Ein Protokoll zur größenbasierten Anreicherung von Lipidtröpfchen aus rinderlichen Milchepithelzellen und Milchgeweben

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine größenbasierte Trennung und Anreicherung von Lipidtröpfchen durch sequentielle Zentrifugation zu erreichen, was eine genaue, reproduzierbare Untersuchung der Lipidstoffwechselmechanismen und lipidtröpfchenassoziierter biologischer Prozesse ermöglicht.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen sequentiellen differentiellen Zentrifugationsansatz zur Anreicherung von Lipidtröpfchen (LDs) unterschiedlicher Größe aus rinderlichen Mammariatepithelzellen (BMECs) und Milchgeweben, wodurch eine größenaufgelöste Analyse jenseits herkömmlicher Bulk-LD-Isolationsmethoden möglich ist. Als dynamische regulatorische Hubs des intrazellulären Lipidstoffwechsels erfüllen LDs entscheidende Funktionen, indem sie neutrale Lipide (wie Triglyzeride und Cholesterylester) speichern und deren Synthese, Hydrolyse und Transport koordinieren. Sie spielen eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Energiehomöostase, unterstützen die Membranbiogenese und erleichtern die Übertragung zellulärer Signale. Die LD-Extraktion ist unerlässlich, um die regulatorischen Mechanismen des Lipidstoffwechsels zu untersuchen. Die Untersuchung des Lipidstoffwechsels der Milchdrüse hat bedeutende Auswirkungen auf die Entwicklung von Säuglingen, die menschliche Gesundheit, die Agrarökonomie und die fundamentale Zellbiologie. Daher beschreiben wir eine differenzielle Zentrifugationsmethode zur Gewinnung von LDs aus BMECs und Milchdrüsengewebe. Im Gegensatz zu herkömmlichen Massen-LD-Isolationsansätzen ermöglicht dieses Protokoll eine größenbasierte Anreicherung von LD-Subpopulationen durch sequentielle Anpassung der Zentrifugalkräfte. Die Integrität und relative Anreicherung der LD-Fraktionen werden vorläufig mittels BODIPY493/503-Färbung bewertet, was einen praktischen und reproduzierbaren Ansatz für nachgelagerte Analysen des Lipidstoffwechsels und LD-assoziierter Prozesse bietet.

Einleitung

Lipidtröpfchen (LDs) sind dynamische Organellen in Zellen, die als primäre Speicherplätze für^neutrale Lipide dienen. Eine abnormale Anhäufung von LDs ist mit einer Vielzahl von Krankheiten verbunden, die über die Fettleibigkeit hinausgehen und Erkrankungen wie Fettleber², Herz-Kreislauf-Erkrankungen³, Diabetes⁴ und Krebs⁵ umfassen. Umgekehrt kann eine unzureichende Anzahl von LDs auch schwerwiegende Folgen haben, was zum Verlust zellulärer Energiereserven und daraus resultierenden funktionellen Beeinträchtigungen^führt. Im Kontext der Agrarökonomie können unzureichende LDs bei Wiederkäuern zu einer unzureichenden Milchfettsekretion führen, was zu einer Fettdepression der Milch führt, die wiederum den Nährwert und die Vermarktbarkeit von Milchprodukten beeinträchtigt⁷. Derzeit hat sich die Regulation des LD-Stoffwechsels als bedeutendes Forschungsgebiet etabliert.

Die Entwicklung von Extraktionstechniken für LDs seit dem 20. Jahrhundert zielte stets darauf ab, LDs in größeren Mengen, mit höherer Reinheit und besser erhaltener biologischer Aktivität zu extrahieren. Dies beinhaltet die kontinuierliche Etablierung und Optimierung von Methoden. Derzeit haben mehrere Unternehmen kommerzielle Bausätze für LD Separation⁸ entwickelt. Obwohl diese Kits die Trennzeit erheblich verkürzen und nur den Einsatz herkömmlicher Zentrifugen erfordern, kann das Reagenz für schwer dissoziierbare Proben nicht angepasst werden, und es ist schwierig, die Testschritte zu optimieren. Darüber hinaus spielt die Extraktion von LDs eine unverzichtbare Rolle bei der Aufklärung von Krankheitsmechanismen, einschließlich solcher von Stoffwechselerkrankungen wie Fettleber⁹, Krebs¹⁰ und neurodegenerativen^{Erkrankungen 11}, und dient als multidimensionale Sonde zur Entschlüsselung pathologischer Signalwege. Die Protein- und Lipidzusammensetzungen können ebenfalls durch Extraktion von LDs zerlegt werden, um die Vielfalt der biologischen Funktionen von LDs aufzuzeigen¹².

