Transkriptomische Analyse zeigt mitochondrial gesteuerte Untergruppen bei atopischen Dermatitisläsionen

Yingyao Yu; Yuanyuan Shang; Xinhong Ge; Lingdi Dong; Kexin Li

doi:10.3791/70240

Research Article

Transkriptomische Analyse zeigt mitochondrial gesteuerte Untergruppen bei atopischen Dermatitisläsionen

DOI:

10.3791/70240

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May 26th, 2026

Yingyao Yu¹ , Yuanyuan Shang¹ , Xinhong Ge¹ , Lingdi Dong¹ , Kexin Li¹

¹Department of Dermatology, General Hospital of Ningxia Medical University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atopische Dermatitis (AD) ist eine chronisch entzündliche Hauterkrankung mit erheblicher molekularer Heterogenität. Diese Studie identifiziert zwei transkriptomisch unterschiedliche AD-Untergruppen, die durch unterschiedliche mitochondriale Genexpression und Immuninfiltration getrieben werden, und offenbart vier Hub-Gene als potenzielle Biomarker für die Patientenstratifizierung.

Abstract

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Atopische Dermatitis (AD) ist eine häufige und chronisch entzündliche Hauterkrankung mit globaler Prävalenz. Seine klinische Heterogenität und komplexen molekularen Mechanismen stellen erhebliche Herausforderungen für die Entwicklung wirksamer Therapien dar. Die Molekularheterogenität von AD mithilfe lesionaler Hauttranskriptomdaten zu erforschen, deren biologische und Immunprofile zu charakterisieren und Schlüsselgene zu identifizieren, die der Differenzierung zugrunde liegen. Differenziell exprimierte Gene wurden mit DESeq2 identifiziert, gefolgt von Weg- und Koexpressionsanalysen mit GSEA bzw. WGCNA. Mitochondrial-bezogene Gene wurden extrahiert, indem sie DEGs und WGCNA-Module mit der MitoCarta3.0-Datenbank überschneiden, und ihre funktionelle Relevanz wurde durch GO- und KEGG-Anreicherung bewertet. Hub-Gene wurden durch Protein-Protein-Interaktionsnetzwerkanalyse identifiziert, die anschließend zur Erstellung eines Klassifikationsmodells verwendet wurden. Transkriptionsregulatoren wurden mit hTFtarget vorhergesagt, während die Infiltration von Immunzellen mit CIBERSORT quantifiziert wurde. Es wurden zwei molekulare Untergruppen identifiziert. Cluster 1 war mit Zellsignal- und Adhäsionswegen angereichert, während Cluster 2 eine Hochregulierung der oxidativen Phosphorylierung und proteasombezogener Prozesse aufwies. Insgesamt wurden 85 mitochondrial assoziierte Gene, die hauptsächlich am Energiestoffwechsel beteiligt sind, zwischen den Clustern unterschiedlich exprimiert. Die Analyse des PPI-Netzwerks identifizierte vier Hub-Gene (BAD, BOLA1, CHCHD5 und ISOC2), die in Cluster 1 signifikant hochreguliert wurden. Ein hubgenbasierter Klassifikator zeigte eine starke Diskriminierungskraft (Fläche unter der Kurve > 0,7). Zu den vorhergesagten wichtigsten transkriptionellen Regulatoren gehörten ATF3, BRD2, BRD4 und CEBPA. Das Immunprofiling zeigte eine höhere regulatorische Infiltration von T-Zellen in Cluster 1 und eine erhöhte follikuläre Helfer-T-Zelle in Cluster 2. Diese Studie zeigt zwei molekular und immunologisch unterschiedliche AD-Subtypen, die durch unterschiedliche mitochondriale Funktionen und Signaturen der Immunmikroumgebung gekennzeichnet sind.

Introduction

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Atopische Dermatitis (AD) ist eine häufige und chronisch entzündliche Hauterkrankung, die bis zu 20 % der Kinder und 10 % der Erwachsenen betrifft¹. Sie ist gekennzeichnet durch starken Juckreiz und wiederkehrende ekzemöse Läsionen². Klinisch entsteht AD aus einem dynamischen Zusammenspiel von polygener Anfälligkeit (z. B. Mutationen bei Funktionsverlust von FLG), Immundysregulation und Umweltbelastungen wie niedriger Luftfeuchtigkeit und mikrobieller Dysbiose³. Obwohl AD einige pathophysiologische Merkmale mit Psoriasis teilt, schließen sich ihre klinischen Erscheinungen gegenseitig aus, mit unterschiedlichen genetischen Effekten in gemeinsamen Signalwegen und unterschiedlichen Immunveränderungen⁴.

AD ist eine heterogene Erkrankung, die durch unterschiedliche Transkriptomprofile über verschiedene Patientengruppen und Krankheitssymptome⁵ gekennzeichnet ist. Integrierte Analysen von Hautgeweben und peripheren Blutmononuklearzellen haben gezeigt, dass klinische Merkmale wie Erythem und Papuulation mit unterschiedlichen immunologischen Signaturen assoziiert sind, was das Zusammenspiel zwischen lokaler Haut und systemischen Immunantworten widerspiegelt⁶. Groß angelegte transkriptomische Studien heben zudem die Rolle der IL-13-Wege bei der AD-Pathogenese hervor, während AD eine größere molekulare Heterogenität als Psoriasis aufweist, mit Unterschieden in den Genexpressionsmustern, die mit Krankheitsschwere, Auftretensalter und genetischem Hintergrund zusammenhängen ^5,7. Diese Unterschiede unterstreichen die Komplexität der AD-Pathogenese und die Notwendigkeit personalisierter Ansätze in Forschung und Therapie.

