Forschungsartikel

Häufige molekulare Mechanismen und Kandidat-Wirkstoffziele bei Typ-2-Diabetes mellitus und atherosklerotischer Herz-Kreislauf-Erkrankung

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DOI:

10.3791/70237

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4. August 2026

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1Department of Cardiology, Ningxia Gem Flower Hospital, 2Department of General Surgery, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University, 3Department of Anesthesiology, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University, 4Department of Orthopedics, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie identifizierte gemeinsame Gene, biologische Wege, Immunassoziationen und potenzielle therapeutische Ziele, die Typ-2-Diabetes mellitus und atherosklerotische Herz-Kreislauf-Erkrankungen durch integrierte Bioinformatik und experimentelle Validierung zugrunde liegen.

Zusammenfassung

Diese Studie untersuchte die Mechanismen, die der Komorbidität zwischen Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) und atherosklerotischer Herz-Kreislauf-Erkrankung (ASCVD) zugrunde liegen und identifizierte potenzielle therapeutische Ziele. Gemeinsame differenziell exprimierte Gene (C-DEGs) zwischen T2DM und ASCVD wurden aus den GSE78721- und GSE12288-Datensätzen extrahiert. Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Signalweganreicherungsanalysen, Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke (PPI)-Netzwerke, Hub-Gen-Identifikation und Analyse der Drug-Gene Interaction Database (DGIdb) wurden durchgeführt. Die Verbindung zwischen Hub-C-DEGs und immuninfiltrierenden Zellen wurde mit der CIBERSORT-Methode analysiert. Die Expressionsniveaus von Hub-C-DEGs wurden mittels qRT-PCR und Western-Blot-Analysen quantifiziert. Insgesamt wurden 32 C-DEGs identifiziert, die 20 upregulierte und 12 downregulierte Gene umfassen. C-DEGs waren überwiegend in wichtigen Signalwegen angereichert, darunter virale Myokarditis, arrhythmogene Rechtsventrikel-Kardiomyopathie, hypertrophe Kardiomyopathie und dilatierte Kardiomyopathie. Die PPI-Analyse zeigte 29 Knoten und 39 Kanten, was zur Identifikation von acht Hub-C-DEGs (HSP90B1, PLAU, SLPI, TOP3A, NCF4, PRF1, TUBA1C und CS) in beiden Datensätzen führte. Darüber hinaus zeigten Hub-C-DEGs (TOP3A, SLPI, NCF4, PRF1 und PLAU) signifikante Korrelationen mit immuninfiltrierenden Zellniveaus. Medikamente, die speziell auf diese Hub-C-DEGs abzielen, bieten vielversprechende Kandidaten für die Behandlung von T2DM und ASCVD. Zusätzlich wurde die Expression von Hub-C-DEGs sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinniveau bei Patienten mit T2DM und ASCVD validiert. Eine integrierte bioinformatische Analyse erleichterte das Screening von Kandidaten für therapeutische Ziele, Mechanismen und Medikamente für T2DM und ASCVD und lieferte neue Einblicke in molekulare Therapien für diese Erkrankungen.

Einleitung

Diabetes mellitus (DM) ist eine chronische Krankheit mit einer komplexen Ätiologie, die von verschiedenen genetischen und Umweltfaktoren beeinflusst wird und derzeit schätzungsweise 463 Millionen Menschen weltweit betrifft; die Zahl wird bis 2045 voraussichtlich auf 700 Millionen steigen. Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) ist eine multifaktorielle Erkrankung, die durch Insulinresistenz und relativen Insulinmangel durch Betazellversagen gekennzeichnet ist und zu Hyperglykämie und Dyslipidämie führt und 90 % der DM-Fälleausmacht. Insulinresistenz ist ein wichtiger Vorläufer zahlreicher kardiovaskulärer Stoffwechselauffälligkeiten, die gemeinsam die Entwicklung einer atherosklerotischen Herz-Kreislauf-Erkrankung (ASCVD) fördern und deren Prognose beeinflussen können. Die koronare Herzkrankheit (CAD) entsteht hauptsächlich durch die fortschreitende Ansammlung von atherosklerotischem Material, was zu einer Luminalverengung und einer Blutverengungführt. Arteriosklerose wird durch mehrere Faktoren verursacht, darunter Hypercholesterinämie und Diabetes 9,10. Die erheblichen menschlichen und finanziellen Belastungen im Zusammenhang mit T2DM und CAD sowie Herausforderungen im langfristigen Management unterstreichen den dringenden Bedarf an effektiven Präventionsstrategien.

Patienten mit CAD und gleichzeitiger T2DM haben ein deutlich höheres Risiko für Herzereignisse11. Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) sind eine häufige Komplikation von T2DM und stellen die häufigste Mortalitätsursache bei T2DM-Patienten dar, wobei etwa 32,2 % von CVD12 betroffen sind. Die LoDoCo2-Substudie bestätigt, dass das begleitende T2DM mit einem erhöhten Risiko für schwerwiegende kardiovaskuläre Ereignisse in chronischen CAD-Populationen korreliert13. Personen mit T2DM haben ein erhöhtes Risiko für ASCVD14,15, und diejenigen mit chronischer CAD, die ebenfalls Diabetes haben, haben ein deutlich höheres Risiko für nachfolgende kardiovaskuläre Ereignisse16, was einen kritischen, ungedeckten Bedarf an innovativen Behandlungsoptionen unterstreicht.

