Methodenartikel

Kartierung der Infant-Immunität mit minimalem Input: Integratives Einzelzell- und multiomisches Profiling

DOI:

10.3791/70279

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3. April 2026

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1Department of Pediatrics, Yale University School of Medicine, 2Department of Biomedical Informatics and Data Science, Yale University School of Medicine, 3Department of Biostatistics, Yale University School of Public Health, 4Center for Systems and Engineering Immunology, Yale University, 5Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 6Department of Obstetrics, Gynecology, & Reproductive Sciences, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme und Erhaltung von Blutproben von neonatalen und pädiatrischen Patienten sowie die Anwendung von scRNA-seq, Proteomik und spektraler Flowzytometrie zur Charakterisierung der Immunzellpopulationen aus diesen Proben.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bei der Geburt wird das neonatale Immunsystem abrupt mit einer radikal anderen Umgebung konfrontiert, die reich an mikrobiellen und Umweltreizen ist. Zunehmende Belege deuten darauf hin, dass die Immunität im frühen Leben nicht nur unreif ist, sondern vielmehr einzigartig an die besonderen Anforderungen dieses Entwicklungsfensters angepasst ist. In dieser Zeit ist das Immunsystem hochdynamisch und durchläuft schnelle Veränderungen, um sich an die sich verändernde äußere Landschaft anzupassen. Das Verständnis dieser komplexen und sich entwickelnden Immunlandschaft erfordert eine direkte Untersuchung bei Neugeborenen. Eine wesentliche Einschränkung bei solchen Untersuchungen ist jedoch das niedrige Gesamtblutvolumen bei Neugeborenen (~100 mL/kg), was die sicher für Forschung gesammelte Menge, insbesondere bei extrem niedrigem Geburtsgewicht (ELBW) oder extrem frühgeborenen Säuglingen, einschränkt. In unserer jüngsten Arbeit gehen wir diese Einschränkung an, indem wir zeigen, wie hochdimensionale Immunprofilierung mit winzigen Mengen neonatalen Blutes durchgeführt werden kann. Wir führen eine Reihe optimierter Protokolle für die Longitudinal-Probenahme im frühen Leben ein und wenden fortschrittliche Techniken an, darunter Durchflusszytometrie, Proteomik und Einzelzell-RNA-Sequenzierung, um die aus minimalen Eingaben gewonnene Informationen zu maximieren. Zusammen ermöglichen diese Methoden einen umfassenden Überblick über die transkriptomischen und proteomischen Signaturen zirkulierender Immunzellen bei Neugeborenen und bieten neue Einblicke in den einzigartigen Verlauf der frühen Lebensimmunität.

Einleitung

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Dieses Protokoll ist für 100–250 μL Blutproben optimiert, die innerhalb von 12 Stunden entnommen werden, entweder kryokonserviert oder sofort verwendet. Bei der Geburt wird das neonatale Immunsystem in eine radikal andere Umgebung gedrängt, angereichert mit mikrobiellen und Umweltreizen, die zuvor im geschützten intrauterinen Settingfehlten. Dieser Wandel erfordert, dass das Immunsystem sich an eine Vielzahl neuer Antigene anpasst und darauf reagiert, ein Prozess, der für das Überleben unerlässlich ist, aber auch erheblicheHerausforderungen mit sich bringt. Zunehmende Belege deuten darauf hin, dass die Immunität im frühen Leben nicht einfach unreif oder eine Miniaturversion des erwachsenen Immunsystems ist. Stattdessen ist es individuell auf die spezifischen Bedürfnisse dieser kritischen Entwicklungsphasezugeschnitten 3,4. Während dieses neonatalen Zeitfensters reifen die zellulären Komponenten des Immunsystems, darunter verschiedene Arten von T-Zellen, B-Zellen und myeloiden Zellen, und entwickeln einzigartige Eigenschaften und Funktionen, die spezifisch für das frühe Lebensind. Trotz ihrer Bedeutung bleibt die neonatale Immunität aufgrund ethischer und praktischer Einschränkungen schwer direkt zu untersuchen. Eine wesentliche Einschränkung ist das geringe Blutvolumen bei Neugeborenen, das durchschnittlich ~100 mL/kg 9,10 beträgt. Diese Herausforderung wird noch ausgeprägter, wenn man Blut von extrem Frühgeborenen (geboren vor der 30. Schwangerschaftswoche) und ELBW-Säuglingen entnimmt, die mit nur 40 ml zirkulierem Blut nur 400 g wiegen. Dies schränkt die sichere Abnahme von Blut ein und unterstreicht die Notwendigkeit von Ansätzen, die die Datenausbeute minimaler Proben maximieren. Um diese Herausforderung zu bewältigen, demonstrieren wir optimierte Protokolle für hochdimensionale Immunprofilierung mit winzigen Blutmengen (100–250 μL), wie sie beispielsweise bei ELBW-Säuglingen gewonnen wurden.

