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Forschungsartikel
Diese Forschung entdeckte erhöhte HMGA1-Spiegel und eine verringerte HAND1-Expression im Kehlkopfkrebs, was auf eine umgekehrte Beziehung und signifikante Zusammenhänge mit Metastasen und klinischem Stadium hinweist, was darauf hindeutet, dass beide zum Tumorfortschritt beitragen.
Diese Studie untersuchte die Expressionsprofile der HMGA1- und HAND1-Gene im laryngealen Plattenepithelkarzinom (LSCC) sowie in benachbarten normalen Kehlkopfhäutegeweben mittels Anwendung von Immunhistochemie und RT-PCR-Methoden. Das Ziel war es, ihre möglichen Rollen bei der Initiierung, Entwicklung, Invasion und Metastasierung des LSCC zu untersuchen. Sowohl HMGA1 als auch HAND1 wurden in krebsartigen und angrenzenden normalen Geweben nachgewiesen. Dennoch zeigte HMGA1 eine signifikant erhöhte Expression in LSCC-Geweben, während HAND1 deutlich reduzierte Expressionsniveaus aufwies. Die erhöhte HMGA1-Expression war positiv mit Lymphknotenmetastasen (100,0 % vs. 50,0 %) und fortgeschrittenem klinischen Stadium (91,7 % vs. 44,4 %) assoziiert, war jedoch nicht mit dem histologischen Tumorgrad, klinischem Typ oder Patientenalter assoziiert. Im Gegensatz dazu war die reduzierte HAND1-Proteinexpression mit Lymphknotenmetastasen, klinischem Stadium und pathologischem Grad assoziiert, was auf eine Rolle beim Tumorfortschritt und bei Metastasen hindeutet. Darüber hinaus wurde eine lineare negative Korrelation zwischen den Expressionen von HMGA1 und HAND1 festgestellt, was auf eine mögliche regulatorische Interaktion hindeutet, bei der HMGA1 die HAND1-Expression unterdrücken könnte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass HMGA1 und HAND1 komplementäre Funktionen in der Pathogenese von LSCC haben, wobei HMGA1 die Tumorentwicklung fördern könnte und HAND1 als Suppressor dient. Die Wechselwirkung dieser beiden Gene könnte neue Perspektiven auf die molekularen Mechanismen bieten, die das Fortschreiten und die Metastasierung von LSCC antreiben.
Kehlkopfkrebs ist nach Nasenkrebs der zweithäufigste primäre bösartige Tumor von Kopf und Hals und macht 26 % bis 30 % aller Kopf- und Halstumoren weltweitaus 1. Über 90 % der Kehlkopfkrebserkrankungen werden als Kehlkopfplattenkarzinom (LSCC)2 klassifiziert. Die Hauptbehandlungen bei Kehlkopfkrebs sind Chirurgie und Strahlentherapie. Lokale Rückfälle und Metastasen an Lymphknoten sind die Haupttodesursachen bei Patienten mit Kehlkopfkrebs. Daher bleibt das effektive Management von Rückfall und Metastasen eine große klinische Herausforderung. Mit dem Fortschritt der Molekularbiologie wurden verschiedene Gene mit abnormaler Expression bei Kehlkopfkrebs identifiziert. Die Mechanismen, die der Tumorinvasion und Metastasen bei Kehlkopfkrebs zugrunde liegen, bleiben jedoch unklar und erfordern weitere Untersuchungen.
Proteine der High Mobility Group A (HMGA) sind nicht-histonchromatinbindende Proteine, die sich im Zellkern befinden. HMGA1 bindet an DNA und zugehörige Proteine und induziert strukturelle Veränderungen des Chromatins, die die Gentranskriptionregulieren 3. Als chromatinassoziierter Transkriptionsregulator moduliert HMGA1 die Expression mehrerer tumorbezogener Gene, die an Proliferation und Metastasierung beteiligt sind. Frühere Studien haben gezeigt, dass HMGA1 in einer Vielzahl menschlicher Krebsarten überexprimiert ist, darunter Schilddrüsen-, Kolorektal-, Bauchspeicheldrüsen- sowie Kopf-Hals-Malignantien 4,5,6,7 sowie andere in der Literatur berichtete epitheliale und solide Tumore. HMGA1 reguliert die Tumorgenese, indem es die Expression mehrerer nachgelagerter Zielgene moduliert, die an der Proliferation und Metastase8 beteiligt sind.