Eine zunehmende Zahl von Forschungsgruppen screent auf neuartige differenziell exprimierte Gene (DEGs) in T2DM und ASCVD durch umfassende Analysen von transkriptomischen Daten aus verschiedenen Datenbanken. Die Bemühungen konzentrieren sich darauf, den Zusammenhang zwischen diesen Krankheiten aufzuklären und wirksame biologische Funktionen zu identifizieren. Jüngste bioinformatische Studien haben T2DM im Zusammenhang mit anderen Erkrankungen untersucht; zum Beispiel identifizierten Song et al. gemeinsame DEGs zwischen T2DM und Arthrose17, Castillo-Velázquez et al. sagten die Beziehung zwischen Alzheimer und DM18 voraus, und wichtige Gene und Signalwege bei T2DM und polyzystischem Ovarialsyndrom wurden durch bioinformatische Analysen erkannt19. Die molekularen Mechanismen, die T2DM und ASCVD verbinden, sind jedoch weiterhin schlecht verstanden, was die Bedeutung der Identifizierung neuer potenzieller therapeutischer Ziele zur Behandlung des Fortschreitens beider Erkrankungen unterstreicht.

Diese Studie zielt darauf ab, systematisch gemeinsame molekulare Wege und potenzielle therapeutische Ziele zwischen T2DM und ASCVD zu identifizieren, indem eine integrierte bioinformatische Analyse transkriptomischer Daten aus den GSE78721 (T2DM) und GSE12288 (ASCVD) Datensätzen durchgeführt wird. Diese Datensätze wurden ausgewählt, um abgestimmte Patienten- und Kontrollproben für jede Krankheit bereitzustellen, wobei vergleichbare Mikroarray-Plattformen verwendet werden, um eine robuste vergleichende Analyse zu ermöglichen. Der aktuelle Ansatz beinhaltete die Identifizierung häufiger DEGs (C-DEGs), die Durchführung von funktionellen Anreicherungs- und Proteininteraktionsanalysen, die Bewertung von Zusammenhängen mit der Immuninfiltration sowie die Vorhersage interagierender Medikamente. Zusätzlich wurde eine vorläufige experimentelle Validierung durchgeführt. Diese Arbeit liefert neuartige Erkenntnisse und Kandidatenziele zum Verständnis der Komorbidität von T2DM und ASCVD.

Protokoll

Dieses Studienprotokoll wurde vom Institutional Review Board der Ningxia Medical University für Ethik geprüft und genehmigt (Internal Review Board Reference Number: Ethics [2023]-YCSKT-002) und entsprach den in der Helsinkier Erklärung festgelegten Prinzipien. Die schriftliche Zustimmung wurde von allen an der Studie beteiligten Patienten vor deren Teilnahme eingeholt.

Quellen von Expressionsdaten für T2DM und ASCVD

Genexpressionsdaten für T2DM und ASCVD wurden aus den GSE78721- bzw. GSE12288-Datensätzen aus der GEO-Datenbank gewonnen. Beide Datensätze nutzten Mikroarray-Daten aus dem [PrimeView] Affymetrix Human Gene Expression Array und den [HG-U133A] Affymetrix Human Genome U133A Array-Plattformen. Der GSE78721-Datensatz enthielt Expressionsdaten von 68 T2DM-Patienten und 62 normalen Proben (Details in Ergänzungstabelle 1), während der GSE12288-Datensatz Expressionsdaten von 110 ASCVD-Proben und 112 normalen Kontrollpersonen enthielt (Details in Ergänzungstabelle 2). Gensonden wurden auf Basis von Plattformannotationsinformationen in ihre entsprechenden Gensymbole umgewandelt.

Identifikation unterschiedlich exprimierter Gene in T2DM und ASCVD

Nach dem Herunterladen der Daten aus der GEO-Datenbank wurden die rohen Ausdrucksmatrizen für T2DM und ASCVD korrigiert und mit dem Softwarepaket "limma" zur Identifizierung von DEGs normalisiert. Für das DEG-Screening wurde eine Schwelle von P < 0,05 angewendet. Differentialexpressionsergebnisse wurden mit den Paketen 'heatmap' und 'ggplot2' R visualisiert, um jeweils eine Heatmap und ein Vulkandiagramm zu erzeugen. C-DEGs zwischen T2DM und ASCVD wurden anhand eines Venn-Diagramms identifiziert.

Genontologie (GO) funktionelle und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Signalweganreicherungsanalysen von C-DEGs

Biologische Funktionen und Signalwege wurden durch GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen bestimmt. Die R-Paket-Organisation. Hs.eg.db wurde verwendet, um C-DEG-Namen in Gen-IDs umzuwandeln, und die GO-Anreicherungsanalyse wurde mit den R-Paketen clusterProfiler, enrichplot, ggplot2 und GOplot durchgeführt, um gängige biologische Funktionen der C-DEGs zu erforschen. Anschließend wurde eine KEGG-Analyse durchgeführt, um gemeinsame signifikante Signalwege zu identifizieren, die in den molekularen Mechanismen der Komorbidität von T2DM und ASCVD zugrunde liegen. Die Ergebnisse der GO- und KEGG-Anreicherung wurden in Balkendiagrammen dargestellt, die Genzählungen, funktionelle Beschreibungen und P-Werte darstellen, wobei die statistische Signifikanz als P < 0,05 definiert ist.

