Methodenartikel

Kryo-Elektronen-Tomographie-Workflow für dickes Gewebe demonstriert im Maus-Hippocampus

DOI:

10.3791/70192

⸱

27. März 2026

 ,  , 
1Cryo-EM Center, Southern University of Science & Technology, 2Interdisciplinary Center for Brain Information, the Brain Cognition and Brain Disease Institute, Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll standardisiert die Kryo-Elektronen-Tomographie (Kryo-ET) für dickes Gewebe, indem es Hochdruck-Gefrieren (HPF) mit der Waffelmethode, kryogenen Fokusionenstrahl (Cryo-FIB) Lift-out und dosissymmetrische, parallele Aufnahme integriert, wodurch gleichmäßig dünne Lamellen und vitrifizierte Proben für eine reproduzierbare In-situ-Analyse im Maus-Hippocampus entstehen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Kryo-Elektronen-Tomographie (Kryo-ET) ermöglicht eine 3D-Visualisierung der nativen zellulären Ultrastruktur, aber ihre Anwendung auf dickes Gewebe ist durch das Fehlen einer zuverlässigen Vitrifizierung und der Low-Throughput-Lamellenpräparation eingeschränkt. Hier wird ein End-to-End-Workflow präsentiert, der Hochdruckgefrieren (HPF; ~2100 bar; Dissektionszeit bis Gefrierzeit ≤90 s) unter Verwendung einer "Waffel"-Baugruppe mit Kupferfolie zum Vorverdünnen des Gewebes, Kryo-FIB-Lift-out und kontrolliertem Ausdünnen auf 120–200 nm Lamellen mit Überneigungskompensation integriert. Die leitfähige Beschichtung ist standardisiert (Sputter-Pt 30 mA/15 s; GIS-Begrenzung von 0,5–1,0 μm), um Vorhänge zu minimieren. Automatisierte, dosissymmetrische Datenerfassung (0°, ±3°, ±6°... auf ±60–66°; Schrittweite von 2–3°; Gesamtdosis 100–150 e⁻/Å2) wird über PACEtomo-Skripte implementiert, wobei der Anfangswinkel aus dem Fräswinkel und der Probeausrichtung abgeleitet wird. Die Verarbeitung mit AreTomo 3 bietet Funktionen für Bewegungskorrektur, CTF-Schätzung, Ausrichtung und WBP-Rekonstruktion in nahezu Echtzeit; IsoNet kann optional die fehlende Keil-Anisotropie reduzieren. Die Subtomogramm-Mittelung (RELION 4.0) folgt einer Pseudo-Subtomogramm-Strategie mit Auflösungsberichterstattung basierend auf einem FSC-Cutoff von 0,143. Demonstriert auf dem Maus-Hippocampus, erzeugt der Workflow routinemäßig gut vitrifizierte Proben und einheitliche Lamellen (Zieldicke 150 ± 40 nm) und erreicht eine Hochdurchsatz-Neigungsseriensammlung (typischerweise 5–8 Minuten pro Neigungsserie). Dieses Protokoll bietet einen reproduzierbaren Weg, um die In-situ-Strukturbiologie direkt aus komplexen Gewebeumgebungen zu studieren.

Einleitung

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Die Kryo-Elektronen-Tomographie (Kryo-ET) hat sich als zentrale Technik zur Visualisierung makromolekularer Komplexe und zellulärer Architekturen in ihrem nativen, hydratisierten Zustand 1,2,3,4,5 etabliert. Durch die Rekonstruktion dreidimensionaler Volumina aus Kippserien von Projektionsbildern überbrückt Cryo-ET die Lücke zwischen zellulärem Kontext und nahezu atomarer Auflösung und bietet beispiellose Einblicke in die Strukturbiologie in situ6. Während Kryo-Elektronen-Tomographie-Workflows für zelluläre Proben7 (einschließlich kryo-FIB-verdünnter Zellen in Suspensionen und adhärenten Zellen) inzwischen gut etabliert sind, bleibt ihre direkte Ausbreitung auf dicke, architektonisch intakte Gewebe äußerst herausfordernd 8,9,10. Dies gilt besonders für Gewebe mit hohem Wassergehalt wie Gehirn11, wo eine zuverlässige Vitrifizierung und die Herstellung elektronentransparenter Lamellen (typischerweise <200 nm) weiterhin anhaltende Engpässe12 darstellen.

