Auswirkungen der chronischen Niereninsuffizienz in Kombination mit Vorhofflimmern auf die Funktion des linken Vorhofendothels in einem Beagle-Modell

Zusammenfassung

Diese Studie etablierte ein neuartiges in vivo Beagle-Modell mit chronischer mittlerer Niereninsuffizienz kombiniert mit Vorhofflimmern durch Transkatheter-Nierenarterienembolisierung und schnellem Vorhofflimmern und zeigte, dass diese Kombination die Funktion des linken Vorhofendothels stark beeinträchtigte, die Prokoagulantenaktivität steigerte und das Thrombosenrisiko durch entzündliche und RAAS-vermittelte Signalwege erhöhte.

Zusammenfassung

Das gemeinsame Auftreten von Vorhofflimmern (AF) und Niereninsuffizienz (RI) stellt ein klinisch komplexes Phänomen mit hoher Prävalenz dar. Diese Studie untersuchte die Auswirkungen von chronisch moderater RI in Kombination mit AF auf die Funktion des linken Vorhofendothels bei Beagles. Chronische RI wurde durch Transkatheterembolisierung des Hauptarms der linken Nierenarterie mittels Gelatineschwammgranulen induziert, wobei die Tiere drei Monate lang gehalten wurden, um die Entwicklung chronischer Nierenparenchymschäden zu ermöglichen. AF wurde anschließend durch kontinuierliches, schnelles atriales Pacing (Grundzykluslänge, 60 ms; Spannung, 4-fach der diastolischen Pacing-Schwelle; 180 min) induziert. Histologische Veränderungen wurden mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen bewertet. Parameter, die mit der Endothelfunktion, Gerinnung, Fibrinolyse, Entzündung und der Aktivität des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems (RAAS) in Plasma- und Herzgeweben verbunden sind, wurden mittels enzymgebundenem Immunsorbent-Test, quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion und Western-Blotting untersucht. Die Ergebnisse zeigten die erfolgreiche Etablierung eines chronischen Nierenschädigungsmodells mit moderater RI, bestätigt durch signifikant erhöhte Plasmakreatinin-, Harnstoffstoff-Stickstoffwerte und eine reduzierte Kreatinin-Clearance. Die Funktion des linken Vorhofendothels war bei Beagles mit kombinierter RI und AF signifikant beeinträchtigt, begleitet von verstärkten prokoagulanten Effekten und verminderter Fibrinolyse. Die Entzündungsmarker waren nach dem RI-Verfahren oder der AF-Induktion erhöht und wurden in der kombinierten RI+AF-Gruppe weiter erhöht. Zusätzlich war die RAAS-Aktivität, die sich durch erhöhte Renin- und Aldosteronwerte zeigte, nach RI erhöht und durch die Kombination mit AF weiter erhöht. Zusammenfassend etablierte diese Studie erfolgreich ein in vivo Tiermodell mit chronisch-moderater RI kombiniert mit AF bei Beagles und zeigte, dass diese Kombination die Funktion des linken Vorhofendothels signifikant störte und das thrombotische Risiko erhöhte.

Einleitung

Vorhofflimmern (AF), die häufigste Form anhaltender Herzrhythmusstörungen, steht in engem Zusammenhang mit ungünstigen klinischen Ergebnissen. Aufgrund der systemischen pathophysiologischen Eigenschaften von AF führt diese Arrhythmie häufig zu komplexen pathophysiologischen Übersprechen mit einer Reihe begleitender Begleiterkrankungen, darunter kognitiver Abbau, Depression und systemische Embolien¹. Die chronische Nierenerkrankung (CKD) wurde als unabhängiger Risikofaktor sowohl für die Entwicklung von AF als auch für das Auftreten thromboembolischer Ereignisse identifiziert. Ungefähr 15 % bis 20 % der Patienten mit CKD sind von AF betroffen, während der Anteil der Patienten, die eine Nierenersatztherapie erhalten und AF entwickeln, zwischen 15 % und 40 ^{% liegt}. Gleichzeitig zeigen etwa 30 % bis 60 % der Patienten mit AF-Diagnose gleichzeitig eine leichte bis moderate Niereninsuffizienz (RI)³. Daher ist das gemeinsame Auftreten von AF und RI zu einem komplexen klinischen Phänomen mit hoher Prävalenz unter Patientengruppen geworden. Die bidirektionale Beziehung zwischen AF und RI erhöht das Inzidenzrisiko für AF stark und verschärft zudem das Fortschreiten der Nierenerkrankung, was letztlich zu schlechteren klinischen Ergebnissen beiträgt⁴.