Analyse des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI) von C-DEGs

C-DEGs und Hub-Gene wurden in dieser Studie als gemeinsame Gene definiert. Um funktionale Assoziationen zwischen diesen gemeinsamen Genen zu bewerten, wurde ein PPI-Netzwerk mit der STRING-Datenbank (https://string-db.org) aufgebaut. Die Analyse begann mit der Auswahl von "Multiple Proteins" unter der Funktion "SEARCH" und der Eingabe der C-DEG-Namen, während die Art als "Homo sapiens" angegeben wurde. Grundlegende Parameter für die C-DEGs wurden so konfiguriert, dass sie das PPI-Regulierungsnetzwerk darstellen. Die Visualisierung des PPI-Netzwerks erfolgte mit der Cytoscape-Software (Version 3.9.1) (https://apps.cytoscape.org/), die eine grafische Darstellung der Interaktionen zwischen den C-DEGs bereitstellte. Hub C-DEGs wurden innerhalb des PPI-Netzwerks mithilfe des CytoHubba-Plugins in Cytoscape identifiziert, basierend auf dem Degree-Ranking-Algorithmus.

Analyse der Immunzellinfiltration

Um die Unterschiede in der Immunzellinfiltration zwischen der T2DM-Gruppe und der normalen Kontrollgruppe zu untersuchen, wurde die CIBERSORT-Methode eingesetzt, um die Häufigkeit verschiedener immuninfiltrierender Zelltypen zu bewerten. Der Wilcoxon-Testalgorithmus wurde anschließend angewandt, um die Anteile dieser infiltrierenden Immunzellen zwischen T2DM und Kontrollproben zu vergleichen und so die Bewertung beobachteter Unterschiede zu erleichtern. Die Visualisierung der Daten erfolgte durch Geigendiagramme. Um die Korrelation zwischen C-DEGs und immuninfiltratorischen Zellen zu validieren, wurden R-Pakete wie limma, scales, tidyverse und ggplot2 zur Berechnung der Spearman-Korrelationskoeffizienten verwendet. Dieser Schritt quantifizierte die Beziehung zwischen C-DEG-Expression und Immunzellinfiltrationsniveaus, wobei die Ergebnisse als Heatmaps dargestellt wurden. Ein P-Wert von weniger als 0,05 galt als statistisch signifikant.

Wechselwirkungsanalyse von Hub-C-DEGs mit potenziell zielgerichteten Medikamenten

Die Drug-Gene Interaction Database (DGIdb) bietet einen umfassenden Katalog von Arzneimittel-Gen-Interaktionen und genetischen Profilen zugelassener und potenzieller Therapeutika. In dieser Studie wurde die Liste der Hub-C-DEGs in die Datenbank eingetragen, um Interaktionsinformationen zwischen den Hub-C-DEGs und ihren potenziellen Zielmedikamenten abzurufen, die anschließend mit der Cytoscape-Software visualisiert wurden.

Experimentelle Validierung von Kerngenen durch klinische Proben

Um die Kerngene experimentell zu validieren, wurden periphere Blutproben von klinischen Probanden entnommen. Die Studienkohorte umfasste eine experimentelle Gruppe und eine Kontrollgruppe. Die experimentelle Gruppe bestand aus 15 Patienten, bei denen sowohl T2DM als auch ASCVD diagnostiziert wurden, was eine komorbide Erkrankung darstellt. Die Kontrollgruppe bestand aus 10 gesunden Freiwilligen ohne Vorgeschichte von Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen oder anderen schwerwiegenden systemischen Erkrankungen, die alters- und geschlechtsangepasst waren. Alle Patienten der experimentellen Gruppe wurden endgültig nach festgelegten klinischen Richtlinien für T2DM und ASCVD diagnostiziert.

Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR)

Total-RNA wurde mit TRIzol-Reagens isoliert, und die cDNA aus dem ersten Strang wurde mit einem Reverse Transcription System Kit synthetisiert. Die cDNA wurde anschließend für qRT-PCR mit SYBR-green PCR Master Mix verdünnt, wobei GAPDH als interne Kontrolle diente. Relative Faltungsänderungen in der Expression wurden mit der 2−ΔΔCt-Methode berechnet. Die für die Analyse verwendeten Zündhütchen waren wie folgt: TUBA1C-vorwärts: 5′-GACCTCGTGTTGGACCGAAT-3′ und rückwärts: 5′-CGAGGTGAACCCAGAACCAG-3′; NCF4 vorwärts: 5′-CTAAGTTTCAAAGCTGGAGATGTG-3′ und rückwärts: 5′-GAATTCCTGAAAGGGCTCCTG-3′; PRF1-vorwärts: 5′-CCCAGTGGACACACAAAGGTT-3′ und rückwärts: 5′-TCGTTGGGGATGCCTACGAG-3′; SLPI-Vorwärts: 5′-CCCTTCCTGGTGCTGCTT-3′ und rückwärts: 5′-CCTCCTTGTTGGGTTTTTGGTTGG-3′; HSP90B1 vorwärts: 5′-CCGAAGAAGAACCTGAAGAG-3′ und rückwärts: 5′-CATCTGTTCCCACATCCATT-3′; PLAU-vorwärts: 5′-GGGGAGATGAAGTTTGAGGTGG-3′ und rückwärts: 5′-GCAATGTCGTTGTGGTGAGC-3′; GAPDH-vorwärts: 5′-CAGGGCTGKTTTTAACTTTGG-3′ und rückwärts: 5′-GGGTGGAATCATATTGGAACA-3′.