Die Bildung von Milchfett ist nicht nur ein Prozess des Substratabbaus; vielmehr stellt sie einen hoch orchestrierten Lipidsynthese- und Verpackungsprozess dar, der von Milchepithelzellen durchgeführt wird. ¹³. Die Bildung von Milchfett bei Milchkühen beruht auf dem Sekretionsmechanismus der apikalen Membran dieser Zellen: Triglyzeride, die im endoplasmatischen Retikulum synthetisiert werden, bilden zytoplasmatische LDs, die dann zur apikalen Membran transportiert und durch Knospung ausgeschieden werden. Während dieses Prozesses werden LDs von einer Milchfettkugel-Membran umhüllt, die von der apikalen Membran abgeleitet ist, was zur Bildung strukturell stabiler^{Milchfett-Globus 14} führt. Die Rinderbänderdrüse dient als klassisches Modell zur Untersuchung der Laktation bei Säugetieren, und die Kernmechanismen, die die LD-Synthese und -sekretion steuern, sind beim Menschen hoch konserviert¹⁵. Die Entwicklung von Methoden zur Gewinnung von LDs sowohl aus BMECs als auch aus Milchgewebe kann die Viehproduktion und die menschliche Gesundheit verbinden. Proteom- und lipidomische Analysen der extrahierten LDs können anschließend genutzt werden, um die Milchleistung und -qualität zu verbessern und so Sicherheit und Schutz zu gewährleisten.

Die vorliegende Methode basiert hauptsächlich auf der niedrigen Dichte-Eigenschaft von LDs, die dazu führt, dass sie während der Zentrifugation¹⁶ an die Spitze des Gradienten schweben. Das Extraktionsverfahren besteht aus drei Hauptschritten: Probenentnahme, Ultrazentrifugation für LD-Flotation und LD-Wasch. Sukrose (2,5 m) wird dem Puffer zugesetzt, um die LDs zu schützen; die Zentrifugationsgeschwindigkeit wird dann entsprechend den experimentellen Anforderungen angepasst; typischerweise können große LDs bei Kräften unter 10.000 x g angereichert werden, während höhere Geschwindigkeiten (über 10.000 x g) verwendet werden, um kleine LDs zu extrahieren, da größere LDs unter diesen Bedingungen platzen können. Abschließend werden die extrahierten LDs mehrfach gewaschen, um eine Kontamination zu verhindern, und die Reinheit der Extraktion wird vorläufig mittels BODIPY493/503-Färbung bewertet.

Konventionelle LD-Isolationsmethoden erreichen in erster Linie die Massenerholung heterogener LD-Populationen, was die Analyse größenabhängiger struktureller und funktioneller Unterschiede einschränkt. Das vorliegende Protokoll erweitert Standardansätze, indem es eine größenbasierte Anreicherung von LD-Subpopulationen durch sequentielle differentielle Zentrifugation ermöglicht und so die Untersuchung von LD-Wachstum, Fluktuation, intrazellulärem Transport und differenzierter Nutzung durch lipolytische oder autophagische Signalwege erleichtert. Dieser Ansatz erreicht Anreicherung statt absoluter Reinigung, und es kann aufgrund kontinuierlicher Größenverteilungen und gemeinsamer physikalischer Eigenschaften teilweise Überschneidungen zwischen Größenanteilen auftreten.

Protokoll

Bestimmung der Ziel-Lipidtröpfchengröße für die Anreicherung (Abbildung 1).

