Methodenartikel

Zervikales Lymphkanal-Rattenmodell zur Bestimmung des lymphatischen Transports vom Kopf und Gehirn

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DOI:

10.3791/70217

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10. März 2026

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1State Key Laboratory of Natural Medicines, School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, 2MOE Joint International Research Laboratory of Target Discovery and New Drug Innovation, China Pharmaceutical University, 3Department of Drug Delivery, Disposition and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses experimentelle Protokoll demonstriert ein tiefes zervikales Lymphkanal-Rattenmodell, das eine direkte und quantitative Beurteilung des lymphatischen Abflusses aus dem Kopfbereich ermöglicht. Das Modell erleichtert eine detaillierte Analyse von aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) abgeleiteten gelösten Stoffen, Immunzellpopulationen sowie der Verteilung und Clearance von ZNS-gezielten Therapeutika.

Zusammenfassung

Die Lymphe fließt vom zentralen Nervensystem (ZNS) über eine Reihe von Lymphgefäßen (LVs) und Lymphknoten, die an den Halswirbellymphgängen zusammenlaufen. Neben der Aufrechterhaltung des Flüssigkeitsgleichgewichts spielen diese Lymphgänge eine Schlüsselrolle beim Transport einer Vielzahl von Substanzen, darunter endogene Metaboliten, Signalmoleküle, Immunzellen sowie kleine und makromolekulare Arzneimittel. Dies ist entscheidend für die physiologische Homöostase und die Immunfunktion sowohl in den intrakraniellen (z. B. Gehirn-) als auch in den extrakraniellen Bereichen (z. B. Nasen- und Mundhöhlen). Eine beeinträchtigte Lymphdrainage aus dem Gehirn wird zunehmend mit einer Reihe neurologischer und neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die Kanüle des zervikalen Lymphkanals ermöglicht die Sammlung von Lymphen, die Kopf und Gehirn entwässern, wodurch die Messung der Konzentration und der Transportgeschwindigkeit verschiedener Substanzen über das Lymphsystem ermöglicht wird. Veränderungen dieser Faktoren als Reaktion auf verschiedene Herausforderungen (z. B. Medikamente, Stress, Trauma) und Krankheiten (z. B. Schlaganfall, Infektion, Alzheimer) können ebenfalls festgestellt werden. Hier beschreiben wir ein anästhesiertes, tief zervikales Lymphkanal-Rattenmodell, das eine Lymphabnahme für mehrere Stunden nach der Operation ermöglicht. Die Methode kann mit Bildgebungs- und Multi-Omics-Technologien kombiniert werden, um eine Vielzahl von interessanten Parametern in der Lymphe zu messen. Dies erleichtert grundlegende physiologische und pathophysiologische Forschung an Kopf- und Halsregion sowie pharmakokinentische/pharmakodynamische Studien von Arzneimitteln, insbesondere zur Behandlung von ZNS-Erkrankungen.