Mitochondriale Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der AD-Pathogenese durch dysregulierten oxidativen Stress und metabolische Wege. Studien zeigen eine erhöhte Aktivität des mitochondrialen Komplexes I und II in nicht-läsionalen AD-Keratinozyten, was zu einer übermäßigen Oxidation langkettiger Fettsäuren und einer erhöhten ROS-Produktion führt, was die Dysfunktion der epidermalen Barriere^erhöht ^8,9. Gleichzeitig identifizieren proteomische Analysen reduzierte NRF2-Antioxidant-Signalwegproteine und mitochondriale Komponenten in der AD-Epidermis, wodurch die oxidative Stressauflösung¹⁰ reduziert wird. Schäden an der mitochondrialen DNA tragen zudem zu entzündlichen Reaktionen bei, während Interventionen wie der Einsatz mitochondrial-gezielter Antioxidantien eine wirksame Wiederherstellung der epidermalen Homöostase durch die Minderung von ROS^11,12 zeigen. Diese Ergebnisse unterstreichen mitochondriale Proteine sowohl als Treiber der AD-Pathologie als auch als potenzielle therapeutische Ziele.

Jüngste Transkriptomanalysen von AD haben das Verständnis seiner genetischen Architektur und molekularen Heterogenität erheblich vorangebracht. Die erste RNA-Sequenzierungsprofilierung von AD zeigte die erhöhte Expression im TREM-1-Weg und im IL-36-Zytokin¹³. Die Analyse des gewichteten Gen-Koexpressionsnetzwerks auf Basis des Genexpressionsprofils hat zudem unterschiedliche molekulare Module und Hub-Gene wie HSPA4, LCE3E und LCE3D aufgedeckt, die entzündliche Reaktionen und Keratinisierung orchestrieren und potenzielle therapeutische Ziele¹⁴ hervorheben. Diese Studien unterstreichen den Wert von Multi-Gewebe-Transkriptomik und polygener Risikomodellierung bei der Verfeinerung der Krankheitsprognose und der Aufdeckung der komplexen Grundlagen von AD. Bestehende Studien konzentrieren sich jedoch überwiegend auf die gesamte AD-Transkriptomik, ohne die Rolle mitochondrialer Gene bei der Definition molekularer Untergruppen speziell zu klären. Die vorliegende Studie geht über frühere transkriptomische Analysen hinaus, indem sie mehrere GEO-Datensätze integriert, um konsensbasierte AD-Untergruppen zu identifizieren und systematisch differenziell exprimierte Gene, WGCNA-Module sowie einen kuratierten mitochondrialen Genkatalog zu überschneiden, um Hub-Mitochondriengene zu identifizieren, die die Identität der Untergruppen definieren und als neuartige Biomarker dienen könnten.

Mit der Hypothese, dass läsionale AD-Haut molekular unterschiedliche transkriptomische Untergruppen beherbergt, die durch unterschiedliche mitochondriale Genexpression gekennzeichnet sind, was der klinischen Heterogenität von AD zugrunde liegen könnte. Um dies zu testen, integrierte diese Studie RNA-Sequenzierungsdaten aus veröffentlichten Studien und sammelte Genexpressionsdaten von Hautproben von Läsionen von 266 AD-Patienten. Molekulare Untergruppen wurden anhand von Konsens-Clustering der Genexpression identifiziert, und die Genexpression wurde zwischen den beiden molekularen Untergruppen verglichen. Die Gene, die diesen Unterschied antreiben, zeigen eine funktionelle Anreicherung der Zellsignalübertragung und oxidative Phosphorylierung. Darüber hinaus wurden mitochondriale Gene untersucht, die die beiden molekularen Gruppen unterscheiden, und die Schlüssel-Hub-Gene wurden innerhalb eines Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks identifiziert. Diese Erkenntnisse heben die genetische Heterogenität der AD-Erkrankung hervor und erweitern das Wissen über die Rolle mitochondrialer Proteine in der AD-Pathologie.

Protocol

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Diese Studie nutzte öffentlich zugängliche Genexpressionsdatensätze aus der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank. Es wurden keine patientenidentifizierbaren Daten abgerufen und keine neuen Patientenproben gesammelt. Daher war für diese sekundäre Analyse öffentlich zugänglicher Daten weder eine Genehmigung des Institutional Review Board (IRB) noch die Zustimmung des Patienten erforderlich. Die Software und die verwendeten Datenbanken sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1 Daten und Ressourcen

Transkriptomdaten von Patienten mit atopischer Dermatitis (AD) wurden aus der GEO-Datenbank gewonnen, darunter vier Studien: GSE121212 (N = 55)⁵, GSE157194 (N = 57)¹⁵, GSE193309 (N = 111)¹⁶ und GSE277961 (N = 43)¹⁷. Alle Datensätze enthielten rohe oder vornormalisierte Zähldaten aus läsionellen Hautbiopsien. Rohzählmatrizen wurden heruntergeladen und in Studien integriert. Cross-Study-Batch-Effekte wurden mit der ComBat-seq-Methode (sva R Package, v3.44.0) korrigiert, um die Ausdrucksprofile über die vier GEO-Datensätze hinweg vor der nachgelagerten Analyse zu harmonisieren. Alle vier Datensätze basieren auf RNA-Seq, die an menschlichen Hautbiopsieproben durchgeführt wurden, und wurden mithilfe von studienspezifischen Pipelines auf das menschliche Referenzgenom GRCh38 ausgerichtet. Die Gen-Expressionsquantifizierung wurde mittels Ensembl-Genannotation (v105) durchgeführt.