In früheren Studien wurden Ratten häufig verwendet, um RI-Modelle zu etablieren; ihre kleine Herzgröße macht sie jedoch ungeeignet für kardiale elektrophysiologische Experimente. Hunde hingegen werden häufig in mittel- und großtierischen Modellen der Niereninsuffizienz eingesetzt, wobei die Nephrektomie die primäre^{Modellierungsmethode ist}. Dennoch ist dieser Ansatz mit einer begrenzten Erfolgsquote bei der Modellierung verbunden. Wichtiger ist, dass eine Nephrektomie keine direkten Schäden an der Nierenparenchym verursacht und daher die pathologischen Prozesse der Niereninsuffizienz nicht effektiv simuliert. Daher ist es unerlässlich, ein geeignetes Tiermodell mit RI und AF zu etablieren. Bemerkenswert ist, dass Liang Z et al. erfolgreich ein mildes RI-Modell bei Beagles etablierten, indem sie für zwei Wochen kleine Äste der Nierenarterie in der linken Niere mit Gelatineschwammgranulaten embolierten, was mit AF⁶ assoziiert war; allerdings gilt eine zweiwöchige Beobachtungsperiode im Allgemeinen als unzureichend für die Simulation klinischer CKD, da die charakteristischen Merkmale der chronischen Nephropathie, darunter Glomerulosklerose und Tubulointerstitielle Fibrose, in Tiermodellen ^7,8 längere Perioden anhaltender Nierenparenchymalschäden erfordern, um sich vollständig zu entwickeln. Dies unterstreicht die Notwendigkeit eines chronischen Modells mit längerer Beobachtungszeit, das die fortschreitende Natur der klinischen CKD genauer wiedergibt.

Die vorliegende Studie zielte daher darauf ab, ein Tiermodell für chronisch moderate RI in Kombination mit AF zu etablieren, indem eine Transkatheter-Embolisation des Hauptrumpfes der linken Nierenarterie bei Beagles durchgeführt und die Tiere drei Monate lang erhalten wurden, um die Entwicklung einer etablierten chronischen Nierenerkrankung zu ermöglichen. Darüber hinaus untersuchten wir die Pathogenese der Dysfunktion des linken Vorhofendothels unter diesen pathologischen Bedingungen und testeten die Hypothese, dass die Kombination aus chronisch moderater RI und AF synergistisch die Funktion des linken Vorhofendothels durch verstärkte Entzündung und RAAS-Aktivierung beeinträchtigen würde, wodurch das Thrombosenrisiko über beide Erkrankungen hinaus erhöht wird. Diese Ergebnisse könnten ein tieferes Verständnis der chronischen RI in Kombination mit AF bieten und die Grundlage für weitere Untersuchungen zu den Vorteilen der Antikoagulanzientherapie bei Patienten mit AF und RI legen.

Protokoll

Diese Studie wurde strikt gemäß den Empfehlungen im Leitfaden zur Pflege und Nutzung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt (Publikation Nr. 85-23, überarbeitet 1996). Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee des Beijing Anzhen Hospital genehmigt (Genehmigungsnummer 81700293). Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee unserer Einrichtung überprüft und genehmigt. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um das Tierleiden zu minimieren und die Anzahl der in der Studie verwendeten Tiere zu reduzieren. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Tiermodell und experimentelles Design