Einleitung

Das Lymphsystem, das im ganzen Körper verteilt ist, ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Flüssigkeitshomöostase, die Regulierung der Immunantworten und die Förderung des Transports von Nährstoffen und Signalmolekülen1. Die peripheren Lymphatika beginnen in den lymphatischen Kapillaren, die interstitielle Flüssigkeit und gelöste Stoffe sammeln und in größere Sammellymphgefäße (LVs) abfließen, die eine umgebende glatte Muskelschicht besitzen; Diese Gefäße liefern dann Lymphknoten an lokale Lymphknoten zur Immunverarbeitung 2,3. Das lymphatische Netzwerk, das den Kopfbereich drainiert, ist wichtig für die Homöostase sowohl der intrakraniellen (z. B. Gehirn-) als auch der extrakraniellen (z. B. Nasen- und Mundhöhlen) Organe. Es wird angenommen, dass die Struktur und Organisation des extrakraniellen lymphatischen Netzwerks denen peripherer Lymphatics im gesamten Körper ähnelt, während das intrakranielle lymphatische System einzigartige anatomische und funktionelle Merkmale aufweist (siehe Abbildung 1 für eine detaillierte schematische Darstellung in Rattenmodellen)4,5. Obwohl typische LVs im Gehirnparenchym fehlen, werden lymphatische Funktionen durch das spezialisierte glialabhängige lymphatische Transportsystem (Glymphatic) vermittelt, das den Austausch zwischen Gehirnspinalflüssigkeit (CSF) und Interstitieller Flüssigkeit (ISF)6 ermöglicht. Während das glymphatische System die Vermischung von ISF im Hirnparenchym mit Liquor ermöglicht, transportieren die meningealen, perivaskulären und nasopharyngealen LVs gelöste Stoffe aus dem Liquor aus der Schädelhöhle. Konkret leitet der meningeale lymphatische Weg den Liquor vom Subarachnoidalraum in die meningealen LVs und verbindet die intrakranielle Fluiddynamik mit peripherer lymphatischer Clearance7. Parallel dazu ermöglichen perineurale Bahnen den Ausfluss von Liquor und zugehörigen gelösten Stoffen entlang der Schädel- und Spinalnervenhüllen, am auffälligsten über die Riechnerven in den nasopharyngealen Lymphplexus 5,8. Gleichzeitige Arbeit dieser Systeme hält die flüssige Homöostase im Gehirn 6,7,8. Jüngste Fortschritte im Verständnis des durch das ZNS entleerenden lymphatischen Systems haben neue Einblicke in die Gehirnphysiologie und Pathophysiologie geliefert. Diese Ergebnisse könnten neue Wege für therapeutische Interventionen bei ZNS-Erkrankungenbieten.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der lymphatischen Clearance-Pfade des ZNS. Diese Bahnen bestehen aus (A) dem glymphatischen Weg über perivaskuläre Räume; (B) den nasopharyngealen lymphatischen Weg und (C) die meningealen LVs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Die vom Kopf und ZNS abfließenden lymphatischen Netzwerke treffen sich in die zervikalen Lymphgänge im Hals zusammen, wo die Lymphe durch die zervikalen Lymphknoten gefiltert wird, bevor sie in den systemischen Kreislauf gelangt. Die zervikalen Lymphknoten werden je nach ihrer anatomischen Lage im Hals in oberflächliche (sCLNs) und tiefe zervikale Lymphknoten (dCLNs) eingeteilt. Veränderungen in der Zusammensetzung der Lymphflüssigkeit in den Halswirbellymphgängen spiegeln zugrundeliegende pathophysiologische Variationen im Gehirn wider, wobei Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson (PD), traumatische Hirnverletzungen (TBI) und post-stroke-kognitive Beeinträchtigung (PSCI) repräsentative Beispielesind: 9,10,11,12,13. Bemerkenswert ist, dass in AD eine beeinträchtigte Drainage von Amyloid-β (Aβ) und phosphorylierten Tau-Proteinen (P-tau) durch diese lymphatischen Bahnen als beitragender Faktor für das Krankheitsverlaufin Verbindung gebracht wird. Indem Lymphgänge direkt mit benachbarten Venen verbunden werden, um den lymphatischen Abfluss umzuleiten, wird die lymphatische venöse Anastomose (LVA) sowohl bei Tieren als auch beim Menschen als therapeutische Strategie untersucht, um den lymphatischen Ausfluss aus dem ZNS zu erhöhen, wodurch die Aβ-Beseitigung aus dem Gehirn erleichtert und das Fortschreiten von AD 6,15,16 möglicherweise verzögert wird. Die Bedeutung dieses Weges wird weiter durch Beobachtungen bei Mäusen verdeutlicht, bei denen die zervikalen Lymphknoten operativ entfernt wurden (Lymphadenektomie), was zu einer verminderten Entfernung der zervikalen Lymphknoten führte. Eine beeinträchtigte Clearance führt zu einer toxischen Ansammlung von Aβ und P-tau, mit anschließender Aktivierung pathologischer Kinase-Signalwege. Diese Veränderungen stehen im Zusammenhang mit einer fortschreitenden Verschlechterung der AD-ähnlichen Tauopathie und einem erhöhten Risiko für angst- und depressionähnliches Verhalten14,16. Darüber hinaus deuten CSF-basierte Studien darauf hin, dass ZNS-Tumore wie Hirnlymphome die lymphatische Clearance durch die tiefen Halswirbellymphgänge physisch blockieren und gleichzeitig die Onkoproteinkonzentrationen im CSF 9,17,18 erhöhen können. Hinweise aus entzündungsbasierten Studien des ZNS deuten zudem darauf hin, dass Zellen, die in den Meningen stammen, über die meningealen LVs zu den zervikalen Lymphknotenwandern können. Diese Zellen bestehen hauptsächlich aus Lymphozyten, mit kleineren Populationen von dendritischen Zellen, Makrophagen undEndothelzellen 19,20. Während einer Entzündung oder nach einer Verletzung des ZNS oder einer Operation wird der Austausch der lymphatischen Immunzellen deutlich verstärkt, begleitet von erhöhten Spiegeln von Immunbiomarkern wie Zytokinen, Chemokinen und anderen entzündlichen Mediatoren21.

Neben seinen pathophysiologischen Funktionen wird das zervikale lymphatische Netzwerk zunehmend als wichtiger Kanal für die Medikamentenentsorgung anerkannt. Frühere Tierstudien haben gezeigt, dass mehrere für die Verabreichung des ZNS entwickelte Arzneimittelformulierungen aus dem Gehirn über die zervikalen Lymphkanäle und Lymphknoten (in unterschiedlichem Ausmaß) ausgeschieden werden können, beispielhaft durch intrazerebral verabreichte nanopartikelbasierte Wirkstoffe (z. B. Lamotrigin, Talazoparib) und Biologika (z. B. monoklonale Antikörper, radiomarkierte Tracer-Proteine)22,23,24,25. Beim Menschen haben MRT-Bildgebungsstudien gezeigt, dass bestimmte Moleküle, wie Gadobutrol, aktiv vom Glymphsystem zu den zervikalen Lymphgängentransportiert werden.