Herz- und neuronale Kamm-Derivate (HAND) Gene gehören zur Familie bHLH (Basic Helix–Loop–Helix), einschließlich HAND1 und HAND2. HAND1 spielt als Transkriptionsfaktor eine Rolle bei der Trophoblast-Differenzierung und der Herzentwicklung9. Der Expressionsmechanismus von HAND1 in der extra-embryonalen Zellschicht bleibt jedoch unklar. Es wurde bestätigt, dass HMGA1 direkt an den HAND1-Promotor bindet und die HAND1-Aktivität sowohl in vivo als auch in vitro10 hemmt. HAND1 wurde als Repressorprotein an der Regulierung der Zelldifferenzierung und Krebsbildung beteiligt. Studien haben gezeigt, dass die Expression von HAND1 im menschlichen Magenkrebs11, Bauchspeicheldrüsenkrebs12, Eierstockkrebs13 und Schilddrüsenkrebs14 unterdrückt und hypermethyliert ist. Soweit wir wissen, haben jedoch nur begrenzte Studien die HAND1-Expression im Kehlkopfkrebsgewebe untersucht.
In der vorliegenden Studie wurden Immunhistochemie (zweistufige Nachweismethode) und die Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) verwendet, um die Expression von HMGA1- und HAND1-Proteinen sowie mRNA in LSCC und benachbarten normalen Schleimhautgeweben nachzuweisen. Die Immunhistochemie ermöglicht die Visualisierung der Proteinlokalisierung innerhalb der Gewebearchitektur, während RT-PCR eine sensible Detektion der Genexpression auf Transkriptionsebene ermöglicht und ergänzende Einblicke in Protein- und mRNA-Expressionsmuster liefert. Im Vergleich zu quantitativer PCR (qPCR), die eine höhere Sensitivität und präzise Quantifizierung bietet, Western Blotting, das eine Protein-Validierung ermöglicht, aber keinen räumlichen Kontext bietet, und RNA-Sequenzierung (RNA-seq), die umfassende transkriptomische Profilierung bietet, aber fortgeschrittene computergestützte Analyse erfordert, stellt die kombinierte Verwendung von Immunhistochemie und RT-PCR eine kosteneffektive und klinisch anwendbare Strategie für die Biomarker-Forschung dar. Die Studie hatte zum Ziel, die Rolle und Korrelation dieser beiden Faktoren beim Auftreten, der Entwicklung, dem Fortschreiten und der Metastasierung von LSCC zu untersuchen. Darüber hinaus kann die Bewertung der Expression von HMGA1 und HAND1 Biomarker für Diagnose und prognostische Bewertung bei Kehlkopfkrebs liefern, was die Risikostratifizierung verbessern und die klinische Entscheidungsfindung unterstützen kann.
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Diese Studie wurde vom Forschungsethikkomitee des Shijiazhuang Volkskrankenhauses geprüft und genehmigt (Genehmigungsnummer YKLS 2026 Nr. 041; 27. März 2026). Die Studie wurde gemäß den Vorschriften zur ethischen Überprüfung biomedizinischer Forschung mit menschlichen Probanden durchgeführt, den Vorschriften zur ethischen Überprüfung von Lebenswissenschaften und medizinischer Forschung mit menschlichen Proben, der Erklärung von Helsinki sowie den internationalen ethischen Leitlinien für gesundheitsbezogene Forschung mit Menschen. Menschliche Gewebeproben wurden aus archivierten chirurgischen Proben in Übereinstimmung mit institutionellen ethischen Vorgaben entnommen, um Anonymisierung und Vertraulichkeit der Patientendaten zu gewährleisten. Eine schriftliche informierte Zustimmung wurde von den Teilnehmern eingeholt oder ein Verzicht auf die Zustimmung des Ethikkomitees für die Nutzung anonymisierter archivierter Proben erteilt, je nachdem.
Versuchsmaterialien
Herkunft der Exemplare
Insgesamt wurden zwischen Februar 2011 und August 2012 42 Fälle von LSCC-Geweben und 25 Fälle benachbarter normaler Kehlkopfschleimhaut aus chirurgischen Resektionsproben des LSCC in der Hals-Nasen-Ohren-Hals-Chirurgie in Hebei gewonnen. Unter diesen wurden 25 Fälle benachbarter normaler Schleimhaut (entnommen von einer Stelle > 1,0 cm vom Krebsrand entfernt) pathologisch als entzündlich oder normale Schleimhaut bestätigt. Die 42 LSCC-Proben wurden alle pathologisch als Plattenepithelkarzinom bestätigt. Alle Gewebe wurden bei -80 °C gelagert. Die 42 Patienten waren männlich, keine weiblichen Patienten. Unter den LSCC-Fällen waren 15 gut differenziert, 18 moderat differenziert und 9 schlecht differenziert. Achtzehn Fälle hatten Lymphknotenmetastasen, während 24 Fälle keine hatten. Die klinische Stufeneinteilung basierte auf dem TNM-Klassifikations- und Stufensystem (UICC, 2002), mit 20 Fällen in den Stufen I und II sowie 22 Fällen in den Stufen III und IV. Es gab 30 Fälle des supraglottischen Typs, 11 Fälle des glottischen Typs und 1 Fall des subglotischen Typs. Die Altersgruppe der Patienten betrug 40–75 Jahre, mit einem Medianalter von 60 Jahren. Keiner der Patienten erhielt vor der Operation eine Strahlen- oder Chemotherapie, und die klinischen Daten waren vollständig.