Jüngste Fortschritte bei der Blutentnahme und -verarbeitung haben die Untersuchung von Immunantworten in Populationen ermöglicht, in denen die Probenentnahme traditionell schwierig ist. Mikronadelgeräte wie die Tasso- und Touch Activated Phlebotomy-Systeme wurden ursprünglich für eine bequeme Blutentnahme zu Hause bei Erwachsenen entwickelt. Seitdem wurden sie für den Einsatz bei Säuglingen angepasst, sodass primäre Betreuer und klinische Teams mit minimalen Beschwerden Proben entnehmen können. Außerdem können sie zu Hause ohne den Stress wiederholter klinischer Besucheverwendet werden, was die Einhaltung und Zugänglichkeit erleichtert. Eine Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Mikroröhre sollte zusammen mit dem Gerät verwendet und über Nacht im Labor geliefert werden, wobei die entsprechenden Biohazard-Protokolle eingehalten werden. Am nächsten Morgen, wenn die Proben eintreffen, sollten sie mit Methoden der roten Blutkörperchen (RBC) verarbeitet werden, um zirkulierende Immunzellen6 zu erfassen. Erwähnenswert ist, dass EDTA-Röhrchen die Isolation von lebenden Zellen ermöglichen, aber Zeitüberlegungen sind wichtig. Für funktionelle Tests mit Stimulation müssen Proben innerhalb von weniger als 4 Stunden und idealerweise weniger als 2 Stunden nach der Entnahme verarbeitet werden. Für die unten aufgeführten nicht-funktionalen, phänotypischen Assays sollten die Proben innerhalb von 12 Stunden verarbeitet werden, um einen Übernachttransport zu ermöglichen und gleichzeitig die Wiedergewinnung zu gewährleisten, da die Zelllebensfähigkeitim Laufe der Zeit abnimmt. Im Vergleich zur traditionellen Dichtegradiententrennung mit Ficoll ist die Lyse schneller, weniger arbeitsintensiv und führt zu einer höherenRückgewinnung 13. Allerdings kann die isolierte periphere mononukleäre Zelle durch Lyse kontaminierende Granulozyten hinterlassen, was die Reinheit verringert, aber für Studien zu diesen Zelltypen14 von Vorteil sein kann. Diese Abwägungen zeigen, wie methodische Anpassungen bei der Untersuchung seltener oder sensibler klinischer Proben, wie etwa von Neugeborenen, Machbarkeit und Genauigkeit ausbalancieren. Auch die nachgelagerte Handhabung isolierter Zellen profitierte von methodischen Verfeinerungen. Die Kryokonservierung mit fetalem Rinderserum (FBS) und Dimethylsulfoxid (DMSO) bleibt ein robuster Ansatz für Immunzellen, insbesondere im fetalen und neonatalen Blut, wo Zelllebensfähigkeit und -erholung entscheidend sind. Neben der Optimierung des Blutentnahmeprozesses haben wir auch nachgelagerte Techniken eingeführt, die maximale Informationen aus kleinen Probenmengen extrahieren. Wir führen eine Reihe optimierter Protokolle ein, die die Probenahme im frühen Leben erleichtern und so eine detaillierte Analyse der Immundynamik über die Zeit ermöglichen. Unser Ansatz nutzt fortschrittliche Techniken wie spektrale Flusszytometrie, Proteomik und Einzelzell-RNA-Sequenzierung, die zusammen einen unvergleichlichen Überblick über die proteomischen und transkriptionellen Signaturen zirkulirender Immunzellen im frühen Leben bieten. Darüber hinaus bietet die spektrale Flowzytometrie Möglichkeiten, mit minimalem Zellinput funktionelle Einblicke zu gewinnen.

Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Techniken, wie vollständige Blutwerte (CBCs), zur Analyse von blutabgeleiteten Immunzellen15 eingesetzt, während andere die Immunzellverhältnisse in neonatalen Vollblutproben mittels DNA-Methylierung 16,17 analysiert haben. Obwohl diese Techniken hilfreich waren, um die Anteile bekannter Immunzellen zu erfassen, gibt es dennoch Einschränkungen in unserer Fähigkeit, tiefgehende Einblicke in Zellen ohne Multi-Omics-System zu gewinnen. CBCs liefern nur grobe Messungen wichtiger Blutzelltypen, was sie nützlich macht, um den allgemeinen Immunstatus im klinischen Umfeld zu etablieren, aber in ihrer Fähigkeit, Subtypen oder funktionelle Zustände zu erkennen, begrenzt ist. Zuletzt haben Studien begonnen, diese Einschränkung anzugehen, indem plasmaabgeleitete transkriptomische und metabolomische Veränderungen bei Säuglingen bereits in der ersten Lebenswoche von18 Jahren verwendet wurden. Die auf Massenspektrometrie basierende Proteomik wurde angepasst, um Immunprofile in neonatalen Proben zu untersuchen19. Dieser Ansatz ist leistungsstark, um eine breite Palette von Proteinen unvoreingenommen zu messen und potenzielle Biomarker zu identifizieren. Wichtige Einschränkungen sind jedoch der Bedarf an relativ großem Proteininput und das Fehlen direkter Informationen zur Zellidentität, obwohl sowohl lösliche als auch unlösliche Proteine erfasst werden. Der gezielte Multiplex-Proteomik-Assay (TMPA) bietet Alternativen für Proben mit geringem Input. Diese Methoden verwenden gezielte antikörperbasierte Detektion und bieten hochsensible Profilierungen für Proben mit begrenztem Material. Eines davon wurde insbesondere verwendet, um frühe Immunentwicklungsbahnen längszeitlich20 zu verfolgen.

Die Flowzytometrie ermöglicht die quantitative Analyse von Immunzellproteinen auf Einzelzellebene, indem fluoreszenzmarkierte Zellen durch einen fokussierten Laserstrahl geleitet und die resultierenden Lichtstreu- und Fluoreszenzsignale gemessen werden. Bei dieser Technik binden fluoreszenzmarkierte Antikörper an spezifische Oberflächen- oder intrazelluläre Proteine. Dies ermöglicht die gleichzeitige Erkennung und Quantifizierung mehrerer Immunzell-Subtypen und ihrer definierenden Eigenschaften basierend auf ihren Fluoreszenzprofilen. Die spektrale Flowzytometrie erweitert diesen Ansatz, indem sie das gesamte Emissionsspektrum jedes Fluorochroms erfasst, was eine präzise spektrale Entmischung und den gleichzeitigen Nachweis von über 35 Markern in einem einzigen Testermöglicht. Dies ermöglicht die Analyse von deutlich mehr Markern als herkömmliche Durchflusszytometriepanels, die auf ~8–12 Marker begrenzt sind. Als Ergänzung zu diesen zytometrischen Techniken hat die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) immunologische Studien grundlegend verändert, indem sie hochauflösende, unvoreingenommene transkriptomische Profilierung aus minimalem Inputmaterialermöglicht. Trotz höherer Kosten und der Abhängigkeit von der Zellviabilität bietet scRNA-seq unvergleichliche Einblicke in die frühe Immunheterogenität im Vergleich zur Massensequenzierung. Zusammen zeigen diese Fortschritte, wie Innovationen in der Sammlung, Erhaltung und Analyse angepasst werden, um die besonderen Herausforderungen der Untersuchung fetaler und neonataler Immunität zu meistern.