1. Tiervorbereitung und Unterbringung
   Vierundzwanzig gesunde männliche Beagles, im Alter von 4–5 Jahren und mit einem Gewicht von 10–12 kg, wurden von der Shanghai Jiao Tong University Agricultural Experimental Animal Farm Co., Ltd. bezogen (siehe Materialtabelle). Nur männliche Beagles wurden eingesetzt, um potenzielle störende Effekte hormoneller Schwankungen im Zusammenhang mit dem Östruszyklus auf Gerinnung, Endothelfunktion und Entzündungsreaktionen zu minimieren. Alle Beagle wurden einzeln in Standardkäfigen gehalten, die bei einer Temperatur von 22–25 °C mit 40–60 % Luftfeuchtigkeit und einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden bis 12 Stunden gehalten wurden. Die Tiere erhielten eine standardmäßige Laborfutter für Hunde und Wasser ad libitum. Vor Beginn der experimentellen Verfahren durchliefen alle Beagles eine einwöchige Eingewöhnungsphase. Die transthorakale Echokardiographie (TTE) wurde bei allen Tieren mit einem Ultraschallsystem durchgeführt, das mit einem 3,5-MHz-Phased-Array-Transducer ausgestattet war, um Klappenpathologien, Kardiomyopathie und andere strukturelle Herzerkrankungen auszuschließen.
2. Anästhesie und Gefäßzugang
   Alle Beagles wurden vor dem Eingriff 12 Stunden gefastet. Die Anästhesie wurde durch intravenöse Verabreichung von Natriumpentobarbital in einer Dosierung von 20 mg/kg über die Cephalvene induziert, die langsam über etwa 3–5 Minuten verabreicht wurde, bis der Verlust des palpebralen Reflexes bestätigt wurde. Sobald eine ausreichende Anästhesie erreicht war, wurde eine endotracheale Intubation mit einer entsprechend großen (Innendurchmesser 7,0–8,0 mm) gecufften endotrachealen Röhrchen durchgeführt, und eine mechanische Belüftung wurde bei einem Gezeitenvolumen von 15 ml/kg und einer Atemfrequenz von 12–15 Atemzügen/min eingeleitet. Während des gesamten Eingriffs wurde eine kontinuierliche hämodynamische Überwachung aufrechterhalten. Ein dreifaches Oberflächenelektrokardiogramm (EKG) wurde zur Überwachung der Herzfrequenz und des Herzrhythmus eingesetzt, und Pulsoximetrie wurde zur Überwachung der Sauerstoffsättigung eingesetzt. Eine periphere intravenöse Leitung wurde für die Flüssigkeitsverabreichung (laktierte Ringer-Lösung, mit einer Rate von 5–10 mL/kg/h infundiert) und bei Bedarf ergänzende Anästhesiedosen aufrechterhalten.
   Anschließend wurde unter aseptischen Bedingungen ein Hautschnitt von etwa 3–4 cm im rechten Leistenbereich gemacht, um die arterie Oberschenkelarterie mit stumpfer Dissektion freizulegen. Der erfolgreiche arterielle Zugang wurde durch pulsierendes Blut bestätigt. Eine 6F-Gefäßscheide wurde mit der modifizierten Seldinger-Technik in die rechte Oberschenkelarterie gelegt. Heparinnatrium (4000 IU, verdünnt in 10 ml normaler Kochsalzlösung) wurde durch die Scheide verabreicht, um Thromboembolie zu verhindern.

2. Nierenarterienembolisierung zur Induktion von chronischer, mittlerer RI

Ein 5F-Multifunktionskatheter wurde durch die arterielle Scheide eingeführt und unter der C-Arm-Fluoroskopie in die Bauchaorta eingeführt. Selektive Kanule der linken Nierenarterie wurde durchgeführt, und eine Baseline-Angiographie der Nierenarterie wurde durchgeführt, indem 5–8 ml nicht-ionisches iodiertes Kontrastmittel mit einer Geschwindigkeit von 3 mL/s injiziert wurden, um den vollständigen Nierenarterienbaum sichtbar zu machen. Die erfolgreiche Katheterposition wurde durch die Demonstration der gesamten linken Nierenarterie und ihrer Äste auf den angiographischen Bildern bestätigt.

Anschließend wurde die RI durch Transkatheterembolisation des Hauptzweigs der linken Nierenarterie mit resorbierbaren Gelatineschwammgranulen (50 mg Durchmesser) indiziert. Die Gelatineschwammgranulate wurden als Schlamm hergestellt, indem etwa 50 mg Granulate mit einer 1:1-Mischung aus Kontrastmittel und normaler Kochsalzlösung zu einem Gesamtvolumen von etwa 2–3 ml gemischt wurden. Die Embolisationsschlamm wurde langsam durch manuelle Injektion durch den Katheter über etwa 2–3 Minuten unter kontinuierlicher fluoroskopischer Überwachung injiziert. Die erfolgreiche Embolisation wurde durch eine wiederholte Angiographie der linken Nierenarterie bestätigt, die das Fehlen einer distalen arteriellen Opacifikation in den embolisierten Ästen nachwies. Nach angiographischer Bestätigung wurden Katheter und Scheide entfernt, und die Oberschenkelarterie wurde mit einer 6-0-Polypropylen-Naht repariert. Die chirurgische Wunde wurde in mehreren Schichten geschlossen, und die Tiere durften sich unter enger Überwachung erholen.