Wie bereits erwähnt, entwässern zervikale Lymphknoten, sowohl sCLNs als auch dCLNs, Lymphe aus bestimmten Bereichen des Kopfes; Die spezifischen Schädelregionen, die von jedem Knoten entwässert werden, bleiben jedoch unklar:27,28. Überlappende Drainageflächen, anatomische Variabilität zwischen den Individuen und mögliche strukturelle Unterschiede zwischen Arten erschweren die Beschreibung der zervikalen lymphatischen Abflussmuster bei Tieren und Menschenweiter 29. Innerhalb des komplexen zervikalen lymphatischen Netzwerks wurden die tiefen zervikalen Lymphgänge als wichtige Ausflusswege für Liquor identifiziert, die sich flussabwärts der nasopharyngealen und meningealen LVs8 befinden. Im Vergleich zu den oberflächlichen zervikalen Lymphgängen, die feine und variable Netzwerke im subkutanen Gewebe bilden und sich stark in Größe und Verzweigung zwischen einzelnen Ratten unterscheiden, bietet der tiefe zervikale Lymphgang einen zugänglicheren und praktischeren Weg zur Sammlung von ZNS-abgeleiteter Lymphe in Kleintiermodellen20,30. Das aktuelle Protokoll konzentriert sich daher darauf, eine zuverlässige Methode zur Entnahme von Lymphe aus dem tiefen Halswirbellymphgang zu etablieren.

Nur eine begrenzte Anzahl von Studien im letzten Jahrzehnt hat die Sammlung von Zervikal-Lymphflüssigkeiten zur Untersuchung von ZNS-Erkrankungen oder zur Analyse der Arzneimittelverteilung beschrieben. Eine frühere Studie beschrieb die Messung der Arzneimittelkonzentrationen in der zervikalen Lymphe durch das Spülen oder Pressen von Flüssigkeit aus isolierten Gewebeschnitten (wie solche, die an einem einzelnen dCLN angrenzen). Experimentelle Protokolle zur kontinuierlichen Aufnahme von Lymphe aus den zervikalen Lymphgängen bei kleinen Labortieren, insbesondere Ratten, sind jedoch noch unausgereift. Dieses Protokoll etabliert eine leicht zugängliche und reproduzierbare Methode zur Kanüllierung des (Ratten-)zervikalen Lymphkanals, um eine kontinuierliche Lymphentnahme zu ermöglichen und den lymphatischen Transport des ZNS, die Immunreaktionen und die Pharmakokinetik zu untersuchen. Ihr wesentlicher Vorteil liegt in der Fähigkeit, den Lymphfluss und die Zusammensetzung über definierte Zeiträume zu quantifizieren, wodurch die quantitative Messung von Medikamenten, Lipiden, Fettsäuren und zellulären Bestandteilen ermöglicht wird. Insbesondere erfasst dieses Modell lymphatische Transportprozesse, die durch Plasma-/Liquorproben- oder Bildgebungstechniken nicht ausreichend repräsentiert werden, und bietet neuartige Einblicke in die Arzneimittelverteilung im ZNS, den Lipid- und Nährstofftransport sowie die Immunsignalisierung20.

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Protokoll

Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden vom universitären Tierethikkomitee genehmigt und gemäß den experimentellen ethischen Richtlinien der China Pharmaceutical University durchgeführt. Bevor Sie mit tierbezogenen Verfahren beginnen, sollten Sie die erforderlichen Genehmigungen vom zuständigen institutionellen oder organisatorischen Ethikkomitee einholen. Männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten mit einem Gewicht von 220 bis 250 g werden als Versuchstiere verwendet. Die Tiere werden von autorisierten Lieferanten von Versuchstieren bezogen (siehe Materialtabelle) und in speziellen Käfigen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten, bis das Experiment beginnt. In diesem Protokoll wird die Kanüle des linken tiefen cervikalen Lymphkanals als repräsentatives Beispiel beschrieben. Derzeit gibt es nur begrenzte Belege für anatomische Unterschiede zwischen den linken und rechten tiefen zervikalen Lymphkanälen. Basierend auf Beobachtungen aus zuvor abgeschlossenen Experimenten wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Seiten, einschließlich der Lymphflussraten, festgestellt.

1. Sicherheitsvorkehrungen und -verfahren

  1. Führen Sie alle Verfahren gemäß institutionellen Biosicherheitsrichtlinien durch, und das gesamte Personal sollte vor Durchführung dieses Protokolls eine angemessene Ausbildung in mikrochirurgischen Techniken, dem Umgang mit experimentellen Tieren und der Chemikaliensicherheit erhalten.
  2. Tragen Sie während des gesamten Eingriffs geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), darunter einen Laborkittel, chirurgische Handschuhe und Schutzbrillen. Da ein flüchtiges Anästhetikum (Isofluran) verwendet wird und bei Menschen nach längerer Exposition eine Depression des Zentralnervensystems und kardiovaskuläre Toxizität verursachen kann, führen Sie das Verfahren in einer gut belüfteten Umgebung durch. Lebensmittel und Getränke dürfen nicht ins Labor gebracht werden, und sicherzustellen, dass fließendes Wasser jederzeit leicht zugänglich ist.
  3. Behandle alle scharfen Gegenstände, einschließlich Spritzennadeln, Rasierklingen und Mikroscheren, sorgfältig und entsorge sie sofort nach der Verwendung in ausgewiesenen Behältern für scharfe Gegenstände; Unter keinen Umständen sollten einwegscharfe Gegenstände wiederverwendet werden.
  4. Behandeln Sie alle biologischen Proben (z. B. entnommene Lymphe) und tierische Körperflüssigkeiten (z. B. Blut) als potenziell gefährlich und führen Sie alle Entnahmegeräte sorgfältig, während Sie die Proben vom Operationsbereich fernhalten. Im Falle einer versehentlichen Nadelstichverletzung oder Hautkontakt mit gefährlichen Substanzen waschen Sie den betroffenen Bereich sofort mit Seife und Wasser und melden Sie den Vorfall gemäß den institutionellen Sicherheitsvorschriften.