Dieses Protokoll wurde für die Analyse von kryopreservierten peripheren Immunzellen, die durch serielle RBC-Lyse isoliert wurden, optimiert. Forscher sollten dieses Protokoll in Betracht ziehen, wenn ihre Studien eine hochauflösende Immunprofilierung aus kleinen Blutmengen (100–500 μL) erfordern, insbesondere wenn eine Längsschnittanalyse entscheidend ist. Die Methode ist sowohl auf Termingeborene als auch auf Frühgeborene anwendbar und mit einer Vielzahl von nachgelagerten Analysen kompatibel, wodurch sie für vielfältige Forschungsfragen in der neonatalen und pädiatrischen Immunologie geeignet ist.

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Protokoll

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Eine informierte elterliche Zustimmung und die vollständige Einhaltung der relevanten nationalen ethischen Vorschriften wurden gemäß dem Institutional Review Board (IRB) der Yale University sichergestellt. Wie im genehmigten IRB-Protokoll festgelegt, wurden die Eltern in der ersten Woche nach der Geburt des Säuglings vom Forschungsteam kontaktiert, um vor der Einschreibung die Zustimmung einzuholen. Es wurden keine Studienverfahren mit menschlich hergestellten Materialien vor dokumentierter ethischer Genehmigung eingeleitet.

