Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Forschungsartikel
Diese Studie identifiziert eine verringerte Vielfalt der Darmmikrobiota und veränderte Stoffwechselwege bei Typ-2-Diabetes (T2DM) und weist auf erhöhte Proteobakterien und reduzierte nützliche Taxa hin, was darauf hindeutet, dass mikrobielle Dysbiose mit T2DM assoziiert ist und möglicherweise zu seiner Pathophysiologie beiträgt.
Der weltweite Anstieg von Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) unterstreicht die Notwendigkeit, die zugrunde liegenden biologischen Mechanismen besser zu verstehen, insbesondere solche, die Wirts-Mikrobiom-Interaktionen betreffen. Diese Studie zielte darauf ab, die Vielfalt der Darmmikrobien, die taxonomische Zusammensetzung und die vorhergesagten metabolischen Signalwege bei neu diagnostizierten T2DM-Patienten im Vergleich zur nicht-diabetisch gematchten (NM) Gruppe zu charakterisieren. Frische Stuhlproben wurden mittels 16S rDNA-Sequenzierung analysiert. Alpha-Diversität (Chao-, ACE-, Shannon- und Simpson-Indizes) und Beta-Diversität wurden berechnet, um die Struktur der mikrobiellen Gemeinschaften zu bewerten. Taxonomische Unterschiede wurden mittels Wilcoxon-Rangsummentests und der Effektgröße der linearen Diskriminantenanalyse (LEfSe) bewertet. Die Vorhersage funktioneller Signalwege wurde mittels phylogenetischer Untersuchung von Gemeinschaften durch Rekonstruktion nicht beobachteter Zustände (PICRUSt2) basierend auf KEGG- und MetaCyc-Annotationen durchgeführt. Die Mendelsche Randomisierungsanalyse (MR), einschließlich inverser Varianzgewichtung, MR-Egger und gewichteten Medianmethoden, wurde angewandt, um genetisch vorhergesagte Assoziationen zwischen mikrobiellen Taxa und T2DM zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten eine verminderte mikrobielle Fülle, wie sich in niedrigeren Chao- und ACE-Indizes widerspiegelt, sowie eine veränderte Diversitätsstruktur, wie sie sich in niedrigeren Shannon- und höheren Simpson-Indizes bei T2DM-Patienten widerspiegelt, begleitet von signifikanten Zusammensetzungsverschiebungen. Es wurden eine erhöhte relative Häufigkeit von Proteobakterien und eine verringerte Häufigkeit nützlicher Taxa wie Lachnospiraceae und Blautia beobachtet. Die funktionelle Vorhersage zeigte eine verringerte Häufigkeit von Wegen, die mit dem nicht-oxidativen Pentosephosphatweg, der Isobutanol-Biosynthese und der L-Isoleucin-Biosynthese verbunden sind. Die MR-Analyse lieferte ergänzende Belege, die Assoziationen zwischen spezifischen mikrobiellen Taxa und der T2DM-Anfälligkeit unterstützen. Zusammenfassend ist T2DM mit einer geringeren mikrobiellen Fülle, veränderter Diversitätsstruktur sowie deutlichen taxonomischen und funktionellen Veränderungen verbunden. Diese Erkenntnisse unterstreichen die Relevanz der Darmmikrobiota bei T2DM und unterstützen den potenziellen Nutzen mikrobiombasierter Biomarker und therapeutischer Strategien. Weitere Studien sind erforderlich, um diese Ergebnisse zu validieren und die zugrunde liegenden Mechanismen zu klären.
Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) ist zu einer der am schnellsten wachsenden chronischen Krankheiten weltweit geworden, angetrieben durch rasante Urbanisierung, westlich geprägte Ernährungsgewohnheiten und zunehmend sesshafte Lebensstile 1,2. Sie trägt maßgeblich zu globaler Morbidität und Mortalität bei und verursacht eine erhebliche öffentliche Gesundheitsbelastung3. Obwohl die genetische Anfälligkeit eine Rolle spielt, unterstreicht der rasche Anstieg der T2DM-Inzidenz die Bedeutung von Umwelt- und Stoffwechseldeterminanten4. Die Identifizierung modifizierbarer biologischer Mechanismen ist daher unerlässlich, um Strategien zur Früherkennung und Prävention zu verbessern. Jüngste Fortschritte haben die Darmmikrobiota als wichtigen Regulator der metabolischen Homöostaseidentifiziert. Das intestinale mikrobielle Ökosystem beeinflusst den Glukosestoffwechsel, die Immunfunktion, die Integrität der Darmbarriere und chronische, niedriggradige Entzündungen, die alle zentral für die Entstehung von T2DM6 sind. Dysbiose wurde mit Fettleibigkeit, Insulinresistenz, Endotoxämie und verändertem Energiegleichgewicht in Verbindung gebracht, was auf einen mechanistischen Zusammenhang zwischen mikrobiellen Veränderungen und dem Krankheitsverlauf hindeutet7. Darüber hinaus wurden mikrobielle Metabolite, darunter kurzkettige Fettsäuren, Gallensäuren und verzweigte Aminosäuren, an der Modulation der Insulinsensitivität und des Wirtsstoffwechsels8 in Verbindung gebracht.