Experimentelle Methoden und Schritte
HE-Färbungsverfahren
Objektträgervorbereitung und Hämatoxylin–Eosin-Färbung
Glasobjektträger für die Immunhistochemie wurden zunächst 24 Stunden lang in konzentrierter Säure eingeweicht, anschließend mindestens 10 Minuten gründlich unter fließendem Leitungswasser gewaschen, um die Restsäure zu entfernen, und zweimal mit sanftem Umrühren in destilliertes Wasser für 30 Minuten mit sanftem Rühren untergetaucht, um eine vollständige Spülung sicherzustellen. Nach 2 Stunden Einweichen in 95 % Ethanol wurden die Objektträger in einem 60 °C Ofen getrocknet und dann 1 Minute lang in eine APES-Acetonmischung (1:49, v/v) mit sanftem Schütteln zur gleichmäßigen Beschichtung eingetaucht, gefolgt vom Abspülen mit reinem Aceton. Abschließend wurden sie bei Raumtemperatur (20–25 °C) an der Luft getrocknet, um eine ordnungsgemäße Gewebehaftung bei nachfolgenden Färbeverfahren zu gewährleisten.
Die mit Paraffin eingebetteten Gewebeschnitte wurden nacheinander jeweils 10 Minuten in Xylen I und Xylen II eingetaucht, um Paraffin zu entfernen, gefolgt von der Rehydrierung durch graduales Ethanol (100 %, 95 %, 80 %) für jeweils 5–10 Minuten und anschließend 2 Minuten in destilliertem Wasser gespült. Anschließend wurden die Schnitte einer Hämatoxylin–Eosin (HE) Färbung wie folgt unterzogen: 4 Minuten Hämatoxylin-Färbung, 3 Minuten unter fließendem Leitungswasser spülen und kontinuierlich färben, um überschüssige Färbung zu entfernen, Differenzierung mit 1 % Salzsäure in Ethanol für 30 Sekunden, dreimaliges Waschen mit Leitungswasser zur Beendigung der Differenzierung und 10 Sekunden Eosinfärbung. Die routinemäßige graduierte Dehydrierung erfolgte nacheinander, indem jeweils 70 % Ethanol, 80 % Ethanol, 95 % Ethanol, wasserfreies Ethanol I und wasserfreies Ethanol II jeweils 5 Minuten lang verwendet wurden. Nach dem Trocknen wurde der Schlitten mit neutralem Balsam montiert.
Immunhistochemisches Verfahren
Paraffinabschnitte mit einer Dicke von 4 μm wurden geschnitten, flach auf APES-beschichtete Objektträger gelegt und über Nacht in einen 67 °C-Ofen gelegt, gefolgt von einer Deparaffinisierung mit Xylol I und II für jeweils 10 Minuten. Die schrittweise Dehydrierung erfolgte mit jeweils 100 %, 90 % und 70 % Alkohol für jeweils 5 Minuten, gefolgt von einem Waschen mit Leitungswasser und destilliertem Wasser für 3 Minuten. Um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren, wurden die Objektträger mit frisch zubereiteter 3%iger Methanol-Wasserstoffperoxid-Lösung inkubiert, um eine vollständige Abdeckung des Gewebeschnitts bei Raumtemperatur (20–25 °C) für 20 Minuten sicherzustellen, gefolgt von drei Wascharbeiten mit destilliertem Wasser für 5 Minuten in 0,01 m PBS.