1. Probensammlung, -verarbeitung und -lagerung (Abbildung 1)

  1. Stationäre Blutentnahme
    1. Entnahme und Verarbeitung von Säuglingsproben nach Eingang, lagerung bei 4 °C und Verarbeitung innerhalb von 12 Stunden nach der Entnahme.
    2. Sammeln Sie ~250 μL Vollblut und lagern Sie sie in einem Antikoagulanten EDTA-Blutentnahmeröhrchen. Wenden Sie das Blutentnahmerohr 8 Mal um, um das Antikoagulans zu mischen.
    3. Beginnen Sie mit der Verarbeitung des Vollbluts mittels roter Blutlyse, wie in Abschnitt 1.3 beschrieben (Vollblutprobeaufnahme).
    4. Um trockene Blutflecken zu sammeln, verwenden Sie die sterile Lanzette, um einen Stich an der gereinigten Spitze/Ferse zu machen.
      1. Alternativ pipettieren Sie ~25–30 μL Blut aus dem EDTA-Rohr auf das Filterpapier. Berühre leicht das Filterpapier mit dem Bluttropfen.
    5. Fülle mindestens einen Kreis mit frei fließendem Blut, einen Tropfen pro Kreis. Lass den Blutfleck trocknen. Lassen Sie das Filterpapier offen, bis die Blutflecken gründlich getrocknet sind.
    6. Beschriften Sie entsprechend mit Entnahmezeit, Verarbeitungsdatum, Zeitpunkt und Probenidentifikation.
    7. Leg sie in eine durchsichtige Plastiktasche mit Reißverschluss. Bewahren Sie Blutfleckkarten bei −20 °C oder −80 °C auf, um die Stabilität zu verlängern, bis sie zur proteomischen Analyse bereit sind.
  2. Ambulante Blutentnahme
    HINWEIS: Mit Zustimmung des Institutional Review Board der Yale University erhielten Eltern ambulanter Teilnehmer die Möglichkeit, Blutproben zu Hause mit einem Mikronadel-Selbstentnahmegerät zu entnehmen. Dieses Gerät gewinnt Kapillarblut durch eine Lanzette, die auf die Haut aufgetragen wird. Eltern, die diese Methode wählten, erhielten eine klinische Schulung mit Demonstrationskits und erhielten anschließend detaillierte schriftliche Anweisungen sowie Sammelsets für den Heimgebrauch.
    1. Waschen Sie sich vor der Anwendung die Hände und tragen Sie Handschuhe. Sammle alle notwendigen Gegenstände, einschließlich eines Spiegels, falls nur ein Elternteil die Blutentnahme durchführt.
    2. Nehmen Sie das Gerät aus dem Werkzeugkasten und drehen Sie die Kappe von einem kompatiblen Rohr ab.
    3. Drücken Sie das Rohr in das Gerät, bis es fest sitzt und die Füllleitungen nach außen zeigen.
    4. Nimm die Windel des Babys ab und halte es aufrecht.
    5. Folgen Sie den Anweisungen des Wärmepacks zur Aktivierung.
      HINWEIS: Wenn kein Rucksack verfügbar ist, verwenden Sie eine andere Erwärmungsmethode, wie zum Beispiel eine Hand.
    6. Halte das Wärmepack 2–4 Minuten auf der Stelle (Po) zum Erwärmen und zur Steigerung der Durchblutung.
    7. Reinigen Sie die Stelle mit einem Alkoholpolster und lassen Sie sie trocknen.
    8. Entfernen Sie die durchsichtige Abdeckung vom roten Knopf. Lösen Sie die Lasche vom Gerät ab und kleben Sie fest auf den vollsten Teil des Gesäßes des Säuglings, während Sie es aufrecht halten.
      HINWEIS: Passen Sie ihre Haltung bei Bedarf an, um den Schlauch vollständig senkrecht für eine ordnungsgemäße Blutentnahme zu halten.
    9. Drück den Knopf einmal ganz nach unten und lass los. Stell den Timer auf 5 Minuten. Beobachte, wie das Rohr bei Bedarf mit dem Spiegel gefüllt wird.
    10. In den ersten 1-2 Minuten kann kein Blut erscheinen. Entferne das Gerät nach maximal 5 Minuten oder früher, wenn das Blut bis zur oberen Indikatorlinie gefüllt ist, vor 5 Minuten.
    11. Entferne das Rohr mit einer leichten Drehung vom Gerät und ziehe nach unten. Schnell die Kappe ganz auf das Rohr schnappen. Wenden Sie den Schlauch mindestens 10 Mal um, wobei das Blut bei jeder Inversion die Kappe berührt, um Gerinnung zu verhindern.
    12. Proben über Nacht nach der Entnahme versenden.
  3. Vollblutprobenaufbereitung
    1. Verarbeiten Sie Blutproben in einem biologischen Sicherheitsschrank.
    2. Übertragen Sie vorsichtig die 250 μL Blut in ein 50 ml konisches Rohr mit 10 ml 1x RBC-Lysepuffer. Spülen Sie das Blutabnehmrohr mit 10 ml Rotblasen-Lysepuffer, bis es leer ist. Lassen Sie die Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) lysieren.
    3. Nach Abschluss der Lyse gib ~30 ml PBS bei RT zum Waschen und Schleudern bei 430 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Saugen Sie das Supernatant mit einem Vakuum ab, ohne das Pellet zu stören.
    4. Setzen Sie die Übertragung und Spülung der Probe wie in Schritt 1.3.2 beschrieben fort, bis das Zellpellet frei von sichtbaren roten Blutkörperchen erscheint. Zentrifugiere bei 430 × g für 5 Minuten und entferne dann vorsichtig den Überstandsmittel, ohne das Pellet zu stören.
    5. Für jeweils 250 μL gesammeltes Blut wird das resultierende Zellpellet in 2 mL Gefriermedium (10 % DMSO im FBS) neu suspendiert und in zwei Kryoviale zur Konservierung aufgeteilt.
    6. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zelle, indem Sie Zellen in Feezing-Medien mit einem Hämozyometer unter Verwendung von Trypan-Blue-Ausschluss zählen.
    7. Übertragen Sie 1 ml von Schritt 1.3.5 auf jeden Kryovialen. Beschriften Sie entsprechend mit Entnahmezeit, Verarbeitungsdatum, Zeitpunkt und Probenidentifikation.
    8. Lagere Kryoviale zwischenzeitlich bei -80 °C in einem Gefrierbehälter mit Isopropanol auf. Nach 24 Stunden werden die Kryoviale in flüssigen Stickstoff umgeleitet, bis sie zur Analyse bereit sind.