Obwohl sich zahlreiche Belege für die Rolle des Darmmikrobioms im T2DM stützen, stützen sich die meisten bisherigen Studien auf Beobachtungsdesigns, die die kausale Inferenz begrenzen. Alternative Ansätze wie Shotgun-Metagenomik und gezielte Metabolomik können funktionale Einblicke mit höherer Auflösung liefern, sind jedoch oft durch Kosten, Rechenkomplexität und begrenzte Machbarkeit in explorativen oder pilotbasierten Studien eingeschränkt. Im Gegensatz dazu ist die 16S-rDNA-Sequenzierung eine kosteneffiziente, weit verbreitete Methode zur Profilierung der Zusammensetzung mikrobieller Gemeinschaften, obwohl ihre taxonomische Auflösung auf Artebene beschränkt ist und funktionelle Metaboliten nicht direkt quantifizieren kann. Daher wurde für diese Studie die 16S-rDNA-Sequenzierung als kosteneffektiver, skalierbarer Ansatz ausgewählt, der für explorative klinische Kohorten geeignet ist und gleichzeitig die Integration mit nachgelagerten funktionellen Vorhersagen und komplementären analytischen Rahmenwerken ermöglicht. Daher kann die Integration von 16S-basiertem mikrobiellem Profiling mit bioinformatischer funktionaler Vorhersage und komplementären Ansätzen wie Mendelscher Randomisierung (MR) einen ausgewogenen Rahmen bieten, um sowohl kompositorische als auch potenziell kausale Zusammenhänge zu erforschen.
Bemerkenswert ist, dass es weiterhin relativ wenige Daten gibt, die sich speziell auf neu diagnostizierte, behandlungsnaive T2DM-Patienten konzentrieren. In solchen Populationen werden mikrobielle Veränderungen weniger wahrscheinlich durch pharmakologische Interventionen, insbesondere Metformin, gestört, das bekannt ist, die Zusammensetzungund Funktion der Darmmikrobiota signifikant zu verändern. Dies stellt eine wichtige Lücke in der aktuellen Literatur dar, da viele bestehende Studien heterogene Patientengruppen mit unterschiedlichen Behandlungsexpositionen und begrenzter Integration von Mikrobiomprofilierung mit genetisch informierten analytischen Ansätzen umfassen.
In diesem Zusammenhang zielte die vorliegende Studie darauf ab, die Vielfalt der Darmmikrobiota, die taxonomische Zusammensetzung und die vorhergesagten funktionellen Signalwege bei neu diagnostizierten T2DM-Patienten im Vergleich zur NM-Gruppe mithilfe von 16S-rDNA-Sequenzierung und bioinformatischer Analyse zu charakterisieren. Zusätzlich wurde die Mendelsche Randomisierung unter Verwendung öffentlich verfügbarer genomweiter Assoziationsdaten angewendet, um potenzielle genetisch vorhergesagte Assoziationen zwischen spezifischen mikrobiellen Taxa und T2DM-Risiken zu erforschen. Diese kombinierte analytische Strategie ermöglicht ergänzende Einblicke aus mikrobiellen Gemeinschaftsprofilierungen und populationsbezogenen genetischen Daten. Konkret liefert die 16S-rDNA-Sequenzierung eine direkte Charakterisierung der mikrobiellen Zusammensetzung in der Studienpopulation, während die Mendelsche Randomisierung genetische Instrumente unabhängiger Kohorten nutzt, um zu bewerten, ob beobachtete Assoziationen mit genetisch vorhergesagten Beziehungen übereinstimmen. Diese Integration soll eine zentrale Einschränkung beobachtender Mikrobiomstudien adressieren, indem sie ergänzende Belege liefert, die die Robustheit der Assoziationen zwischen Mikrobiota und T2DM unterstützen. Daher soll die Integration dieser Ansätze eine Kreuzvalidierung statt Redundanz ermöglichen und so die Interpretierbarkeit von Mikrobiota–T2DM-Assoziationen stärken.