Bei der Kontrollgruppe und der AF-Gruppe (Scheinverfahren wurde der identische Katheterisierungsprozess durchgeführt, und ein gleiches Volumen (2–3 ml) Normalsalzlösung wurde nach der Nierenarterieangiographie über den Mehrzweckkatheter in die linke Nierenarterie injiziert.

3. AF-Induktion durch schnelles atriales Pacing

Drei Monate nach dem RI-Verfahren (oder Scheinverfahren) wurde AF in der AF-Gruppe und der RI+AF-Gruppe eingeleitet. AF wurde bei insgesamt 12 Beagles induziert (n = 6 in der AF-Gruppe und n = 6 in der RI+AF-Gruppe). Nach der oben beschriebenen Wiederbetäubung und dem Gefäßzugang wurde die rechte Oberschenkelvene für den Kathetereinsatz kanuliert. Ein 6F-Quadripolar-Elektrodenkatheter (siehe Materialtabelle) wurde unter fluoroskopischer Führung vorgeschoben und an der seitlichen Wand des rechten Vorhofs positioniert. Die korrekte Katheterposition wurde durch die Aufnahme charakteristischer atrialer Elektrogramme am intrakardialen Kanal bestätigt, die deutliche, scharfe Vorhofablenkungen zeigten. Die diastolische Pacing-Schwelle wurde durch schrittweise Absenkung der Ausgangsspannung des Stimulators um 0,1 V von 5 V bis zum Beobachten des Verlusts des Vorhofffangs bestimmt; Die niedrigste Spannung, die eine konsistente 1:1-Vorhoffseinfangung erreichte, wurde als diastolischer Pacing-Schwelle erfasst. Schnelles atriales Pacing (Grundzykluslänge, 60 ms, entsprechend einer Pacing-Rate von 1000 Schlägen pro Minut; Ausgangspulsbreite 2 ms; Spannung 4-fach der diastolischen Pacing-Schwelle, typischerweise 2–4 V) wurde kontinuierlich 180 Minuten lang mit einem Herzstimulator zur Induktion von AF durchgeführt, wie zuvor beschrieben⁹. Die erfolgreiche AF-Induktion wurde durch das Auftreten anhaltender unregelmäßiger R-R-Intervalle auf dem Oberflächen-EKG und schneller, desorganisierter atrialer Potentiale im intrakardialen Elektrogramm bestätigt, die mindestens eine Minute nach kurzer Pacing-Pause anhielten. Alle 12 Beagles (100 %) erreichten nach Abschluss des Pacing-Protokolls eine anhaltende AF. Die durchschnittliche Dauer anhaltender AF nach Abbruch des Pacings lag zwischen 3 und 8 Minuten vor der spontanen Kardioversion zum Sinusrhythmus.

Es ist wichtig zu beachten, dass im Gegensatz zu Burst-Pacing-Protokollen (typischerweise 3–10 Sekunden-Bursts), die zur Beurteilung der AF-Anfälligkeit verwendet werden, der in dieser Studie verwendete kontinuierliche 180-minütige schnelle atriale Pacing-Methode speziell entwickelt wurde, um anhaltende AF zu modellieren und frühe molekulare Remodellierung zu ermöglichen. Dieses Protokoll ist gut etabliert und umfassend in der Forschung zur Hunde-AF-Erkrankung ^9,10 validiert.

4. Versuchsdesign und Gruppenzuweisung

Versuchstiere wurden zufällig vier Gruppen zugeteilt (n = 6 pro Gruppe): Kontrollgruppe, RI-Gruppe, AF-Gruppe und RI kombiniert mit AF-(RI+AF)-Gruppe. Beagles in der RI-Gruppe und der RI+AF-Gruppe unterzogen sich zu Beginn des RI-Embolisationsverfahrens, und Beagles in der Kontrollgruppe und der AF-Gruppe erhielten die Scheininjektion von Kochsalzlösung in die Nierenarterie. Drei Monate später wurde AF in den oben beschriebenen AF- und RI+AF-Gruppen eingeleitet. Ein schematischer Überblick über das gesamte experimentelle Design und den Zeitplan ist in Abbildung 1 dargestellt.

