Forschungsartikel

Auswirkungen auf die RNA-Qualität von PBMCs unter unterschiedlichen Kryokonservierungszeiten und Verarbeitungsmethoden bei Patienten mit fortgeschrittenem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs

240 Ansichten

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DOI:

10.3791/70261

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21. April 2026

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1Biobank, Jilin Cancer Hospital, 2Medical Oncology Translational Research Lab, Jilin Cancer Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie vergleicht das Triple Isolation Reagent (TRIzol) mit der klassischen Lösung (FBS + DMSO) zur Kryokonservierung der PBMCs von NSCLC-Patienten. TRIzol erhält eine zufriedenstellende RNA-Integrität für bis zu 6 Monate, was es für die hochwertige RNA-Konservierung empfohlen macht.

Zusammenfassung

Kryokonservierte periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) werden weit verbreitet in der RNA-Sequenzierung (RNA-seq) eingesetzt, und die Qualität ihrer RNA beeinflusst direkt die Testergebnisse. Kryokonservierung kann jedoch leicht zum RNA-Abbau in PBMCs führen, und die Frage, wie die RNA-Qualität während der Langzeit-Kryokonservierung verbessert werden kann, bleibt ungelöst. PBMCS aus frischen Blutproben, die von Patienten mit fortgeschrittenem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) entnommen wurden, wurden als Kontrollgruppe verwendet. Die RNA-Erhaltungswirksamkeit von PBMC-Proben wurde zwischen der klassischen Zell-Kryokonservierungslösung (90 % fetales Rinderserum [FBS] + 10 % Dimethylsulfoxid [DMSO]) und dem üblichen RNA-Extraktionsreagenz (TRIzol) bei -80 °C für 1, 3 und 6 Monate verglichen. RNA-Konzentration, Reinheit und Integrität (gemessen durch die RNA-Integritätszahl [RIN]) wurden mit einem Multiproben-Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer und einem automatisierten mikrofluidischen elektrophoretischen Bioanalysator bewertet, um eine theoretische Grundlage für die Erhaltung hochwertiger RNA-Proben zu schaffen. Diese Studie zeigte, dass die Konzentration, Reinheit und Integrität der RNA in PBMCs mit längerer Kryokonservierungsdauer abnahmen. Obwohl die beiden Verarbeitungsmethoden keinen Einfluss auf die RNA-Konzentration hatten, beeinflussten sie jedoch die Reinheit und Integrität der RNA. Die RNA-Integrität von PBMCs, die 6 Monate lang mit TRIzol kryokonserviert wurden, blieb zufriedenstellend. Unsere Ergebnisse zeigen, dass TRIzol zur effektiven Kryokonservierung beiträgt und hochwertige RNA aufrechterhält.

