungen werden vom montierten Schiff entfernt vorgenommen, um Schäden zu minimieren.
  14. Wiederhole die Montage für alle MRAs.
  15. Heize die Kammern auf 37 °C und überwache die Temperatur (typisch 20–30 Minuten).
  16. Nullstellen Sie die Kraftwerte in der Benutzeroberfläche, bevor Sie das Normalisierungsverfahren starten.

5. Normalisierungsverfahren für die MRA

HINWEIS: Aortenringe sind an einer festen, vordefinierten Vorspannung montiert. Daher wird kein separater Normalisierungsschritt durchgeführt.

  1. Normalisierungsparameter in der Datenerfassungssoftware einstellen: Okularkalibrierung = 1; Zieldruck = 13,3 kPa (≈ 100 mmHg); normalisierter Innenumfang (IC1) = 0,9 für Ratten-MRAs und 1,0 für Maus-MRAs; Durchschnittszeit = 2 s; Verzögerung = 60 s.
  2. Geben Sie die behälterspezifischen Parameter wie folgt in das Normalisierungsmodul ein:
    1. Für Gewebeendpunkte (mm): setze a1 = 0 und a2 = die gemessene Länge der MRA in Millimetern (die genaue Länge während der Exzision).
    2. Hier kommt der Drahtdurchmesser ins Spiel: 40 μm.
    3. Mikrometermessung: Geben Sie den Basis-Mikrometerwert ein, der mit dem Gefäß montiert und vollständig entspannt aufgezeichnet wird.
  3. Beginnen Sie das Normalisierungsverfahren, indem Sie das montierte MRA schrittweise in 50 μm-Schritten dehnen. Nach jeder Dehnung geben Sie den neuen Mikrometermesswert in das Normalisierungsmodul ein und warten Sie 60 Sekunden zwischen den Schritten.
    HINWEIS: Plötzliche Zugabfälle nach einer Mikrometeranpassung deuten in der Regel auf ein Verrutschen des Gefäßes hin. Die Befestigungsschrauben sollten vorsichtig, aber fest angezogen werden.
  4. Warten Sie, bis das Normalisierungsmodul die Ruhewandspannung (mN/mm) gegen den inneren Umfang (μm) darstellt und eine exponentielle Kurve anpasst. Mit dem Mikrometer wird die schrittweise Dehnung fortgesetzt, bis die Zug-Umfangskurve den 100 mmHg Isobar schneidet. In der Nähe der Kreuzung reduzieren Sie die Schrittweite auf 10–30 μm, um eine Überdehnung des Gefäßes zu vermeiden.
  5. Wenn die Kurve den 100 mmHg Isobar schneidet, beachten Sie den softwareberechneten internen Umfang und setzen Sie den Mikrometer auf den entsprechenden vom Modul berechneten Wert, sodass die Präparation am Ziel-normalisierten inneren Umfang (IC₁) ruht.
    HINWEIS: Eine schlechte Kurvenanpassung weist in der Regel auf falsche Parameter hin, die in die Software eingegeben wurden, wie Gewebelänge, Drahtdurchmesser oder Mikrometerwerte.
  6. Wiederholen Sie das Normalisierungsverfahren für alle montierten MRAs und lassen Sie dann die Schiffe 30–45 Minuten mit wiederholten Pufferwechseln mit 37 °C Krebs ausgleichen.
  7. Null die Kraftmessungen in der Benutzeroberfläche unmittelbar vor Beginn der Experimente.
    HINWEIS: Wichtige Unterschiede zwischen Mäusen und Ratten werden in Tabelle 1 zusammengefasst.
ParameterMausRatte
Prätensionswert für Aortenringe5 mN10 mN
Ziel-IC-1-Verhältnis für MRA10.9
Typische MRA-Branch-Ordnung für 200–250 μm Innendurchmesser2.3. bis 4.

Tabelle 1: Wichtige Parameterunterschiede zwischen Mäusen und Ratten.