5. Bestimmung der Kreatinin-Freigabe

Die Kreatinin-Clearance (CCr) wurde mit der 30-minütigen endogenen Kreatinin-Clearance-Methode¹¹ bestimmt. Kurzzeitig wurde nach der Anästhesie ein Foley-Katheter unter aseptischen Bedingungen in die Harnblase eingeführt, und die Blase wurde vollständig entleert. Anschließend wurde die 30-minütige Urinabnahme eingeleitet, während der gesamte Urinabgabe über den Katheter in ein kalibriertes Sammelgefäß aufgenommen wurde. Am Ende der 30-minütigen Entnahmephase wurde die Blase erneut entleert, um eine vollständige Urinerholung zu gewährleisten. Gleichzeitig wurde eine Blutprobe aus der Jugularvene zur Bestimmung des Plasmakreatinins entnommen. CCr wurde mit der Standardformel berechnet: CCr (mL/min/kg) = (Urinkreatininkonzentration × Urinvolumen) / (Plasmakreatininkonzentration × Sammelzeit), normalisiert auf das Körpergewicht.

6. Gewebe- und Blutprobenentnahme

Blutproben wurden von der Jugularvene zu Baseline und vor der Opferung in EDTA-antikoagulierte und einfache Serumseparatorröhrchen¹¹ entnommen. Schließlich wurden alle Beagles mit einer intravenösen Injektion einer tödlichen Dosis Natriumpentobarbital in einer Dosierung von 150 mg/kg vor der Erholung aus der Anästhesie eingeschläfert. Die Nieren wurden zur histologischen Untersuchung entnommen. Die Herzen wurden entnommen, und das linke Vorhofanhängsel (LAA) wurde sorgfältig seziert, innerhalb von 5 Minuten nach der Exzision in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur molekularen Analyse bei −80 °C gelagert. Das LAA wurde für die Gewebeanalyse ausgewählt, da es der häufigste Ort der Thrombusbildung bei AF-Patienten ist und daher der klinisch relevanteste anatomische Ort zur Bewertung der Endothelfunktion und des Thrombosenrisikos darstellt.

7. Histologische Beobachtung

Das Nierengewebe wurde 24 Stunden lang mit 10 % neutralem gepuffertem Paraformaldehyd fixiert, durch eine graduierte Ethanolserie (70 %, 80 %, 90 %, 95 % und 100 % Ethanol, jeweils 1 H) dehydriert, mit Xylol (zwei Wechsel jeweils 30 Minuten) gereinigt, in Paraffin eingebettet und mit einem rotierenden Mikrotom in 5 μm dicke Scheiben geschnitten. Anschließend wurden die Scheiben mit HE gefärbt, um histopathologische Veränderungen zu beobachten. Konkret wurden die Schnitte mit Xylol (zwei Wechsel, jeweils 10 min) deparaffinisiert, durch eine absteigende Ethanolserie rehydriert, 5 Minuten mit Hämatoxylinlösung gefärbt, 30 Sekunden lang in 1 % Salzsäure–Ethanol differenziert, 10 Minuten lang in fließendem Leitungswasser ausgespült, 2 Minuten lang mit Eosinlösung gegenfärbt, dehydriert, gereinigt und mit neutralem Balsam montiert. Schnitte wurden unter einem Lichtmikroskop mit Vergrößerungen von 100× und 400× untersucht.