Die vorliegende Studie konzentriert sich auf drei Aspekte. Erstens werden Veränderungen der Darmmikrobiota bei neu diagnostizierten, behandlungsnaiven T2DM-Patienten bewertet, um Störungen durch pharmakologische Eingriffe zu reduzieren. Zweitens integriert es taxonomisches Profiling mit vorhergesagten funktionellen Wegen, um eine systemebene Sicht auf mikrobiota-assoziierte Stoffwechselveränderungen zu liefern. Drittens integriert sie die Mendelsche Randomisierungsanalyse, um zu beurteilen, ob beobachtete Assoziationen mit genetisch vorhergesagten Beziehungen übereinstimmen, wodurch methodische Triangulation ermöglicht wird. Zusammen bieten diese Aspekte einen komplementären und reproduzierbaren Rahmen für die Mikrobiomanalyse statt einer rein beschreibenden Studie, wodurch diese Arbeit von früheren Studien unterschieden wird, die typischerweise auf einmethodischen Beobachtungsdesigns basieren und keine mikrobielle Profilierung, funktionelle Vorhersage und genetisch informierte Inferenz in einem einheitlichen analytischen Rahmen integrieren.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Alle Verfahren mit menschlichen Teilnehmern wurden vom Ethikausschuss des Chongqing Chenjiaqiao Krankenhauses überprüft und genehmigt (Genehmigungsnr. 20240131). Vor der Probenentnahme wurde von allen Teilnehmern eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt. Alle Stuhlproben und Teilnehmerinformationen wurden mit de-identifizierten Studiencodes verarbeitet, wie sie in der Materialtabelle aufgeführt sind.
Teilnehmerauswahl und Einschreibung
Neu diagnostizierte Patienten mit T2DM, die zwischen Juni 2023 und Dezember 2023 das Chongqing Chenjiaqiao Hospital besuchten, wurden auf ihre Berechtigung untersucht. Die Teilnehmer wurden in die DM-Gruppe aufgenommen, wenn sie zwischen 20 und 65 Jahre alt waren, eine neue Diagnose von T2DM hatten, einer frischen Stuhlprobe zustimmten und die erforderliche Anamnesbegutachtung sowie klinische Untersuchungen absolvierten. Gesunde Freiwillige, die im gleichen Zeitraum rekrutiert wurden, wurden als nicht-diabetisch gematchte (NM) Gruppe einbezogen und so eng wie möglich hinsichtlich Alter, Geschlecht und allgemeinen demografischen Merkmalen der DM-Gruppe zugeordnet. Teilnehmer wurden ausgeschlossen, wenn sie hämatologische Erkrankungen, Erkrankungen des zentralen Nervensystems, aktive rheumatische Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, akute oder chronische Magen-Darm-Infektionen, chronischer Durchfall, Verstopfung, aktives oder heilendes Magen-Darm-Ulkus, entzündliche Darmerkrankungen, Reizdarmsyndrom, intestinale Tuberkulose, gastrointestinale Tumore, andere Malignitäten, schwere Herzinsuffizienz, schwere Leberinsuffizienz, schwere Niereninsuffizienz und andere schwere Stoffwechselerkrankungen hatten. Krankheiten, Mangelernährung, Immunschwäche, angeborene Stoffwechselstörungen, psychiatrische Erkrankungen, Gebrauch von Beruhigungsmitteln und Hypnose oder Drogenmissbrauch. Teilnehmer wurden außerdem ausgeschlossen, wenn sie innerhalb eines Monats vor der Stuhlentnahme Antibiotika, säuresuppressive Mittel, gastrointestinale Motilitätsmedikamente, Probiotika, Glukokortikoide oder Immunsuppressiva erhalten hatten. Darüber hinaus wurden Personen, die Durchfall erlebt hatten, sich einer gastrointestinalen Operation oder gastrointestinalen Endoskopie unterzogen oder innerhalb eines Monats von plötzlichen Veränderungen der Wohnumgebung oder Ernährungsgewohnheiten berichtet hatten, ausgeschlossen. Vor der Probenentnahme wurde jedem berechtigten Teilnehmer ein einzigartiger Studiencode zugewiesen. Aus der berechtigten Kohorte wurden 12 neu diagnostizierte T2DM- und 12 NM-Teilnehmer für die nachträgliche 16S-rDNA-Sequenzierung und Mikrobiomanalysen basierend auf der Probenverfügbarkeit und den Anforderungen an die Sequenzierungsqualität ausgewählt.
