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Diese Studie wurde vom Ethikausschuss des Liyuan-Krankenhauses, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology genehmigt [Genehmigungsnummer: 2026IEC(RYJ016)]. Alle Patienten gaben eine informierte Einwilligung, und die Entnahme und Nutzung klinischer Proben entsprach den einschlägigen ethischen Richtlinien der Erklärung von Helsinki. Die wichtigsten experimentellen Materialien und Instrumente, die in dieser Studie verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.
Entnahme klinischer Gewebeproben und Nachweis der CDCP1-Expression
Chirurgische Gewebeproben wurden von sieben Patienten entnommen, bei denen zwischen Januar 2019 und Dezember 2019 Nasopharyngealkarzinom diagnostiziert wurde. Gleichzeitig wurden Nasengewebeproben von sechs Patienten mit Rhinitis als Kontrollpersonen entnommen. Alle Gewebeproben wurden nach der Entnahme sofort in flüssigem Stickstoff für die anschließende RNA-Extraktion eingefroren.
RNA-Extraktion und quantitative PCR-Detektion in Echtzeit
Die gesamte RNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers aus Gewebeproben extrahiert. Für jede Probe wurden 50–100 mg Gewebe auf Eis in 1 ml Extraktionsreagenz mit einem Gewebehomogenisator verarbeitet. Die Homogenisierung wurde 30 Sekunden lang durchgeführt und dreimal wiederholt, um eine vollständige Störung des Gewebes sicherzustellen. Nach Gewebestörung erhielt jedes Lysat 200 μL Chloroform. Die Röhren wurden 15 Sekunden lang kräftig durch Vortexen geschüttelt, 3 Minuten bei Raumtemperatur gehalten und dann 15 Minuten bei 4 °C bei 12.000 × g gedreht, um die Phasen zu trennen. Die klare wässrige Schicht wurde entfernt, ohne die Interphase zu stören, und in ein neues Rohr überführt.
RNA wurde aus diesem wässrigen Anteil durch Zugabe von Isopropanol im Volumenverhältnis von 1:1 gewonnen. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Proben bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, um die RNA zu pelletieren. Das Überdachungsmittel wurde entsorgt und das Pellet einmal mit 1 ml 75% Ethanol abgespült. Nach einem zweiten Zentrifugationsschritt bei 7.500 × g für 5 Minuten bei 4 °C wurde die Ethanolwaschung entfernt. Das RNA-Pellet wurde anschließend 5–10 Minuten bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet und in 20 μL RNase-freiem Wasser wieder suspendiert. RNA-Menge und Reinheit wurden spektrophotometrisch bestimmt.
Für die cDNA-Präparation wurde 1 μg Gesamt-RNA für die Reverse-Transkription verwendet. Die Reaktion erfolgte bei 37 °C für 15 Minuten und wurde dann für 5 Sekunden auf 85 °C erhitzt. Quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) wurde anschließend mit TB Green Premix Ex Taq II auf einem Echtzeit-PCR-System durchgeführt. Jede 20-μL-Reaktion enthielt 2 μL cDNA-Template, Vorwärts- und Rückwärtsprimer mit jeweils 0,4 μmol/L, 10 μL SYBR Green-Premix und nukleasefreies Wasser. Das Amplifikationsprotokoll begann mit einer Denaturierung bei 95 °C für 30 Sekunden. Darauf folgten 40 Zyklen, wobei jeder Zyklus 95 °C für 5 Sekunden und 60 °C für 30 Sekunden für Glüh- und Verlängerungszeiten umfasste. Die Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Immunhistochemische Detektion der CDCP1-Proteinexpression
Gewebeproben wurden zunächst 24 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert, gefolgt von Standarddehydrierung, Paraffineinbettung und der Vorbereitung von 4 μm dicken Schnitten. Die Paraffinabschnitte wurden anschließend mit Xylol behandelt, um Paraffin zu entfernen, und sequentiell durch graduierte Ethanollösungen rehydriert. Für die Antigenentmaskierung wurden die Objektträger in einen Citratpuffer (pH 6,0) gelegt und nach dem Siedepunkt der Lösung für 3 Minuten in einem Schnellkochtopf erhitzt. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde durch 10 Minuten Aussetzung der Abschnitte mit 3 % Wasserstoffperoxid gedämpft.
Nach Blockade der endogenen Enzymaktivität wurden die Schnitte über Nacht bei 4 °C inkubiert, wobei der Anti-CDCP1-Primärantikörper bei 1:200 verdünnt wurde. Am folgenden Tag wurden die Objektträger mit einem Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörper für 30 Minuten bei Zimmertemperatur behandelt. Die Signalvisualisierung erfolgte mit einem DAB-Substratkit, und die Schnitte wurden anschließend mit Hämatoxylin gekontert. Abschließend wurden die Objektträger dehydriert, montiert und unter einem optischen Mikroskop untersucht.
Zellkultur und Gruppierung
CNE2- und HK1-Zellen des humanen nasopharyngealen Karzinoms wurden in hochglukosehaltigem DMEM erhalten, das mit 10 % fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt wurde. Die Zellen wurden bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO₂ kultiviert. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichten, wurden sie gemäß den folgenden Gruppen transfektiert: Kontrollgruppe (Kontrollgruppe): transfektiert mit leerer Vektor- oder negativer Kontroll-siRNA; CDCP1-Überexpressionsgruppe (CDCP1-OE): transfektiert mit CDCP1-Überexpressionsplasmid ; CDCP1-Silencing-Gruppe (si-CDCP1): transfiziert mit CDCP1 siRNA; Rettungs-Experimentgruppe (CDCP1-OE + U0126): Behandelt mit dem ERK1/2-spezifischen Inhibitor U0126 (10 μmol/L) für 48 Stunden auf Basis der CDCP1-Überexpression .