Westlicher Blot-Assay

Das Gesamtprotein wurde isoliert, im Lastpuffer verdünnt und durch 10 % SDS-PAGE getrennt, gefolgt von der Übertragung auf PVDF-Membranen. Die Membranen wurden blockiert und mit spezifischen primären Antikörpern untersucht, darunter anti-TUBA1C (1:1000, ab222849), Anti-HSP90B1 (1:1000, ab238126), anti-NCF4 (1:1000, 14648-1-AP), anti-PRF1 (1:1000, ab256453), anti-SLPI (1:1000, ab46763), anti-PLAU (1:1000, 17968-1-AP) und anti-GAPDH (1:5000, 10494-1-AP). Sekundäre Antikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP) (1:2000, ab6721), wurden aufgetragen, und die Bänder wurden mit verstärktem chemilumineszentem (ECL) Substrat visualisiert.

Statistische Analyse

Die statistische Analyse erfolgte mit der GraphPad Prism Software, wobei die Daten als Mittelwert ± SD angegeben wurden. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem Student's t-Test bewertet, und ein P-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Identifikation von DEGs

Zwei Datensätze, GSE78721 und GSE12288, wurden für bioinformatische Analysen in dieser Studie verwendet. Im GSE78721 wurden insgesamt 2.266 DEGs zwischen T2DM-Patienten und normalen Proben identifiziert, darunter 1.209 hochregulierte und 1.057 herunterregulierte Gene (Abbildung 1A). Im Jahr GSE12288 wurden 924 DEGs zwischen ASCVD-Patienten und Kontrollgruppen verifiziert, darunter 403 überexprimierte Gene und 521 herunterregulierte Gene (Abbildung 1C). Die 50 wichtigsten DEGs, die in beiden Datensätzen identifiziert wurden, sind in Heatmaps dargestellt, die in Abbildung 1B,D dargestellt sind. Durch das Kreuzen dieser beiden Datensätze wurden 32 C-DEGs identifiziert, bestehend aus 20 hochregulierten und 12 herunterregulierten Genen (Abbildung 2A,B).

GO- und KEGG-Anreicherung der C-DEGs

Um die biologischen Funktionen und Schlüsselwege, die mit den 32 C-DEGs verbunden sind, zu erläutern, wurden GO- und KEGG-Analysen durchgeführt. Die zehn wichtigsten Begriffe im Zusammenhang mit biologischem Prozess (BP), zellulärer Komponente (CC) und molekularer Funktion (MF) unter den C-DEGs sind in Abbildung 3A dargestellt. Die BP-Funktionen umfassen überwiegend die Regulation der Plasminogenaktivierung, die Regulation der Fibrinolyse, die positive Regulation der Kardiozytendifferenzierung, die negative Regulation der Proteinbindung und die Kardioblastendifferenzierung. Die Funktionen des CC betreffen den Serin-Typ Endopeptidasekomplex, Proteinkomplexe, die an der Zell-Matrix-Adhäsion beteiligt sind, kondensiertes Chromosom, spezifische Granulatmembran und PML-Körper. Das MF umfasst strukturelle Bestandteile des Zytoskeletts, die Superoxid-erzeugende NADPH-Oxidase-Aktivatoraktivierung, die intramolekulare Transferase-Aktivität (Phosphotransferasen), die Serin-Typ-Exopeptidase-Aktivität und die IgG-Bindung (Abbildung 3A). Im Rahmen der KEGG-Analyse waren die C-DEGs hauptsächlich an kritischen Signalwegen beteiligt, darunter virale Myokarditis, arrhythmogene Rechtsventrikel-Kardiomyopathie, Komplement- und Koagulationskaskaden, Prostatakrebs, hypertrophe Kardiomyopathie, dilatierte Kardiomyopathie, Apoptose, Phagosom und Proteinverarbeitung im endoplasmatischen Retikulum (Abbildung 3B).

Aufbau von PPI-Netzwerken und Hub-Gen-Screening

Unter den 32 C-DEGs wiesen drei Gene keine bekannten Interaktionen mit anderen C-DEGs in der STRING-Datenbank auf und wurden daher vom PPI-Netzwerkaufbau ausgeschlossen. Die STRING-Plattform wurde für die PPI-Analyse der verbleibenden 29 C-DEGs eingesetzt und zeigte ein Netzwerk mit 29 Knoten und 39 Kanten, das mit Cytoscape visualisiert wurde (Abbildung 4A). Anschließend wurden acht Hub-C-DEGs (HSP90B1, PLAU, SLPI, TOP3A, NCF4, PRF1, TUBA1C und CS) basierend auf ihrem Konnektivitätsgrad identifiziert (Abbildung 4B).