Entnahme und Lagerung von Stuhlproben
Jeder Teilnehmer erhielt einen sterilen Stuhlsammlungsbehälter, der nur mit dem zugewiesenen Studiencode beschriftet war, um die Deidentifikation zu gewährleisten. Die Teilnehmer wurden angewiesen, ihre Blase vor der Defäkation zu entleeren, um eine Urinkontamination zu minimieren, und frischen Stuhl direkt in den sterilen Behälter zu holen, ohne mit Toilettenwasser, Urin, Desinfektionsmitteln oder anderen potenziellen Schadstoffen in Kontakt zu kommen. Unmittelbar nach der Entnahme wurden etwa 1–2 g Stuhl mit einem sterilen Einweg-Probelöffel in ein steriles kryogenes Rohr überführt. Das Rohr wurde fest versiegelt und sofort auf Trockeneis oder in einen vorgekühlten Transferbehälter gelegt. Alle Proben wurden innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme ins Labor transportiert. Bei Ankunft im Labor wurde der Studiencode überprüft und jedes Rohr auf Leckage oder sichtbare Kontamination überprüft. Für alle Proben wurden Entnahme- und Lagerzeiten aufgezeichnet. Stuhlproben wurden anschließend bei −80 °C gelagert, bis genomische DNA-Extraktion durchgeführt wurde. Proben galten für eine nachgelagerte Analyse nur dann als akzeptabel, wenn sie während der Lagerung und des Transports vollständig eingefroren blieben und keine Hinweise auf Rohrleckage oder äußere Kontamination zeigten.
Genomische DNA-Extraktion
Die Stuhlproben wurden aus −80 °C Lagerung entfernt und vor der Verarbeitung auf Eis gelegt. Jede Probe wurde nur so lange aufgetaut, bis eine Homogenisierung möglich war, um den durch wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen verbundenen Abbau zu minimieren. Ungefähr 200 mg Stuhl wurden in ein steriles Mikrozentrifugenrohr übergeben, und der im Stuhl-DNA-Extraktionskit bereitgestellte Lysepuffer wurde gemäß den Herstelleranweisungen in der Materialtabelle hinzugefügt. Die Proben wurden 30 Sekunden lang energisch vortexiert, um eine vollständige Homogenisierung zu erreichen, und anschließend bei Raumtemperatur für 5–10 Minuten inkubiert, um die Zelllyse zu erleichtern. Nach der Lyse wurden die Proben bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Der Supernatant wurde vorsichtig in ein neues, steriles Mikrozentrifugenrohr übertragen, ohne das Pellet zu stören. Genomische DNA wurde anschließend mit dem mit dem Kit gelieferten Elutionspuffer oder nukleasefreiem Wasser gemäß dem Protokoll des Herstellers eluiert. Die extrahierte DNA wurde bei −20 °C für den kurzfristigen Gebrauch oder bei −80 °C zur Langzeitkonservierung gelagert. DNA-Proben, die für die nachgelagerte Analyse geeignet galten, waren klar und frei von sichtbarem Partikelmaterial.
DNA-Qualitätsbewertung
Die DNA-Qualität wurde mittels Agarosegel-Elektrophorese und fluoreszenzbasierter Quantifizierung bewertet. Ein 1%iger Agarosegel wurde im Elektrophoresepuffer hergestellt, und die extrahierten DNA-Proben, vermischt mit dem Ladepuffer, wurden in die Gelbrunnen geladen. Die Elektrophorese wurde durchgeführt, bis die DNA-Bänder ausreichend getrennt waren, danach wurde das Gel unter ultravioletter oder blauer Lichtbeleuchtung untersucht. DNA-Integrität galt als akzeptabel, wenn ein intaktes genomisches DNA-Band ohne deutlichen Abbau oder übermäßige Verschmierung beobachtet wurde. Die DNA-Konzentration wurde anschließend mit einem fluoreszenzbasierten DNA-Quantifizierungssystem quantifiziert. Die Proben wurden dann auf die für die nachgelagerte PCR-Amplifikation erforderliche Konzentration verdünnt. Hochwertige DNA-Proben wiesen typischerweise ein deutliches Band auf der Agarosegel-Elektrophorese auf und waren ausreichend konzentriert für spätere Amplifikationsverfahren.