Die Transfektion erfolgte gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion in 6-Well-Platten mit 2 × 105 Zellen pro Well plattiert, wobei jede Welle 2 mL antibiotikafreies Medium enthielt. Die Transfektion begann, als die Kulturen etwa 70 % Zusammenfluss erreichten. Das Kulturmedium wurde dann entfernt und durch frisches, serumfreies Medium ersetzt. Für jedes Bohrloch wurden entweder 2 μg Plasmid-DNA oder 100 pmol siRNA separat aus 5 μL Transfektionsreagenz hergestellt, wobei jede Komponente in 250 μL reduziertem serumhaltigem Medium verdünnt wurde. Beide Mischungen wurden 5 Minuten bei Zimmertemperatur gelagert. Die verdünnte Nukleinsäure und das Transfektionsreagenz wurden dann kombiniert und bei Raumtemperatur 20 Minuten stehen lassen, um die Transfektionskomplexe zu erzeugen. Diese Komplexe wurden tropfenweise zu den Zellen hinzugefügt, sanft über das Bohrloch verteilt und 6 Stunden lang mit den Zellen inkubiert. Nach Abschluss der Inkubationszeit wurde das Transfektionsgemisch entfernt und die Zellen mit einem vollständigen Medium ausgestattet, das 10 % FBS enthielt.
Zellproliferations-Assay
48 Stunden nach der Transfektion wurden CNE2- und HK1-Zellen aus jeder Gruppe gesammelt und in 96-Bohrlochplatten mit einer Dichte von 3 × 103 Zellen pro Bohrloch und 100 μL Medium pro Bohrloch ausgesaat, mit fünf Replikationsbohrungen pro Gruppe. Nachdem die Zellen 24, 48 oder 72 Stunden kultiviert worden waren, wurden 10 μL MTT-Lösung mit 5 mg/mL zu jedem Brunnen hinzugefügt. Die Platten wurden dann erneut bei 37 °C mit 5 % CO₂ für weitere 4 Stunden inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde der Kultursupernatant vorsichtig entsorgt und 100 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) zu jedem Brunnen hinzugefügt, um die Formazankristalle aufzulösen. Die Platten wurden 10 Minuten lang bewegt, um eine vollständige Auflösung zu gewährleisten. Die Absorption wurde anschließend mit einem Mikroplattenleser bei 570 nm aufgezeichnet, wobei 630 nm als Referenzwellenlänge verwendet wurde.
Apoptose-Aktivitätstest
48 Stunden nach der Transfektion wurden CNE2-Zellen aus jeder Gruppe entnommen, und Caspase-3-Aktivität wurde mit einem Caspase-3-Aktivitäts-Assay Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. Insgesamt wurden 100 μL Lysispuffer in 1 × 106 Zellen gegeben, 15 Minuten auf Eis gelysiert und anschließend bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Das resultierende Supernatant wurde zur späteren Analyse übertragen. Für den Caspase-3-Test erhielt jeder Brunnen 50 μL Reaktionspuffer und 5 μL Caspase-3-Substrat (DEVD-pNA). Die Platte wurde dann 2 Stunden lang bei 37 °C gehalten, und die Absorption wurde mit einem Mikroplattenleser bei 405 nm gemessen.
Western-Blot-Analyse
48 Stunden nach der Transfektion wurden CNE2- und HK1-Zellen aus jeder Versuchsgruppe zur Proteinextraktion entnommen. Die Zellen wurden in einem RIPA-Puffer mit Proteaseinhibitoren zerstört und 30 Minuten lang auf Eis gehalten. Die daraus resultierenden Lysate wurden bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, danach wurden die Supernatantenfraktionen gesammelt. Die Proteinkonzentration wurde mit einem BCA-Protein-Assay-Kit gemessen.
Für die Western-Blot-Analyse wurden 30 μg Gesamtprotein aus jeder Probe mit einem 5-fachen Ladepuffer gemischt und bei 100 °C für 10 Minuten erhitzt, um die Proteine zu denaturieren. Die Proben wurden auf 10%igen SDS-PAGE-Gelen bei 120 V für 90 Minuten getrennt, gefolgt von der Übertragung auf PVDF-Membranen mit einem konstanten Strom von 300 mA für 90 Minuten. Nach dem Transfer wurden die Membranen mit 5 % fettarmer Milch für 1 Stunde bei Zimmertemperatur blockiert.
Die Membranen wurden über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen CDCP1 (1:1.000), E-Cadherin (1:1.000), Vimentin (1:1.000), p-ERK1/2 (1:2.000), ERK1/2 (1:1.000) und GAPDH (1:5.000) inkubiert.
Am folgenden Tag wurden die Membranen dreimal in TBST gespült, wobei jede Wäsche 10 Minuten dauerte. Anschließend wurden sie 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur mit Meerrettichperoxidase-konjugierten sekundären Antikörpern ausgesetzt. Nach drei weiteren TBST-Waschungen wurden die Proteinsignale mit einem ECL-chemilumineszenz-Substrat visualisiert. Die Bandintensität wurde mit der ImageJ-Software gemessen, und GAPDH wurde als Normalisierungssteuerung verwendet.
Statistische Analyse
Alle Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) präsentiert. Unterschiede zwischen mehreren Gruppen wurden durch eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) bewertet, und Tukeys Methode wurde für paarweise Post-hoc-Vergleiche verwendet. Ein P-Wert von < 0,05 galt als statistisch signifikant.