Unterschiede in der Infiltration von Immunzellen und deren Korrelation zu Hub-C-DEGs

Diese Analyse konzentrierte sich ausschließlich auf den T2DM-Datensatz (GSE78721), um vorläufig Veränderungen im immunologischen Mikroumfeld im Kontext von T2DM und deren Beziehung zu Hub-Genen zu untersuchen. Violindiagramme wurden verwendet, um die Beziehung zwischen dem T2DM-Datensatz und den Infiltrationsniveaus von 22 Immunzelltypen zu visualisieren (Abbildung 5A; Details in ergänzender Tabelle 3). Die Analyse der Immunzellinfiltration zeigte einen höheren Anteil aktiverter dendritischer Zellen in der T2DM-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (P = 0,049), während der Anteil der ruhenden dendritischen Zellen in der T2DM-Gruppe signifikant niedriger war (P = 0,023). Darüber hinaus wurde die Beziehung zwischen den Expressionsniveaus der acht Hub-C-DEGs und den Infiltrationsniveaus der 22 verschiedenen Immunzelltypen mithilfe einer Heatmap visualisiert (Abbildung 5B). Bemerkenswert ist, dass die TOP3A-Expression eine starke positive Korrelation mit dem Infiltrationsniveau regulatorischer T-Zellen (Tregs ) aufwies (P < 0,001), während die SLPI-Expression stark positiv mit der Gamma-Delta-T-Zellinfiltration korreliert war (P < 0,001). Umgekehrt zeigte die NCF4-Expression eine starke negative Korrelation mit dem Infiltrationsniveau aktiverter NK-Zellen (P < 0,001), die PRF1-Expression war stark negativ mit dem Infiltrationsniveau der M2-Makrophagen korreliert (P < 0,001) und die PLAU-Expression war stark negativ mit dem Infiltrationsniveau naiver B-Zellen verbunden (P < 0,001).

Kandidat-Arzneimittelziel-Netzwerk für Hub-C-DEGs

Unter den acht identifizierten Hub-C-DEGs wurden CS und TOP3A nicht als bekannte Arzneimittelziele in der DGIdb-Datenbank aufgeführt und wurden daher von der anschließenden Analyse des Kandidaten-Ziel-Netzwerks ausgeschlossen. Um Medikamente mit potenziellen therapeutischen Rollen bei T2DM und ASCVD zu identifizieren, wurden die verbleibenden sechs Hub-C-DEGs der DGIdb-Datenbank übermittelt (Details in ergänzender Tabelle 4). Anschließend wurde Cytoscape eingesetzt, um ein Kandidaten-Ziel-Netzwerk zu erstellen, das die Zusammenhänge zwischen Hub-C-DEGs und gezielten Kandidatenmedikamenten veranschaulicht (Abbildung 6). Dieses Netzwerk bestand aus sechs Hub-C-DEGs, 136 molekularen Medikamenten und 137 Kanten. Konkret wurden 82, 5, 5, 4, 1 und 42 Kandidaten-Zielmedikamente für TUBA1C, NCF4, PRF1, SLPI, HSP90B1 und PLAU identifiziert, wobei die Mehrheit als antineoplastische, entzündungshemmende und antithrombotische Medikamente klassifiziert wurde.

Validierung des Hub-C-DEG-Ausdrucks

Da CS und TOP3A als Kandidat-Wirkstoffziele in der DGIdb-Datenbank fehlen und ihre biologischen Funktionen weniger direkt mit therapeutischen Strategien im Kontext der T2DM- und ASCVD-Forschung zusammenhängen, konzentrierte sich die Studie auf die verbleibenden sechs Hub-C-DEGs (HSP90B1, PLAU, SLPI, NCF4, PRF1 und TUBA1C) für die experimentelle Validierung. Um die Rolle dieser Hub-C-DEGs weiter zu untersuchen, wurden qRT-PCR und Western-Blot-Assays durchgeführt, um die Expressionsniveaus von Kerngenen in verschiedenen Gruppen zu bewerten (Abbildung 7 und Abbildung 8). Die Expressionswerte von TUBA1C, NCF4, SLPI, HSP90B1 und PLAU wurden bei Patienten mit T2DM und ASCVD im Vergleich zu entsprechenden gesunden Kontrollgruppen signifikant hochreguliert, während die PRF1-Expression herunterreguliert war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Kerngene eine bedeutende Rolle im Fortschreiten von Patienten mit T2DM und ASCVD spielen könnten.

DATENVERFÜGBARKEIT:Die Genexpressionsdatensätze, die GSE78721 und GSE12288 für die bioinformatische Analyse in dieser Studie verwendet werden, sind in der öffentlichen NCBI GEO-Datenbank verfügbar. Die Rohdaten aus dem experimentellen Validierungsteil, der in dieser Studie generiert wird, sind in Supplementary File 1 bereitgestellt.