6. Experimentelles Protokoll (Beispielsequenz)

  1. Viability-Check: Lösen Sie eine kontraktile Reaktion mit einer depolarisierenden hohen K⁺-Herausforderung aus (z. B. 120 mM KCl).
    HINWEIS: Der High-K⁺-Puffer (KPSS) wird durch äquimolare Substitution von NaCl mit KCl aus dem Standard-Krebs-Puffer hergestellt, um die Osmolarität zu erhalten, und ist kontinuierlich mit 95 % O2/5 %CO2 sauerstoffhaltig. Um Kälteschocks zu vermeiden, erwärmen Sie das KPSS vor der Anwendung auf 37 °C. KPSS-Pufferzusammensetzung (Endkonzentrationen, pH 7,4): 120 mM KCl, 14,7 mM NaCl, 1,17 mM MgSO4, 1,18 mM KH2PO₄, 1,6 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, 5,5 mM Glukose und 0,03 mM EDTA.
  2. Führen Sie mindestens drei aufeinanderfolgende Waschen mit frischem 37 °C sauerstoffhaltigem Krebspuffer durch, bis eine stabile passive Basalspannung wiederhergestellt ist.
    HINWEIS: Alle Waschschritte werden durchgeführt, indem die Badelösung vollständig entfernt und durch einen frischen, sauerstoffreichen Krebspuffer mit 37 °C ersetzt wird. Kommerzielle Myographen verfügen häufig über eine eingebaute Waschfunktion, die die Myographiekammern entleert.
  3. Erzeugen Sie eine kumulative Konzentration-Antwort-Kurve (CRC) auf Phenylephrin (PE), wobei steigende Konzentrationen hinzugefügt werden (Beispielbereich 10⁻9 bis 10⁻4 M). Lassen Sie jede Konzentration ein Plateau erreichen, bevor Sie die nächste hinzufügen, bis ein stabiles maximales Plateau erreicht ist.
  4. Führen Sie mindestens drei aufeinanderfolgende Waschen mit frischem 37 °C sauerstoffhaltigem Krebspuffer durch, bis eine stabile passive Basalspannung wiederhergestellt ist.
  5. Endothelfunktion bewerten: Vorkonstriktion mit submaximaler PE-Konzentration, Stabilisierung der Antwort und anschließend endothelabhängige Relaxation mit ACh (Beispielbereich 10⁻⁹ bis 10⁻⁵ M) beurteilen. Lassen Sie jede Konzentration ein Plateau erreichen, bevor Sie die nächste hinzufügen, bis eine stabile maximale Relaxation erreicht ist. Rekordprozentuale Entspannung relativ zum vorverengten Ton (siehe Schritt 7.4). Präparate mit <70 % Entspannung sind ausgeschlossen.
    HINWEIS: Gefäßwanderkrankungen wie Bluthochdruck sind häufig mit einer endothelialen Dysfunktion verbunden, die häufig zu einer beeinträchtigten, endothelabhängigen Vasorelaxationsreaktion auf ACh19 führt. Unter diesen Bedingungen sollten Präparate mit <70 % Entspannung nicht automatisch ausgeschlossen werden, da dies eine echte krankheitsbedingte endotheliale Dysfunktion und kein technisches Versagen darstellen kann.
  6. Führen Sie mindestens drei aufeinanderfolgende Waschen mit frischem 37 °C sauerstoffhaltigem Krebspuffer durch, bis eine stabile passive Basalspannung wiederhergestellt ist.
  7. Testen Sie andere vasoaktive Substanzen, mit und ohne pfadspezifische Inhibitoren, wie es die experimentelle Frage vorschreibt.
  8. Am Ende des Experiments werden alle montierten Gefäße entfernt, alle Kammern mit 8 % Essigsäure gereinigt, anschließend drei Wasserspülungen durchgeführt und schließlich der Gastank sowie die Maschine ausgeschaltet.
  9. Entsorgung biologischer und chemischer Abfälle gemäß institutionellen Verfahren.