2. TMPA aus getrockneten Blutflecken (DBS) (Abbildung 2)

  1. Am Tag der Verarbeitung bringen Sie das Filterpapier zu RT. Mit einem 3-mm-Metallstanzer perforieren Sie 2–3 Kreise in das Filterpapier, wo das Blut hindurchgegangen ist, so zentral wie möglich auf dem Blutfleck.
  2. Heben Sie jeden 3-mm-Punch mit einer Pinzette auf und geben Sie eine 96-Loch-Platte oder ein niedrigbindendes PCR-Rohr mit 20 μL Elutionspuffer (1x PBS, 1x Protease-Inhibitor, 0,05% Tween 20) in einen Brunnen. Stelle sicher, dass der Stempel mit einem Elutionspuffer abgedeckt ist.
  3. Schließe die Schläuche oder decke die Platte mit einem Kunststoffschürtel ab und setze sie auf einen Digital Vortex, der sich bei 600 U/min für 60 Minuten bei RT dreht.
  4. Am Ende der Inkubation wird das Eluat vorsichtig in ein neues, wenig bindendes Rohr oder eine 96-Well-Platte übertragen. Entsorge die Röhren oder die Platte mit den Filterlochern.
  5. Quantifizieren Sie den Proteingehalt mit einem BCA-Assay.
    1. Nehmen Sie 2 μL jeder Probe oder BSA-Standard, um serielle Verdünnungen von 1:10 und 1:100 in Wasser zu erzeugen. Stellen Sie Proben und Standards doppelt vor, indem Sie 15 μL verdünnte Proben oder standardmäßig zu 200 μL 1x Arbeitslösung hinzufügen. Proben 30 Minuten bei 37 °C inkubieren.
    2. Lesen Sie das Signal bei 562 nm auf einem Kennzeichenleser aus. Berechnen Sie die endgültige Proteinkonzentration basierend auf der BSA-Standardneigung und dem Hintergrund des Elutionspuffers.
  6. Stellen Sie Aliquoten von 30 μL für Proben mit 0,5–1 mg/mL in niedrig bindenden 1,5 mL Schraubkapsel-Mikroröhren her. Frost die Proben bei -80 °C ein, damit sie später mit dem TMPA-Dienst verarbeitet werden können.