2. Vorbereitung am Tag vor der Operation

  1. Fasten oder füttern Sie die Ratten entsprechend den Anforderungen des jeweiligen Experiments. Dieses Protokoll schreibt keinen bestimmten Fasten- oder Ernährungsstaat vor.
  2. Bereiten Sie eine Antikoagulanslösung vor, indem Sie Heparin oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) auf eine Endkonzentration von 10 IU/ml verdünnen. Füllen Sie diese Mischung (ca. 0,7 ml) in eine 1 ml sterile Insulinspritze, die mit einer 30-G-Nadel versehen ist, vor, um die Innenseite der Polyethylenkanüle (PE) (verwendet für Lymphkanalkanulierung) vorzuschichten. Lagern Sie diese vorbereitete Mischung unter sterilen Bedingungen bis zur Gebrauchszeit.
  3. Bereite Kanülen für die Lymphprobenentnahme vor, indem eine PE-Kanüle in einer Kopf-zu-Schwanz-Konfiguration zusammengebaut wird, wobei 0,5 mm Außendurchmesser (OD), 0,3 mm Innendurchmesser (ID) Schlauch für beide Endabschnitte und 0,6 mm OD- und 0,5 mm ID-Schlauch für den mittleren Abschnitt verwendet werden.
    1. Schneiden Sie die Kanülensegmente auf Längen von 2 cm für den proximalen Teil, der mit der Spritzennadel verbunden ist, 40 cm für den mittleren Abschnitt und 8 cm für den distalen Teil, der für die Kanulierung vorgesehen ist.
    2. Schneiden und schrägen Sie das distale Ende der Kanüle in einem Winkel von etwa 45° ab, um das glatte Einsetzen in den Halswirbellymphgang zu erleichtern. Siehe Abbildung 2 für eine detaillierte Darstellung der Kanüle-Baugruppe.
      HINWEIS: Dieser Fasen erleichtert das sanfte Einsetzen in den Lymphkanal und verringert das Risiko einer Verstopfung, indem er die effektive Querschnittsfläche vergrößert. Nach erfolgreicher Kanulation wird der proximale (2 cm) Abschnitt getrennt, und die Lymphe wird direkt vom freiliegenden proximalen Ende des Mittelabschnitts gesammelt (wie ausführlich in Schritt 4.9 & 4.10 beschrieben).

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Abbildung 2: Schematisches Diagramm der Kanülebaugruppe (nicht maßstabsgetreu). Das Diagramm zeigt die Abmessungen jeder Komponente des zusammengesetzten PE-Rohrs, das zur Herstellung der Kanüle verwendet wurde. Von links nach rechts wird die zusammengesetzte Kanüle fortan als proximales Ende, mittlerer Abschnitt bzw. distales Ende bezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.  

  1. Bereiten Sie das Anästhesieinhalationssystem vor, indem Sie flüssiges Isofluran vorab in den druckbeaufschlagten Behälter mit einem Verdampfer füllen. Vor der Nutzung führen Sie einen Testlauf (Priming) des Verdampfers durch, um die Luftdichtheit zu bestätigen und einen stabilen und gleichmäßigen Gasfluss zu gewährleisten.
  2. Falls erforderlich, bereiten Sie das Testmedikament in einem geeigneten Fahrzeug vor. Führen Sie Stabilitätsstudien durch, um die Integrität der Formulierung während der Lagerung und während der gesamten Verabreichungsphase zu bestätigen. Fügen Sie gegebenenfalls zusätzliche Mittel hinzu (z. B. biologische Farbstoffe wie Evans Blue).
  3. Bereiten Sie die Behälter für die Lymphentnahme vor, indem Sie sterile Mikrozentrifugenröhren vorabwägen und ihr Anfangsgewicht aufzeichnen. Beschriften Sie jede Röhre nacheinander gemäß den geplanten Sammelzeitpunkten (z. B. stündliche Intervalle). Fügen Sie jedem Röhrchen konzentriertes Heparin (oder EDTA) hinzu und entfernen Sie das Lösungsmittel durch Stickstoffblowdown-Verdunstung, wobei pro Röhre 2 bis 5 IE getrocknetes Heparin (oder EDTA) übrig bleibt, um eine ungleichmäßige Verdünnung der gesammelten Lymphe zu verhindern.