2 Konsensclustering

Unüberwachtes Konsensclustering wurde mit dem ConsensusClusterPlus R-Paket (v1.64.0)¹⁸ durchgeführt, um 266 läsionale Hautproben von AD-Patienten basierend auf transkriptomischen Profilen zu stratifizieren. Vor dem Clustering wurden die Rohzähldaten aller Studien zusammengeführt und die Effekte der Kreuzstudien-Batch-Effekte mit der Funktion removeBatchEffect aus dem Limma-Paket korrigiert. Die Genexpressionsdaten wurden anschließend varianzstabilisierend transformiert (VST) mit DESeq2 und gefiltert, um die 5.000 variablesten Gene zu erhalten. Das Clustering wurde mittels hierarchischer Clustering mit Pearson-Korrelation und durchschnittlicher Verknüpfung über 1.000 Iterationen durchgeführt, wobei 80 % der Stichproben pro Iteration untersampelt wurden. Die beste Anzahl von Clustern (k reicht von 2 bis 10) wurde durch die Bewertung der Konsens-Kumulativverteilungsfunktion (CDF), der Delta-Flächendiagramme und der Cluster-Konsenswerte bestimmt. Die resultierenden Cluster wurden mittels Konsens-Heatmaps und PCA validiert und in nachgelagerten biologischen und klinischen Analysen verwendet.

3 Analyse der differenziellen Genexpression

Die Genexpressionsniveaus wurden zwischen molekularen Untergruppen mit dem DESeq2 R-Paket (v1.46.0)¹⁹ verglichen. Rohzähldaten wurden eingetragen, um die genweise Dispersion zu schätzen und ein negatives Binomialmodell anzupassen. Differentiell exprimierte Gene (DEGs) wurden mittels des Wald-Tests identifiziert, und die Ergebnisse wurden anhand eines Signifikanzschwellenwerts mit einem angepassten p-Wert < 0,01 und absoluter log2-facher Änderung > 1 gefiltert.

4 Analyse der Genmengenanreicherung

Die Genset-Anreicherungsanalyse (GSEA) wurde mit dem clusterProfiler R-Paket (v4.12.6)²⁰ durchgeführt. Alle Gene wurden nach ihrer log2-fachen Änderung aus der differentiellen Expressionsanalyse bewertet, und die GSEA-Funktion wurde mit den Parametern eps = 0, minGSSize = 10 und maxGSSize = 500 angewendet, während andere Einstellungen auf Standard gehalten wurden. Die Anreicherung erfolgte gegen die MSigDB Hallmark-Gensätze. Für jeden molekularen Cluster (Cluster 1 und Cluster 2) wurden die drei wichtigsten angereicherten Signalwege anhand des nominalen p-Werts und des normalisierten Anreicherungswerts (NES) ausgewählt. Die Ergebnisse wurden mit dem GseaVis R-Paket (v0.1.0)²¹ visualisiert.

5 Analyse des gewichteten Gen-Koexpressionsnetzwerks

WGCNA wurde am Genexpressionsprofil von AD-Patienten durchgeführt, um Gen-Koexpressionsmodule zu identifizieren, die mit der transkriptomischen Subtypidentität verbunden sind, mit dem R-Paket WGCNA (v1.73)²². Die Gene wurden gefiltert, um die obersten 75 % mit der höchsten Varianz über alle Stichproben hinweg zu behalten. Ein signiertes Ko-Ausdrucksnetzwerk wurde mit einer weichen Schwellenpotenz konstruiert, die von 1 bis 30 ausgewählt wurde, um eine skalenfreie Topologie zu approximieren. Genmodule wurden durch hierarchische Clusterbildung und dynamisches Baumfällen identifiziert. Modul-Trait-Assoziationen wurden untersucht, indem ko-exprimierte Moduleigengene mit den Molekular-Subtyp-Labels korreliert wurden, und Module mit signifikanter Korrelation (p < 0,05) mit molekularem Subtyp wurden für die nachfolgende Analyse ausgewählt.

6 Mitochondriale Proteine in AD-molekularen Untergruppen

Um mitochondriale assoziierte Gene innerhalb der DEGs und WGCNA-Module zu identifizieren, wurden diese Gensätze mit der kuratierten Liste mitochondrialer Proteine aus MitoCarta3.0²³ überlappt. Die sich schneidenden Gene galten als mutative mitochondriale Proteine, die für den AD-Krankheitskontext relevant sind.

7 Genontologie und KEGG-Anreicherungsanalyse

Um die wichtigsten Zellfunktionen und biologischen Prozesse zu identifizieren, die molekulare Untergruppen differenzieren. GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen wurden für mitochondriale assoziierte Gene mit ClusterProfiler durchgeführt. Die GO-Anreicherung wurde separat für die Kategorien Biological Process (BP), Cellular Component (CC) und Molecular Function (MF) unter Verwendung der EnrichGO-Funktion mit OrgDb = "org. Hs.eg.db", ont = "ALL" und Standardparameter. Die KEGG-Anreicherung des Signalwegs wurde mit der EnrichKEGG-Funktion durchgeführt, wobei der Organismus auf "has" gesetzt war. Angereicherte Terme mit bereinigtem p-Wert < 0,05 wurden als signifikant betrachtet.