3. Spektrale Flusszytometrie von rot lysiertem Blut (Abbildung 3)

  1. Am Tag des Experiments tauen Sie ein Fläschchen mit roten Blutzellen schnell in einem 37 °C starken Wasserbad auf, bis nur ein kleiner Eistropfen übrig bleibt.
  2. Gib die Zellsuspension zu einem 15-mL konischen Rohr mit 10 mL vorgewärmter (37 °C) vollständiger RPMI (hergestellt mit 500 mL RPMI 1640, 50 mL FBS, 5,6 mL Penicillin-Streptomycin und 5,6 mL Glutamin-Supplement). Zentrifugiere bei 400 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entferne vorsichtig das Supernatant und entsorge es.
  3. Lassen Sie das Pellet vorsichtig mit 3 ml vollständiger RPMI wieder suspendieren und bestimmen Sie die Zellzahl mit einer geeigneten Methode.
  4. Drehen Sie die resuspendierten Zellen bei 400 × g 5 Minuten bei Zimmertemperatur. Aspiriere und entsorge das Supernatantant.
  5. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 1 × 106 Zellen/ml bei vollständiger RPMI an. Geben Sie 100 μL pro Bohrloch (0,1 × 10⁶ Zellen) in eine 96-Well-V-Bodenplatte ein. Zentrifugiere bei 764 × g für 2 Minuten bei 4 °C und entferne das Überwasser.
  6. Fügen Sie 100 μL Live/Dead-Farbstoff in PBS mit einer Verdünnung von 1:2.000 mit Fc-Block und Monozyt-Block (1:100-Verdünnung) zu allen Proben hinzu, außer der unverfärbten Kontroll. Inkubiere 15 Minuten bei 4 °C.
  7. Waschen Sie mit 100 μL PBS und zentrifugieren Sie bei 764 × g für 2 Minuten bei 4 °C. Entsorge das Supernatant vorsichtig.
    HINWEIS: Es ist unerlässlich, Fc-Block und Monocytenblock zu verwenden, um eine unspezifische Bindung der Antikörper zu verhindern.
  8. Fügen Sie 100 μL des Oberflächencocktails verdünnt (1:200 Verdünnung) im FACS-Puffer (500 mL PBS, 2,5 g Rinderserumalbumin (BSA), 2 mM EDTA, pH 8,5) zu allen Proben außer der unverfärbten Kontrolle hinzu. Inkubiere 30 Minuten bei 4 °C.
  9. Waschen Sie mit 100 μL FACS-Puffer und zentrifugieren Sie bei 764 × g für 2 Minuten bei 4 °C. Entsorge das Supernatant vorsichtig.
  10. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 100 μL 4%-Paraformaldehyd zu jeder Probe hinzufügen. Inkubiere 15 Minuten im RT im Dunkeln.
  11. Waschen Sie mit 100 μL FACS-Puffer, zentrifugieren Sie bei 764 × g für 2 Minuten bei 4 °C und suspendieren Sie erneut in 200 μL FACS-Puffer.
  12. Bereite Ultra-Comp-Perlen als einfarbige Steuerungen vor. Färben Sie die einfarbigen Kontrollperlen nach demselben Protokoll wie die Proben, einschließlich der Fixierung, wenn die Proben fixiert waren.
  13. Bereite fluoreszierende Minus-eins (FMO)-Kontrollen mit demselben Verfahren wie bei den Proben vor.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die einfarbigen Steuerungen und die FMOs genauso zu behandeln wie die Samples. Wenn zum Beispiel die Proben nach der Färbung fixiert sind, sollten auch die FMOs und die Einfarbkontrollen festgelegt werden.
  14. Führen Sie die Proben, Einfarb-Kontrollen, unverfärbte Kontrollen und FMO-Kontrollen mit einem konventionellen/spektralen Durchflusszytometer durch. Analysieren Sie die Daten mit Software.
  15. Stellen Sie die Gatter basierend auf den passenden Isotyp- und FMO-Kontrollen ein. Zuerst werden Zellen mit Gate-Cells ausgewählt, um die Leukozytenpopulation mithilfe des Vorwärtsstreu- (FSC) versus Seitenstreudiagramms (SSC) auszuwählen, was hilft, Trümmer auszuschließen und Zellen basierend auf Größe und Granularität auszuwählen.
  16. Nach der Leukozytenselektion werden die Zellen mit einem Diagramm zwischen Vorwärtsstreufläche (FSC-A) und Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H) ausgeschlossen.
    HINWEIS: Dies stellt die Auswahl von Einzelzellen (Singlets) sicher, wobei entlang der Diagonale liegende Zellen als Singlets betrachtet werden, während Doublets und Klumpen ausgeschlossen werden.
  17. Gate-Zellen zur Viabilität mit einem Viability-Farbstoff, um tote Zellen auszuschließen und sicherzustellen, dass die anschließende Analyse nur lebende Zellen umfasst.
  18. Nach diesen ersten Gating-Schritten werden lebende Einzelzellen weiter nach spezifischen Linienmarkern gegatet, um verschiedene Immunzellpopulationen zu unterkategorisieren. Teilen Sie die lebenden Einzelzellen basierend auf CD33+-myeloiden Zellen und CD33-Lymphozyten anhand der CD33-Expression auf.
  19. Innerhalb der CD33+- Population wird CD14+ -Monozyten differenziert und CD11c+ dendritische Zellen (DCs) als Zellen identifiziert, die CD11c, aber nicht CD14 exprimieren.
  20. Innerhalb der CD33-Lymphozytenpopulation werden CD3+ T-Zellen und Subgates zur Identifikation der CD4+- und CD8+-T-Zell-Subsets identifiziert.
  21. Identifizieren Sie zusätzlich CD56+ natürliche Killerzellen (NK) durch CD56-Expression und gaten CD19+ B-Zellen durch CD19-Expression.