3.  Vorbereitungen unmittelbar vor der Operation

  1. Überprüfen Sie die Öffnung jeder Kanüle, indem Sie mit der vorbereiteten Antikoagulanslösung spülen. Schließen Sie eine Spritze am proximalen Ende der zusammengesetzten Kanüle an und geben Sie vorsichtig ein kleines Volumen Lösung ab. Stellen Sie sicher, dass die Lösung reibungslos aus dem distalen Ende austritt, ohne Anzeichen von Undichtigkeiten. Wenn ein Leck festgestellt wird, wie typischerweise durch das Ausweichen von Flüssigkeit an den Anschlusspunkten, entsorgen Sie die gesamte Kanülebaugruppe und rekonstruieren Sie eine neue gemäß Schritt 2.3.
    HINWEIS: Dieser Schritt beschichtet gleichzeitig die Innenseite der Kanüle mit einem Antikoagulans (dieser Schritt kann auch am Tag vor der Operation durchgeführt werden, sodass die Kanüle über Nacht vorbeschichtet wird).
  2. Beginnen Sie etwa 5 Minuten vor Beginn der Operation mit der Verabreichung von inhaliertem Isofluran über eine Nasen-Kegelmaske. Halten Sie während des gesamten Eingriffs die Anästhesie mit einer Verabreichungsrate von 0,4 bis 0,6 L/min bei einem Druck von 101,3 kPa bei 20 °C aufrecht. Stellen Sie die Tiefe der Anästhesie sicher, indem Sie die Reaktion des Zehenkneins beurteilen.
    1. Überwachen Sie kontinuierlich die Tiefe der Anästhesie. Euthanasiere die Ratte sofort, wenn Anzeichen von Stress oder physiologischer Instabilität festgestellt werden.
  3. Positioniere die Ratte im Rücken auf eine beheizte OP-Platte, die bei 37 °C gehalten wird. Neigen Sie den Kopf und strecken Sie den Nacken, wobei Sie bei Bedarf eine kleine Unterstützung (Kissen) verwenden, um die Nackenregion zu maximieren. Sichern Sie den Kopf in der Anästhesiemaske, um eine kontinuierliche Verabreichung von Isofluran sicherzustellen, und halten Sie die Vordergliedmaßen vorsichtig mit Gummibändern oder chirurgischen Tapes fest, um die Bewegung während des Eingriffs zu minimieren.
  4. Spülen Sie das Fell über dem Gebärmutterhalsbereich mit steriler Kochsalzlösung, um das Rasieren zu erleichtern. Rasieren Sie die gesamte Operationsstelle gründlich (mit einer zweischneidigen Sicherheitsrasierklinge), typischerweise den Hals und das Schlüsselbein, um die vollständige Entfernung des Fells vor dem Schnitt sicherzustellen (siehe Abbildung 3A für ein Beispiel des rasierten Halsbereichs).
  5. Reinigen Sie den gesamten rasierten Bereich mit Desinfektionsmitteln, wie einem jodhaltigen Mittel.
  6. Markieren Sie die Operationsstelle, indem Sie eine 2,5 cm gestrichelte Linie zeichnen, um die Länge des ursprünglichen Schnitts zu bestätigen. Positioniere die Linie leicht rechts von der Mittellinie des Körpers der Ratte. Setzen Sie das obere Ende des Schnitts etwa 1 bis 1,5 cm unterhalb der Unterlippe (siehe Abbildung 3B für ein Beispiel der Schnittstelle, mit Messungen unterstützt durch ein Lineal).

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Abbildung 3: Vorbereitung der Operationsstelle. (A) Der Halsbereich wird zur Vorbereitung auf den Schnitt rasiert; (B) ungefähre Länge und Lage des Schnitts, angezeigt durch die 2,5 cm große gestrichelte Linie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