1. Aufbau des Reagens

1. PBS: Gewicht 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 3,58 g Na₂HPO₄·12H₂O und 0,24 g KH₂PO₄ in 800 mL ddH₂O. Den pH-Wert mit HCl auf 7,4 einstellen, gründlich mischen und das Volumen auf 1 L bringen. Nach dem Autoklavieren bis zu 1 Jahr bei 4 °C aufbewahren.
2. Saccharose (2,5 m): 856 g Saccharose abwägen und in 400 ml ddH₂O auflösen. Gründlich umrühren, bis die Saccharose vollständig gelöst ist, dann das Volumen auf 1 l anpassen. Die Lösung autoklavieren und bis zu 3 Monate bei 4 °C lagern.
3. Puffer A: Wiege 1,79 g Tricin und löse es in 400 mL ddH₂O. Stelle den pH-Wert mit KOH auf 7,8 an. Nach der pH-Anpassung fügen Sie 50 ml vorgefertigte 2,5 m Saccharoselösung hinzu. Mische gründlich und stelle die Lautstärke auf 500 mL ein. Nach dem Autoklavieren kann der Puffer bis zu 3 Monate bei 4 °C gelagert werden.
4. Puffer B: Gewicht 0,95 g HEPES, 1,49 g KCl und 0,038 g MgCl₂·6H₂O separat in 180 mL ddH₂O. PH mit KOH auf 7,4 einstellen, gründlich mischen und die Lautstärke auf 200 mL erhöhen. Nach dem Autoklavieren bis zu 3 Monate bei 4 °C lagern.
5. PMSF (1.000x, 0,2 m): Wiege 0,175 g PMSF und löse es in 5 mL DMSO. Lagern Sie bis zu einem Jahr vor Lichtschutz bei -20 °C geschützt.
   HINWEIS: PMSF ist hochgradig toxisch; Angemessene Schutzmaßnahmen müssen ergriffen werden. Während der Vorbereitung sollte vollständiger Schutz vor Licht gewährleistet sein; PMSF ist schwer aufzulösen und kann in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren aliquotiert werden.