Die Antigengewinnung erfolgte durch Eintauchen der Objektträger in einen Citratpuffer (pH 6,0) und das Erhitzen in einem Schnellkochtopf bei ~ 95–100 °C für HMGA1 für 8 Minuten und 10 Minuten für HAND1 mit fest geschlossenen Deckeln zur Aufrechterhaltung konstanter Druckbedingungen. Die Abschnitte wurden dann bei Raumtemperatur (20–25 °C) abgekühlt und dreimal in 0,01 M PBS für jeweils 3 Minuten unter sanfter Bewegung gewaschen. Primäre Antikörper gegen HMGA1 und HAND1 wurden in Antikörperverdünner (1:150 bzw. 1:100) verdünnt und sanft durch Pipettieren vermischt, bevor sie gleichmäßig aufgetragen wurden, um jeden Gewebeschnitt vollständig zu bedecken. Die Objektträger wurden über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer bebrütet. Nach der Übernachtung wurden die Objektträger aus der befeuchteten Kammer genommen und für 10 Minuten auf Raumtemperatur ausgeglichen gelassen. Die Objektträger wurden dreimal mit 0,01 M PBS (5 Minuten pro Wasch) unter sanftem Rühren gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Überschüssige Flüssigkeit wurde entfernt, und ein sekundärer Antikörper (HRP-markiertes Polymer-Antikaninchen/Maus) wurde hinzugefügt, um die Gewebeschnittsflächen vollständig zu bedecken. Die weitere Brutzeit erfolgte bei 37 °C für 35 Minuten.
DAB-Substratlösung wurde tropfenweise aufgetragen, um das Gewebe zu bedecken, und die Farbentwicklung wurde unter dem Mikroskop 1–3 Minuten überwacht, bis braune Färbungen auftraten und sofort durch das Abspülen mit destilliertem Wasser stoppten, sobald die optimale Färbintensität erreicht war. Hämatoxylin-Neufärbung, Salzsäurealkoholdifferenzierung und Ammoniaklösung zur blauen Rückkehr wurden durchgeführt. Darauf folgte routinemäßig eine graduierte Alkoholdehydrierung, Xylengtransparenz und eine Montage mit neutralem Balsam zur Beobachtung unter dem Mikroskop. PBS wurde als Blank-Kontrolle anstelle des primären Antikörpers verwendet. Zusätzlich wurden zuvor bestätigte HMGA1-positive Kopf- und Halsplattenepithel-Karzinom-Gewebeschnitte und HAND1-positive Plazentagewebeschnitte als positive Kontrolle verwendet, um die Färbungsqualität und -konsistenz sicherzustellen.
Ergebnisbestimmung
Das in diesem Experiment verwendete Chromogen ist das DAB-H2O2-System. Nach einer Hämatoxylin-Neufärbung wird hauptsächlich im Zellkern eine positive HMGA1- und HAND1-Färbung beobachtet, mit einigen zytoplasmatischen Färbungen. Zur Bewertung wurde der Bereich mit der höchsten Dichte positiv gefärbter Zellen unter niedriger Vergrößerung (×40) identifiziert. Bei ×100 Vergrößerung wurden fünf Felder mit der höchsten positiven Zelldichte ausgewählt und 100 Zellen in jedem Feld gezählt. Der durchschnittliche Prozentsatz positiver Zellen aus den fünf Feldern wird für jede Folie als Ergebnis verwendet. Die Bewertungskriterien waren wie folgt: keine gefärbten Zellen (-), positive Zellen < 25 % (+), positive Zellen 25 %–50 % (++) und positive Zellen > 50 % (+++), basierend auf einer semi-quantitativen Bewertungsmethode, die häufig in immunhistochemischen Analysen verwendet wird. Die Bewertung wurde unabhängig voneinander von zwei qualifizierten Pathologen in doppelblinder Weise durchgeführt: 15,16,17. Wenn ihre Meinungen unterschiedlich sind, sollten sie diskutieren und zu einer Schlussfolgerungkommen. 18.
RT-PCR-Methode
Grundbücher
Primer wurden mit Primer-Design-Software auf Basis von Zielgensequenzen entwickelt, wobei Fokus auf Primer-Spezifität, Schmelztemperaturkompatibilität und erwartete Produktgröße gelegt wurde. Die detaillierten Primer-Sequenzen, Produktgrößen und Glühtemperaturen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Primer wurden auf eine Konzentration von 2 OD synthetisiert, in zwei Röhrchen aufgeteilt und mit DEPC-behandeltem Wasser auf 10 pmol/μL verdünnt, um bei -20 °C zu speichern. Die Glühtemperatur wurde mit der Formel berechnet: Tm= 2(A + T) + 4(G + C)
RNase-Behandlung von experimentellen Materialien und Geräten:
Kunststoffteile (z. B. Pipettenspitzen, EP-Tuben): Die Kunststoffteile wurden in eine sterilisierte Weitflasche gelegt, mit DEPC behandeltes Wasser wurde hinzugefügt, bis die Gegenstände vollständig untergetaucht waren, und die Materialien wurden über Nacht in einer Abzugshaube bei Raumtemperatur (20–25 °C) inkubiert. Anschließend wurden sie 120 Minuten unter Druck sterilisiert und bei 65 °C getrocknet.