Die Vitrifizierung in Geweben ist aufgrund ihres hohen Wassergehalts und des begrenzten Wärmetransfers schwierig. Während Tauchgefrieren bei dünnen Proben (≤20 μm)13 wirksam ist, scheitert es bei den meisten Geweben. Hochdruckgefrieren (HPF) unterdrückt die Eisnukleation durch Hochdruck, was theoretisch eine Vitrifizierung von Proben bis zu ~200 μm ermöglicht. Allerdings ist die Effizienz herkömmlicher HPF oft suboptimal für vergießende Gewebe. Um die Ergebnisse zu verbessern, wurden in jüngsten Initiativen Strategien wie das Hinzufügen von Kryoprotektanten14 und die Durchführung von Pre-Sectioning15,16 (z. B. mit einem Vibratom) eingesetzt, um die Probendicke mechanisch vor dem Einfrierenvon 11,17 zu reduzieren. Obwohl diese Ansätze die Vitrifizierungsqualität verbessern können, beinhalten sie oft eine längere Ex-vivo-Handhabung und den Einsatz chemischer Zusatzstoffe, die Gefahr haben, die natürlichen Strukturen zu verändern. Um diese Einschränkungen zu beheben, modifizierte diese Studie die ursprünglich von Kelley et al.18 entwickelte "Waffel"-Trägerstrategie, indem sie eine kritische Optimierung einführte: Das Gehirngewebe wird vor dem Einfrieren physisch mit zwei polierten Kupferträgern komprimiert, wodurch die Probe vorverdünnt und gleichzeitig zwischen einem gefilmten Gitter und einer Kupferfolie gesichert wird. Dieses Design fördert nicht nur eine schnelle und gleichmäßige Vitrifizierung, sondern verbessert auch die mechanische Stabilität erheblich, wodurch Gitterbruch und Probenverlust bei der anschließenden Behandlung effektiv verhindert werden und so eine solide Grundlage für die Gewinnung intakter, hochwertiger eingefrorener Gewebeproben geschaffen wird.

Nach der Vitrifizierung bleibt die Verdünnung ein großes Hindernis für Durchsatz und Qualität. Als frühe und weit verbreitete Technik ermöglicht die Kryo-Ultramikrotomie zahlreiche grundlegende In-situ-Strukturstudien. Dennoch führt es häufig zu Kompressions- und Schnittartefakten19,20, die die strukturelle Integrität beeinträchtigen. Im Gegensatz dazu bietet die kryofokussierte Ionenstrahl-Fräsung (Cryo-FIB)21 eine überlegene Präzision und minimale Verzerrung 7,22. Anfangs wurde das Kryo-FIB-Fräsen direkt auf vitrifizierte Proben auf Gittern angewendet, um Lamellen23 zu erzeugen; Dieser In-situ-Ansatz ist jedoch vor allem für dünne Proben24,25 (z. B. kultivierte Zellen oder periphere Geweberegionen) wirksam und kann keinen Zugang zu tieferen Strukturen in dickem, voluminösem Gewebe erhalten. Um diese Tiefenbegrenzung zu überwinden, wurden Lift-out-Strategien26 entwickelt, die die standortspezifische Extraktion von Interessensregionen (ROIs) aus dem Inneren der Proben ermöglichen. Nachfolgende methodische Fortschritte, darunter Serial Lift-out27 und On-grid Serialized Sectioning (SOLIST)28, verbesserten den Durchsatz, die Lamellärstabilität und die Präzision der 3D-Korrelativzielung in komplexen Geweben weiter. In jüngerer Zeit haben Innovationen das Feld weiter vorangetrieben, darunter die sechsseitige Befestigungsmethode von Tang et al.29, die die mechanische Stabilisierung beim Lift-out und Ausdünnen verbessert, sowie neuartige On-Grid-Fräsmethoden von Benjamin C. Creekmore et al.11, die den Zugang zu tiefen Strukturen ermöglichen und gleichzeitig den nativen Gewebekontext erhalten. Trotz dieser Fortschritte variieren die Protokolle weiterhin in Effizienz, Reproduzierbarkeit und Anpassungsfähigkeit zwischen verschiedenen Gewebetypen. Eine kritische Lücke besteht bei der Etablierung eines standardisierten, leicht replizierbaren und breit anwendbaren Workflows, der diese Optimierungen in eine kohärente Pipeline für verschiedene dicke Gewebe integriert.