8 Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke

Die 85 DEGs und das AD-assoziierte Modul überlappenden mitochondrialen Gene wurden in der STRING-Datenbank (https://string-db.org)²⁴ abgefragt, um bekannte und vorhergesagte PPIs zu ermitteln. Die Netzwerktopologieanalyse wurde mit sieben Messgrößen (Grad, Nähe, Zwischenheit, Eigenvektor, PageRank, Hub und Autorität) durchgeführt, um die Knotenprämie jedes Proteins zu bewerten. Die 30 besten Gene jeder Messung wurden ausgewählt, und die Schnittpunkte aller sieben Ansätze wurden mit einem UpSet-Diagramm visualisiert. Die vier sich schneidenden Gene aus den Messgrößen wurden verwendet, um ein Klassifikationsmodell basierend auf ihren Genexpressionsniveaus zu erstellen. Modellgenauigkeit, Sensitivität, Spezifität und Fläche unter der ROC-Kurve (AUC) wurden berechnet, um die Klassifikationsleistung zu bewerten.

9 Analyse der transkriptionalen Regulation

Die hTFtarget-Datenbank (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget)²⁵ wurde abgerufen, um experimentell unterstützte TF-Target-Interaktionen für vier sich schneidende Hub-Gene abzurufen. Das resultierende TF-Gen-Regulationsnetzwerk wurde mit den Paketen igraph²⁶ und ggraph²⁷ R konstruiert und visualisiert.

10 Bulk RNA-seq Immunzellinfiltrationsanalyse

Der CIBERSORT-28-Algorithmus (https://cibersort.stanford.edu/) wurde verwendet, um die relativen Anteile von 22 Immunzelltypen in läsionalen Hauttranskriptomdaten zu schätzen. Normalisierte Genexpressionsdaten wurden zusammen mit der LM22-Signaturmatrix in den CIBERSORT (v0.1.0) eingetragen. Die Analyse wurde mit 1.000 Permutationen durchgeführt und die Quantilnormalisierung deaktiviert. Proben mit CIBERSORT-Ausgabe-p-Werten < 0,05 wurden für die nachgelagerte Analyse berücksichtigt. Die geschätzten Immunzellfraktionen wurden zwischen molekularen Untergruppen mit dem Wilcoxon-Rangsummentest und FDR-Korrektur für mehrere Vergleiche über die 22 Immunzelltypen verglichen (p.adjust.method = "FDR"), und die Ergebnisse wurden mit Boxplots mit dem ggplot2²⁹ R-Paket visualisiert.

Results

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Transkriptionelle Untergruppen bei atopischer Dermatitis

RNA-Seq-Daten aus 266 AD-Patientenproben wurden analysiert, um die transkriptionelle Heterogenität innerhalb der Krankheit zu untersuchen. Nach Qualitätskontrolle und Korrektur für Batch-Effekte in mehreren Studien zeigte unüberwachtes Konsensclustering zwei unterschiedliche molekulare Untergruppen (Abbildung 1A). Clusterstabilität und optimale Clusterzahl wurden anhand des kumulativen Verteilungsfunktionsdiagramms (CDF) (Abbildung 1B), des Delta-Flächendiagramms (Abbildung 1C) und der Konsensmatrix-Wärmekarte (Abbildung 1D) bewertet. Zusammen unterstützen diese Ergebnisse das Vorhandensein von zwei robusten transkriptionellen Subtypen in AD, die die zugrunde liegende genetische Heterogenität widerspiegeln.

Differenziell exprimierte Gene zwischen AD-Untergruppen

Das t-SNE-Diagramm basierend auf der normalisierten Genexpressionsmatrix validierte die durch Konsensus-Clustering identifizierten transkriptionellen Untergruppen weiter. Das t-SNE-Diagramm zeigte zwei gut voneinander getrennte Cluster, die jeweils einer der zuvor definierten Untergruppen entsprechen (Abbildung 2A), was das Vorhandensein unterschiedlicher molekularer Profile bei AD-Patienten unterstützt. Die differentielle Expression zwischen den beiden Untergruppen wurde dann mit DESeq2 analysiert, mit einem Schwellenwert von angepasstem p < 0,01 und |log₂-facher Änderung| > 1. Das resultierende Vulkandiagramm (Abbildung 2B) zeigte differenziell exprimierte Gene (DEGs), was auf eine starke transkriptionelle Divergenz hinweist. Die Top 10 hochregulierten Gene sind ABHD2, ADAR, ADCY3, ADCY9, ADD1, ADIPOR2, AFF1, AGFG1, AGRN und AHNAK in Cluster 1 und C2orf68, CTTN, GPR108, HERPUD1, LRPAP1, MAP1LC3B2, NKIRAS2, NR1H2, PDE5D und PMPCA in Cluster 2 (Abbildung 2C).

AD-Untergruppen-assoziierter Gensatz

Die Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) zeigte unterschiedliche funktionelle Anreicherungsprofile zwischen den beiden transkriptomischen Clustern (Abbildung 3A). Cluster 1 zeigte eine signifikante Anreicherung der an der Zellsignalübertragung und -adhäsion beteiligten Signalwege, einschließlich der fokalen Adhäsion (Abbildung 3B) und des MAPK-Signalwegs (Abbildung 3C), was auf einen aktiven Zustand hindeutet, der durch verstärkte Zell-Zell-Extrazellulär-Matrix-Interaktionen und Proliferation gekennzeichnet ist. Im Gegensatz dazu zeigte Cluster 2 eine starke Anreicherung für oxidative Phosphorylierung (Abbildung 3D) und Proteasomfunktion (Abbildung 3E), was auf einen aktiven oxidativen und proteolytischen Stoffwechselphänotyp hindeutet.