PCR-Amplifikation der 16S rDNA V3–V4-Region
Die V3–V4-hypervariable Region der bakteriellen 16S-rDNA wurde mit barcodedierten Primern amplifiziert. Die Zündersequenzen waren wie folgt: vordere Zündhütung 5′-ACTCCTACGGGAGGCAG-3′ und Rückwärtszündung 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′. PCR-Reaktionen wurden auf Eis in einem Endvolumen von 20 μL hergestellt, das 4 μL PCR-Puffer, 2 μL Nukleotidgemisch (2,5 mmol/L), jeweils 0,8 μL Vorwärts- und Rückwärtsprimer (5 μmol/L), 0,4 μL hochpräzise DNA-Polymerase, 10 ng Template-DNA und nukleasefreies Wasser pro Volumen enthielt. Die Reaktionsmischungen wurden sanft durch Pipettieren vermischt und kurz zentrifugiert, um die Flüssigkeit am Boden des Rohrs aufzufangen. Die PCR-Verstärkung erfolgte unter folgenden Zyklusbedingungen: Anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten, gefolgt von 25 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 Sekunden, Glühen bei 55 °C für 30 Sekunden und Verlängerung bei 72 °C für 30 Sekunden, mit einem abschließenden Ausbreitungsschritt bei 72 °C für 10 Minuten. Um den Amplifikationsbias zu minimieren, wurde jede Probe in dreifachen Reaktionen verstärkt, und die daraus resultierenden PCR-Produkte derselben Probe wurden anschließend in einem einzigen Röhrchen zusammengefasst. Die erfolgreiche Verstärkung wurde durch das Vorhandensein eines klaren Ampliconbandes der erwarteten Größe bei der Agarosegel-Elektrophorese bestätigt.
PCR-Produktverifikation und -reinigung
PCR-Produkte wurden mit 2%iger Agarosegel-Elektrophorese verifiziert. Die kombinierten PCR-Produkte jeder Probe wurden auf das Gel geladen und elektrophoresisiert, bis die Zielampliconbänder klar getrennt waren. Bänder, die der erwarteten Amplicongröße entsprachen, wurden mit einer sauberen, sterilen Klinge entfernt und mit einem Gel-Extraktionsset gemäß den Herstelleranweisungen in der Materialtabelle gereinigt. Gereinigte PCR-Produkte wurden anschließend in Elutionspuffer oder nukleasefreiem Wasser eluiert. Die Konzentration jedes gereinigten PCR-Produkts wurde mit einem fluoreszenzbasierten DNA-Quantifizierungssystem quantifiziert, und die Konzentrationswerte wurden für die nachgelagerte Bibliotheksvorbereitung erfasst. Erfolgreiche Verstärkung und Reinigung wurden durch ein einzelnes, klares Band bei der erwarteten Amplicongröße bei der Agarosegel-Elektrophorese bestätigt.
Bibliotheksvorbereitung und Pooling
Sequenzierungsbibliotheken wurden mit einem DNA-Bibliotheks-Vorbereitungsset gemäß den Herstelleranweisungen in der Materialtabelle vorbereitet. Sequenzierungsadaptersequenzen wurden gemäß dem Standard-Bibliotheksvorbereitungsprozess an die gereinigten Amplicons gebunden. Adapter-ligierte Produkte wurden je nach gewähltem Bibliotheksvorbereitungsprotokoll entweder entweder mit Gelextraktion oder einer perlenbasierten Reinigungsmethode gereinigt. Gereinigte Bibliotheksprodukte wurden mit 2%iger Agarosegel-Elektrophorese untersucht, um die angemessene Fragmentverteilung zu bestätigen. Die Bibliothekskonzentrationen wurden mit einem fluoreszenzbasierten DNA-Quantifizierungssystem quantifiziert. Basierend auf DNA-Konzentration und Fragmentgröße wurde jede Bibliothek auf dieselbe molare Konzentration normalisiert, um eine ausgewogene Sequenztiefe über die Proben hinweg zu gewährleisten. Gleiche molare Mengen einzelner Bibliotheken wurden dann im Verhältnis 1:1 zusammengefasst, um den endgültigen Sequenzbibliothekspool zu erzeugen. Vor der Sequenzierung wurde die gepoolte Bibliothek gemäß dem Sequenzierungsplattform-Protokoll vor dem Sample-Laden denaturiert. Bibliotheken, die als geeignet für die Sequenzierung angesehen wurden, zeigten eine klare Fragmentverteilung innerhalb des erwarteten Größenbereichs und eine ausreichende Konzentration für die nachgelagerte Sequenzierungsanalyse.
Paar-End-Sequenzierung
Die endgültige Pool-Bibliothek wurde gemäß den Standardarbeitsverfahren des Herstellers auf eine gepaarte Endsequenzierungsplattform geladen. Die Paarend-Sequenzierung wurde entweder mit einer 2 × 250 bp oder 2 × 300 bp Run-Konfiguration durchgeführt, um eine ausreichende Sequenztiefe für eine umfassende Charakterisierung der mikrobiellen Diversität in jeder Probe sicherzustellen. Die Sequenzierungsqualität wurde während des gesamten Laufs mittels plattformgenerierter Qualitätskennzahlen überwacht. Nach Abschluss der Sequenzierung wurden für jede Probe rohe FASTQ-Dateien mit gepaarten Enden für die nachgelagerte bioinformatische Analyse exportiert. Sequenzierungsdatensätze galten als akzeptabel, wenn sie eine ausreichende Lesetiefe pro Probe, angemessene Q30-Qualitätswerte und eine erfolgreiche Barcode-Zuweisung zeigten.
