Quantifizierung von Veränderungen der Bifidobakterien- und Lactobacilli-Koloniebildungseinheiten während der Rifaximin-Behandlung und des synbiotischen Gels bei gesunden Freiwilligen

Summary

Diese klinische Studie bewertete die Anzahl von Bifidobakterien und Lactobacillen nach einer Woche Rifaximin-Behandlung sowie ein synbiotisches Gel, bestehend aus Lactobacillus acidophilus NCFM und Bifidobacterium lactis Bi07, mit Agave-Inulin, während der Rifaximin-Behandlung und 4 Wochen danach im Vergleich zu einem Placebo-Gel, was zeigte, dass das synbiotische Gel helfen kann, Laktobacillen und Bifidobakterien zu erhalten.

Abstract

Obwohl die Darmmikrobiota im Allgemeinen stabil ist, kann sie durch eine antibiotische Behandlung beeinflusst werden. Rifaximin, das zur Behandlung von gastrointestinalen Erkrankungen eingesetzt wird, wird häufig zusammen mit Probiotika verabreicht, um das Risiko einer Dysbiose zu senken. Lactobacillus acidophilus interagiert mit Darmzellen und verwendet präbiotische Verbindungen. Bifidobacteria, insbesondere Bifidobacterium infantis ssp. lactis Bi07, ist ein Probiotikum, das mit positiven Effekten im Darm in Verbindung gebracht wird. In-vitro-Studien haben die Überlegenheit von Agavefruktanen gegenüber Chichorie-Inulin gezeigt. Keine Studien haben Veränderungen der Laktobacillen- und Bifidobakterienzahlen nach der gleichzeitigen Verabreichung von Rifaximin und Synbiotikum dokumentiert. Unser Ziel war es, Veränderungen der CFU-Werte von Darmbifidobakterien und Laktobacillen bei gesunden Freiwilligen nach Einnahme von Synbiotic Gel, das Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07 und Agaveinulin als Präbiotikum enthält, während einer Woche Rifaximinbehandlung und für 4 Wochen danach zu bewerten. In einer randomisierten, placebokontrollierten, doppelblinden klinischen Studie wurden gesunde Teilnehmer ohne antimikrobielle Behandlung im Vormonat 1:1 in zwei Gruppen randomisiert (10 Teilnehmer pro Gruppe). Die Synbiotic Gel-Gruppe erhielt 10,32 g Agaveninulin als Präbiotikum und 4 × 10⁹ CFU/g Lactobacillus acidophilus NCFM sowie 4 × 10⁹ CFU/g Bifidobacterium lactis Bi07 pro Tag für 5 Wochen und 200 mg Rifaximin zweimal täglich in der ersten Woche. Die Placebo-Gel-Gruppe erhielt 5 Wochen lang Placebogel und 200 mg Rifaximin zweimal täglich in der ersten Woche. Bakterielle Veränderungen wurden durch die Quantifizierung der CFU durch mikrobiologische Beurteilung des Stuhls geschätzt. Fünf Wochen später änderten sich die Laktobacillen- und Bifidobakterienpopulationen nicht. Der Nachweis von Lactobacillus acidophilus NCFM und Bifidobacterium lactis Bi07 in einigen Stuhlproben deutet auf vorübergehende und teilweise Besiedlung hin, was die Notwendigkeit von Dosis-Wirkungs-Studien mit diesem synbiotischen Produkt unterstreicht.

Introduction

Die menschliche Darmmikrobiota ist eine dicht besiedelte Gemeinschaft, zu der dauerhaft vorhandene einheimische Arten und andere vorübergehende Mikroorganismen gehören. Obwohl seine Zusammensetzung von Person zu Person variieren kann, gilt sie im Allgemeinen als stabil. Allerdings kann es durch Alter, Infektion und Antibiotikabehandlung ^beeinflusst werden^. Rifaximin, ein breitbandiges Antibiotikum mit geringer Darmaufnahme, wird zur Behandlung von Darmerkrankungen eingesetzt und kann die Mikrobiota verändern. Probiotische Bakterien aus den Gattungen Lactobacillus und Bifidobacterium werden verwendet, um^{diese Effekte} abzumildern.

Stämme von Bifidobacterium spp. wurden als rifaximinresistent² berichtet, was einen interessanten Effekt hat, eine Darmbiota zu fördern, die ausreichend viele Bifidobacterium-Arten enthält, um positive probiotische Effekte zu ermöglichen.