8. Enzymgekoppelter Immunsorbent-Assay (ELISA)

Die Blutproben wurden 20 Minuten lang bei 3000 × g bei 4 °C zentrifugiert, anschließend wurde das Supernatant (Plasma) gesammelt und bis zur Analyse bei −80 °C gelagert. Die Plasmaspiegel von Kreatinin, Harnstoffstickstoff, Von-Willebrand-Faktor (vWF), Thrombomodulin (TM), asymmetrischem Dimethylarginin (ADMA), Stickstoffmonoxid (NO), Plasminogen-Aktivator-1 (PAI-1), Gewebeplasminogenaktivator (t-PA), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), hochsensitivem C-reaktivem Protein (HS-CRP), Interleukin-6 (IL-6), Renin und Aldosteron (ALD) wurden mit kommerziellen ELISA-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers untersucht. Kurz gesagt wurden 100 μL Plasmaprobe oder Standardprobe zu antikörperbeschichteten 96-Well-Mikroplatten hinzugefügt, bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert, viermal mit Washpuffer gewaschen, 1 Stunde mit biotinyliertem Detektionsantikörper bei 37 °C inkubiert, erneut gewaschen, 30 Minuten lang mit Streptavidin-HRP-Konjugat bei 37 °C inkubiert, gefolgt von der TMB-Substratentwicklung für 15–20 Minuten im Dunkeln. Die Reaktion wurde mit 50 μL Stoplösung gestoppt, und die Absorption wurde mit einem Mikroplattenleser bei 450 nm gemessen. Alle Proben wurden doppelt geprüft.

9. Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR)

Die Extraktion der gesamten RNA aus den LAA-Geweben erfolgte mit TRIzol-Reagens, gefolgt von der Erkennung der RNA-Reinheit und -Konzentration mit einem Spektrophotometer bei Absorptionsverhältnissen von 260/280 nm (akzeptabler Bereich 1,8–2,0). Insgesamt wurde 1 μg RNA rückwärts in komplementäre DNA (cDNA) mit einem PrimeScript RT-Reagenz-Kit transkribiert. Die Reverse-Transkriptionsreaktion wurde bei 37 °C für 15 Minuten durchgeführt, gefolgt von einer Inaktivierung bei 85 °C für 5 Sekunden. Quantitative Echtzeit-PCR wurde anschließend auf dem PCR-System mit SYBR Green Master Mix durchgeführt. Das thermische Zyklusprogramm bestand aus einer anfänglichen Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 10 Sekunden und Glühen/Verlängerung bei 60 °C für 30 Sekunden. Das Fluoreszenzsignal wurde am Ende jedes Verlängerungsschritts mit dem SYBR-Grünkanal detektiert. Die Schwellenzykluswerte (Ct) wurden automatisch von der Instrumentensoftware bestimmt. Die Faltungsänderungen der mRNA-Spiegel wurden mit der 2^{−ΔΔCt-Methode} bestimmt. β-actin diente als interne Kontrolle. Alle Proben wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt.

10. Western-Blotting

Das Gesamtprotein wurde aus den LAA-Geweben mittels Radioimmunpräzipitation Assay (RIPA) Lysepuffer extrahiert (bestehend aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,5 % Natriumdeoxycholat, 0,1 % SDS, ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitor-Cocktails; siehe Materialtabelle). Die Gewebe wurden auf Eis homogenisiert und 15 Minuten lang bei 12.000 g × g bei 4 °C zentrifugiert, wobei der Supernatant gesammelt wurde. Die Proteinkonzentration wurde mit einem BCA-Protein-Assay-Kit quantifiziert. Anschließend wurden gleiche Mengen Protein (30 μg pro Lane) mit 12 % SDS-PAGE getrennt bei 80 V für 30 Minuten (Stapelgel), gefolgt von 120 V für etwa 60 Minuten (auflösendes Gel) und anschließend auf Polyvinylidenfluoridmembranen (PVDF) bei 300 mA für 90 Minuten im Transferpuffer übertragen (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20 % Methanol). Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Milch in TBST (Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20) bei Zimmertemperatur für 2 Stunden blockiert und dann über Nacht mit primären Antikörpern (siehe Materialtabelle für Antikörperquellen, Katalognummern und Verdünnungen) bei 4 °C untersucht. Am folgenden Tag wurden die Membranen dreimal mit TBST (jeweils 10 Minuten) gewaschen und mit dem entsprechenden HRP-konjugierten Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle) für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach drei weiteren TBST-Waschungen (jeweils 10 Minuten) wurden Flecken mit einem verbesserten Chemikulumineszenz-(ECL)-Kit mit einem chemilumineszenzbildenden Bildgebungssystem visualisiert. Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) diente als interne Kontrollelemente. Die densitometrische Analyse wurde mit der Software ImageJ durchgeführt, und die relativen Proteinexpressionswerte wurden auf GAPDH normalisiert. Die ungefähren Molekulargewichte der nachgewiesenen Proteine waren wie folgt: vWF (~260 kDa), TM (~60 kDa), endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS, ~130 kDa), induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS, ~130 kDa), PAI-1 (~45 kDa), t-PA (~70 kDa) und GAPDH (~36 kDa). Vollwertige, unbeschnittene Western Blot-Bilder sind in ergänzender Abbildung 1 und ergänzender Abbildung 2 bereitgestellt.