Diese Lücke wird hier geschlossen, indem wichtige technische Details aus etablierten Methodologien synthetisiert und zu einer verallgemeinerten, durchgängigen Pipeline verfeinert werden. Dieses Protokoll verwendet nicht nur die verbesserte HPF-Waffel-Methode für eine robuste Vitrifizierung, sondern integriert auch eine Reihe optimierter Schritte im Cryo-FIB-Lift-out und Verdünnen, wie systematische Überneigungskompensation, standardisierte leitfähige Beschichtung und kalibrierte Frässequenzen, die gemeinsam die Gleichmäßigkeit der Lamellen verbessern, Artefakte (z. B. Vorhänge) reduzieren und den Durchsatz verbessern. Im Gegensatz zu Protokollen, die auf bestimmte Zelltypen oder Modellorganismen zugeschnitten sind, ist dieser Workflow im Kern mit Verallgemeinerbarkeit konzipiert und bietet ein vielseitiges Rahmenwerk, das an eine Vielzahl dicker, komplexer Gewebe anpassbar ist, einschließlich solcher, die relativ weich sind und anfällig für Kompressionen sind, jenseits des demonstrierten Mäusehippocampus.

Demonstriert im anspruchsvollen Modell des Maus-Hippocampus, das für seine Anfälligkeit für Eisschäden und strukturelle Komplexität bekannt ist, erzeugt dieser integrierte und verallgemeinerte Arbeitsablauf zuverlässig hochwertige Lamellen (120–200 nm) und unterstützt eine effiziente Neigungsserienerfassung (5–8 Min/Serie). Diese Zusammenführung bewährter Praktiken zu einem kohärenten, zugänglichen und weit anwendbaren Protokoll bietet einen reproduzierbaren Rahmen, der die technische Hürde für die Implementierung von Kryo-ET in der Dickgewebsforschung in verschiedenen biologischen und biomedizinischen Kontexten senkt.

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Protokoll

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Alle Verfahren mit tierischem Gewebe entsprachen SUSTech IACUC (Protokoll SUSTech-JY202501019). Die Regenten und die verwendete Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Beispielunterstützungsvorbereitung

  1. HPF-Trägervorbereitung (siehe Abbildung 1A)
    1. Besorge ein Paar 6-mm-Kupfer-HPF-Träger (Typ B). Stellen Sie sicher, dass einer der Träger eine ebene Oberfläche hat.
    2. Befeuchte die flache Oberfläche des Trägers und schleife dann weiter. Verwenden Sie zunächst 8000er-Schleifpapier, bis die ursprünglichen Bearbeitungsspuren vollständig entfernt sind. Dann wechselt man auf Schleifpapier mit 12.000 Körnung und schleift weiter, bis Kratzer aus dem vorherigen Schritt weitgehend beseitigt sind, was zu einer gleichmäßig glatten Oberfläche führt. Abbildung 2 zeigt typische Bilder der Trägeroberfläche während des Schleif- und Polierenprozesses.
    3. Polieren Sie die Grundoberfläche mit einem weichen metallografischen Tuch und W0,5-Diamantpaste: Zunächst tragen Sie die Paste auf das Tuch auf und polieren Sie die Oberfläche dann 1–2 Minuten in einer kreisenden Bewegung, bis eine glatte, hochpolierte Oberfläche erreicht ist. Spülen Sie den Träger gründlich mit Ethanol ab, gefolgt von destilliertem Wasser, um alle Schleifrückstände zu entfernen.
    4. Tauchen Sie die polierten Träger mindestens 4 Stunden (oder über Nacht) in 1-Hexadecen ein, bevor sie verwendet werden.
      HINWEIS: Polierte und behandelte Träger können untergetaucht in 1-Hexadecen gelagert werden.
      VORSICHT: 1-Hexadecen ist entflammbar und schädlich beim Einatmen; Ich arbeite in einer Abzugshaube mit PSA.
  2. TEM-Unterstützungsgittervorbereitung (siehe Abbildung 1B)
    1. Verwenden Sie 100-Mesh Kupfergitter mit einer durchgehenden Formvar-/Kohle-Trägerfolie.
    2. Sputter-Schichten Sie beide Seiten der Gitter mit Gold und verwenden Sie einen Sputter-Coater: Stellen Sie den Strom auf 50 mA ein und beschichten Sie jede Seite für 120 Sekunden, um eine Schicht von etwa 6 nm pro Seite zu erreichen.
  3. Herstellung von Kupferfolie (siehe Abbildung 1C)
    1. Erhalten Sie hochreine Kupferfolie mit einer Dicke von 1 μm.
      HINWEIS: Die Wärmeleitfähigkeit von Kupfer variiert mit der Reinheit, und eine niedrigere Reinheit führt zu einer geringeren Wärmeleitfähigkeit. Daher wird hochreine Kupferfolie (Cu ≥ 99,9 %) benötigt.
    2. Stanzen Sie die Kupferfolie mit einem kreisförmigen Lochstanz in Scheiben mit einem Durchmesser von 3 mm.