Glasstücke: Das Glas wurde über Nacht in Säure eingeweicht, gründlich abgespült, getrocknet, in Alufolie eingewickelt, 6 Stunden in einem 200 °C-Ofen gebacken und für die spätere Verwendung sauber aufbewahrt.
Metallgegenstände (z. B. Schere, Pinzette): Die Metallgegenstände wurden gereinigt, 6 Stunden in einem 200 °C-Ofen gebacken und für den späteren Gebrauch sauber aufbewahrt.
Herstellung von Lösungen
0,1 % (v/v) DEPC-Lösung: 1 mL DEPC wurde 1000 mL destilliertem Wasser zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,1 % (v/v) zu erreichen, gut geschüttelt, über Nacht bei 4 °C inkubiert, durch Autoklavierung sterilisiert und bei 4 °C gelagert.
75 % (v/v) Ethanollösung: 75 ml absolutes Ethanol wurden mit 25 ml DEPC-behandeltem Wasser gemischt, um eine Endkonzentration von 75 % (v/v) zu erreichen, und bei 4 °C gelagert.
Totale RNA-Extraktion aus Gewebe
Nach der RNA-Extraktion wurde die RNA-Integrität vor der Reverse-Transkription und der nachgelagerten Analyse bewertet. 80 mg Gewebe wurden mit einer elektronischen Waage gewogen, in kleine Stücke geschnitten und in einen vorbehandelten Glashomogenisator gegeben. 1 mL vorgekühltes RNA-Extraktionsreagenz wurde bei 4 °C zugesetzt, und die Probe wurde auf Eis homogenisiert, indem wiederholtes Mahlen durchgeführt wurde, bis ein einheitliches Lysat ohne sichtbare Gewebefragmente entstand, wodurch die Blasenbildung vermieden wurde. Das homogenisierte Gemisch wurde in ein 1,5 mL RNase-freies EP-Rohr übertragen und 5 Minuten auf Eis inkubiert. 400 μL Chloroform wurden jedem Rohr zugegeben, 10–15 Sekunden lang energisch vortisiert, um eine vollständige Phasenmischung zu gewährleisten, gefolgt von 5 Minuten Inkubation auf Eis. Die Röhren wurden bei 4 °C, 12.000 x g für 15 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde die obere wässrige Phase sorgfältig mit einer RNase-freien Pipette aspiriert, ohne die Interphasenschicht zu stören, in ein neues Rohr. Ein gleiches Volumen Isopropanol wurde hinzugefügt, das durch vorsichtiges Invertieren des Rohrs 8–10 Mal vermischt wurde, bis die Schichten verschwunden waren, und mindestens 10 Minuten bei -20 °C inkubierte. Das Gemisch wurde bei 4 °C, 12.000 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Die Überlagerungsschicht wurde entsorgt, 400 μL 75 % eiskalten Ethanol hinzugefügt, um das RNA-Pellet zu suspendieren. Das Gemisch wurde erneut bei 4 °C, 12.000 x g. für 5 Minuten zentrifugiert. Die Überlagerungsschicht wurde verworfen und das RNA-Pellet leicht getrocknet. Das RNA-Pellet wurde in RNase-freiem Wasser gelöst und bei -80 °C für die spätere Verwendung gelagert.
RNA-Integritätsdetektion
Zur RNA-Integritätsdetektion wurden 5 μL RNA-Probe mit 5 μL Bromphenol-Blau-Ladepuffer vermischt, und die Elektrophorese wurde auf einem 2%igen Agarosegel durchgeführt. Die RNA-Integrität galt als akzeptabel, wenn klare 28S-, 18S- und 5S-Bänder ohne offensichtliche Verschmierung sichtbar waren.
Reverse Transkription (RT) zur Synthese von cDNA
6 μL RNA wurden bei 70 °C für 10 Minuten vorgeheizt, dann wurden 25 mM MgCl2 (4,0 μL), dNTP (2,0 μL), AMV (0,7 μL), 10× AMV-Puffer (2,0 μL), Oligo(dT) (1,0 μL), RNasin (0,5 μL) und deionisiertes Wasser sequentiell auf Eis hinzugefügt, um ein endgültiges Reaktionsvolumen von 20 μL zu erreichen, gefolgt von sanftem Mischen und kurzer Zentrifugation. Die Reaktionsbedingungen waren 25 °C für 1 Minute, 42 °C für 60 Minuten, 98 °C für 5 Minuten und anschließend unbegrenzt bei 4 °C gelagert. Sobald die Reaktion 4 °C erreichte, wurde das Produkt aus der PCR-Maschine entnommen, als cDNA-Vorlage für die nächste PCR-Reaktion verwendet und bei -20 °C für spätere Verwendung gelagert.