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Abbildung 1: Identifikation der DEGs in den Datensätzen GSE78721 und GSE12288. (A,C) Die Vulkandiagramme der DEGs in GSE78721 bzw. GSE12288. |logFC|≥ 0,5 und P < 0,05 wurden als Screening-Schwelle festgelegt; die hochregulierten Gene waren als rot markiert, die herunterregulierten Gene als grün. (B,D) Heatmaps der 50 besten DEGs in GSE78721 bzw. GSE12288. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Venn-Diagramm der C-DEGs aus zwei Datensätzen. (A) Venn-Diagramm hochregulierter C-DEGs aus T2DM und ASCVD in GSE78721 und GSE12288 Datensätzen. (B) Venn-Diagramm der herunterregulierten C-DEGs aus T2DM und ASCVD in GSE78721 und GSE12288 Datensätzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Funktionale und Weganreicherungsanalyse von C-DEGs. Balkendiagramme der GO (A) und KEGG (B) Anreicherungsanalysen. Vertikale Koordinaten geben die Beschreibung verschiedener GO-Elemente oder KEGG-Pfade an, und horizontale Koordinaten geben die Anzahl der angereicherten C-DEGs an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: PPI-Netzwerk- und Hub-Gen-Screening von C-DEGs. (A) Das PPI-Netzwerk der C-DEGs. Rot und Blau stehen für die hochregulierten bzw. herunterregulierten C-DEGs. (B) Acht Hub-Gene wurden unter den C-DEGs identifiziert. Knoten stellen einen C-DEG dar, und Kanten stehen für die Interaktion zwischen C-DEGs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 5: Analyse der Immunzellinfiltration. (A) Unterschiede in der Infiltration von 22 Immunzelltypen zwischen der T2DM-Gruppe und der Kontrollgruppe. Horizontale Achse: Subtypen von Immunzellen; Vertikale Achse: relative Infiltrationsstufe der Immunzellen. (B) Korrelations-Wärmekarte der Expression von 8 Hub-C-DEGs und der Infiltrationsniveaus von 22 Immunzelltypen. Rote Quadrate: positive Korrelation; Blaue Quadrate: negative Korrelation. Dunklere Farben deuten auf stärkere Korrelationen hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 6: Kandidat-Arzneimittelziel-Netzwerk für sechs Hub-C-DEGs. Rote Knoten stehen für Hub-C-DEGs, grüne Knoten für Kandidaten-Zielmedikamente und die Kanten zwischen ihnen für Interaktionspaare. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 7: Validierung der Kerngenexpression bei Patienten mit T2DM und ASCVD mittels qRT-PCR. Die mRNA-Expressionsniveaus von HSP90B1 (A), PLAU (B), SLPI (C), NCF4 (D), PRF1 (E) und TUBA1C (F) wurden durch qRT-PCR nachgewiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 8: Validierung der Kerngenexpression bei Patienten mit T2DM und ASCVD durch Western Blot. Die Proteinexpressionswerte von HSP90B1 (A), PLAU (B), SLPI (C), NCF4 (D), PRF1 (E) und TUBA1C (F) wurden durch Western-Blot-Tests nachgewiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Tabelle 1. Genexpressionsmatrix für den GSE78721-Datensatz, verwendet für die T2DM-Transkriptomanalyse in dieser Studie. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2. Genexpressionsmatrix für den GSE12288-Datensatz, verwendet für die ASCVD-Transkriptomanalyse in dieser Studie. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 3: Analyse der Immunzellinfiltration im GSE78721-Datensatz. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 4: Kandidaten-Arzneimittel-Ziel-Interaktionen für zentrale gemeinsame differenziell exprimierte Gene. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Die Rohdaten aus dem experimentellen Validierungsteil, der in dieser Studie generiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

T2DM und ASCVD sind komplexe Krankheiten, wobei neue Hinweise auf einen signifikanten Zusammenhang zwischen beiden hindeuten. Insulinresistenz dient als entscheidender Vorläufer verschiedener kardiovaskulärer Stoffwechselanomalien, darunter T2DM, die zusammen zur Entwicklung von ASCVD beitragen und deren Prognosebeeinflussen können. Außerdem ist DM ein treibender Faktor im Verlauf von Arteriosklerose20. Personen mit T2DM haben ein erhöhtes Risiko von CAD21, dennoch bleiben Fragen zu den zugrunde liegenden Mechanismen der Komorbidität bestehen. Diese Studie zielt darauf ab, die Beziehung und die Mechanismen zwischen diesen beiden Krankheiten zu untersuchen und potenzielle Biomarker durch bioinformatische Analysen und experimentelle Validierung zu identifizieren.