Einleitung

RNA-seq von PBMC bei NSCLC-Patienten spielt eine entscheidende Rolle bei der Bewertung der Wirksamkeit der Immuntherapie. Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) ist weltweit ein häufiger bösartiger Tumor, und etwa 70 % der Patienten werden in fortgeschrittenem Stadium mit schlechter Prognose 1,2 diagnostiziert. Die Immuntherapie hat das Behandlungsparadigma für NSCLC revolutioniert und innovative therapeutische Strategien bereitgestellt 3,4. Bei der Behandlung von Immuncheckpoint-Inhibitoren (ICI) kann RNA-Sequenzierung (RNA-seq) peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs), die von NSCLC-Patienten erhalten werden, die dynamischen Veränderungen der klinischen Vorteile der Immuntherapieüberwachen. Stichprobenquellen für RNA-seq umfassen Tumorgewebe und PBMCs 6,7, wobei PBMCs als wichtige biologische Probe sowohl in klinischen Studien als auch in der Grundlagenforschung dienen8. Kryokonservierung stellt die primäre Methode zur langfristigen Probenlagerung dar, bei der Zellen und Gewebe in einem Ruhezustand gehalten werden, während ihr biologisches Potenzial und ihre Eigenschaften erhalten bleiben. Folglich hat sich die Kryokonservierung von PBMCs als praktikabler und weit verbreiteter Ansatz etabliert. Cryopreserved PBMC erleichtert die Chargenanalyse von Proben, minimiert die intralaborale und interlaborale Variabilität und optimiert die Ressourcennutzung 8,9. Studien haben beispielsweise gezeigt, dass die Verwendung eines gefrorenen RPMI-1640-Mediums, ergänzt mit 40 % fetalem Kalbserum (FCS) und 20 % Dimethylsulfoxid (DMSO) zur PBMC-Kryokonservierung, zeigt, dass die Anteile der T- und B-Zellen, die die Kombination von CD39 und CD73 exprimieren, innerhalb von sechs Monaten nach der Speicherungrelativ stabil blieben. Eine Studie verglich drei kommerzielle Kryokonservierungskits und zwei kryoprotektive Mittel (90 % RPMI-10 % DMSO, 90 % Plasma-10 % DMSO) und zeigte eine ähnliche Zelllebensfähigkeit (81,0 %) und Erholungsraten (73,7 %) über verschiedene Methoden hinweg. Allerdings zeigten alle kryokonservierten PBMCs im Vergleich zu frischenProben eine signifikant reduzierte Viabilität 5. Weitere Forschungen zeigten, dass resuspendierte PBMC in TRIzol-Reagenzen ausfällt und sie sofort bei -80 °C einfriert. Nach 1–2 Tagen stellten sie fest, dass der RIN-Wert von PBMCs höher war als der von Vollblutproben11.

Eine weitere Untersuchung verglich Leukozytenproben, die mit TRIzol, RNAlater und anderen Reagenzien behandelt wurden, und zeigte, dass alle Methoden die RNA-Integritätszahl (RIN)-Werte >7 erreichten. Die RNA-Integrität wurde mit einem automatisierten mikrofluidischen elektrophoretischen Bioanalysator bewertet, und RIN wurde als quantitatives Maß für die RNA-Qualität berechnet. Proben mit RIN ≥7 wurden als geeignet für RNA-seq-Analyse12 angesehen. Bemerkenswert ist, dass die Leukozyten+ RNAlater-Gruppe eine signifikant geringere RNA-Ausbeute aufwies als die Leukozyten+TRIzol-Gruppe12. Die aktuelle Forschung zur PBMC-Kryokonservierung konzentriert sich jedoch überwiegend auf die Lebensfähigkeit der Zellen und die Analyse des Phänotyps von Immunzellen nach dem Tauwetter; Nur begrenzte Aufmerksamkeit wurde der systematischen, langfristigen Bewertung der RNA-Qualität unter verschiedenen Erhaltungsbedingungen gewidmet. Darüber hinaus sind standardisierte Protokolle zur Kryokonservierung von PBMC-Proben zur Erhaltung der RNA-Integrität noch unausgereift 13,14,15. Diese Lücke ist besonders relevant für die NSCLC-Immuntherapie, bei der hochwertige RNA aus longitudinal gesammelten PBMCs für eine zuverlässige Biomarkerentdeckung und Überwachung der Behandlungsansprache unerlässlich ist.

In dieser Studie stellen wir die Hypothese auf, dass die Wahl der Kryokonservierungsmethode die langfristige Integrität und Qualität der aus PBMCs gewonnenen RNA signifikant beeinflusst und ein optimiertes Protokoll die RNA-Eignung für sensible Assays wie RNA-seq erhalten kann. Um dem entgegenzuwirken, wurden frisch isolierte PBMCs aus Blutproben von Patienten mit fortgeschrittenem NSCLC als Kontrolluntersuchungen verwendet. Die RNA-Erhaltungswirksamkeit von PBMC-Proben wurde zwischen zwei Behandlungsmethoden (90 % FBS + 10 % DMSO und TRIzol) bei -80 °C für 1, 3 und 6 Monate verglichen (Abbildung 1). RNA-Konzentration, Reinheit und Integrität (gemessen vom RIN) wurden mit einem Multiproben-Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer und einem automatisierten mikrofluidischen elektrophoretischen Bioanalysator bewertet. Diese Studie zielt darauf ab, eine theoretische Grundlage für hochwertige RNA-Probenkonservierung zu schaffen und die translationale Forschung sowie die Probenkonservierung in der Tumor-Präzisionsmedizin voranzutreiben.