7. Datenanalyse und -berichterstattung

  1. Basisdefinition und Aufzeichnung. Erfassen Sie die Grundspannung unmittelbar vor Beginn eines vasokonstriktoren Challenges (z. B. High-K⁺-Challenge, vasokonstriktor CRC oder Präkonstriktion vor einem vasodilatatoren CRC).
    HINWEIS: Für eine anschließende Analyse ist es praktisch einfacher, die Kraftmessungen auf der Benutzeroberfläche nach einer ausreichenden Reinigung einer vorherigen Stimulation unmittelbar vor Beginn einer vasokonstriktorischen Herausforderung (d. h. angezeigte Grundspannung = 0) auf null zu stellen.
  2. High-K⁺-Herausforderung. Berechnen Sie die aktive Kraft als: Aktive Kraft = Maximaler Ton nach KCl - Grundspannung (Einheiten: mN). Drücken Sie die aktive Kraft aus, die entweder auf die Einheitslänge (mN/mm) oder die Querschnittsfläche (mN/mm2) des montierten arteriellen Segments normalisiert wird. Die Messung der Querschnittsfläche erfordert eine anschließende histologische Analyse der montierten Arteriensegmente, um die Wanddicke zu bestimmen.
    HINWEIS: Da Aortenringe oft eine nicht-plateauierende Antwort erzeugen, sollte die maximale High-K⁺-Antwort innerhalb einer vorgegebenen Zeit (z. B. 10 Minuten) über alle Präparaten hinweg gemessen werden, um die Variabilität zu minimieren. Bei MRAs wird die maximale High-K⁺-Reaktion meist innerhalb von Sekunden nach der Stimulation erreicht.
  3. Kontraktile CRCs. Für jede Konzentration in einem kontraktilen kumulativen CRC (z. B. PE) wird die aktive Kraft wie folgt berechnet. Drücken Sie die aktive Kraft bei jeder Konzentration als Prozentsatz der Antwort aus, die durch die hohe K⁺-Herausforderung ausgelöst wird. Verwenden Sie diese Prozentwerte zum Anpassen kontraktiler CRCs (siehe Schritt 7.5).
    Aktive Kraft = Maximaler Ton nach der Anwendung des Medikaments – Basisspannung (Einheiten: mN)
    HINWEIS: Bestimmte Bedingungen können zu Variabilität der maximalen High-K⁺-Reaktionen zwischen Präparaten führen (z. B. Veränderungen der glatten Muskelmasse oder des Differenzierungszustands infolge von Pathologie). Unter diesen Umständen wird die aktive Kraft an jeder Konzentration ausgedrückt, die entweder auf die Längeneinheit (mN/mm) oder die Querschnittsfläche (mN/mm2) des montierten arteriellen Segments normalisiert wird.
  4. Beruhigende CRCs. Für Relaxations-CRCs nach einer submaximalen Vorverengung (Vorverengungston) berechnen Sie die prozentuale Relaxation bei jeder Konzentration wie folgt. Verwenden Sie diese Prozentwerte für die Anpassung von Relaxations-CRCs (siehe Schritt 7.5).
    Entspannung = (Vorverengungston – Tonus nach der Anwendung des Medikaments) / (Vorverengungston – Grundspannung) × 100.
  5. Kurvenanpassung. Für sowohl kontraktile als auch entspannende kumulative CRCs wird log [Agonistenkonzentration] auf der x-Achse gegenüber der normalisierten Antwort auf der y-Achse dargestellt. Passen Sie die dargestellte Kurve mit einem Vier-Parameter-Logistikmodell unter Verwendung nichtlinearer Regression aus. Extrahiere Emax (maximaler Effekt) und pEC50 (−logEC50) für statistische Vergleiche, wobei EC50 die Agonistenkonzentration ist, die 50 % von Emax erzeugt.
  6. Datenpräsentation: Präsentieren Sie die normalisierten CRCs. Für jeden der Datenpunkte auf der Kurve verwenden Sie den Gruppenmittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) oder der Standardabweichung (SD). Fügen Sie repräsentative ursprüngliche Spuren hinzu und stellen Sie eine Parametertabelle bereit, die die Werte Emax und pEC50 (Mittelwert ± SEM oder SD) zusammenfasst.
  7. Statistische Analyse:
    1. Vergleichen Sie CRCs zwischen experimentellen Gruppen mittels zweiseitiger Varianzanalyse (ANOVA) mit einem geeigneten Post-hoc-Test (z. B. Bonferroni). Überprüfen Sie jedoch Annahmen (Sphärizität, Normalität) und verwenden Sie alternative Ansätze (z. B. Mixed-Effects-Modelle), wenn Daten fehlen oder unausgewogen sind.
    2. Vergleiche pEC50 und EMax zwischen zwei experimentellen Gruppen mit einem ungepaarten t-Test oder Einweg-ANOVA, wenn man mehr als zwei experimentelle Gruppen vergleicht. Alternativ verwenden Sie nichtparametrische Tests, wenn die Annahmen zur Varianzhomogenität und Normalität verletzt werden. Setze die statistische Signifikanz auf p < 0,05.

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Ergebnisse

Ein Schaltplan, der den gesamten Arbeitsablauf der Drahtmyographie in von Mäusen oder Ratten isolierten Kanal- und Widerstandslagern darstellt, ist in Abbildung 1 dargestellt. Repräsentative Bilder der Isolierung und Montage eines Mausaortenrings thorakaler Ordnung und eines MRA 2. Ordnung sind in Abbildung 2 bzw. Abbildung 3 dargestellt. Software-Screenshots, die Vorspannungs- und Normal...