PCR-Verstärkung
Für jede PCR-Reaktion enthielt die Mischung eine cDNA-Schablone (1 μL), einen für das HMGA1, HAND1 oder GAPDH (1 μL) spezifischen Forwardprimer, einen für das Zielgen oder GAPDH spezifischen Reversprimer (1 μL), PCR-Mastermischung (10 μL) und DEPC-behandeltes Wasser (7 μL), mit einem Gesamtvolumen von 20 μL. Für jedes Zielgen wurden separate Reaktionen vorbereitet (HMGA1, HAND1) und das interne Kontrollgen (GAPDH), wobei jede Reaktion ihr jeweiliges genspezifisches Vorwärts- und Rückwärtsprimerpaar enthält.
Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 20 μL. Nach vorsichtigem Mischen der Reaktionskomponenten und kurzer Zentrifugation für 5–10 Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit wurde das Rohr in eine vorgeheizte PCR-Maschine gesetzt und entsprechend den Reaktionsbedingungen in Tabelle 2 verstärkt.
Bestätigung und Analyse von PCR-amplifizierten Produkten
Gelzubereitung
2 g Agarose wurden gewogen und in eine dreieckige Flasche gelegt. 2 ml 50× TAE-Elektrophoresepuffer und 100 ml destilliertes Wasser (bereiten Sie ein 2%iges Agarosegel vor) wurden hinzugefügt und anschließend in einer Mikrowelle mit intermittierendem Wirbeln (15–20 Sekunden) erhitzt, bis die Agarose vollständig aufgelöst war. Nach dem Abkühlen auf etwa 55 °C wurden 10 μL EB-Lösung hinzugefügt und gründlich gemischt. Das Gel wurde dann bei Zimmertemperatur (20–25 °C) in eine saubere Gelschale gegossen, mit destilliertem Wasser gewaschen und ein Kamm eingesetzt, um Probenbrunnen zu erzeugen. Die Gel-Dicke betrug 0,4 cm. Das Tablett wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (20–25 °C) auf eine ebene Oberfläche gestellt, bis das Gel vollständig erstarrt war. Der Kamm wurde vorsichtig entfernt.
Lädungsproben
4 μL jeder DNA-Probe wurden in die Brunnen des Gels gegeben, und der DNA-Marker wurde dem linkesten Brunnen hinzugefügt.
Elektrophorese
Das geladene Gel-Tray wurde in einen Elektrophoresetank mit TAE-Elektrophorese-Puffer platziert, um sicherzustellen, dass der Pufferstand etwa 1 mm über der Geloberfläche blieb. Ein Ende der Bohrungen befand sich an der Kathode (damit DNA zur Anode wandern kann). Das Elektrophoresesystem war an ein Netzteil angeschlossen und lief etwa 45 Minuten lang mit 120 V und 60 mA, bis der Lastpuffer über die Mittellinie des Gels hinauswanderte, woraufhin der Strom abgeschaltet wurde.
Ergebnisbeobachtung und Bildgebung
Nach der Elektrophorese wurde das Gel sorgfältig entfernt, und die Ergebnisse wurden unter einem UV-Transilluminator beobachtet und mit dem DNA-Marker verglichen, um festzustellen, ob das Molekulargewicht der amplifizierten Fragmente an den erwarteten Positionen erschien. Das Gelbildgebungssystem wurde verwendet, um Bilder aufzunehmen und die Ergebnisse am Computer zu speichern.
Steuerungsaufbau
Anstelle von cDNA wurde destilliertes Wasser als Negativkontrolle verwendet.
Semi-quantitative Analyse
Die Ergebnisse der Agarosegel-Elektrophorese wurden analysiert und mit dem Gel-Bildgebungssystem erfasst. Bildanalyse-Software wurde verwendet, um die Helligkeit der Bänder zu analysieren. Die absoluten integrierten OD-Werte des Zielgen-Amplifikationsbandes und des entsprechenden internen Kontrollgen-Amplifikationsbandes wurden gemessen. Die Ergebnisse wurden als Verhältnis des absolut integrierten OD-Werts des Zielbands zum absolut integrierten OD-Wert des entsprechenden internen Kontrollbandes ausgedrückt.
Das heißt, relative Expression = OD-Wert des Zielgens / OD-Wert des internen Kontrollgens.