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Protokoll

Alle Verfahren mit menschlichen Gewebeproben und klinischen Proben in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom Ethikausschuss des Jilin Cancer Hospital genehmigt (Ethische Genehmigung Nr. 202507-002-01). Vor der Probenentnahme wurde eine schriftliche informierte Zustimmung von allen Teilnehmern oder deren gesetzlichen Vormündern eingeholt. Periphere Blutproben (10 ml pro Patient) wurden von 19 Patienten mit fortgeschrittenem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) im Jilin Cancer Hospital entnommen, was insgesamt 133 RNA-Proben ergab. Um die Sicherheit im Labor zu gewährleisten, wurden alle Operationen mit gefährlichen Chemikalien in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt.

Detaillierte Informationen zu den Instrumenten, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien, die im Experiment verwendet wurden, wurden in der Materialtabelle bereitgestellt.

Isolierung der PBMC
Periphere Blutproben wurden innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme zur PBMC-Isolierung verarbeitet. PBMCs wurden isoliert und durch Ficoll-Paque-Dichtegradientenzentrifugation bei 400 × g für 25 Minuten bei Raumtemperatur mit deaktivierter Bremse gereinigt. Nach der Zentrifugation wurde die intermediäre milchige weiße Lymphozytenschicht (mit PBMCs) vorsichtigaspiriert. Wichtig ist, dass wir die PBMC-Eingangskonzentration für jede Probe und jede Gruppe streng standardisiert haben, um konsistente Zellzahlen über alle experimentellen Bedingungen hinweg zu gewährleisten und so die durch Zelleingabe und -verarbeitung verursachte Variation zu minimieren. Dies stellt sicher, dass die beobachteten Unterschiede echte Effekte unterschiedlicher Erhaltungsmethoden widerspiegeln und nicht technische Variabilität. Für jeden Patienten wurden isolierte PBMCs in 7 Röhrchen aufgeteilt: Ein Tube wurde für die sofortige RNA-Extraktion verwendet, und Konzentration, Reinheit und Integrität wurden bewertet. Die übrigen sechs Röhrchen wurden mit einer Abkühlrate von -1 °C/min kryokonserviert: Drei wurden mit 1 ml 90 % FBS + 10 % DMSO behandelt, die anderen drei mit 1 ml TRIzol, gefolgt von einer Lagerung bei -80 °C. Die RNA-Extraktion und Qualitätsbewertung erfolgten nach 1, 3 und 6 Monaten Tiefkühlung.

RNA-Extraktion
Die Proben wurden aus dem Lager bei -80 °C entnommen und bei 4 °C aufgetaut, bissie vollständig aufgetaut waren, 17 °C. Proben, die mit 90 % FBS + 10 % DMSO- oder TRIzol-Kryokonservierungslösung konserviert wurden, wurden einmal mit PBS gewaschen, bei 200 × g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, und das Supernatant wurde entsorgt, um das Zellpellet zu speichern. Die Gesamt-RNA wurde mit TRIzol extrahiert. Konkret wurde das Trizolreagenz in das Mikrozentrifugenrohr mit der verarbeiteten Probe gegeben, durch Inversion gemischt und bei Raumtemperatur 5 Minuten inkubiert, um eine vollständige Lyse sicherzustellen. Anschließend wurden 200 μL Chloroform hinzugefügt, gründlich durch Schütteln vermischt und 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach der Zentrifugation bei 2400 × g für 15 Minuten bei 4 °C wurde die obere wässrige Phase sorgfältig aspiriert und in ein neues Eppendorf-Rohr übertragen. Isopropanol (0,5 ml) wurde dann hinzugefügt, gut vermischt und bei Zimmertemperatur 5–10 Minuten inkubiert. Nach der Zentrifugation bei 2400 × g für 10 Minuten bei 4 °C wurde der Supernatant abgeworfen, sodass das RNA-Präzipitat am Boden des Röhrchens zurückblieb.