Rohsequenzverarbeitung
Roh-gepaarte FASTQ-Dateien wurden in eine Mikrobiom-Bioinformatik-Analysepipeline zur nachgelagerten Verarbeitung importiert. Die Sequenzen wurden basierend auf den jeweils jeder Probe zugewiesenen Barcodes demultiplexiert. Qualitätsfilterung wurde anschließend durchgeführt, um Lesungen mit niedriger Bewertung, mehrdeutige Basen oder Sequenzierungsartefakte zu entfernen. Niedrigqualitative Basen am Ende der Lesungen wurden basierend auf der Qualitätsverteilung der Punktzahl getrimmt, um die Gesamtzuverlässigkeit der Sequenzen zu verbessern. Nach der Qualitätskontrolle wurden gepaarte Endlesungen über sich überlappende Regionen hinweg zusammengeführt, um vollständige Sequenzen zu rekonstruieren. Für spätere Mikrobiomanalysen wurden nur hochwertige, zusammengeführte Sequenzen beibehalten.
Generierung von Amplicon-Sequenzvarianten (ASV) und taxonomische Annotation
Das Sequenz-Deoising wurde mit einem validierten Deoising-Algorithmus durchgeführt, darunter DADA2 oder Deblur, um Sequenzfehler zu korrigieren und die Sequenzgenauigkeit zu verbessern. Chimäre Sequenzen wurden während des Entraubungsprozesses identifiziert und entfernt. Repräsentative ASV-Sequenzen und entsprechende ASV-Häufigkeitstabellen wurden anschließend für jede Probe erstellt. Die taxonomische Zuordnung von ASV-Sequenzen erfolgte mit einem Naiven Bayes-Klassifikator, und taxonomische Annotationen wurden anhand der SILVA 138 Referenzdatenbank durchgeführt. Taxonomische Häufigkeitstabellen wurden auf Stamm-, Familien- und Gattungsebene für nachgelagerte Analysen exportiert. Der endgültige ASV-Datensatz enthielt repräsentative Sequenzen, Häufigkeitsinformationen und entsprechende taxonomische Annotationen für jede Probe.
Alpha- und Beta-Diversitätsanalyse
Alpha-Diversitätsindizes, darunter Chao, ACE, Shannon, Simpson und Coverage, wurden berechnet, um die mikrobielle Diversität und Vielfalt innerhalb der Stichprobe zu bewerten. Alpha-Diversitätsindizes wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die Normalität der Daten wurde mit dem Shapiro–Wilk-Test bewertet. Normalverteilte Variablen wurden zwischen den DM- und NM-Gruppen mittels Student's t-Tests verglichen, während nicht-normalverteilte Variablen mit Wilcoxon-Rangsummentests analysiert wurden. Beta-Diversitätsdistanzen wurden anschließend mit einer geeigneten Distanzmatrix berechnet, um Unterschiede in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zwischen den Proben zu bewerten. Die Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) wurde durchgeführt, um Unterschiede in der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur zwischen Gruppen zu visualisieren. Zusätzlich wurde eine Analyse der Ähnlichkeiten (ANOSIM) durchgeführt, um festzustellen, ob Intergruppenunterschiede die intragruppenmäßige Variation überstiegen, und die entsprechenden ANOSIM-R- und p-Werte wurden berichtet. Die Alpha-Diversitätsanalyse spiegelte die mikrobielle Vielfalt innerhalb der Probe wider, während die Beta-Diversitätsanalyse Unterschiede in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften zwischen den Gruppen bewertete.
Differentialtaxonomische Analyse
Die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften wurde auf Stamm-, Familien- und Gattungsebene zusammengefasst. Gestapelte Bar-Plots wurden erstellt, um die relative Häufigkeit dominanter Taxa über einzelne Stichproben und Studiengruppen hinweg zu visualisieren. Pan-/Core-Kurven und Venn-Diagramme wurden weiter konstruiert, um gemeinsame und gruppenspezifische ASVs zwischen den DM- und NM-Gruppen zu vergleichen. Unterschiede in der Taxonhäufigkeit zwischen den Gruppen wurden mittels Wilcoxon-Rangsummentests bewertet. Die LEfSe-Analyse wurde anschließend durchgeführt, um mikrobielle Taxa zu identifizieren, die am stärksten zur Intergruppendiskriminierung beitrugen. Die differentielle taxonomische Analyse ermöglichte die Identifizierung mikrobieller Taxa, die entweder in der DM- oder NM-Gruppe angereichert sind.