2. Extraktion von LDs aus Zellen

1. BMEC-Kultur
   1. Entnehmen Sie fünf Röhren mit gefrorenen BMEC-Zellen aus dem -80 °C Kühlschrank und tauen Sie sie schnell in einem 37 °C Wasserbad auf. Zentrifugieren Sie die Röhren bei 250 x g für 4 Minuten und 30 Sekunden nach vollständigem Auftauen.
   2. Entsorge das Kryokonservierungsmedium mit einem Pipettor, gib 1 ml 10 % FBS hinzu, um die Zellen wieder zu suspendieren, vermische die Zellen und gib die Zellen vorsichtig in eine 100 mm große Zellkulturschale mit 6 ml 10 % FBS. Wiege die Schale vorsichtig, um eine gleichmäßige Zellverteilung sicherzustellen, und inkubiere bei 37 °C mit 5 % CO₂.
   3. Überwachen Sie die Zellmorphologie unter dem Mikroskop und führen Sie Subkultivierung durch, wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreichen.
      HINWEIS: Gewährleisten Sie vor der LD-Extraktion einen optimalen Zellzustand und eine ausreichende Zellanzahl, um Ertrag und Reproduzierbarkeit zu verbessern.
   4. Entsorgen Sie das ursprüngliche Kulturmedium in der Petrischale mit einer Pipette und fügen Sie 1 ml PBS an die Wand jeder Schale hinzu. Nach zweimaligem Waschen geben Sie 1 ml Trypsin zu jedem Gericht und inkubieren Sie bei 37 °C für 3 Minuten 30 Sekunden.
   5. Beobachten Sie, ob die Zellen unter dem Mikroskop vollständig verdaut sind, fügen Sie 1 ml 10 % FBS hinzu, um die Verdauung nach Abschluss der Verdauung zu beenden. Die Zellen vorsichtig durch Pipettieren wieder aufhängen, in ein 2-mL Mikrozentrifugenrohr übertragen und bei 250 x g für 4 Minuten 30 Sekunden zentrifugieren.
   6. Entsorgen Sie den Supernatant und wiederholen Sie die in Schritt 1.2 beschriebenen Verfahren.
   7. Erweitern Sie die Zellen mit etwa 30 Kulturschalen oder größeren Kulturgefäßen oder verwenden Sie größere Kulturschalen für die Zellkultur. Fügen Sie 150 μmol/L t10,c12-CLA (verdünnt in DMEM) zur Behandlung der Zellen in der Nacht vor der Extraktion hinzu. Verwenden Sie 7 ml Kulturmedium pro 100 mm Kulturschale. Die Kulturzeit hängt von der Größe der LDs ab, die getrennt werden müssen.
      HINWEIS: Basierend auf vorheriger Optimierung werden BMECs 6 Stunden lang mit t10,c12-CLA behandelt, um große LDs zu bereichern, oder 12–24 Stunden, um kleine LDs zu bereichern. Da Zellen nur wenige LDs enthalten, werden exogene Fettsäuren üblicherweise hinzugefügt, um die Ansammlung von LDs zu induzieren. In dieser Studie wird T10,c12-CLA zu kultivierten Zellen hinzugefügt, um die Ansammlung von LDs zu induzieren.
2. Probenentnahme
   1. Das Originalmedium entsorgen, 1 ml eiskaltes PBS hinzufügen und dreimal waschen. Werfen Sie PBS während der Endwäsche nicht weg. Nehmen wir 30 Schüsseln mit 100-mm-Zellen als Beispiel und sammeln Zellen von jeweils 10 Platten in einem 15-mL-Zentrifugenrohr; jede Röhre enthält etwa 1x108, was insgesamt 3 Zentrifugenröhren ergibt.
      HINWEIS: Halten Sie alle Proben während des gesamten Extraktionsprozesses bei ≤4 °C, um den Proteinabbau in LDs zu verhindern.
   2. Nach dem Ausgleich zentrifugieren Sie bei 1.000 x g, 4 °C für 10 Minuten.
   3. Verwerfen Sie das PBS. Fügen Sie 10 ml vorgefertigten Puffer A und 10 μL PMSF (1.000x, 0,2 M) in das Zentrifugenrohr hinzu. Gründlich mischen und 20 Minuten auf Eis ausbrüten.
3. Zelllyse und anfängliche Fraktionierung
   1. Störe die Zellen mit einem sondartigen Ultraschallhomogenisierer, der in gepulsten Zyklen von 5 s AN und 10 s AUS betrieben wird, was zu einer effektiven Gesamtsonikationszeit von 10 Minuten über einen Zeitraum von 30 Minuten führt. Stellen Sie das Instrument mit einer Sondensonde mit 3 mm Durchmesser auf 40 % Leistung ein (entsprechend einer Sondenamplitude von etwa 76 μm).
      HINWEIS: Bewahren Sie Proben während des gesamten Eingriffs auf Eis auf, um Überhitzung zu vermeiden.
   2. Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 3.000 x g und 4 °C für 10 Minuten, um Kerne und Zellreste zu entfernen. Sammeln Sie das Supernatant als postnukleares Supernatant (PNS).
4. Ultrazentrifugation schwebender LDs
   1. Filtern Sie das Supernatant durch ein 100 μm Zellsieb.
   2. Pipettieren Sie 10 ml PNS in ein 15 mL Zentrifugenrohr. Fügen Sie 2 ml Saccharose (2,5 m) und 2 ml Puffer B nacheinander an den oberen Rand des PNS hinzu (das Saccharosevolumen kann entsprechend reduziert werden, während das Volumen des Puffers B erhöht wird, um die LD-Reinheit zu erhöhen), und dann zum ersten Mal zentrifugieren (5.000 x g, 4 °C, 20 min).
   3. Nach der Zentrifugation sammeln Sie die milchige, cremeartige LD-Schicht am oberen Rand des Röhrchens auf. Um LDs zu sammeln, geben Sie zunächst 100 μL Puffer B in ein 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr und verwenden Sie dann eine 20 μL Pipette, um die schwebende LD-Schicht mehrfach sanft zu aspirieren und so viele LDs wie möglich zu sammeln.
      HINWEIS: LDs bilden oben eine schwebende cremefarbene Schicht; Vermeiden Sie es, die darunterliegende Lösung so weit wie möglich zu aspirieren, um eine Verunreinigung zu vermeiden.
   4. Führen Sie eine zweite Zentrifugation durch (10.000 x g, 4 °C, 30 min) und sammeln Sie die LDs.
   5. Übertragen Sie die Lösung in ein Ultrazentrifugenrohr, das mit einem Schwingschaufelrotor kompatibel ist, schließen Sie es ab und balancieren Sie die Röhren. Führen Sie die dritte Zentrifugation in einer Ultrazentrifuge durch (50.000 x g, 4 °C, 40 min) und sammeln Sie die LDs.
      HINWEIS: Präzise ausbalancieren Sie die Röhren (auf 0,0001 g), um einen sicheren Betrieb der Ultrazentrifuge zu gewährleisten.
   6. Nach dem Balancieren führen Sie die vierte Zentrifugation durch (150.000 x g, 4 °C, 50 min), um die LDs weiter zu sammeln. Optimieren Sie Geschwindigkeit und Dauer entsprechend der Zielgröße der LD.
      HINWEIS: Langanhaltende oder wiederholte Hochgeschwindigkeitszentrifugation kann LDs stören. Im Gegensatz dazu entfernt eine kurzzeitige Zentrifugation bei 10.000 x g während der Waschphase hauptsächlich Verunreinigungen und hat minimale Auswirkungen auf die LD-Integrität. Diese Methode ist anpassungsfähig; Optimierung kann für verschiedene Zelltypen oder Gewebe erforderlich sein.
5. Waschen LDs
   1. Die gesammelten LDs werden in kaltem Puffer B wieder suspendiert und bei 10.000 x g und 4 °C für 5 Minuten zentrifugiert.
   2. Entfernen Sie vorsichtig das Überlagerungsmittel und wiederholen Sie den Waschschritt mindestens viermal mit demselben Puffervolumen, der Zentrifugalkraft und der Zentrifugationszeit. Bei kleinen LDs sollte die Zentrifugalkraft bei Bedarf erhöht werden, um eine effiziente Trennung zu gewährleisten.
   3. Nach dem letzten Waschen werden die LD-Fraktionen zusammengemischt, sanft vermischt und bei −80 °C gelagert.
      HINWEIS: Lassen Sie keine Waschschritte aus, auch wenn ein gewisser Verlust der LD unvermeidlich ist. Spülen Sie weiter, bis keine sichtbaren Membranreste mehr übrig sind.