Koexprimierte Gene in AD-molekularen Gruppen

Um Koexpressionsmodule zu identifizieren, die mit transkriptomischen Subtypen assoziiert sind, wurde WGCNA nach der Datenvorverarbeitung durchgeführt. Ausreißer-Proben wurden zunächst identifiziert und auf Basis von hierarchischer Clusterung der Probenentfernungen entfernt, um die Robustheit des Downstream-Netzwerkaufbaus sicherzustellen (Abbildung 4A). Anschließend wurde eine weiche Schwellenwert anhand des skalenfreien Topologiekriteriums ausgewählt, wobei eine Potenz von 6 gewählt wurde, um ein skalenfreies R² > 0,85 zu erreichen (Abbildung 4B). Genmodule wurden durch hierarchische Clustering und dynamischen Baumschnitt identifiziert, gefolgt von Eigengen-Clustering zur Zusammenführung enger verwandter Module (Abbildung 4C und Abbildung 4D). Das resultierende Gennetzwerk wurde mithilfe einer Heatmap topologischer Überlappungen visualisiert, die das Vorhandensein unterschiedlicher Gen-Koexpressionsmuster bestätigte (Abbildung 4E). Die Analyse der Modul-Trait-Beziehung zeigte eine starke und signifikante Korrelation zwischen dem MEyellow-Modul (N_Gen = 743) und der molekularen Untergruppe (Abbildung 4F).

Funktionelle Anreicherung der AD-Untergruppe assoziierter mitochondrieller Gene

Anschließend wurden GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen an den überschneidenden Genen (N = 85) unter DEGs, Genern im MEyellow-Modul und einer Liste mitochondrialer Proteine aus MitoCarta3.0 (Abbildung 5A) durchgeführt, um die funktionellen Rollen mitochondrial-assoziierter Gene zu untersuchen, die die transkriptionellen Unterschiede zwischen Clustern antreiben. Die KEGG-Weganalyse identifizierte eine Anreicherung in oxidativer Phosphorylierung und metabolischen Wegen (Abbildung 5B). Die GO-Anreicherungsanalyse zeigte eine signifikante Überrepräsentation von Begriffen, die mit der mitochondrialen Funktion assoziiert sind, einschließlich der protonengetriebenen mitochondrialen ATP-Synthese, des respiratorischen Kettenkomplexes und der NADH-Dehydrogenase-Aktivität (Abbildung 5C), was darauf hindeutet, dass diese Gene hauptsächlich mit dem mitochondrialen Energiestoffwechsel und der Energieregulation assoziiert sind.

Hub-Mitochondriale Gene in der AD-molekularen Differenzierung

Um die Schlüsselgene in den 85 mitochondrialen Transkriptom-Subgruppen-assoziierten Genen zu identifizieren, wurde ein PPI-Netzwerk aufgebaut (Abbildung 6A). Basierend auf der Rangfolge in jedem der sieben topologischen Maße (siehe Methoden) wurden die 30 besten Gene ausgewählt, und ihre Schnittpunkte wurden in einem UpSet-Diagramm analysiert und visualisiert (Abbildung 6B). Diese Analyse führte dazu, dass vier Hub-Gene anhand aller Rankingkriterien (BAD, BOLA1, CHCHD5, ISOC2) konsistent als zentrale Knoten identifiziert wurden. Ihre Expressionsprofile wurden über die beiden transkriptomischen Cluster hinweg untersucht und festgestellt, dass alle vier Hub-Gene in Cluster 1 im Vergleich zu Cluster 2 signifikant hochreguliert waren (Abbildung 6C). Die paarweise Genexpressionskorrelationsanalyse zeigte positive Korrelationen zwischen allen vier Genen, was auf eine koordinierte Regulation hindeutet, wobei CHCHD5 und ISOC2 die stärkste Korrelation aufwiesen (Abbildung 6D). Darüber hinaus zeigte ein Klassifikationsmodell, das wir mit der Expression dieser vier Gene erstellt haben, eine robuste Unterscheidungskraft zwischen den beiden Clustern, wobei die ROC-Kurve eine Fläche unter der Kurve (AUC) > 0,7 zeigt (Abbildung 6E). Zusätzlich wurde eine Transkriptionsfaktor-(TF)-Regulationsnetzwerkanalyse durchgeführt, um die regulatorischen Mechanismen zu untersuchen, die die Expression der vier identifizierten Hub-Gene steuern. Alle bekannten und vorhergesagten Transkriptionsfaktoren, die diese Hub-Gene potenziell regulieren, wurden aus hTFtarget abgerufen, und die Ergebnisse wurden als transkriptionelles regulatorisches Netzwerk integriert und visualisiert (Abbildung 7). Im TF-Hub-Genregulierungsnetzwerk hatte BAD die höchste Anzahl an TFs, und ATF3, BRD2, BRD4 und CEBPA interagierten jeweils mit allen vier Hub-Genen, was auf einen gemeinsamen Regulationsmechanismus hindeutet.

Vergleich der Immunzellinfiltration zwischen AD-Untergruppen

Um die immunologische Landschaft der transkriptomischen Untergruppen zu untersuchen, wurde eine Immunzellinfiltrationsanalyse mittels CIBERSORT durchgeführt, die die relativen Anteile von 22 Immunzelltypen anhand von Bulk-Transkriptomdaten schätzt (Abbildung 8). Unter den Immununtergruppen wurden regulatorische T-Zellen (Tregs) in Cluster 1 deutlich häufiger gefunden, was auf eine immunsuppressive Mikroumgebung hindeutet, die potenziell mit mitochondrialer Aktivität und hochregulierten Signalwegen in dieser Gruppe assoziiert ist. Im Gegensatz dazu wurden follikel-Helfer-T-Zellen in Cluster 2 signifikant angereichert, was auf eine potenziell aktivere adaptive Immunantwort in dieser Untergruppe hinweist.