2. Hochdruckgefrieren

  1. Geben Sie einen 10-μL-Tröpfchen mit 10%iger Saccharoselösung auf eine saubere Glasoberfläche.
  2. Sezieren Sie schnell den Hippocampus einer frisch eingeschläfelten Maus. Entfernen Sie kleine Gewebestücke von etwa 0,5–1 mm3 mit einer scharfen Rasierklinge (siehe Abbildung 1D).
  3. Übertragen Sie das Gewebe auf die Kupferstütz-TEM-Gitter (100 Mesh) im HPF-Träger mit einem Zahnstocher oder einer feinen Bürste. Verwenden Sie 2-Methylbutan (Isopentan), um das Gewebe vorsichtig an ihren Platz zu bringen und dabei die mechanische Belastung des Gitters zu minimieren.
    VORSICHT: 2-Methylbutan (Isopentan) ist extrem entflammbar. Behandle es in einer Abzugshaube ohne Zündquellen.
  4. Decken Sie das Gewebe und das Gitter mit einer Kupferfolie mit 3 mm Durchmesser ab. Schließen Sie die Montage ab, indem Sie den zweiten HPF-Träger (flach mit der Vorderseite nach unten) oben darauf legen, um das versiegelte "Waffel"-Sandwich zu formen (siehe Abbildung 1E).
    HINWEIS: Die Kupferfolie erfüllt eine entscheidende mechanische Funktion in der Waffelbaugruppe. Es klemmt das Gewebe zwischen dem TEM-Gitter und der Folie selbst ein. Während der Montage übt diese Konfiguration sanften Druck aus, der hilft, eine dünnere, gleichmäßigere Gewebescheibe zu bilden, die ideal für die Vitrifizierung ist. Darüber hinaus verhindert die Folie Gewebeverlust während der Handhabung und hilft, den Druck beim Hochdruck-Einfrieren zu verteilen, wodurch das Risiko eines Gitterbruchs verringert wird. Nach dem Einfrieren erleichtert die Folie zudem die Trennung der Träger vom vitrifizierten Probengitter. Diese Vorbereitungsmethode kann jedoch zu mechanischen Kompressionsschäden führen und ist möglicherweise nicht für Proben geeignet, die empfindlich auf druckbedingte Artefakte reagieren. Für solche Proben sollten alternative Schneidtechniken in Betracht gezogen werden, die eine angemessene Dicke ohne Kompression erreichen, wie etwa Vibratom-Schnitt oder Probenstanzen.
  5. Starten Sie sofort das Hochdruck-Einfrierverfahren gemäß dem Betriebsprotokoll des Herstellers. Stellen Sie den Zieldruck auf ~2100 bar ein und stellen Sie sicher, dass die Gesamtzeit von der Gewebedissektion bis zum Einfrieren 90 Sekunden nicht überschreitet.
    HINWEIS: Der gesamte Eingriff von der Sektion bis zum Einfrieren sollte innerhalb von 90 Sekunden abgeschlossen werden, um strukturelle Veränderungen im Zusammenhang mit längerer Ex-vivo-Zeit zu minimieren. Der Gewebedickenbereich im Gehirn beträgt etwa 20–40 μm.

3. FIB-Fräsen und Lift-out

HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte mit einem Doppelstrahlmikroskop mit einer Kryostufe durch. Halten Sie die Probentemperatur während der gesamten Zeit unter -170 °C.