4. Kanüle des Halswirbellymphgangs

  1. Positioniere die Ratte mit dem Kopf zum Bediener gerichtet. Verwenden Sie für diesen Schritt ein Mikroskop aufgrund des relativ kleinen Durchmessers des Halslymphkanals.
  2. Mit einem sterilen Skalpell wird die oberflächliche Schicht der Halsmuskulatur vorsichtig entlang der erwähnten 2,5 cm langen Markierung eingeschnitten, die fast parallel zur Mittellinie ausgerichtet ist (siehe Abbildung 4A für die geöffnete oberflächliche Hautschicht).
  3. Trennen Sie vorsichtig die verbleibenden Muskelschichten, vor allem die oberflächliche Halsfaszie, um die Halsarterie freizulegen, die typischerweise durch ihre rote Färbung zu erkennen ist.
  4. Ziehen Sie den Musculus sternomastoidus und die submandibuläre Drüse zurück und neigen Sie sie vorsichtig vom Operationsfeld weg, um die Identifizierung des Halslymphkanals zu erleichtern. Verwenden Sie einen Gewebeexpander, um das chirurgische Fenster aufrechtzuerhalten, und verwenden Sie einen Wattestäbchen, um das Muskelgewebe vorübergehend beiseite zu halten, während der Lymphknoten und der zugehörige Lymphkanal lokalisiert werden. Stellen Sie sicher, dass der Gewebeexpander während des gesamten Kanulierungsprozesses an Ort und Stelle ist (siehe Abbildung 4B für das geöffnete chirurgische Fenster mit dem Gewebeexpander).
  5. Lokalisieren Sie den Halswirbellymphgang (vorzugsweise unter dem Mikroskop): Der Gang erscheint als undurchsichtiges, farbloses Gefäß mit einem Durchmesser von etwa 0,2 bis 0,5 mm und verläuft unmittelbar parallel zur Halsschlagader. Ein oder mehrere angrenzende, fleischfarbene dCLNs sind häufig entlang des Verlaufs des zervikalen Lymphkanals zu beobachten (siehe Abbildung 4C für eine mikroskopische Ansicht des freiliegenden tiefen cervikalen Lymphkanals und eines angrenzenden dCLN).
    HINWEIS: Die zervikalen Lymphkanäle haben typischerweise eine Farbe, die dem umliegenden Gewebe sehr ähnlich ist, und ihre Identifizierung erfordert oft eine sorgfältige Untersuchung, insbesondere bei Ratten mit mehr Fettgewebe. Für chirurgische Praxiszwecke (aber nicht für Studien zum lymphatischen Transport von Medikamenten oder endogenen Substanzen) kann Evans Blue zu Beginn der Operation subkutan unter den Hals injiziert werden, damit der Halswirbellymphgang besser sichtbar werden kann, wenn der Farbstoff über die Lymphatik abfließt.
  6. Mit einer stumpfen Zange wird vorsichtig durch das getrennte Bindegewebe geführt und die Pinzette in Position gehalten, damit der zervikale Lymphkanal im Operationsfeld gut sichtbar bleibt.
  7. Isolieren Sie den zervikalen Lymphgang sorgfältig von den umliegenden Binde- und Fettgeweben durch eine stumpfe Dissektion, wobei Sie besonders darauf achten, Schäden zu vermeiden, da das Gefäß äußerst empfindlich ist.
  8. Verwenden Sie eine Mikroskopschere, um einen kleinen Schnitt in der oberen Hälfte des freiliegenden Kanals zu machen. Trennen Sie den Kanal nicht vollständig; Die beiden Hälften müssen intakt bleiben.
  9. Überprüfen Sie und stellen Sie sicher, dass die vorbereitete Kanüle, vorbeschichtet mit Antikoagulanslösung (wie in Schritt 2.3 beschrieben), frei von Luftblasen ist, indem Sie eine sanfte Spülung durchführen. Unmittelbar vor dem Einsetzen greifen Sie vorsichtig das distale Ende der Kanüle mit der Pinzette und richten sie so aus, dass das abgeschrägte Gesicht nach oben gerichtet ist. Dann führt man die Kanüle vorsichtig etwa 2 mm durch den Schnitt in den Kanal und richtet sie zum Kopf (siehe Abbildung 4D für eine erfolgreiche Kanulation). Die tatsächliche Einsetztiefe kann je nach individueller Ratte variieren.
    HINWEIS: Da das Einsetzen der Kanüle bei diesem Eingriff relativ flach ist, kann ein zusätzlicher Befestigungspunkt im umliegenden Bereich hilfreich sein. Dies wird erreicht, indem mit einer Schere eine kleine sekundäre Hauteinstichung (Loch) etwa 1,5 cm vom Operationsfenster entfernt erzeugt wird. Diese Öffnung wird in den folgenden Schritten weiter stabilisiert (z. B. mit Naht oder Klebstoff). Abbildung 4E zeigt diesen Schritt im Zusammenhang mit der Verwendung von Gewebeklebstoff. Die Kanüle sollte durch das Loch geführt werden, um ihre Position zu sichern.
  10. Lösen Sie die Insulinspritze zusammen mit dem kurzen (2 cm) proximalen Segment der Kanüle vom Rest der Kanüle. Lymphe kann dann direkt vom freiliegenden proximalen Ende des größeren Mittelsegments gesammelt werden. Überwachen Sie die distale Spitze dieses Sammelsegments 1–2 Minuten lang. Bestätigen Sie die erfolgreiche Kanulierung durch einen sichtbaren, langsamen und stetigen Ausfluss von Lymphflüssigkeit aus dem kanülierten Gang.
  11. Sobald die Kanüle als erfolgreich bestätigt ist, sichern Sie die Kanüle, indem Sie mit einer Pipette einen kleinen Tropfen Cyanoacrylat-Gewebeklebstoff sowohl an der Lymphkanal-Schnittstelle als auch am sekundären Fixierungsloch auftragen (siehe Abbildung 4E für eine Demonstration der Kanülenfixierung). Achten Sie besonders darauf, das Gefäß nicht zu verstopfen oder den Lymphfluss zu beeinträchtigen.
  12. Beobachten Sie den Lymphfluss mehrere Minuten lang, um einen stetigen Ausfluss zu bestätigen (ein sichtbarer Stropfen bildet sich typischerweise innerhalb einer Minute am Ende der Kanüle). Nach Verifikation entferne du vorsichtig den Gewebeexpander aus dem Operationsfenster und positioniere die Submandibulardrüse an ihren ursprünglichen Platz.
  13. Befestigen Sie ein voretikettiertes, mit Antikoagulantis beschichtetes Mikrozentrifugenrohr (siehe Schritt 2.6) am distalen Ende der Kanüle, um die frei fließende Lymphe aufzufangen.