Statistische Analyse
Alle Daten wurden mit Excel organisiert und mit Statistiksoftware ausgewertet. Kontinuierliche Variablen wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben und zwischen zwei Gruppen mit dem unabhängigen Stichproben-t-Test verglichen. Nominale kategoriale Variablen, einschließlich immunhistochemischer positiver Expressionsraten, wurden mit demχ-2-Test analysiert. Ordinale kategoriale Variablen, einschließlich pathologischer Grad und klinischer Stufe, wurden mit dem Rangsummentest analysiert (Mann-Whitney U-Test für Zweigruppenvergleiche, wo zutreffend). Die Korrelation zwischen der Expression von HMGA1 und HAND1 wurde mittels linearer Korrelationsanalyse untersucht. Alle Tests wurden zweiseitig durchgeführt; P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen, P . < 0,01 als hochsignifikant.
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Ergebnisse des immunhistochemischen Nachweises
Repräsentative Hämatoxylin–Eosin (HE)-Färbungsbilder, die die histologische Morphologie der benachbarten normalen Kehlkopfschleimhaut und LSCC mit unterschiedlichen Differenzierungsgraden (gut, moderat und schlecht) veranschaulichen, werden gezeigt. Konkret zeigt Abbildung 1A die angrenzende normale Kehlkopfschleimhaut, Abbildung 1B gut d...
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Kehlkopfkrebs, einer der häufigsten Tumore von Kopf und Hals, hat in den letzten Jahren eine zunehmende Häufigkeit gezeigt, vermutlich im Zusammenhang mit Umwelt- und Lebensstilfaktoren. Wie bei anderen bösartigen Tumoren bleiben ihr Rückfall und Metastasen die Hauptursachen für den Tod. Mit Fortschritten in der Molekularbiologie wurden viele Faktoren identifiziert, die mit der Entstehung von Kehlkopfkrebs in Verbindung stehen, aber die Mechanismen von Entstehung und Metastasierung sind ...
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Die Autoren möchten die Unterstützung ihrer Institution und aller Beteiligten an dieser Studie würdigen.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Automatische Gewebeeinbettungsmaschine | Sakura Finetek, Tokio, Japan | Tissue-Tek TEC 5 | Paraffin-Einbettung |
| Mikrotome | Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland | RM2135 | Sektionierung (4 & mu; m) |
| Slide Dryer | Xiaogan Hongye Medical Instrument Co., Ltd., China | CS-VI | Rutschtrocknung |
| Heizinkubator | Shanghai Yangguang Experimental Instrument Co., Ltd., China | 303-4A | Temperaturkontrollierte Brutzeit |
| Optisches Mikroskop | Olympus Corporation, Tokio, Japan | BX41 | Histologische Beobachtung |
| Bilderfassungssystem | QImaging, Kanada | QCapture Pro 7 | Mikroskopische Bildgebung |
| Clean Bench | Beijing Xicheng Halbleiterausrüstungsfabrik, China | SW-CJ-1FD | Steriler Arbeitsbereich |
| Gekühlte Zentrifuge | Pekinger Medizinische Instrumentenreparaturfabrik, China | LXJ-64-01 | RNA-Trennung |
| Tisch-Zentrifuge | Shanghai Peiqing Technology Co., Ltd., China | PQ-1600A | RNA/DNA-Verarbeitung |
| Magnetischer Rührer | Jiangsu Jintan Medizinische Instrumentenfabrik, China | HJ-3 | Lösungsvorbereitung |
| Mini-Mixer | Shanghai Peng' s Industrial Co., Ltd., China | H-1 | Sample-Mischen |
| Elektronische Bilanz | METTLER Toledo, Schweiz | PB3002-S | Probenwiegung |
| PCR-Verstärker | Eppendorf AG, Deutschland | Mastercycler 5333 | PCR-Verstärkung |
| Elektrophorese-Stromversorgung | Beijing Liuyi Instrumentenfabrik, China | DIY-6C | Spannungsregelung |
| Elektrophorese-Tank | Beijing Liuyi Instrumentenfabrik, China | DYCZ-24DN | Gelelektrophorese |
| Mikrowellenofen | Shanghai Zhongda Medical Application Research Institute, China | WD800SL23 | Agarose-Zubereitung |