Funktionale Vorhersage
PICRUSt2 oder eine äquivalente validierte funktionelle Vorhersagepipeline wurde verwendet, um mikrobielle funktionelle Signalwege aus 16S rDNA-Sequenzierungsprofilen abzuleiten. ASV-Häufigkeitsdaten wurden gemäß den Anforderungen der ausgewählten analytischen Pipeline normalisiert, und vorhergesagte Funktionen wurden auf KEGG- oder MetaCyc-Wegannotationen abgebildet. Die vorhergesagten Signalweghäufigkeiten wurden anschließend zwischen den DM- und NM-Gruppen verglichen. Signifikant unterschiedliche Wege wurden mithilfe von Heatmaps oder anderen geeigneten grafischen Ansätzen visualisiert. Vorhergesagte Funktionen wurden als abgeleitetes mikrobielles metabolisches Potenzial interpretiert, nicht als direkt gemessene Metabolitenhäufigkeit. Die funktionelle Prädiktionsanalyse ermöglichte die Identifizierung von mikrobiellen Kandidaten, die sich zwischen den Gruppen unterschieden, einschließlich Wegen, die mit dem Kohlenhydrat- und Aminosäurestoffwechsel assoziiert sind.
Mendelsche Randomisierungsanalyse
Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) Zusammenfassungsstatistiken für die Darmmikrobiota wurden aus öffentlich zugänglichen Datensätzen gewonnen10. Genomweite signifikante Assoziationsdaten für mikrobielle Taxa wurden aus dem NHGRI-EBI GWAS-Katalog (https://www.ebi.ac.uk/gwas/) mit Accessionsnummern von GCST90032172 bis GCST90032644 abgerufen. Weitere metagenomische Daten wurden aus der FINRISK-2002-Kohorte über das European Genome-Phenome Archive (Forschungs-ID: EGAS00001005020) abgerufen. GWAS-Zusammenfassungsstatistiken für Typ-2-Diabetes mellitus wurden ebenfalls aus dem NHGRI-EBI GWAS-Katalog (Zugangsnummer: EBI-A-GCST006867) gewonnen. Genetische Varianten, die mit mikrobiellen Taxa assoziiert sind, wurden gemäß vordefinierten statistischen Schwellenwerten als instrumentelle Variablen ausgewählt, und Varianten im Verknüpfungsungleichgewicht wurden ausgeschlossen. Expositions- und Ergebnisdatensätze wurden harmonisiert, um eine konsistente Allelorientierung sicherzustellen. Die Mendelsche Randomisierungsanalyse wurde anschließend mit der inversen Varianzgewichteten (IVW)-Methode als primärer analytischer Ansatz durchgeführt. Sensitivitätsanalysen wurden mit MR-Egger- und gewichteten Medianmethoden durchgeführt. Die Instrumentenstärke wurde mittels F-Statistik bewertet, während die Heterogenität zwischen den instrumentellen Variablen mit dem Cochranschen Q-Test bewertet wurde. Die horizontale Pleiotropie wurde mit dem MR-Egger-Intercept-Test untersucht. Die Bonferroni-Korrektur wurde angewandt, um mehrere Vergleiche zu berücksichtigen. Mendelsche Randomisierungsergebnisse wurden als genetisch vorhergesagte Assoziationen und nicht als eindeutige Kausalitätsbelege interpretiert.
Datenausgabe und Endpunkt
Die endgültigen analytischen Ergebnisse umfassten ASV-Häufigkeitstabellen, taxonomische Zusammensetzungsdiagramme, Alpha-Diversitätsmetriken, Beta-Diversitätsanalysen, differentielle taxonomische Ergebnisse, vorhergesagte funktionale Wegprofile und Mendelsche Randomisierungsschätzungen. Alle Stichprobenkennungen in den Sequenzierungsdatensätzen wurden überprüft, um die Konsistenz mit den entsprechenden de-identifizierten Studiencodes sicherzustellen. Rohsequenzierungsdateien, verarbeitete ASV-Tabellen, statistische Ausgaben und Figurenquellendateien wurden für nachgelagerte Analysen und Datenmanagement archiviert. Das Protokoll galt als vollständig, nachdem hochwertige Sequenzierungsdaten, taxonomische Profile, Diversitätsmetriken, prognostizierte funktionale Weganalysen und Mendelsche Randomisierungsergebnisse erfolgreich generiert und verifiziert worden waren.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Die demografischen und klinischen Merkmale der ursprünglich gescreenten klinischen Kohorte sind in Tabelle 1 dargestellt. Eine repräsentative Untergruppe, bestehend aus 12 neu diagnostizierten T2DM- und 12 NM-Teilnehmern, wurde anschließend für die 16S-rDNA-Sequenzierung und nachgelagerte Mikrobiomanalysen ausgewählt.