Der Niederschlag wurde in 75 % Ethanol (1 mL) mit sanftem Schütteln wieder suspendiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1600 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Das Supernatant wurde entsorgt und das RNA-Pellet wurde 5–10 Minuten an der Luft bei Raumtemperatur trocknen. Abschließend wurden die RNA-Proben in 50 μL DEPC-behandeltem Wasser gelöst und in einem 55–60 °C Wasserbad für 5–10 Minuten18 inkubiert. Nachweis der RNA-Konzentration und Reinheit. RNA-Konzentration und -Reinheit wurden mit der ultravioletten Absorptionsmethode und einem Multiproben-Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer gemessen (Messbereich: 2,5–3000 ng/μL). Die RNA-Konzentration wurde anhand des Absorptionswerts bei 260 nm bestimmt, während die RNA-Reinheit mit dem A260/A280-Verhältnis bewertet wurde. Die Messsoftware wurde eingeführt; "Nukleinsäure" wurde auf der Hauptschnittstelle angeklickt. Die Detektionsplattform wurde zweimal mit doppelt destilliertem Wasser gespült, anschließend wurden 1,5 μL der RNA-Probe darauf pipettiert. RNA-40 wurde für den Probentyp ausgewählt, "Measure" angeklickt, und die Reinheitswerte der Konzentration sowie A260/280 wurden erfasst. Ein A260/A280-Verhältnis zwischen 1,9 und 2,1 deutete auf eine hohe RNA-Reinheit hin, während Werte unter 1,8 auf eine Proteinkontamination hindeuteten und Werte über 2,2 auf potenzielle RNA-Abbau oder Restisothiocyanat19 hindeuteten.

RNA-Integritätsdetektion
Die RNA-Integrität (RIN) wurde mit einem automatisierten mikrofluidischen elektrophoretischen Bioanalysator und Detektionskit bewertet. Der RIN liegt zwischen 1 und 10, wobei 1 stark degradierte RNA und 10 intakte RNA anzeigt. Zur Analyse wurden 1,2 μL RNA in ein PCR-Rohr gelegt, bei 70 °C für 2 Minuten mit einem thermischen Zykler thermisch denaturiert und sofort auf Eis gelegt. Anschließend wurde 1 μL denaturierte RNA zu den Detektionsbohrungen des Chips zur Analyse20 hinzugefügt. Die Software wurde gestartet, "Assays" ausgewählt und "RNA" aus dem Dropdown-Menü ausgewählt. Das Programm "Eukaryote Total RNA Nano Series II.xsy" wurde entsprechend dem verwendeten Reagenz ausgewählt. "Start" wurde geklickt, um die Erkennung zu starten. Nach etwa 10 Minuten wurden die Spitzenzahl und die maximale Höhe der Leiter auf Normalität überprüft.

Statistische Methoden
Für alle Daten wurden Normalitätstests durchgeführt. Normal verteilte Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben, während nicht-normal verteilte Daten als Median (Interquartilbereich, IQR) angegeben wurden. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden mit dem gepaarten t-Test für normalverteilte Daten und dem nichtparametrischen Test für nicht-normalverteilte Daten mit verwandten Stichproben analysiert. Für Vergleiche zwischen drei oder mehr Gruppen wurde für normalverteilte Daten eine Varianzanalyse mit wiederholten Messungen verwendet, und für nicht-normalverteilte Daten wurde der nichtparametrische Test mit verwandten Stichproben verwendet. Alle statistischen Analysen wurden mit SPSS 19.0 und GraphPad Prism 9.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001 durchgeführt.

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Ergebnisse

Auswirkungen unterschiedlicher Kryokonservierungszeiten und -verarbeitungsmethoden auf die RNA-Konzentration in PBMC-Proben
Die Wirkung unterschiedlicher Kryokonservierungszeiten: Die frischen PBMC-Proben von fortgeschrittenen NSCLC-Patienten dienten als Kontrollgruppe. Die Proben wurden entweder mit TRIzol oder 90 % FBS + 10 % DMSO behandelt und bei -80 °C für 1, 3 und 6 Monate gelagert; Gesamt-RNA wurde extrahiert, um die RNA-Konzentration zu messen. Bei mit TRIzol ...