3. Extraktion von LDs aus dem Gewebe

1. Probenentnahme
   1. Entnahme von Rindermilchgewebeproben aus flüssigem Stickstoff. Wiege 5 g Gewebe ab und taue es auf Eis, bis keine Eiskristalle mehr übrig sind.
   2. Spülen Sie das Gewebe mit PBS oder physiotherapeutischer Kochsalzlösung ab.
   3. Zerkleinern Sie das Gewebe mit einer chirurgischen Schere in 1–2 mm Stücke.
   4. Das gehackte Gewebe wird in einen vorgekühlten Mörser mit 12 ml Puffer A und 10 μL PMSF (1.000x, 0,2 m) übertragen. Mahlen Sie die Mischung etwa 10 Minuten auf Eis.
   5. Inkubiere das Homogenat 20 Minuten auf Eis.
   6. Nach gründlichem Mahlen wird das Homogenat in ein 15-mL-Zentrifugenrohr aufgenommen.
   7. Zentrifugiere bei 2.500 x g, 4 °C für 10 Minuten. Das resultierende Supernatant ist PNS.
2. Ultrazentrifugation schwebender LDs
   1. Filtern Sie das Supernatant durch ein 100 μm Zellsieb.
   2. Pipettieren Sie 10 ml PNS in ein 15 mL Zentrifugenrohr. Füge 2 ml Saccharose und 2 ml Buffer B nacheinander hinzu. Durchführung der ersten Zentrifugation (4.000 x g, 4 °C, 20 min). Sammle das milchige, cremeartige Material.
   3. Führen Sie eine zweite Zentrifugation durch (7.000 x g, 4 °C, 30 Min) und sammeln Sie die LDs.
   4. Führen Sie eine dritte Zentrifugation durch (10.000 x g, 4 °C, 40 min) und sammeln Sie die LDs.
   5. Übertragen Sie den Überstand in ein SW40-Rohr und führen Sie Ultrazentrifugation durch (50.000 x g, 4 °C, 50 min). Sammle die LDs.
   6. Führen Sie eine fünfte Zentrifugation durch (100.000 x g, 4 °C, 60 min). Sammle die LDs.
3. Waschen LDs
   Siehe die Waschmethode für zellextrahierte LDs.