Darüber hinaus ist Lactobacillus acidophilus weithin für seine Fähigkeit bekannt, mit dem gastrointestinalen Epithel⁴ zu interagieren, und seine Fähigkeit, Präbiotika wie Polysaccharide, Oligosaccharide und Fructooligosaccharide zu nutzen. Allerdings wurden nur wenige probiotische Stämme, wie der Lactobacillus acidophilus North Carolina Food Microbiology (NCFM)-Stamm, identifiziert. Daher ist es wichtig, ihre in-vivo-Effekte zu untersuchen, ebenso wie das Vorhandensein von Bifidobacterium lactis Bi07 im Magen-Darm-Trakt, was mit verschiedenen gesundheitsfördernden Vorteilen in Verbindung gebracht wurde ^2,5. Diese Probiotika benötigen ein Präbiotikum, um optimal zu wachsen, weshalb ein Synbiotikum, das sowohl ein Probiotikum als auch ein Präbiotikum enthält, synergistisch wirkt; das heißt, seine positive Wirkung ist höher als die des Probiotikums allein. Zusammen mit Präbiotika, die als Substrat für Probiotika dienen, wird erwartet, dass diese Symbiose das Überleben probiotischer Mikroorganismen im Magen-Darm-Trakt verbessert und zu einer stärkeren Wiederherstellung der Mikrobiota⁶ führt.

Eine wichtige Quelle für Präbiotika sind Agavefruktane, bei denen berichtet wurde, dass sie in vitro bessere Effekte auf die Mikrobiota haben als die der Chichorewurzel (Cichorium intybus L.).⁷. Studien haben die Auswirkungen des Probiotikakonsums gemeldet; so untersuchten beispielsweise Engelbrektson et al., ob der Konsum von Probiotika während und nach der Antibiotikaverabreichung die^{durch Antibiotika} verursachten Veränderungen in der Mikrobiota verringern könnte. Sie stellten fest, dass die Gruppe, die die Probiotikum-Mischung erhielt, eine schnellere Erholung der normalen Mikrobiota zeigte als diejenigen ohne diese⁸. Darüber hinaus untersuchten Koning et al. die Dysbiose in der Darmmikrobiota von 40 gesunden Freiwilligen, die mit 500 mg Amoxicillin zweimal täglich für 7 Tage behandelt wurden, sowie die mögliche Genesung der Mikrobiota nach Einnahme einer probiotischen Mischung. Die Ergebnisse zeigten, dass die Amoxicillin-Behandlung die Zusammensetzung der natürlichen Mikrobiota beeinflusste. Wenn eine probiotische Mischung verabreicht wurde, erholte sich die Mikrobiota nach zwei Monaten Einnahme^signifikant.

Die Literatur berichtet jedoch, dass keine Studien die Wirkung der synbiotischen Aufnahme (mit Agavefruktanen als Präbiotikum) auf die Darmmikrobiota während und nach der Verabreichung von Antibiotika, wie etwa Rifaximin, untersucht haben; Wir fanden nur Studien mit Probiotika. Daher bewertete diese Studie Veränderungen der CFU-Werte von Darm-Bifidobakterien und Laktobacillen bei gesunden Freiwilligen nach der Einnahme von Synbiotic Gel, das Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07 und Agaveinulin als Präbiotikum enthält, während einer Woche Rifaximin-Behandlung und für 4 Wochen danach.

Protocol

Das Protokoll wurde vom Institutionellen Ausschuss für biomedizinische Forschung am Menschen (CIIBH) des Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubiran (INCMNSZ) genehmigt (REFERENZ 1734). Alle Teilnehmer gaben vor der Aufnahme in diese Studie eine informierte Einwilligung ab.

Studiendesign und Population

Dies war eine randomisierte, placebokontrollierte, doppelblinde klinische Studie mit einer 5-wöchigen Nachbeobachtungsphase. Die Mitarbeiter des INCMNSZ wurden eingeladen, an der Studie teilzunehmen, und gesunde Freiwillige im Alter von 20–50 Jahren ohne antimikrobielle Behandlung im Vormonat, die das informierte Einwilligungsformular akzeptierten und unterschrieben, wurden zwischen 2011 und 2012 eingeschlossen. Die Studienpersonen wurden 1:1 in die Synbiotic Gel-Gruppe randomisiert: 10,32 g Agaveninulin als Präbiotikum und 4 × 10⁹ CFU/g Lactobacillus acidophilus NCFM sowie 4 × 10⁹ CFU/g Bifidobacterium lactis Bi07 pro Tag, enthalten in 4 Säckchen für 5 Wochen, und 200 mg Rifaximin zweimal täglich in der ersten Woche. Die Placebo-Gel-Gruppe erhielt 4 Packungen mit je 15 g Placebo-Gel für 5 Wochen mit derselben Präsentation und sensorischen Eigenschaften wie das synbiotische Gel sowie 200 mg Rifaximin zweimal täglich in der ersten Woche (Abbildung 1).