  1. Vorbereitung des Empfängergitters
    1. Besorgen Sie ein neues 300-Mesh goldenes Gitter, das als endgültiges Empfängergitter für das Lift-out-Verfahren dient.
    2. Unter einem Stereomikroskop bei Raumtemperatur wird das Gitter vorsichtig in einen kompatiblen Cryo-FIB-AutoGrid-Ring geclippt.
    3. Lagern Sie das zusammengebaute AutoGrid direkt in einem Trockenofen mit etwa 40 °C, um die Frostansammlung vor der Nutzung zu minimieren.
      HINWEIS: Beim Clipping sollte man sicherstellen, dass das Gitter flach und zentriert liegt, um Biegungen oder Fehlausrichtungen zu vermeiden.
  2. Entnahme und Montage des vitrifizierten Gewebegitters
    1. Während Sie die Baugruppe kontinuierlich in flüssigen Stickstoff (LN₂) eintauchen, trennen Sie das vitrifizierte TEM-Gitter (mit dem Gewebe und der Kupferfolie) sorgfältig von den umgebenden "Waffel"-Baugruppen.
      HINWEIS: Der Kupferfolien-Abstandshalter macht das Gitter typischerweise leicht von den Trägern zu trennen.
    2. An einer vorgekühlten, kryogeladenen Arbeitsstation wird das isolierte Gewebegitter in einen zweiten Cryo-FIB AutoGrid-Ring unter LN₂-Schutz montiert.
  3. Co-Lade-Gitter auf das Kryo-Transfer-Shuttle
    1. Lade beide AutoGrids in die vorgesehenen Slots des Kryo-Transfer-Shuttles.
    2. Richte jedes AutoGrid so aus, dass die Fräskerbe nach außen zeigt und vertikal ist.
    3. Halten Sie das geladene Shuttle unter LN₂-Immersion oder vorgekühlt, bis es in das FIB/SEM-Mikroskop überführt wird.
  4. Lokalisierung und leitfähige Beschichtung im FIB/SEM
    1. Nach dem Kryotransfer ins Mikroskop navigieren Sie zum Gewebegitter mit niedriger SEM-Vergrößerung.
    2. Tragen Sie eine leitfähige und schützende Beschichtung auf die gesamte Gitteroberfläche auf.
      1. Die Gitteroberfläche mit Platin (Pt) bei 30 mA für 15 Sekunden zu sputtern.
      2. Eine 0,5–1,0 μm dicke organometallische Pt-Kappe wird mit dem Gasinjektionssystem (GIS) eingezahlt.
      3. Trage eine abschließende, sputterbeschichtete Pt-Schicht auf die Gitteroberfläche bei 30 mA für 15 Sekunden auf.
        HINWEIS: Die GIS-Kappe ist entscheidend, um Vorhangartefakte zu reduzieren.
  5. Isolierung und Lift-out von Gewebeblocken (siehe Abbildung 3)
    1. Standortwahl und Ausrichtung
      1. Navigiere mit dem SEM-Elektronenstrahlbild zum ausgewählten Interessengebiet (ROI) im Gewebegitter.
      2. Richte die Probe für das Fräsen der Vorderseite aus. Eine typische Stufenposition ist auf 110° Drehung und 7° Neigung eingestellt, wobei die Probenoberfläche in einem Winkel präsentiert, der für den Zugang zum Ionenstrahl geeignet ist.
        HINWEIS: Ohne fluoreszierende Marker kann eine Vorab-Screening-Strategie angewandt werden. Diese Strategie zielt darauf ab, die Zielgewebsregion zu lokalisieren und Bereiche auszuschließen, die Kryoprotektionen oder andere Nicht-Gewebekomponenten enthalten. Nach Auswahl eines offenbar eisfreien Bereichs wird ein kleiner Testgraben mit einem höheren Strahlstrom (z. B. 15 nA bei 30 kV) in der Standardfrontseite gefräst und mit einem niedrigeren Strahlstrom (z. B. 1 nA bei 30 kV) poliert. Wechselt man zum Elektronenstrahl, um den Querschnitt zu untersuchen: Das Gewebe zeigt unter dem Elektronenstrahl einen ausgezeichneten Kontrast, eine Eigenschaft, die besonders in membranösen Strukturen und schwer elementreichen Bereichen ausgeprägt ist; Im Gegensatz dazu zeigt der Kryoprotektion typischerweise einen gleichmäßigen Kontrast unter dem Elektronenstrahl. Dies ermöglicht eine schnelle Überprüfung vor dem vollständigen Ausstiegsverfahren.
    2. Grabenfräsen zur Isolierung des Blocks (Abbildung 3A)
      1. Definieren Sie einen rechteckigen Graben, der den Zielgewebeblock umgibt, mit dem Ionenstrahl, der mit 30 kV betrieben wird.