Bewertung der Sequenztiefe
Der Shannon-Index wurde berechnet und die Verdünnungsku...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
In den letzten Jahren hat sich das menschliche Mikrobiom, insbesondere die Darmmikrobiota, als komplexer und einflussreicher Faktor im Wirtsstoffwechsel, der Immunregulation und der Krankheitsentwicklung etabliert. Bei einem gesunden Wirt trägt die Darmmikrobiota zur Immunhomöostase und zur Integrität der Darmbarriere11 bei. Dysbiose wurde mit einer Reihe pathologischer Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Stoffwechselstörungen, Autoimmunerkrankungen und ...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.
BEITRÄGE DER AUTOREN:
Linrui Xie und Kemiao Chen führten Datenanalysen durch und entwarfen das Manuskript. Xican Pan beteiligte sich an der Probenentnahme und experimentellen Verfahren. Xuemei Zhong und Xiaoyu Li konzipierten und entwarfen das Arbeitszimmer, beaufsichtigten das Projekt und überarbeiteten das Manuskript kritisch. Alle Autoren überprüften und genehmigten das endgültige Manuskript.
Die Autoren danken allen Teilnehmern und Mitarbeitenden, die an der Probenentnahme und Datenverarbeitung beteiligt sind, für ihre Beiträge zu dieser Studie.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 16S rRNA Primers (V3–V4) | Sangon Biotech | Custom | Universale Primer für die bakterielle 16S-Region |
| 80 °C Freezer | Haier Biomedical | DW-86L626 | Langzeitlagerung von Proben |
| Agarose Gel System (Sub-Cell GT) | Bio-Rad | 170-4401 | Validierung des PCR-Produkts |
| AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA-Reinigung und Größenselektion |
| Bead-beating Tubes (Lysing Matrix E) | MP Biomedicals | 116913050 | Mechanische Lyse von mikrobiellen Zellen |
| Bioinformatics Workstation | Dell | Precision 7920 | Datenanalyse mit QIIME2 und R |
| DADA2 pipeline | Bioconductor | Version 1.28 | Sequenz-Denoising und ASV-Generierung; https://benjjneb.github.io/dada2 |
| Deblur | QIIME2 | Version 2023.5 | Sequenz-Denoising und Fehlerkorrektur; https://docs.qiime2.org |
| European Genome-Phenome Archive | EMBL-EBI | EGAS00001005020 | Öffentliches Metagenom-Datensatz-Repository; https://ega-archive.org |
| GWAS Catalog | NHGRI-EBI | Accessions GCST90032172–GCST90032644 | Öffentliche Datenbank für genomweite Assoziations-Zusammenfassungsstatistiken; https://www.ebi.ac.uk/gwas |
| Illumina MiSeq Sequencing System | Illumina | SY-410-1003 | Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattform |
| KEGG database | Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes | Release 107 | Datenbank für funktionelle Pathway-Annotation; https://www.genome.jp/kegg |
| MetaCyc database | SRI International | Version 27.1 | Metabolische Pathway-Datenbank; https://metacyc.org |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | Kühlzentrifuge zur Probenvorbereitung |
| Nextera XT Library Prep Kit | Illumina | 20018705 | Bibliotheksvorbereitung für Sequenzierverfahren |
| PCR Master Mix (2x PrimeSTAR Max Premix) | Takara Bio | RR350A | Für hochtreue PCR |
| PCR Thermocycler | Bio-Rad | T100 | PCR-Amplifikationsinstrument |
| PICRUSt2 | PICRUSt2 Development Team | Version 2.5.2 | Funktionelle Pathway-Vorhersage aus 16S rDNA-Sequenzierungsdaten; https://github.com/picrust/picrust2 |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | DNA-Extraktion aus Stuhlproben |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | DNA-Reinigung aus Agarose-Gel |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | DNA-Quantifizierung |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | Version 4.3.1 | Statistische Analyse und Mendelsche Randomisierungsanalyse; https://www.r-project.org |
| SILVA 138 database | SILVA ribosomal RNA database project | Release 138 | Referenzdatenbank für taxonomische Annotation; https://www.arb-silva.de |
| Stool Collection Tube | Sarstedt | 76.9923.001 | Sterile Stuhlproben-Aufnahmeröhre |
| Stool DNA Kit | Omega | D4015-02 | DNA-Extraktionskit |
| TwoSampleMR package | MR-Base | Version 0.5.7 | Mendelsche Randomisierungsanalyse in R; https://mrcieu.github.io/TwoSampleMR |