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Diskussion

Die Drahtmyographie bleibt ein leistungsfähiger, hochauflösender Ansatz zur Ex-vivo-Untersuchung der Gefäßfunktion. Bei sorgfältiger Anwendung liefert diese Methode zuverlässige quantitative Endpunkte, die unterschiedliche biologische Fragestellungen adressieren und gleichzeitig einen rigorosen Vergleich von Makro- und Mikrovaskulärbetten innerhalb desselben Tieres ermöglichen. Studien der Kanalarterie zeigen Veränderungen in der globalen arteriellen Mechanik und der Reaktivität...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

Die Arbeit wurde durch eine NHLBI-Förderung (R00 HL153896 an I.O.) und Startkapital der Universität Toledo unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15-mL konische ZentrifugenröhrenThermo Fisher Scientific14-959-70C
50 mL konische ZentrifugenröhrenThermo Fisher Scientific14-959-49A
EssigsäureThermo Fisher ScientificA490-212
AcetylcholinMillipore SigmaA6625-100G
Analytisches GleichgewichtMettler ToledoMX304
CaCl2Thermo Fisher ScientificC79-500
Carbogen (95 % O2/5% CO2)LuftgasCD USP50
Sektionsmikroskop  ZEISSZEISS Stemi 305
Sektions-PetrischaleInstrumentierung von lebendigen SystemenDD-90-S-BLK
DissektionsstifteDänische Myo-Technologie400626
ZerlegungswerkzeugsetDänische Myo-Technologie101017Das Set besteht aus einer Sektionsschere (1), einer Mehrzweckschere (1), Petrischalen (5), einer Zange (3) und Teilpinnen.
Dumont #5 – Feine PinzetteFeine wissenschaftliche Werkzeuge11254-20
EDTAThermo Fisher ScientificBP2482-500
Gefrierschrank (-20 °C; C)Thermo Fisher ScientificTSG2325FA
GefrierklapperboxenUSA Scientific2310-5848
Handschuhe (Groß)Thermo Fisher Scientific19-041-171D
Handschuhe (Medium)Thermo Fisher Scientific19-041-171C
Handschuhe (Klein)Thermo Fisher Scientific19-041-171B
GlukoseThermo Fisher ScientificD16-500
Abgestufter ZylinderThermo Fisher Scientific08-572G
GraphPad-PrismaGraphPad-SoftwareN/ADatenanalyse und grafische Darstellung
SalzsäurelösungThermo Fisher ScientificSA48-1
EiskübelThermo Fisher Scientific03-395-156
KClThermo Fisher ScientificP217-500
KH2PO4Thermo Fisher ScientificP380-500
LabChart 8 SoftwareAD-InstrumenteN/ADatenerfassungssoftware
LaborkühlschrankThermo Fisher ScientificFBG49RPGA
LED-LichtquelleThermo Fisher ScientificAMPSILED21
Magnetischer RührerThermo Fisher ScientificFB30786159
Magnetische Rührstäbe (Groß)Thermo Fisher Scientific14-513-68
Magnetische Rührstäbe (Medium)Thermo Fisher Scientific14-513-61
MgSO4Thermo Fisher ScientificM63-500
Mikrolöffel und Pfannenwender ProbensetThermo Fisher ScientificS43322
MikrozentrifugenröhrenUSA Scientific1615-5510
Mini-MikrozentrifugeThermo Fisher Scientific07-203-954
Mini-SchraubenzieherThermo Fisher ScientificNC1349489
Mehrdraht-MyographensystemDänische Myo-TechnologieDMT 620M
NaCl Thermo Fisher ScientificS271-3
NaHCO3Thermo Fisher ScientificS233-500
pH-MeterThermo Fisher Scientific01-912-351Enthält pH-Messgerät, LE420-Sensor, Installations-QuickGuide und pH-Puffer-Starterpaket
Phenylephrin Millipore SigmaP6126-5G
PipetreglerThermo Fisher Scientific01-001-023
Pipettenspitzen in Racks (10 & Micro; L)USA Scientific1111-3810
Pipettenspitzen in Racks (1000 & Micro; L)USA Scientific1111-2830
Pipettenspitzen in Racks (200 & Micro; L)USA Scientific1111-1810
PYREX Wiederverwendbare MedienaufbewahrungsflaschenThermo Fisher Scientific06-414-1D
Serologische Pipetten (10 ml)Thermo Fisher Scientific02-923-204
Serologische Pipetten (25 ml)Thermo Fisher Scientific02-923-205
Einkanal-Mikropipetten-MultipackThermo Fisher Scientific13-684-2503x Pipetten (0,5–10 & mu; L, 10-100 & mu; L, 100-1000 & mu; L)
Edelstahldraht (40 & mu; m)Dänische Myo-Technologie400447
TimerThermo Fisher Scientific02-261-840
Ultra Pure Water SystemSartoriusH2O-MM-UV-SET-US
Vannas FrühlingsschereFeine wissenschaftliche Werkzeuge15000-00
VolumenkolbenThermo Fisher Scientific13-756-400
Vortex-MixerThermo Fisher Scientific10-320-807
WasserbadThermo Fisher Scientific07-202-155
Schüsseln wiegenThermo Fisher Scientific02-202-101

Referenzen

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GefäßreaktivitätMesenterialarterienisometrische Myographiearterielle DissektionGefäßfunktionEndothelfunktionglattmuskuläre Funktion

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