      2. Beginnen Sie mit dem Fräsen in einem bestimmten Abstand vom Block mit einem relativ hohen Strom von 15 nA, um eine schnelle Materialentfernung zu erreichen.
      3. Wenn sich die Grabenwände dem Block bis auf wenige Mikrometer nähern, wird der Ionenstrahlstrom auf 7 nA reduziert. Die Reduzierung des Stroms ermöglicht eine präzisere Steuerung und minimiert Schäden durch Ionenstrahl sowie Erwärmung des biologischen Materials im interessierten Bereich.
      4. Lassen Sie eine Seite des Blocks als "Lasche" am Bulkmaterial befestigt, um ihn vorübergehend zu fixieren.
    3. Optionales Unterfräsen für dicke Blöcke (Abbildung 3B)
      1. Für Gewebeblöcke mit einer geschätzten Dicke von mehr als 20 μm führen Sie einen Unterschnittsfrässchritt von der Rückseite aus, um das endgültige Ausheben zu erleichtern.
      2. Drehen Sie die Bühne (z. B. auf -70°) und stellen Sie die Bühnenneigung (z. B. auf 23°) ein, um an den unteren Teil des Blocks zu gelangen.
      3. Fräsen Sie die Unterseitenverbindung mit dem FIB bei 30 kV und einem Strom von 3 nA.
    4. Befestigung an der Mikromanipulatornadel (Abbildung 3C)
      1. Um die Probe an der Nadel zu befestigen, führen Sie sequentielle Querschnitt-Fräsmuster durch.
        HINWEIS: Der Goldblock kann aus dem Balken eines 300-Mesh-Goldgitters extrahiert werden.
    5. Lift-out des Gewebeblocks (Abbildung 3D)
      1. Trennen Sie die verbleibende "Lasche", die den Block mit der Massenprobe verbindet, mit dem FIB (30 kV, 1 nA).
      2. Manövrieren Sie vorsichtig die Mikromanipulatornadel, um den nun isolierten Gewebeblock so anzuheben, dass er vollständig frei vom Graben und dem umliegenden ursprünglichen Gitter ist. Dann zieht man die Nadel zurück und transportiert den Block zum Empfängergitter.
    6. Blocktransfer, Schweißen und Neubeschichtung
      1. Navigieren Sie mit der Nadel zu einem vorgekühlten 300-Mesh goldenen Empfängergitter.
      2. Senken Sie den Block auf ein ausgewähltes Gitterfeld. Bringen Sie den Gewebeblock in Kontakt mit dem Film auf dem Gitter und heben Sie den Block dann vertikal an, um den Kontakt zu lösen. Schleifen Sie einen ~3–4 μm dicken Schnitt vom Block auf den Gitterfilm mit dem Ionenstrahl (30 kV, 1 nA) (Abbildung 3E).
        HINWEIS: Wenn Eisablagerungen vorhanden sind, reinigen Sie die Befestigungsstelle vorab mit einem rechteckigen Muster (30 kV, 50 pA). Stelle sicher, dass der Block Kontakt mit dem Gitterfilm hat, um die elektrostatische Ladung zu reduzieren, die die Scheibe zufällig verdrängen kann.
      3. Schweißen Sie die Scheibe sicher durch Fräsen mit Reinigungsquerschnittsmustern auf beiden Seiten der Verbindung (30 kV, 30 pA) (Abbildung 3F).
      4. Tragen Sie die leitfähige/schützende Beschichtung wie in Schritt 3.4.2 (Abbildung 3G) beschrieben erneut auf.
        HINWEIS: Für diesen GIS-Beschichtungsschritt kann die Dauer je nach Blockgröße verkürzt werden.
    7. Lamellenausdünnung
      1. Drehen Sie die Stufe (z. B. auf -70°) und stellen Sie eine Anfangsneigung der Stufe ein (z. B. 15°) (Abbildung 3H).
        HINWEIS: Der Probenhalter hat eine Vorneigung von 45°.
      2. Definieren Sie die endgültige Lamellenposition innerhalb eines glatten Bereichs des Gewebeblocks.
        HINWEIS: Bestätigen Sie, dass der ausgewählte Bereich frei von Eiskontamination ist.
      3. Führen Sie systematische Fräsarbeiten mit den in Tabelle 1 angegebenen Ionenstrahlströmen durch. Der Fortschritt erfolgt von höheren zu niedrigeren Strömen, je näher sich die Zielebene erreicht (Abbildung 3I,J). Optional kann im Umkreis von 1–2 μm zur Lamelle ein Spannungsentlastungsgraben etwa 1,5 μm entfernt gefräst werden, um das Biegen oder Einrollen derLamelle zu verhindern.
        HINWEIS: Wenn sich das verbleibende Material innerhalb von ~1 μm der Zielebene befindet, begrenzt man die pro Durchgang entfernte Dicke.