11. Statistische Analyse

Alle Werte wurden mit einer statistischen und grafischen Software analysiert und als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Die Normalität der Datenverteilung wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test vor der parametrischen Analyse bewertet. Die Homogenität der Varianz wurde mit dem Levene-Test bewertet. Für die Daten, die die Annahmen von Normalität und Varianzhomogenität erfüllen, wurde ein Differenzenvergleich mit einseitiger ANOVA durchgeführt, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Test für Mehrfachvergleiche mit der Kontrollgruppe. Für Daten, die nicht die Normalitätsannahme erfüllen, wurde der nichtparametrische Kruskal-Wallis-Test angewandt, der von Dunns Post-hoc-Test gefolgt wurde. In dieser Studie erfüllten alle Variablen die Annahmen zur Normalität und zur gleichen Varianz; daher wurden durchgehend parametrische Analysen angewendet. In der Analysesoftware wurden die Daten in gruppierte Datentabellen eingegeben, Einweg-ANOVA im Menü Spaltenanalysen ausgewählt, Dunnetts Test für Post-hoc-Vergleiche und die Signifikanzschwelle auf p < 0,05 gesetzt.

Ergebnisse

Tiermodell von chronisch moderater RI und AF

Ein schematischer Überblick über das experimentelle Design und den Zeitplan ist in Abbildung 1 dargestellt. Die repräsentativen Bilder der Angiographie der linken Nierenarterie vor und nach der Transkatheter-Embolisation, gezeigt in Abbildung 2A,B, zeigten, dass die kleinen Nierenarterienzweige nach der Transkatheter-Emboli...