4. Vorläufige Validierung der LD-Reinheit durch Färbung

1. Bereiten Sie im Voraus unter lichtgeschützten Bedingungen 10 μg/mL neutrale lipidfluoreszierende Farbstofflösung vor (BODIPY: Puffer B = 1:100, V/V).
2. Gib eine passende Menge gemischter LDs und Puffer B in ein Mikrozentrifugenrohr. Unter lichtgeschützten Bedingungen sollte eine angemessene Menge neutrale lipidfluoreszierende Farbstofflösung hinzugefügt werden. Gründlich mischen und 10 Minuten inkubieren.
3. Bereiten Sie einen sauberen Objektträger vor. Geben Sie 2,5 μL des Gemisch auf den Deckmantel. Legen Sie den Folie vorsichtig über die Mischung, vermeiden Sie Luftblasen. Beobachten Sie unter einem umgekehrten Fluoreszenzmikroskop.

5. Validierung der LD-Reinheit durch Western Blot

1. Die Proteinkonzentration der LD-Fraktionen wurde mit einem BCA-Protein-Assay-Kit gemessen.
2. Für die Western-Blot-Analyse mischen Sie 20 μg Protein aus jeder Probe mit einem 5-fachen SDS-Ladepuffer und erhitzen Sie bei 99 °C für 10 Minuten, um eine vollständige Denaturierung sicherzustellen.
3. Anschließend werden die Proteine mit SDS–PAGE auf 10%-Gradienten-Polyacrylamid-Gelen entsprechend ihrem Molekulargewicht getrennt.
4. Nach der Elektrophorese werden die Proteine auf voraktivierte PVDF-Membranen übertragen und dann mit 5 % BSA bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden blockiert. Anschließend wird die Membranen über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern ausgebrütet, darunter Kaninchen-Anti-Perilipin 2 (1:500) und Kaninchen-Anti-β-Aktin (1:5000).
5. Waschen Sie die Membranen dreimal mit 1x TBST für jeweils 10 Minuten und inkubieren Sie dann mit HRP-konjugiertem Ziegen-Antikaninchen-Sekundärantikörper (1:5000) für 1,5 Stunden bei Zimmertemperatur.
6. Nach drei weiteren Waschen mit TBST werden Proteinbänder mit einem Enhanced Chemiluminescence (ECL)-Kit erkannt und mit einem Gel-Bildgebungssystem visualisiert.

6. Pausenpunkte und Lagerrichtlinien

1. Lassen Sie das PNS bis zu 1–2 Stunden vor der Ultrazentrifugation auf Eis.
2. Bewahren Sie die gesammelten LDs bis zu 1–2 Stunden vor dem Waschen auf Eis. Für die Kurzzeitlagerung werden LDs bei bis zu 24 Stunden bei 4 °C gelagert. Für die Langzeitlagerung werden LDs bei −80 °C gelagert und die Frost-Tau-Zyklen auf maximal einen begrenzt, um die LD-Integrität zu erhalten.
3. Während aller experimentellen Pausen werden Proben mit geschlossenen Röhrchenkappen auf Eis gelegt, um die Kontamination zu minimieren.

7. Fehlerbehebung

1. Dünne Schwimmschicht: Puffervolumen oder Zentrifugationskraft anpassen.
2. Schlechte Schwimmwirkung: Erhöhung der Zentrifugationsgeschwindigkeit oder Verlängerung der Zeit.
3. Verunreinigung: Sicherstellung steriler Handhabung und gefilterter Puffer.
4. LD-Ruptur: Proben auf Eis aufbewahren, die Zentrifugationskraft reduzieren oder vorsichtig wieder suspendieren.