4. Cryo-ET-Datenerhebung

  1. Nach erfolgreicher Lamellenpräparation wird das Netz vorsichtig in ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM) geladen, das mit einem Kryohalter, einem Energiefilter und Tomographiesoftware (z. B. SerialEM) ausgestattet ist.
  2. Erfassen Sie eine Atlaskarte des gesamten Gitters (z. B . Abbildung 4A; typische Vergrößerung beträgt 155×).
  3. Navigieren Sie zur Lamellenposition und erhalten Sie eine Montagekarte (z. B. Abbildung 4B; typische Vergrößerung beträgt 3600× mit einem Defokus von -100 μm).
  4. Stellen Sie die nominale Aufnahmevergrößerung ein und überprüfen Sie, ob die Pixelgröße für die vorgesehene Auflösung geeignet ist; in der vorliegenden Studie wurde eine Pixelgröße von 2,109 Å verwendet. Passen Sie die entsprechenden Beleuchtungsparameter an, einschließlich Punktgröße, C2-Aperturdurchmesser und Beleuchtungsfläche, um eine optimierte Dosisrate für den Direktelektronendetektor zu erreichen.
  5. Konfigurieren Sie die Fokus- und Testbeleuchtungsbedingungen so, dass sie den für den Record-Parameter gesetzten entsprechen.
  6. Führen Sie die Datenerhebung mit den PaceTomo-Skripten32 durch und folgen Sie den folgenden Schritten:
    1. Wählen Sie Ziele auf der Montagekarte vorab mit der Funktion "Punkte hinzufügen" im Navigator aus, um sicherzustellen, dass das erste Merkmal ausreichend Kontrast zeigt.
    2. Wähle Ziele mit dem PACEtomo_selectTargets.py Skript32 aus und passe den Feature-Bereich bei Bedarf bei der Vorschauvergrößerung an. Typische Interessensgebiete sind in Abbildung 4C dargestellt.
    3. Erfassen Sie Kippreihen mit einem dosissymmetrischen Schema (z. B. 0°, +3°, -3°, +6°, -6°... bis zu ±60°–66°) mit einer Steigerung von 2° oder 3°. Setze die Erfassungsparameter im PACEtomo.py-Skript: Der Startneigungswinkel wird durch den in Schritt 3.7.1 angegebenen Fräswinkel bestimmt (d. h. 8°), dessen Vorzeichen von der Probenbelastungsorientierung im Kryo-EM abhängt; die minimalen und maximalen Neigungswinkel beziehen sich auf absolute Werte; und die Schrittlänge entspricht dem Neigungsschritt (z. B. 3°).
      HINWEIS: Dieser Anfangswinkel ist so konzipiert, dass die Lamelle horizontal und senkrecht zum Elektronenstrahl positioniert wird. Wenn der Fräswinkel unbekannt ist, kippen Sie das Bild, um die Lamelle in ihrer größten scheinbaren Höhe anzuzeigen; Dies sorgt für eine ausreichend genaue Ausrichtung.
    4. Halten Sie eine kumulative Elektronendosis von 100–150 e⁻/Å2 über alle Neigungen verteilt. Falls vorhanden, verwenden Sie einen Energiefilter mit einer Spaltbreite von 10 eV.
    5. Starte die Datenerfassung. Automatisierte Fokussierung und Verfolgung sind bei jedem Neigungswinkel implementiert. Die typische Aufnahmezeit für eine einzelne Neigungsserie beträgt 5–8 Minuten.
      HINWEIS: Eine Fehlerbehebungsanleitung ist in Tabelle 2 bereitgestellt.