DATENVERFÜGBARKEIT:

Die in dieser Studie analysierten transkriptomischen Daten sind öffentlich im Gene Expression Omnibus (GEO)-Repository unter den Zugangsnummern GSE121212, GSE157194, GSE193309 und GSE277961 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) verfügbar.

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Abbildung 1: Konsens-Clustering von atopischen Dermatitis-Läsionsproben basierend auf transkriptomischen Profilen. (A) Heatmap und hierarchische Clustering der Konsensmatrix über atopische Dermatitis (AD)-Proben hinweg. (B) Konsens-Diagramm der kumulativen Verteilungsfunktion (CDF) zur Bestimmung der optimalen Anzahl von Clustern (k = 2–10). (C) Delta-Flächendiagramm, das die relative Änderung der Fläche unter der CDF-Kurve für jedes k zeigt. (D) Konsens-Clusterzuweisung für k = 2. Jede Spalte stellt eine einzelne Stichprobe dar, und die Farben zeigen die Zugehörigkeit zum Cluster an (Cluster 1, rot; Cluster 2, türkis). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Differenzielle Genexpression atopischer Dermatitis molekulare Subtypen. (A) t-verteiltes stochastisches Nachbar-Einbettungsdiagramm (t-SNE) von AD-Proben. Jeder Punkt stellt eine Probe dar, die in zwei Dimensionen projiziert wird und entsprechend der Clusterzuweisung gefärbt ist. (B) Vulkandiagramm der differenziell exprimierten Gene (DEGs) zwischen Cluster 1 und Cluster 2. Jeder Punkt stellt ein Gen dar, das durch log2-fache Änderung (x-Achse) und −log10-angepassten p-Wert (y-Achse) dargestellt wird. Rote und blaue Punkte zeigen signifikant hochregulierte Gene in Cluster 1 bzw. Cluster 2 an, während graue Punkte auf nicht signifikante Gene hinweisen. (C) Heatmap der zehn hochexpressivsten Gene in Cluster 1 und Cluster 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Gen-Satz-Anreicherungsanalyse von molekularen Subtypen atopischer Dermatitis. (A) Zweiseitiger Balkenplot, der die GSEA-Ergebnisse zwischen Cluster 1 und Cluster 2 zeigt, wobei die obersten signifikant angereicherten Signalwege sind. In Cluster 1 angereicherte Wege sind rechts dargestellt, und jene, die in Cluster 2 angereichert sind, sind links dargestellt. (B–E) Repräsentative Anreicherungsdiagramme für fokale Adhäsion, den MAPK-Signalweg, oxidative Phosphorylierung und Proteatomwege. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Analyse des gewichteten Gen-Koexpressionsnetzwerks von atopischen Dermatitisproben. (A) Probenclustering-Dendrogramm basierend auf Genexpressionsprofilen. (B) Skalenfreier Topologie-Fit-Index und mittlere Konnektivität über Soft-Thresholding-Potenzen (1–30). (C) Clusterbildung und Heatmap der Moduleigengene, wobei Farben paarweise Korrelationen anzeigen. (D) Hierarchisches Clustering-Dendrogramm, das Gene zeigt, die in koexprimierte Module gruppiert sind. (E) Heatmap der topologischen Überlappungsmatrix (TOM), die die Koexpressionsähnlichkeit zwischen Genpaaren darstellt. (F) Heatmap der Modul-Merkmal-Beziehungen, die Korrelationen zwischen Moduleigengen und klinischen Merkmalen zeigt. Innerhalb jeder Zelle werden Korrelationskoeffizienten angezeigt, und die Farbintensität zeigt die Stärke und Richtung der Korrelation an (rot, positiv; blau, negativ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 5: Genontologie und KEGG-Weganreicherung von subtypassoziierten mitochondrialen Genen. (A) Venn-Diagramm, das Überschneidungen zwischen DEGs, subtypassoziierten Modulgenen und mitochondrialen Genen zeigt. (B) Blasendiagramm der 20 wichtigsten angereicherten KEGG-Pfade sich kreuzender Gene. (C) Top 10 angereicherte Genontologie-(GO)-Begriffe für biologische Prozesse (BP), zelluläre Komponenten (CC) und molekulare Funktionen (MF). Alle Anreicherungsanalysen wurden unter Verwendung eines angepassten p-Werts < 0,05 (falsche Entdeckungsrate) als Signifikanzschwelle durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 6: Analyse der Protein-Protein-Interaktionen und Identifikation von Hub-Genen. (A) Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) von 85 sich schneidenden Genen. Knoten repräsentieren Proteine, und Kanten zeigen vorhergesagte oder experimentell validierte Interaktionen aus der STRING-Datenbank an. (B) UpSet-Diagramm, das Schnittpunkte unter den 30 besten Gene basierend auf sieben Netzwerkzentralitätsmessungen zeigt. (C) Boxplots, die die Expressionsniveaus von vier Hub-Genen in Cluster 1 und Cluster 2 zeigen. (D) Paarweise Korrelationsanalyse zwischen den vier Hub-Genen. (E) Empfänger-Betriebscharakteristik (ROC)-Kurve, die die Klassifikationsleistung zeigt, wobei Empfindlichkeit gegen Spezifität dargestellt wird. Der Bereich unter der Kurve (AUC) zeigt die Gesamtgenauigkeit an. Die statistische Signifikanz im Panel (C) wurde mit dem Wilcoxon-Rangsummentest (*p < 0,05) bewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 7: Regulatorisches Netzwerk der Hub-Gene. Rote Kreise stehen für Hub-Gene und blaue Kreise für assoziierte Transkriptionsfaktoren (TFs). Die Ränder zeigen regulatorische Wechselwirkungen an. Die Größe jedes Hub-Genknotens spiegelt die Anzahl der interagierenden TFs wider. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 8: Vergleich der Immunzellinfiltration zwischen atopischen Dermatitis-Untergruppen. Boxplots, die die geschätzten Anteile von 22 Immunzelltypen in jedem Cluster zeigen (Cluster 1, rot; Cluster 2, türkis). Asterisken (*) zeigen statistisch signifikante Unterschiede zwischen Clustern an, bewertet mit dem Wilcoxon-Rangsummentest und Korrektur der Falschentdeckungsrate für Mehrfachvergleiche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Discussion