In dieser Studie wurden insgesamt 32 C-DEGs zwischen T2DM und ASCVD identifiziert, bestehend aus 20 hochregulierten und 12 herunterregulierten Genen. Die Analysen der GO- und KEGG-Anreicherung zeigten, dass diese C-DEGs überwiegend in kritischen metabolischen Signalwegen angereichert waren, die eng mit CAD und T2DM22,23 verwandt sind. Acht Hub-C-DEGs (HSP90B1, PLAU, SLPI, TOP3A, NCF4, PRF1, TUBA1C und CS) wurden über beide Bedingungen gescreent. Bemerkenswert ist, dass Hub-C-DEGs (TOP3A, SLPI, NCF4, PRF1 und PLAU) signifikant mit den Infiltrationsniveaus von Immunzellen assoziiert waren. HSP90B1 wurde mit Krebsprogression24 in Verbindung gebracht und könnte auch mit T2DM25 zusammenhängen. Es wurde gezeigt, dass PLAU eine Rolle bei der Verhinderung vorzeitiger vaskulärer Alterung im Zusammenhang mit T2DM26 spielt und für das Fortschreiten der atherosklerotischen Plaque entscheidend ist, da es Einblicke in frühe Warnbiomarker liefert und Mechanismen für das Fortschreitenvon CAD 27 aufklärt. Die Expression von SLPI nimmt mit fortschreitender metabolischer Dysfunktion28 zu und wurde als C-DEG identifiziert, die mit einer beeinträchtigten Glukosetoleranz und T2DM29 assoziiert ist. NCF4 hat Verbindungen zu CAD30 hergestellt und trägt zur Regulation der NADPH-Oxidase-Aktivität und der Inflammasom-Aktivierung31 bei. Aufgrund der Schlüsselrolle von PRF1 bei der Immunüberwachung und Regulation32 besitzt es diagnostisches Potenzial und unterscheidet zwischen Myokardinfarkt und stabilem CAD33. Darüber hinaus fungiert PRF1 als entscheidender immunregulatorischer Akteur bei der fettleibigkeitsbedingten Insulinresistenz34. TUBA1C wurde ebenfalls mit Krebserkrankungen in Verbindung gebracht und steht in Verbindung mit der Immuninfiltration im Tumormikroumfeld35. Es wurde als Anfälligkeitsgen für koronare Herzkrankheiten36 identifiziert. Die Beziehung zwischen ASCVD und T2DM bleibt jedoch noch wenig erforscht.

Die KEGG-Analyse zeigte die Beteiligung dieser Kandidatengene an Signalwegen wie "Komplement- und Gerinnungskaskaden" und "Proteinverarbeitung im endoplasmatischen Retikulum". Experimentelle Validierung von Schlüsselgenen innerhalb dieser Signalwege, insbesondere PLAU (eine Serinprotease, die an Fibrinolyse und Koagulation beteiligt ist) und HSP90B1 (ein endoplasmatisches Retikulum-Chaperon), bestätigte ihre Dysregulation in unserem T2DM-Modell. Diese Ergebnisse ordnen unsere Forschung in einen spezifischen molekularen Rahmen ein und legen nahe, dass Ungleichgewichte in der Stressantwort des endoplasmatischen Retikulums und den thrombolytischen Signalwegen integraler Bestandteil der diabetischen Pathologie sein könnten und über die weithin anerkannten Entzündungsprozesse hinausgehen.

Umfangreiche Forschungen haben dysfunktionale Immunantworten bei diabetischen Patientendokumentiert 37. Abnormale Immunzellaktivierung spielt eine entscheidende Rolle im Fortschreiten von T2DM38,39. Die Immuninfiltrationsanalyse zeigte eine signifikante Veränderung des dendritischen Zellkompartments in T2DM, gekennzeichnet durch einen erhöhten Anteil aktivierter dendritischer Zellen und einen geringeren Anteil ruhender dendritischer Zellen (Abbildung 5A). Dies deutet auf einen Zustand erhöhter Antigenpräsentation und Immunaktivierung in T2DM hin, was möglicherweise zu chronischen entzündlichen Schäden in Zielgeweben beiträgt. Darüber hinaus deuten starke Korrelationen zwischen spezifischen Hub-Genen (z. B. NCF4 mit aktivierten NK-Zellen, PRF1 mit M2-Makrophagen) (Abbildung 5B) auf mechanistische Verbindungen zwischen der Genexpression im Stoffwechselgewebe und der lokalen Zusammensetzung des Immunsystems hin, wodurch neue Ziele für immunmodulatorische Interventionen identifiziert werden.

Zusätzlich wurde eine Analyse des Arzneimittel-Zielnetzwerks durchgeführt, um potenzielle therapeutische Ziele, zugrunde liegende Mechanismen und Medikamente für T2DM und ASCVD vorherzusagen. Dieses Kandidat-Wirkstoff-Ziel-Netzwerk umfasste sechs Hub-C-DEGs, 136 molekulare Medikamente und 137 Kanten. Die Analyse ergab 82, 5, 3, 4, 1 und 42 Kandidaten-Zielmedikamente für TUBA1C, NCF4, PRF1, SLPI, HSP90B1 bzw. PLAU. Die Mehrheit dieser Medikamente werden als antineoplastische Wirkstoffe, entzündungshemmende und antithrombotische Mittel klassifiziert. Bemerkenswert ist, dass einige Medikamente, darunter Rituximab, Prednison, Antioxidantien, Verapamil, Antibiotika, Colchicin und Heparin, therapeutische Funktionen sowohl bei T2DM 15,40,41,42,43,44,45,46 als auch CAD 15,47,48,49,50 gezeigt haben. 51,52,53,54,55, was auf ihre potenziellen therapeutischen Wirkungen bei Patienten mit T2DM und CAD hinweist. Darüber hinaus haben mehrere Medikamente wie Alendronatnatrium, Calcitriol, Celecoxib, Masoprocol, Mifepriston und Curcumin therapeutische Funktionen speziell in T2DM 56,57,58,59,60,61,62,63 gezeigt, was auch für ASCVD vorteilhaft sein kann. Die Validierung der Expression dieser Hub-C-DEGs in T2DM und ASCVD wurde ebenfalls durchgeführt.