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Abbildung 4: Kanüle des Halswirbellymphkanals. (A) Schnittstelle im Halsbereich; (B) Operationsfenster öffnet sich mit einem Gewebeexpander und die Submandibulardrüse nach rechts zurückgezogen; (C) Zervikaler Lymphgang und ein dCLN unter dem Mikroskop visualisiert. (D) Erfolgreiche Kanunulation, angezeigt durch die grüne gestrichelte Linie (mikroskopische Ansicht). (E) Gewebekleber wurde an der Schnittstelle aufgetragen, und eine sekundäre Hautpunktion wurde mit einer Pipette durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

5. Postoperative Phase und Medikamentengabe

  1. Nach Abschluss der Kanulierung des zervikalen Lymphkanals werden alle Muskelschichten an ihre ursprünglichen Positionen versetzt. Anschließend wird der Hautschnitt mit Nähten und/oder Gewebeklebstoff verschlossen; typischerweise kann ein 2,5 cm langer Schnitt mit 8 Stichen richtig geschlossen werden (siehe Abbildung 5A für ein mit Naht geschlossenes chirurgisches Fenster). Entfernen Sie nach Abschluss dieses Schrittes das einschränkende Gummiband oder die chirurgischen Bänder an den Vordergliedmaßen.
  2. Verabreichen Sie Medikamente in den Liquor über einen geeigneten Weg, wie z. B. intracisterna magna (ICM), intracerebroventrikuläre (ICV) oder lumbale intrathekale (LIT) Injektion. Anhand der ICM-Verabreichung als Beispiel identifizieren Sie die Injektionsstelle an der Cisterna magna, die sich an der Schädelbasis befindet und als einzige weiche Vertiefung auf der Rückenseite sichtbar ist. Rasieren Sie das umliegende Fell bei Bedarf zur Sichtbarkeit (siehe Abbildung 5B für einen markierten geeigneten Bereich für die ICM-Injektion).
    HINWEIS: Um den intrakraniellen Druck (ICP) während der ICM-Injektion aufrechtzuerhalten, wird häufig vor der Verabreichung eines Medikaments ein entsprechendes Volumen an Liquor entnommen. Es wird empfohlen, eine neue, vorgefüllte Spritze zur Injektion zu verwenden. Das Biegen der Spritzennadel kann die Verabreichung erleichtern (siehe Abbildung 5C für eine Demonstration der ICM-Injektion mit einer gebogenen Spritznadel).
  3. Halten Sie die Ratte auf dem erhitzten chirurgischen Pad (bei 37 °C gehalten), um die Körpertemperatur nach der Injektion und während der gesamten Probenentnahme zu erhalten.

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Abbildung 5: Postoperative Behandlung. (A) Geschlossene Schnittstelle mit Seidennaht. (B) Ungefährer Standort der Cisterna magna mit rasiertem Fell umgebend. (C) ICM-Verabreichung eines Medikamentenkandidaten mit einer Insulinspritze und einer gebogenen Nadel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

6. Entnahme von Lymphproben und Analyse

  1. Sammeln Sie die Lymphe kontinuierlich in mit Antikoagulantien beschichtete Mikrozentrifugenröhren und ersetzen Sie die Röhren in vorgegebenen Abständen (typischerweise stündlich). Bewahren Sie die gesammelten Proben mit Eispacks in einer Kühlbox auf. Siehe Abbildung 6 für eine entnommene zervikale Lymphprobe in einem Mikrozentrifugenrohr.
  2. Nach Abschluss des Lymphentnahmeprozesses wird die Ratte human gemäß den entsprechenden Protokollen eingeschläfert.
  3. Bestimmen Sie die Lymphflussrate, indem Sie das Volumen der in jedem geplanten Stundenintervall gesammelten Lymphvolumen messen.
  4. Messen Sie die Konzentrationen von Arzneimitteln (oder interessanten Substanzen) in der Lymphe mit geeigneten analytischen Methoden, einschließlich HPLC, HPLC-MS oder kommerziell erhältlichen Assay-Kits, um deren Clearance-Kinetik aus dem ZNS über das Lymphsystem zu charakterisieren.
  5. Berechnen Sie den Massentransport des lymphatischen Arzneimittels, indem Sie die gemessenen Arzneimittelkonzentrationen mit den entsprechenden Lymphvolumina multiplizieren.

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Abbildung 6: Entnahme von Lymphproben. Fotografie einer gesammelten Probe (ca. 100 μL) in einem Mikrozentrifugenrohr. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

7. Nachbehandlung und Abfallentsorgung

  1. Lagern Sie vorübergehend eingeschläferte Ratten in ausgewiesenen medizinischen Abfallbehältern in einem speziellen Kühlraum (z. B. einem Kühlschrank), bis sie von einem professionellen Team für die Verarbeitung medizinischer Abfälle gesammelt und entsorgt werden.
  2. Sammeln Sie alle entsorgten scharfen Gegenstände in einem dafür vorgesehenen Behälter für scharfe Gegenstände, getrennt von allen anderen Abfällen.
  3. Entsorgen Sie alle anderen nicht scharfen Gegenstände, die im Experiment verwendet wurden (z. B. Wattestäbchen, Gummibänder, PE-Kanülen) in medizinischen Abfallbeuteln und entsorgen Sie sie nicht mit Haushalts- oder allgemeinen Abfällen. Stellen Sie sicher, dass keine scharfen Gegenstände in diese Tasche gelegt werden.
  4. Reinigen und desinfizieren Sie alle verbleibenden wiederverwendbaren Werkzeuge gemäß den Laborprotokollen.