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Atopische Dermatitis ist eine weit verbreitete und genetisch heterogene entzündliche Hauterkrankung, die erhebliche Herausforderungen für personalisierte Behandlungsstrategien darstellt. Diese Studie liefert Einblicke in die molekulare Heterogenität von AD, indem sie zwei unterschiedliche transkriptionelle Untergruppen in 266 läsionalen Hautproben von AD-Patienten identifiziert. Diese Untergruppen zeigen unterschiedliche biologische Funktionsanreicherung und Infiltration von Immunzellen, wobei Cluster 1 durch aktive Zellsignal- und Adhäsionswege sowie eine Anreicherung regulatorischer T-Zellen (Tregs) gekennzeichnet ist, während Cluster 2 durch eine erhöhte oxidative Phosphorylierung und Proteasomenfunktion sowie eine Zunahme der follikellären Helfer-T-Zellen gekennzeichnet ist. Wichtig ist, dass vier mitochondriale assoziierte Gene (BAD, BOLA1, CHCHD5 und ISOC2) identifiziert wurden, die in Cluster 1 hochreguliert sind. Sie sind Hub-Gene im PPI-Netzwerk von 85 Genen, die die beiden transkriptomischen Subtypen definieren und gleichzeitig durch Transkriptionsfaktoren wie ATF3, BRD2, BRD4 und CEPPA reguliert werden können.

Die beiden unterschiedlichen Cluster wurden anhand des Genexpressionsmusters identifiziert, was darauf hindeutet, dass AD eine signifikante Genexpressionsheterogenität aufweist. Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Heterogenität durch genetische, epigenetische und immunvermittelte Mechanismen verursacht werden kann, die unterschiedliche molekulare Endotypen^definieren^. Zwischen den beiden Clustern wurde auch eine unterschiedliche Immunzellinfiltration beobachtet: Cluster 1 ist durch regulatorische T-Zellen gekennzeichnet und Cluster 2 ist mit follikelären Helfer-T-Zellen (Tfh)-Zellen angereichert, was auf eine zugrundeliegende immunologische Heterogenität und möglicherweise unterschiedliche Krankheitsmechanismen in der AD-Kohorte hindeutet. Ein von Treg dominierter Cluster deutet auf ein Immunsystem hin, in dem regulatorische Mechanismen prominent sind, was möglicherweise Versuche zur Entzündungskontrolle oder eine kompensatorische Reaktion auf chronische Immunaktivierung widerspiegelt^32,33. Bei AD kann die Treg-Funktion jedoch trotz erhöhter Werte beeinträchtigt sein, was die Entzündung möglicherweise nicht effektiv unterdrückt. Im Gegensatz dazu deutet ein Tfh-angereicherter Cluster auf eine verstärkte B-Zell-Unterstützung, eine erhöhte Keimzentrumsaktivität und wahrscheinlich eine erhöhte IgE-Produktion hin, die Kennzeichen allergischer Reaktionen und schwererer oder extrinsischer Formen von AD^34,35 sind. Es ist bekannt, dass Tfh-Zellen die Differenzierung von B-Zellen und den Wechsel der Antikörperklassen unterstützen, und ihre Expansion korreliert mit der Krankheitsaktivität und der allergischen Sensibilisierung³⁶. Das Vorhandensein dieser unterschiedlichen Cluster kann unterschiedliche klinische Phänotypen, Krankheitsschwere oder Therapieansprachen widerspiegeln und unterstreicht die Bedeutung personalisierter Ansätze in der AD-Forschung und -Behandlung.

Es ist bekannt, dass mitochondriale Dysfunktion eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese von AD spielt, etwa durch Mechanismen wie die Aufrechterhaltung der epidermalen Barriere³⁷, die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies³⁸ und die Regulation der Immunzellantwort³⁹. Vier mitochondriale Proteine wurden als zentrale Knoten von Genen identifiziert, die mit transkriptomischer Differenzierung assoziiert sind und den molekularen Subtyp mit hoher Genauigkeit vorhersagen können (AUC>0,7). Obwohl keine frühere Studie einen direkten Zusammenhang dieser Gene mit AD gezeigt hat, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass sie potenzielle Biomarker für die Stratifizierung von AD-Patienten und zur Bewertung der mitochondrialen Dysfunktion bei AD-Patienten darstellen. BAD (BCL2-assoziierter Agonist des Zelltodes) ist ein pro-apoptotisches Mitglied der BCL-2-Familie, das an der mitochondrialen apoptotischen Signalübertragung beteiligt ist; ihre Hochregulation in Cluster 1 könnte auf eine verbesserte mitochondriale apoptotische Priming in diesem Subtyp zurückzuführen sein. BOLA1 ist ein mitochondriales Protein, das an der Biogenese des Eisen-Schwefel-Clusters und der Regulation von oxidativem Stress beteiligt ist. CHCHD5 (Coiled-coiled-helix-coiled-coiled-coil-helix domain containing 5) ist ein mitochondriales inneres Membranprotein, das mit der Organisation der Cristae und der Effizienz der Elektronentransportkette assoziiert ist. ISOC2 (Isochorismatase-Domäne mit 2) wurde mit Stoffwechselprozessen und mitochondrialer Funktion in Verbindung gebracht. Die koordinierte Hochregulation dieser vier Gene in Cluster 1 deutet auf einen Zustand erhöhter mitochondrialer Stoffwechselaktivität und apoptotischer Signalübertragung in dieser AD-Untergruppe hin.