Diese Studie hat mehrere Einschränkungen. Erstens waren die klinischen Stichprobengrößen im Validierungsexperiment unzureichend und sollten erweitert werden. Zweitens ist weitere experimentelle Forschung notwendig, um wertvolle Einblicke in die Verbindung zwischen T2DM und ASCVD zu liefern. Zukünftige Arbeiten werden die Ergebnisse mit größeren klinischen Kohorten validieren und umfassendere experimentelle Studien durchführen, um die molekularen Mechanismen und pathologischen Verbindungen dieser beiden Krankheiten zu klären. Im Abschnitt zur experimentellen Validierung wurden Proben von T2DM- und ASCVD-Patienten zu einer einzigen "experimentellen Gruppe" zum Vergleich mit gesunden Kontrollpersonen zusammengefasst. Während dieses Design die Validierung der Gesamtänderungen der Expression in den identifizierten Kern-C-DEG im komorbiden Zustand erleichterte, unterscheidet es nicht, ob diese Expressionsänderungen spezifisch für T2DM, ASCVD oder von beiden geteilt werden. Nachfolgende Studien sollten verschiedene Gruppen von T2DM-Patienten, ASCVD-Patienten und Personen mit T2DM im Vergleich zu ASCVD vergleichen, um die spezifischen Rollen dieser Gene bei einzelnen Erkrankungen im Vergleich zum komorbiden Zustand genauer abzugrenzen. Außerdem wurde die Analyse der Immunzellinfiltration ausschließlich auf dem T2DM-Datensatz (GSE78721) durchgeführt und für den ASCVD-Datensatz (GSE12288) nicht parallel durchgeführt. Daher spiegeln die berichteten Korrelationen zwischen Hub-C-DEGs und Immunzellinfiltrationsniveaus (z. B. TOP3A mit Tregs, SLPI mit Gamma-Delta-T-Zellen) nur ihre potenziellen immunmodulatorischen Rollen im pathologischen Kontext von T2DM wider. Eine weitere Einschränkung ist das Fehlen einer funktionellen Validierung für die vorhergesagten Wirkstoff-Ziel-Interaktionen. Zukünftige Untersuchungen sollten molekulare Andocksimulationen zur Bewertung der Bindungsaffinität sowie in vivo Experimente mit Tiermodellen zur Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit dieser Kandidaten enthalten.

Abschließend identifizierte diese integrierte bioinformatische Analyse, ergänzt durch vorläufige experimentelle Validierung, mehrere gemeinsame Hub-Gene und -Signalwege zwischen T2DM und ASCVD und schlägt potenzielle Arzneimittelkandidaten vor, die diese Gene anvisieren. Diese Ergebnisse bieten neuartige Hypothesen und Kandidatenziele für eine weitere mechanistische und therapeutische Erforschung des komplexen Zusammenspiels zwischen T2DM und ASCVD.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Die Autoren danken dankbar für die finanzielle Unterstützung durch das Ningxia Natural Science Foundation Program (Fördernr. 2023AAC03498) und das Yinchuan Science and Technology Innovation Project (Fördernr. 2024SF005). Die Autoren danken auch allen Teilnehmern und Forschern, deren Beiträge diese Studie möglich gemacht haben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-GAPDHProteintech60004-1-Ig
Anti-HSP90B1Abcam ab238126
Anti-NCF4 Proteintech14648-1-AP
Anti-PLAUProteintech17968-1-AP
Anti-PRF1Abcamab256453
Anti-SLPI Abcamab46763
Anti-TUBA1CAbcam ab222849
CIBERSORT Stanford Universityhttps://cibersortx.stanford.edu
clusterProfiler (R package)Bioconductorhttp://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
CytoHubba (Cytoscape plugin)Cytoscape Consortiumhttps://apps.cytoscape.org
Cytoscape (version 3.9.1)Cytoscape Consortiumhttp://cytoscape.org/
DGIdb
 (Drug-Gene Interaction Database)		Washington Universityhttp://www.dgidb.org/
Enhanced chemiluminescent (ECL) substrate Thermo Fisher Scientific34080
enrichplot (R package)Bioconductorhttp://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/enrichplot.html
Gel imaging system Bio-RadChemiDox XRS
GEO Database
(Datasets: GSE78721, GSE12288)		NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
ggplot2 (R package)CRANhttps://ggplot2.tidyverse.org
GOplot (R package)CRANhttps://cran.r-project.org/web/packages/GOplot/index.html
GraphPad Prism(version 9.1.2)GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
limma (R package)Bioconductorhttp://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html
loading bufferBio-Rad1610737
org.Hs.eg.db (R package)Bioconductorhttps://bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/org.Hs.eg.db.htm
PVDF membraneBio-Rad1620177
R software (version 4.0.2) R Foundationhttps://www.r-project.org/
Real-time PCR systemBio-RadCFX-96
Reverse Transcription System KitTakaraD6110A
scales (R package)CRANhttps://CRAN.R-project.org/package = scales
SDS-PAGE GelsBio-Rad4561085
Secondary antibodyAbcam ab6721
STRING databasSTRING Consortiumhttps://string-db.org/
SYBR-green PCR Master MixVazyme BiotechCat #Q311-02
tidyverse (R package)CRANhttps://cran.r-project.org/web/packages/tidyverse/index.html
Trans-Blot transfer systemBio-Rad1704150
TRIzol reagentThermo Fisher Scientific #1559602

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