Diskussion

Die vorliegende Studie etablierte ein in-vivo-Tiermodell mit moderater RI in Kombination mit AF und untersuchte die Pathogenese der linken Vorhofendotheldysfunktion unter diesen pathologischen Bedingungen. Die Hauptergebnisse dieser Studie sind wie folgt: Erstens hat die Emboliation der linken Hauptnierenarterie für 3 Monate bei Beagles erfolgreich eine moderate RI induziert. Zweitens wurde bei Beagles effektiv ein AF-Modell etabliert. Drittens war die Funktion des linken Vorhof...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6-0 Polypropylennaht	Ethicon (Johnson & Johnson)	8706H	Zur Reparatur der A. femoralis
5F Mehrzweckkatheter	Cordis (Cardinal Health)	521-550S	Zur Nierenarterienkanülierung und Embolisation
6F Quadripolarer Elektrodenkatheter	St. Jude Medical	401443	Zur Stimulation des rechten Vorhofs
6F Vaskulärer Einführschlauch	Terumo	RS*A60K10SQ	Zum Zugang zur A. femoralis
ABI 7500 Echtzeit-PCR-System	Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific)	4351105	Zur qRT-PCR-Thermozyklisierung und Fluoreszenzdetektion
Resorbierbare Gelatineschwammgranulate (50 mg Durchmesser)	Jinling Pharmaceutical	—	Zur transkatheteren Nierenarterienembolisation; als Suspension mit Kontrastmittel und Kochsalzlösung (1:1) zubereitet
ADMA ELISA-Kit (canin)	Cusabio	CSB-E09297c	Zur Plasmamessung asymmetrischen Dimethylarginins
Aldosteron ELISA-Kit (canin)	Cusabio	CSB-E08014c	Zur Plasmaaldosteronmessung
BCA Protein Assay-Kit	Thermo Fisher Scientific	23225	Zur Quantifizierung der Proteinkonzentration
Beagle (männlich, 4–5 Jahre, 10–12 kg)	Shanghai Jiao Tong University Agricultural Experimental Animal Farm Co., Ltd.	—	Gesunde männliche Beagle; einzeln unter Standardbedingungen untergebracht
C-Bogen-Fluoroskopiesystem	GE Healthcare	OEC 9900 Elite	Für fluoroskopische Führung während Katheterisierung und Angiographie
Chemilumineszenz-Imaging-System	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	Zur Western-Blot-Bandvisualisierung
Creatinin ELISA-Kit (canin)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	C011-2-1	Zur Plasmakreatininmessung
Manschettendotrachealtubus (ID 7,0–8,0 mm)	Covidien (Medtronic)	86449	Zur endotrachealen Intubation und mechanischen Beatmung
DF-5A Herzstimulator	Suzhou Dongfang Electronic Technology Research Institute	DF-5A	Für schnelle Vorhofstimulation; Einstellungen: BCL 60 ms, Impulsbreite 2 ms, Spannung 4× Schwelle
ECL Western Blotting-Substrat	Thermo Fisher Scientific	32106	Enhanced Chemiluminescence-Kit für Blot-Visualisierung
EDTA-Antikoagulanzien-Röhrchen	BD Vacutainer	367835	Für Blutentnahme (Plasmatrennung)
eNOS Primärantikörper (Kaninchen)	Cell Signaling Technology	32027	Verdünnung 1:1000; für Western Blotting (~130 kDa)
Eosin-Y-Lösung (wässrig)	Solarbio	G1100	Für H&E-Gegenfärbung (2 min)
Foley-Urinverweilkatheter (8 Fr)	C.R. Bard	0165SI08	Für zeitgesteuerte Urinsammlung während CCr-Bestimmung
GAPDH Primärantikörper (Kaninchen)	Cell Signaling Technology	5174	Verdünnung 1:1000; interner Kontrollwert für Western Blotting (~36 kDa)
GraphPad Prism (Version 8.0)	GraphPad Software	—	https://www.graphpad.com; für statistische Analyse (Einfaktorielle ANOVA, Dunnett's Test)
Hämatoxylin-Lösung (Harris)	Solarbio	G1140	Für H&E-Kernfärbung (5 min)
Heparin-Natrium-Injektionslösung (unfraktioniert)	Changzhou Qianhong Biopharma	H32022088	4000 IE verdünnt in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung; zur Antikoagulation während der Katheterisierung
HRP-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper	Cell Signaling Technology	7076	Verdünnung 1:5000; für Western Blotting
HRP-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper	Cell Signaling Technology	7074	Verdünnung 1:5000; für Western Blotting
hs-CRP ELISA-Kit (canin)	Cusabio	CSB-E08557c	Zur Plasmamessung hochempfindlichen C-reaktiven Proteins
IL-6 ELISA-Kit (canin)	R&D Systems	CA6000	Zur Plasmainterleukin-6-Messung
ImageJ-Software (Version 1.53)	National Institutes of Health	—	https://imagej.nih.gov/ij/; für Western-Blot-Densitometrieanalyse
iNOS Primärantikörper (Kaninchen)	Abcam	ab178945	Verdünnung 1:1000; für Western Blotting (~130 kDa)
Laktat-Ringer-Lösung	Baxter	2B2324	Intravenöse Flüssigkeit; während der Eingriffe mit 5–10 mL/kg/h infundiert
Lichtmikroskop	Olympus	BX53	Für histologische Untersuchung von HE-gefärbten Nierenschnitten
Mechanischer Beatmungsapparat (veterinary)	Midmark	Matrx Model 3000	Tidalvolumen 15 mL/kg; Atemfrequenz 12–15 Atemzüge/min
Mikroplatten-Reader	BioTek	Synergy HTX	Zur ELISA-Absorbanzmessung bei 450 nm
Neutrales gepuffertes Paraformaldehyd (10%)	Solarbio	P1110	Für Nierengewebefixierung (24 h)
NO ELISA-Kit (canin)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A012-1-2	Zur Plasmastickstoffmonoxidmessung
Nicht-ionisches jodiertes Kontrastmittel (Iohexol)	GE Healthcare	Omnipaque 350	5–8 mL pro Injektion bei 3 mL/s für Nierenarterienangiographie
PAI-1 ELISA-Kit (canin)	Cusabio	CSB-E13043c	Zur Plasmamessung von Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1
PAI-1 Primärantikörper (Kaninchen)	Abcam	ab66705	Verdünnung 1:1000; für Western Blotting (~45 kDa)
Paraffinwachs	Leica Biosystems	39601006	Für Gewebeeinbettung
PrimeScript RT Reagenz-Kit	Takara Bio	RR037A	Zur Reverse-Transkription von RNA zu cDNA
Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail	Thermo Fisher Scientific	78440	Zu RIPA-Puffer für Proteinextraktion hinzugefügt
Pulsoximeter (veterinary)