Diese Studie hat mehrere Einschränkungen. Obwohl diese Studie zwei molekulare Untergruppen mit unterschiedlicher Genexpression in mitochondrialen Genen und getrennter Immunzellinfiltration identifizierte, fehlen uns detaillierte klinische Phänotypdaten, die es ermöglichen würden, die Schichtung mit der Krankheitsschwere und den longitudinalen Behandlungsreaktionen in Verbindung zu bringen. Um vollständig zu verstehen, was die hohe Expression dieser vier Hub-Gene in Cluster 1 bedeutet, sollten zukünftige Studien umfassende klinische Metadaten integrieren und idealerweise eine funktionelle Validierung in Keratinozyten- oder Mausmodellen durchführen. Darüber hinaus stützt sich diese Studie auf öffentlich zugängliche, massenhafte RNA-Seq-Daten; Obwohl sie in der großflächigen Analyse leistungsstark ist, fehlt ihr die Auflösung bei bestimmten Zelltypen. Diese Einschränkung macht es schwierig festzustellen, ob die beobachtete differenzielle Expression mitochondrialer Gene von Keratinozyten, infiltrierenden Immunzellen oder anderen hautresidenten Zellpopulationen stammt. Mit der weiten Anwendung von Einzelzell- und räumlichen transkriptomischen Ansätzen würde zukünftige Forschung stark von der Möglichkeit profitieren, die Expressionssignale zu dekonfaltieren und einen genaueren Überblick über das transkriptomische Profil auf zellulärer Ebene zu liefern. Zusätzlich wurden alle Daten aus Lochbiopsieproben gewonnen, die vollständige Hautproben entnehmen. Zukünftige Studien mit Tape-Strip RNA-seq könnten einen komplementären, nicht-invasiven Ansatz zur Profilierung des oberflächlichen epidermalen Transkriptoms bieten und die identifizierten Untergruppensignaturen in einem minimalinvasiven Kontext validieren. Eine zukünftige Integration von Einzelzell-RNA-seq und räumlichen transkriptomischen Daten würde die Auflösung zelltypspezifischer mitochondrialer Signaturen in AD-Haut weiter vorantreiben.

Abschließend untersuchte diese Studie die transkriptomische Heterogenität von AD in 266 Proben, identifizierte wichtige mitochondriale Gene und eine einzigartige Immunzellinfiltration und differenzierte die Untergruppen. Diese Ergebnisse verbessern das Verständnis der molekularen Heterogenität bei AD und heben das Potenzial hervor, präzise Behandlungsansätze auf Basis spezifischer molekularer Profile zu entwickeln.

Disclosures

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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
CIBERSORT	Stanford Universität	v0.1.0; Immunzellentfaltung; https://cibersortx.stanford.edu
clusterProfiler	Bioleiter	v4.12.6; GSEA- und GO/KEGG-Anreicherungsanalyse; https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler
ConsensusClusterPlus	Bioleiter	v1.64.0; unüberwachtes Konsensclustering; https://bioconductor.org/packages/ConsensusClusterPlus
DESeq2	Bioleiter	v1.46.0; Analyse der differentiellen Genexpression; https://bioconductor.org/packages/DESeq2
Genexpressions-Omnibus (GEO)	NCBI	Öffentliches Transkriptomik-Datenarchiv; Datensätze GSE121212, GSE157194, GSE193309, GSE277961; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo
ggplot2	CRAN	Datenvisualisierung; https://ggplot2.tidyverse.org
ggraph	CRAN	Graphen- und Netzwerkvisualisierung; https://ggraph.data-imaginist.com
GseaVis	GitHub (junjunlab)	v0.1.0; GSEA-Visualisierung; https://github.com/junjunlab/GseaVis
hTFtarget	Huazhong Universität für Wissenschaft und Technologie	Zieldatenbank für menschliche Transkriptionsfaktoren; http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget
igraph	CRAN	Netzwerkaufbau und -visualisierung; https://igraph.org
Limma	Bioleiter	removeBatchEffect-Funktion; https://bioconductor.org/packages/limma
MitoCarta3.0	Broad Institute	Kuratierte mitochondriale Proteindatenbank; https://www.broadinstitute.org/mitocarta
MSigDB (Hallmark-Gensätze)	Broad Institute	Gensatzdatenbank für GSEA; https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb
org. Hs.eg.db	Bioleiter	Datenbank zur Annotation des menschlichen Genoms; https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db
R	R-Kernteam	Statistische Rechenumgebung; https://www.r-project.org
STRING	EMBL	v12.0; Protein-Protein-Interaktionsdatenbank; https://string-db.org
sva (ComBat-seq)	Bioleiter	v3.44.0; Korrektur des Batch-Effekts; https://bioconductor.org/packages/sva
WGCNA	CRAN	v1.73; Analyse des gewichteten Gen-Koexpressionsnetzwerks; https://cran.r-project.org/package=WGCNA

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Transkriptomische Analyse zeigt mitochondrial gesteuerte Untergruppen bei atopischen Dermatitisläsionen

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