| UV-Transilluminator | Beijing Liuyi Instrumentenfabrik, China | WD-9403B | DNA-Visualisierung |
| Gel-Bildgebungssystem | Anlai Co., Ltd., China | AlphaImager HP | Gel-Dokumentation |
| Kühlschrank (4 & Grad; C) | Haier Biomedizin, China | BC-165D | Sample-Speicherung |
| Ultra-Niedrigtemperatur-Gefrierschrank | Haier Biomedizin, China | DW-86L388 | Speicher (-80 & Grad; C) |
| Eisbox | Shanghai Fuzhi Technology Co., Ltd., China | FZ-IB-20L | Probentransport |
| Kryogene Aufbewahrungsbeutel | Shanghai Yili Technology Co., Ltd., China | YL-ULT-50 | Probenkonservierung |
| Forschungspipetten | Eppendorf AG, Deutschland | Research Plus | Flüssigkeitshandhabung |
| RNA-Extraktionsreagenz (TRIzol) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific), USA | 15596026 | RNA-Extraktion |
| Rückwärts-Transkriptions-Kit | Takara Bio Inc., Japan | RR037A | cDNA-Synthese |
| PCR Master Mix | Takara Bio Inc., Japan | RR820A | PCR-Verstärkung |
| dNTP Mix | Takara Bio Inc., Japan | 4030 (typisch) | PCR-Komponente |
| RNase-Inhibitor (RNasin) | Promega, USA | N2111 | RNA-Schutz |
| Oligo(dT) Primer | Takara Bio Inc., Japan | 3806 (typisch) | cDNA-Syntheseprimer |
| Agarose | Sigma-Aldrich, USA | A9539 | Gelzubereitung |
| TAE-Puffer (50×) | Sigma-Aldrich, USA | TAE50X-1L (typisch) | Elektrophoresepuffer |
| DNA-Marker (Leiter) | Takara Bio Inc., Japan | DL2000 (3421A) | Größenreferenz |
| Ethidiumbromid (EtBr) | Bio-Rad, USA | 1610433 | DNA-Visualisierung |
| PBS-Puffer | Gibco (Thermo Fisher Scientific), USA | 10010023 | Waschpuffer |
| DEPC-behandeltes Wasser | Invitrogen, USA | AM9916 | RNA-Schutz |
| Chloroform | Sigma-Aldrich, USA | C2432 | RNA-Extraktion |
| Isopropanol | Merck, Deutschland | 109634 | RNA-Präzipitation |
| Ethanol (absolut) | Merck, Deutschland | 100983 | Dehydrierung |
| Methanol | Merck, Deutschland | 106009 | Peroxidase-Blockierung |
| Wasserstoffperoxid (H2O2) | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | Endogene Peroxidase-Blockierung |
| Xylen | Sigma-Aldrich, USA | 534056 | Deparaffinisierung |
| Citrat-Antigen-Rückgewinnungspuffer | Abcam, Großbritannien | ab93678 | Antigengewinnung |
| Antikörperverdünner | Dako, Dänemark | S3022 | Antikörperverdünnung |
| HMGA1 Primärantikörper | Abcam, Großbritannien | ab129153 | Verdünnung 1:150 |
| HAND1 Primärantikörper | Abcam, Großbritannien | ab200040 | Verdünnung 1:100 |
| Sekundärer Antikörper (HRP-konjugiert) | Dako, Dänemark | K5007 | Erkennungssystem |
| DAB-Substrat-Kit | Dako, Dänemark | K3468 | Chromogener Nachweis |
| Hämatoxylin-Färbung | Sigma-Aldrich, USA | H9627 | Nuklearfärbung |
| Eosin-Fleck | Sigma-Aldrich, USA | E4009 | Zytoplasmatische Färbung |
| Neutrales Balsam-Montagemedium | Sinopharm Chemical Reagent Co., China | 10004160 | Verschlussmontage |
| HMGA1-Zündhütchen | Benutzerdefinierte Synthesizer (z. B. IDT/Sangon) | N/A | Genamplifikation |
| HAND1 Primer | Benutzerdefinierte Synthesizer (z. B. IDT/Sangon) | N/A | Genamplifikation |
| GAPDH-Primer (interne Kontrolle) | Individuell synthetisiert | N/A | Putzgenen |
| APES (Aminopropyltriethoxysilan) | Sigma-Aldrich | N/A | Schlittenbeschichtung |
| RNase-freie Mikrozentrifugenröhren | Eppendorf | N/A | RNA-Handhabung |
| RNase-freie Pipettenspitzen | Eppendorf | N/A | Flüssigkeitshandhabung |
| Agarose-Gel Gießtablett und Kamm | Generika | N/A | Gelzubereitung |
| Primer-Design-Software | Integrierte DNA-Technologien, USA | PrimerQuest-Tool | Primer-Design |
| Bildanalyse-Software | Medienkybernetik, USA | Image-Pro Plus 6.0 | Bandquantifizierung |
| Software für statistische Analysen | IBM Corp., USA | SPSS Version 13.0 | Statistische Analyse |