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Ergebnisse

Ein repräsentativer Datensatz der stündlichen Lymphflussraten (mL/h) wurde mit dem Modell der zervikalen Lymphkanüle gewonnen (siehe Abbildung 7 für die entsprechende Tabelle). In diesem Experiment mit drei (n = 3) Studienratten wurde die Lymphe kontinuierlich in Mikrozentrifugenröhrchen aufgenommen, die stündlich über einen Zeitraum von 6 Stunden ersetzt wurden.

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Diskussion

Dieses Protokoll etabliert eine reproduzierbare Methode zur Kanüllierung des zervikalen Lymphkanals bei Ratten, wodurch eine kontinuierliche Lymphansammlung über längere Zeiträume ermöglicht wird. Mit ausreichender mikrochirurgischer Ausbildung kann das Verfahren effizient durchgeführt werden und liefert konsistente Lymphproben unter stabilen physiologischen Bedingungen unter kontinuierlicher Anästhesie, was es für routinemäßige experimentelle Anwendungen geeignet macht. Einmal gemeister...

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Offenlegungen

Die Autoren geben an, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.

Danksagungen

Die Autoren danken Herrn Zhenglin Hao und Frau Jie Zhao vom Tierversuchszentrum der China Pharmaceutical University aufrichtig für ihre Unterstützung bei der Durchführung von Tierversuchen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
30-Gauge-NadelYushou-GesundheitVerwendet zum Verbinden des proximalen Endes der Kanüle (0503) mit der Heparinspritze
Anästhesiespender mit VerdampferYYUN Instrumentenfirma
Stumpfe ZangeRWD Life ScienceF22002-10 
WattestäbchenQingdao Shultz BiotechnologieMQ-02Wurde verwendet, um Muskelgewebe vorübergehend an Ort und Stelle zu halten
Beheiztes OP-PadShanghai Yiheng InstrumenteDimension 15 & Times; 20 cm
HeparinnatriumShanghai Aladdin Biochemische TechnologieH123383Verdünnung vor der Anwendung erforderlich
Insulinspritze (1 ml)Yushou-GesundheitU100-1MLVerwendet ausschließlich zur Heparin-Vorbeschichtung
Isofluran-Lösung zur InhalationRWD Life ScienceR510-22-10Verwendet zur Anästhesie durch einen Verdampfer
MarkerstifteJede MarkeN/A
Mikrozentrifugenröhre (1,5 mL)Nantong Hairui VersuchsausrüstungHR10003Zur Entnahme von Lymphe verwendet
Mikro-SchereRWD Life ScienceGD234BA0007925
Nylon-chirurgische Naht Shanghai Yiheng Instrumente4-0 35CM
Pipette (volumenverstellbar, Messbereich 5 bis 50 & mu; L)Dragon Laboratory Instruments Limited7030301006Nur zur Messung des Gewebeklebstoffs verwendet
Pipettenspitzen Biosharp Life SciencesBS-10-TWird nur zum Transfer von Gewebeklebstoff verwendet, kein spezielles erforderliches Volumen
Polyeyhylen (PE) Kanüle 0,5 mm OD, 0,3 mm ID (0503)AniLab Wissenschaftliche Instrumente (Ningbo)PE-0503
Polyeyhylen (PE) Kanüle 0,6 mm OD, 0,5 mm ID (0605)AniLab Wissenschaftliche Instrumente (Ningbo)PE-0605
RasierklingenGillette ShanghaiQ31/0115000301C004Nur zum Rasieren von Pelzen verwendet
GummibandJede MarkeN/AVerwendet zum Fesseln der Vordergliedmaßen von Ratten
HerrscherJede MarkeN/A
Scapel-Klingen (#23)RWD Life ScienceS31010-01
Natriumchlorid (0,9 %) Lösung für die InfusionShijiazhuang Nr. 4 PharmazeutikH20066533 (Genehmigungsnummer)Nur zum Fellspülen verwendet
Sprague-Dawley RatsBeijing Vital River Labortiertechnologie101Gewicht 220 bis 250 Gramm, keine Altersvorgabe
Chirurgisches LichtBeijing Heo Bio-TechXHA011-1
Chirurgisches MikroskopShanghai Cewei Optoelektronische TechnologieSMZ755TSeziermikroskop ohne mechanische Bühne kann mit einem einziehbaren Stand ausgestattet werden
Gewebeklebstoff3M Vetbond1469SBHauptbestandteil Cyanoacrylat 
Gewebeexpander (Colibri)RWD Life ScienceR22029-04Ausdehnungsbereich 20 mm/4 cm

Referenzen

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