Klinische Bewertung

In beiden Studiengruppen wurden Symptome und Stuhlerscheinung mit der Bristol-Skala bewertet. Gewicht, Körpergröße und Body-Mass-Index (BMI) wurden ebenfalls gemessen. Ein Tagebuch wurde verwendet, um den Konsum von synbiotischem Gel, Placebo-Gel und Rifaximin zu bewerten und das Vorhandensein oder Fehlen von Nebenwirkungen im Zusammenhang mit der Gelaufnahme zu dokumentieren.

Ballaststoffverbrauch

Die Ballaststoffaufnahme wurde in beiden Gruppen anhand eines Ernährungstagebuchs und eines 24-Stunden-Rückrufs pro Woche bewertet.

Therapietreue

Die Einhaltung des Konsums von Rifaximin und Gelen wurde durch Zählung der Anzahl der Rifaximin-Dosen sowie der Anzahl der pro Teilnehmer konsumierten Beutel synbiotischer und Placebo-Gele bewertet. Das Vorhandensein von Lactobacillus acidophilus und Bifidobacterium lactis wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nachgewiesen.

Mikrobiologische Bewertung von Fäkalien

Bei Besuch 0 und wöchentlich für 5 (6 Besuche) in jeder Gruppe wurden die Zahlen von Lactobacilli, Bifidobacteria und Enterobacteria in 120 Stuhlproben mittels Plattenzählung bewertet. Diese Methode misst koloniebildende Einheiten (CFU), indem verdünnte Proben auf spezialisierte Festmediums¹⁰ gelegt werden. Zu Beginn jedes Besuchs wurden Stuhlproben entnommen.

Zur Identifizierung von Mikroorganismen wurden Stuhlproben entnommen und in BBL-Röhrchen aufbewahrt. Das PBG-Fläschchen wurde für anaerobe Bakterien verwendet, und Kotproben wurden in einem Styroporkühler mit gefrorenen Gelpackungen transportiert, um vor der Verarbeitung im Labor eine niedrige Temperatur zu halten. Der Deckel des PBG-Fläschchens für die Koprokultur wurde entfernt, und die Stuhlprobe wurde mit einem Abstrich entnommen, um sicherzustellen, dass der Abstrich mit der Probe imprägniert wurde. Der Applikator wurde dann in ein Rohr mit einem festen Kulturmedium eingesetzt.

Bei anaeroben Bakterien wurden die Fläschchen gewogen, und 5–10 g Stuhl wurden mit einem Löffel gesammelt. Der Stuhl wurde dann mit dem Inhalt des Fläschchens vermischt und fest versiegelt. Für die Probenverarbeitung wurden die Fläschchen mit den Proben und sterilen Stomacher-Beuteln gewogen. Die Probe wurde in einen Beutel entleert, 60 Sekunden zentrifugiert, und anschließend wurden 4,5 ml 0,1% Peptonwasser hinzugefügt. Anschließend wurden 500 μL der Probe in ein Fläschchen übertragen und vortexiert, um die Mischung zu homogenisieren. Nachdem 100 μL der Probe doppelt auf jede Platte des spezifischen selektiven Mediums impfiert wurden: Man Rogosa Sharpe (MRS) Medium für Lactobacillen und DP Beerens Medium mit Cystein + Cycloheximid (zur Beseitigung unerwünschter Flora) für Bifidobakterien, bis zu Verdünnung 8 (Verdünnungsfaktor 0,1 mL). Für Enterobakterien wurde das MacConkey-Medium bei Verdünnungen 5–8 (Verdünnungsfaktor 0,1 mL) verwendet, wobei Bakterienkolonien getrennt und quantifiziert^{wurden 11}. Jedes Mediumpulver wurde in gereinigtem destilliertem Wasser gelöst, die Lösung wurde bis zum Kochen erhitzt, um eine vollständige Auflösung zu gewährleisten, und es wurde 15 Minuten lang in einem Autoklaven bei 121 °C sterilisiert. Die Mischung wurde auf 46,5 °C abgekühlt, um die Gussformtechnik durchzuführen, wobei pro Platte 1 ml doppelt in sterile Petrischalen mit 15–20 ml Kulturmedium gegossen und die Platten erstarren konnten. Die impfierten Proben wurden bei 37 °C in einer CO2-angereicherten Atmosphäre in anaeroben GasPak-Systemen inkubiert, um 24–48 Stunden anaerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten. Die koloniebildenden Einheiten (CFU) wurden mit einem Stift markiert und^{mit 12} gezählt. Folgende Formel wurde angewandt:

CFU/mL = (Anzahl der Kolonien × Gesamtverdünnungsfaktor)/Volumen der verplattenten Kultur (mL)

Identifikation morphologischer Merkmale von Lactobacillen und Bifidobakterien

Gramfärbe wurde verwendet, um die morphologischen Merkmale des Exemplars zu identifizieren. Eine Probe von Bakterienkolonien aus jedem Stamm wurde auf einen Objektträger gelegt, 1 Minute mit Kristallviolett gefärbt und anschließend mit destilliertem Wasser abgespült. Eine Jodlösung wurde 1 Minute lang aufgetragen und dann mit destilliertem Wasser abgespült. Eine Alkohol-Aceton-Lösung wurde 10 Sekunden lang als Entfärber verwendet und mit destilliertem Wasser abgespült. Abschließend wurde Safran als Gegenfleck für 1 Minute aufgetragen und mit destilliertem Wasser abgespült. Die Objektträger des Mikroskops wurden unter einem optischen Mikroskop mit Immersionsöl und einem 100-fachen Objektiv beobachtet.

Die Gesamtquantifizierung erfolgte mittels konventioneller Polymerase-Kettenreaktion (PCR) an zufällig ausgewählten Fäkalproben von fünf Probanden pro Gruppe, wobei insgesamt 60 Proben über 5 Wochen erhalten wurden. Isolate aus Kulturmedien wurden zur Gewinnung von genetischem Material verarbeitet. Die PCR wurde mit universellen bakteriellen Primern durchgeführt, um ein Fragment des 16S-rRNA-Gens¹³ zu amplifizieren. PCR-Produkte wurden gereinigt und sequenziert. Die Sequenzen wurden verifiziert und in die GenBank-Datenbank eingereicht, um das Vorhandensein von Lactobacillus- und Bifidobakteriellenstämmen, die aus den Fäkalproben isoliert wurden, zu bestätigen.

Statistische Analyse

Die Daten werden als absolute und relative Frequenzen oder Median (p25–P75) dargestellt. Die kumulative Schwere der Symptome wurde anhand des Likert-Scores (mild 1; moderat 2; schwer 3) bei jeder Nachuntersuchung bestimmt. Intergruppenvergleiche wurden mit dem Wilcoxon-Rangsummentest und dem Chi-Quadrat- oder Fisher-Exakten Test durchgeführt. Intragruppenvergleiche zwischen Woche 0 und 5 wurden mit dem Friedman-Test und mehreren Vergleichen mit Durbin-Conover durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde auf P < 0,05 gesetzt.

Results

Zwanzig gesunde Freiwillige wurden zufällig in die Synbiotische Gel-Gruppe (n = 10) und die Placebo-Gel-Gruppe (n = 10) eingeteilt (Abbildung 2 und Tabelle 1). In der Synbiotic Gel-Gruppe waren sieben Männer und drei Frauen, mit einem Medianalter von 31 Jahren (Bereich 27–35 Jahre); in der Placebo-Gel-Gruppe waren drei Männer und sieben Frauen, mit einem Medianalter von 33 Jahren (Bereich 28–38 Jahre). Die Gruppen waren in A...

Discussion

In der vorliegenden Studie fanden wir eine signifikante Reduktion der enterobakteriellen Zahlen in den Fäkalproben der Placebo-Gruppe ab der ersten Interventionswoche und bei Probanden der Synbiotic-Gel-Gruppe in der ersten und zweiten Woche. Diese Veränderung lässt sich mit Rifaximin erklären, das als Minderung pathogener bakterieller Überwuchs^{beschrieben wurde 14}. In unserer Studie zeigte die Synbiotic Gel-Gruppe nach Rifaximin einen positiven Effekt: Die median...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BBL-Röhre	NA	NA	Jede Marke kann verwendet werden
DP Medium	NA	NA	Jede Marke kann verwendet werden
Gefrorene Gelpackungen
MacConkey-Medium	NA	NA
MRS Medium	NA	NA	Jede Marke kann verwendet werden
PBG-Fläschchen			Phosphatpuffer, Gelatine, Salze enthalten 0,05 % Cystein als Reduktionsmittel für 02
Petrischalen
Placebo-Mischung	KuragoBiotek-BabyCat.	NA	Gleiche physikalische und sensorische Eigenschaften wie das symiotische Gel, jedoch ohne die Wirkstoffe
Styropor-Continer
Symbiotische Mischung	KuragoBiotek-BabyCat.	NA	Milchfreies Produkt, bestehend aus Lactobacillus acidophilus NCMF und Bifidobacterium infantis Bi-07 (2 x 109  CFU/g) und 17,2 g Agaveninulin als Präbiotikum in einer Packung von 15 g