Ergebnisse

Arbeitsablauf und methodischer Rahmen
Ein Entscheidungsbaum-Schema (Abbildung 1) wurde erstellt, um die Auswahl der Zentrifugationsbedingungen entsprechend den experimentellen Zielen zu leiten. Konkret wurden Zentrifugalkräfte ≤10.000 x g zur Anreicherung großer LDs (≥2 μm) verwendet, während Kräfte >10.000 x g zur Anreicherung kleiner LDs (<1 μm) angewendet wurden. Dieser Rahmen bietet eine praktische Grundlage für die ...

Diskussion

LDs sind einzigartige Organellen, die durch einen neutralen Lipidkern gekennzeichnet sind, der von einer Phospholipid-Monoschicht umgeben ist. Sie knospen aus dem endoplasmatischen Retikulum und verändern dynamisch ihre Größe und Anzahl, was den intrazellulären Transport und die umfangreiche Kommunikation mit anderen subzellulären Strukturen erleichtert, um die zelluläre Lipidhomöostase^zu koordinieren^...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,25 % Trypsin-EDTA	Gibco	25200072	Reagenz
10% PAGE Gel Schnellvorbereitungskits	Beijing BIOMAN	PG112	Reagenz
100 & mu; M-Zell-Sieb	Beyotime	FSTR100	Reagenz
100-mm-Zellkulturschale	Corning	490167	Reagenz
Amersham Imager 600	GE Healthcare Life Sciences	600	Ausrüstung
Autoklav	Panasonic	MLS-3751L	Ausrüstung
BCA-Protein-Assay-Kit	Beijing Dingguo.	BCA01	Reagenz
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	Reagenz
Zentrifuge	Eppendorf		Ausrüstung
DMEM	HyClone	SH30022.01	Reagenz
DMSO	Solarbio	D8370	Reagenz
Fetales Rinderserum	Gibco	2492319	Reagenz
HEPES	MedChemExpress	HY-D0857	Reagenz
HRP-konjugierter AffiniPure-Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper	Proteintech	SA00001-2	Reagenz
KCl	HUSHI	20030666	Reagenz
KH2PO4	HUSHI	10017608	Reagenz
MgCl2	HUSHI	20059028	Reagenz
Na2HPO4· 12H2O	HUSHI	S112623	Reagenz
NaCl	HUSHI	10019328	Reagenz
Omni-Easy Sofort-Protein-Ladepuffer	Shanghai Epizyme Biomedizinische Technologie	LT101S	Reagenz
Omni-ECL Ultra-Sensitive Chemilumineszenz-Detektionsset	Shanghai Epizyme Biomedizinische Technologie	SQ201	Reagenz
PBS	HyClone	SH30256.01	Reagenz
Penicillin & Streptomycin 100 Mal;	NCM Biotech	CLOOC5	Reagenz
pH-Meter	METTLER TOLEDO	S220K	Ausrüstung
Pipette	Eppendorf		Ausrüstung
PMSF	Coolaber	CP8651	Reagenz
PVDF-Membrantransfer-Kit	GenScript	eBlot L1	Reagenz
Rabbit Anti-Perilipin 2	Abcam	15294-1-AP	Reagenz
Kaninchen anti-β-aktin	Proteintech	20536-1-AP	Reagenz
Forschungsqualität invertiertes Fluoreszenzmikroskop	Olympus	IX73	Ausrüstung
Sucrose	Solarbio	S8271	Reagenz
SW 40 Ti Rotor	BECKMAN COULTER	331301	Ausrüstung
Trans-10, cis-12 konjugierte Linolsäure	CAYMAN	90145	Reagenz
Tricin	Coolaber	CT11331	Reagenz
Ultrazentrifuge	BECKMAN COULTER	Optima XE-100	Ausrüstung
Ultraschall-Zellknusper	SCIENTZ	JY92-11N	Ausrüstung