5. Datenverarbeitung

  1. Prozess-Tilt-Series-Bewegungskorrektur, CTF-Schätzung, Ausrichtung und 3D-Tomogramm-Rekonstruktionsbilder mit AreTomo 333, um drei Kernschritte durchzuführen: (1) Bewegungskorrektur von Rohbildbildern, (2) Schätzung der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) für jedes Neigungsbild und (3) Ausrichtung der vollständigen Neigungsserie.
    1. Nach der Ausrichtung rekonstruieren Sie dreidimensionale (3D) Tomogramme mithilfe des gewichteten Rückprojektionsalgorithmus. Erforderliche Eingaben für diesen Schritt umfassten: Rohbildframes, MDCol-Metadatendateien (die Kippreihen-Erfassungsparameter dokumentieren) und die vorgegebene Rotationsachse der Probe.
  2. Fehlende Keilkorrektur
    1. Nach der Rekonstruktion unterziehen Sie die erzeugten Tomogramme der fehlenden Keilkorrektur mit IsoNet34.
  3. Partikelauswahl und Kuratierung
    1. Führen Sie Partikelauswahl in EMAN 2.935 mit der Methode der Vorlagenabstimmung durch. Nach der automatisierten Auswahl wurden Fehlalarme (d. h. Nicht-Zielbereiche oder fehlerhaft ausgewählte Regionen) manuell ausgeschlossen, um die Qualität des ausgewählten Partikeldatensatzes sicherzustellen.
  4. Subtomogrammmittelung
    1. Importiere die Neigungsreihe und ihre entsprechenden Teilchenkoordinaten in RELION 4.0. Führen Sie Subtomogramm-Mittelung nach dem in der RELION 4.0 Dokumentation (https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/STA_tutorial/Introduction.html beschriebenen Standard-Workflow durch, der die Einhaltung etablierter Best Practices für Reproduzierbarkeit sicherstellt.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls ermöglicht die Herstellung hochwertiger, vitrifizierter Gewebelamellen und die anschließende Rekonstruktion von Tomogramme, die eine native zelluläre Ultrastruktur offenbaren. Die folgenden Ergebnisse, die mit Gewebe des Hippocampus der Maus demonstriert wurden, sind repräsentativ für ein erfolgreiches Experiment.

Gewebeblöcke, die durch Hochdruckgefrieren mit der "Waffel"-Methode verarbeitet wurden, zeigten ein ein...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der hier dargestellte Arbeitsablauf etabliert eine verallgemeinerte, optimierte und reproduzierbare Pipeline für die In-situ-Kryo-Elektronen-Tomographie nativer, dicker Gewebe. Ihr Hauptbeitrag liegt nicht in der Erfindung einzelner Techniken, sondern in der systematischen Integration, Verfeinerung und detaillierten Standardisierung des gesamten Prozesses – von der robusten Vitrifizierung mit einer modifizierten Waffel-HPF-Methode bis hin zu einem präzise kalibrierten Cryo-FIB-L...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken dem Personal des Cryo-EM Center der Southern University of Science and Technology für ihre technische Unterstützung. Dieses Projekt wurde von der National Science and Technology Innovation (Brain Science and Brain-like Intelligence Technology – National Science and Technology Major Project, Grant Nr. 2022ZD0211905) und der National Natural Science Foundation of China (Fördernr. 32200998 und Nr. 32161133022) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1-HexadecänSigma-AldrichH2131Chemikalien & Reagenzien
2-MethylpentanSigma-AldrichM65807Chemikalien & Reagenzien
Clip-RingThermo Fisher Scientific1131750; 1188953Verbrauchsgüter
KupferfolieFengcheng-Metallmaterialien1 & Mikro; m-DickeVerbrauchsgüter
Kupferunterstützung TEM-Gitter (100 Mesh)Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., LtdBZ10021bVerbrauchsgüter
Cryo-EMThermo Fisher ScientificKrios G4Ausrüstung 
Kryo-FIBThermo Fisher ScientificAquilos 2Ausrüstung 
Cryo-FIB AutogridThermo Fisher Scientific1205101Verbrauchsgüter
Gitter (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 Mesh)QuantifoilAltrAufoilVerbrauchsgüter
HochdruckgefrierschrankLeica MicrosystemsEM ICEAusrüstung 
HPF-Träger, KupferLeica MicrosystemsTyp B (6 mm)Verbrauchsgüter
Ionen-Sputter-BeschichterQuorumQ150RS plusAusrüstung 
Metallographische PolierpasteLab-testecW0.5Verbrauchsgüter
PoliertuchGORALB00809Verbrauchsgüter
SchleifpapierEagle Brand Sandpaper8000-Körnung, 12000-KörnungVerbrauchsgüter
StereomikroskopLeica MicrosystemsS9iEquipment 
SucroseSigma-Aldrich200-334-9Chemikalien & Reagenzien
Tilt-Series-Akquisitionssoftwarehttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/SerialEM 4.0.9Software
Tilt-Series Ausrichtung & Rekonstruktionssoftwarehttps://github.com/czimaginginstitute/AreTomo3 AreTomo 3Software
Tilt-Series-Akquisitionssoftwarehttps://github.com/eisfabian/PACEtomoPaceTomoSoftware
Tilt-Series Ausrichtung & Rekonstruktionssoftwarehttps://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNetIsoNetSoftware
Tilt-Series Ausrichtung & Rekonstruktionssoftwarehttps://github.com/cryoem/eman2EMAN2Software
Tilt-Series Ausrichtung & Rekonstruktionssoftwarehttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/index.htmlRelion 4Software

Referenzen

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