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Diskussion

Viele Faktoren beeinflussen die RNA-Qualität in biologischen Proben, darunter präanalytische Variablen, Transportbedingungen, Verarbeitungsdauer bei Umgebungstemperatur, Gewebenekrose, Temperatur- und Gefrierprodukte, Aliquot-Größe und -Anzahl sowie Lagerdauer – haben einen erheblichen Einfluss auf die RNA-Qualität21. Bei identischen Proben können Unterschiede in der Kryokonservierungszeit und Verarbeitungsmethoden die RNA-Qualität erheblich beeinflussen. Frühere ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Wir danken den Teilnehmern dankbar für ihre Hilfe bei dem Experiment und für ihre Unterstützung des Fonds. Diese Studie wurde durch Fördermittel des Jilin-Provinzministeriums für Wissenschaft und Technologie (Zuschussnummer YDZJ202501ZYTS691), Gesundheitskommission der Provinz Jilin (Zuschussnummer 2023jc064), unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BNachweis der RNA-Integrität, Bewertung der RNA-Qualität durch Erzeugung der RNA-Integritätszahl (RIN)
Agilent RNA 6000 NanokitAgilent5067-1511         In Zusammenarbeit mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer, der dedizierte Reagenzien und Chips für die RNA-Integrität bereitstellt.
Zentrifuge                                                         Eppendorf   5424RZur Extraktion von RNA
Zentrifuge                                           Eppendorf   5810RZur Extraktion von PBMC
Chloroform                                 China National Pharmaceutical Group Corporation20191031Für die RNA-Extraktion mittels der Trizol-Methode wird verwendet, um die wässrige Phase mit RNA von der organischen Phase mit Verunreinigungen zu trennen
DimethylsulfoxidBeijing Dingguo ChangshengDH105-2Als Kryokonservierungslösung für PBMCs, die eine Langzeitlagerung von Proben bei -80 °C ermöglicht; C
RöhreCorningMCT-150-CFür die Probenlagerung, Reagenzienmischung, Zentrifugation und andere experimentelle Operationen
EthanolShandong Lierkang25071901AIIn-RNA-Extraktion mit der Trizol-Methode, verwendet zum Waschen von RNA-Präzipitaten zur Entfernung von Restresten
Fetales RinderserumXpbiomedC04001-500Als Kryokonservierungslösung für PBMCS ermöglicht sie die Langzeitspeicherung von
Ficoll-TrennlösungBeijing Dingguo Changsheng Biotechnology CO., LTDCC0161Zur Isolierung und Reinigung von PBMC mittels Dichtegradientenzentrifugation
GeneTouch(Plus) ThermocyclerBioerTC-EA-48DAZur thermischen Denaturierung von RNA (70 &°; C für 2 Minuten), gefolgt von der Detektion mit dem Bioanalysator
IsopropanolChina National Pharmaceutical Group Corporation20210929Bei der RNA-Extraktion mit der Trizol-Methode, verwendet für RNA-Präzipitation
Nanodrop 8000 SpektrophotometerGeneCompanyND-8000Für RNA-Konzentration (basierend auf Absorption bei 260 nm) und Reinheit (basierend auf A260/A280-Verhältnis) mit der ultravioletten Absorptionsmethode
PCR-RöhrchenCorningPCR-02-CZur thermischen Denaturierung von RNA (70 &°; C für 2 Minuten), gefolgt von der Detektion mit dem Bioanalysator
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung  Procell-SystemPB180327Für direkte Lyse und Erhaltung von PBMCs oder der anschließenden Gesamt-RNA
Dreifache Isolationsreagenz Adsinads60154Für direkte Lyse und Erhaltung von PBMCs oder der anschließenden Gesamt-RNA

Referenzen

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Kryokonservierung von PBMCsRNA Integrit tRNA ExtraktionTRIzol Konservierungfetales BovinserumDimethylsulfoxidmikrofluidische ElektrophoreseUV Vis Spektrophotometrie

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