4. scRNA-seq von roten Blutbluten-lysiertem Blut (Abbildung 4)

  1. Ein Fläschchen mit kryokonservierten, roten Blutkörperchen-lysierten Zellen in einem 37 °C Wasserbad auftauen. Fügen Sie die Probe 10 ml T-Zell-Medium in einem 15 mL konischen Rohr hinzu. Zentrifugiere bei 430 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Entsorge das Supernatant.
  2. Fügen Sie der Probe weitere 10 ml 1x PBS hinzu. Zentrifugiere bei 430 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Entsorge das Supernatant.
  3. Zähle die Zellen und beurteile die Lebensfähigkeit mit Trypanblau. Wenn die Lebensfähigkeit unter 70 % liegt, gehen Sie mit dem Dead Cell Removal Kit zur Entfernung toter Zellen fort.
    1. Entfernung von toten Zellen
      1. Verdünnen Sie den 20x-Bindungspufferstock mit sterilem, doppelt destilliertem Wasser, um eine 1x-Arbeitslösung zu erhalten.
      2. Lassen Sie das Zellpellet in 100 μL Mikroperlen zur Entfernung toter Zellen pro 1 × 107 Zellen suspendieren. Gründlich mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
      3. Setzen Sie die magnetische Trennsäule in den entsprechenden magnetischen Halter. Spülen Sie die Säule vor der Anwendung mit 500 μL 1x Bindungspuffer, um das Gleichgewicht zu erreichen.
      4. Bring das Zellvolumen auf 500 μL mit 1x Bindungspuffer. Tragen Sie die Zellsuspension auf die Säule auf und sammeln Sie den Durchfluss in einem neuen 1,7-mL-Mikrozentrifugenrohr.
      5. Waschen Sie zweimal mit 500 μL Bindungspuffer. Sammeln Sie den Durchfluss in derselben Mikrozentrifugenröhre.
      6. Zentrifugiere das Eluat bei 300 × g für 10 Minuten. Entsorge das Supernatant.
    2. Zähle die Zellen und beurteile ihre Lebensfähigkeit mit Trypan-Blau.
    3. Resuspendieren Sie 20.000 lebensfähige Zellen in 40 μL PBS mit 0,04 % BSA in einer neuen 1,7-mL Mikrozentrifugenröhre.
    4. Senden Sie die Zellen auf Eis sofort zu einer Genomkernanlage zur Bibliotheksgenerierung und -sequenzierung. Sammeln Sie die Sequenzierungsergebnisse im Format der Cell Ranger-Ausgaben.

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Ergebnisse

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Wir sammelten DBS-Karten von 10 extrem frühgeborenen Säuglingen zu drei Zeitpunkten: 1 Woche (n = 12), 1 Monat (n = 7) und 2 Monate (n = 3) für die TMPA-Proteomanalyse6 (Abbildung 2A). Diese Proben wurden zusammen mit volljährigem Nabelschnurblut des Säuglings (TCB; n = 4) und gesundem Erwachsenenblut (AB; n = 5) analysiert. Die normalisierte Proteinexpression (NPX) von 92 immunbezogenen Proteinen wurde mithilfe der TMPA-Plattform qua...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Gewinnung hochwertiger immunologischer Daten aus minimalen Mengen neonatalem und säuglingsblutigem Blut erfordert methodische Anpassungen über mehrere Schritte hinweg. In diesem Protokoll beschreiben wir vier komplementäre Strategien: (i) optimierte Blutentnahme und Kryokonservierung zur Erhaltung lebensfähiger Zellen für den nachgelagerten Einsatz, (ii) Anwendung der spektralen Flowzytometrie für multiparametrische Immunophenotypisierung, (iii) scRNA-seq zur Auflösung der Immunheter...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken den folgenden Kerneinrichtungen an Yale: Yale Flow Cytometry Core; Yale Zentrum für Genomanalyse. Wir danken dem Yale Center for Clinical Investigation, dem Yale Office of Physician-Scientist and Scientist Development sowie dem Pediatric Critical Care and Trauma Scientist Development Program/NICHD. Respirometrieuntersuchungen wurden vom Chemical Metabolism Core der Yale University durchgeführt. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel an: P01 AI179570 (L.K.), R01AI171980 (L.K.), R01DK129552 (L.K.), R01HL163043 (L.K.), Cystic Fibrosis Foundation (L.K.), finanziert; K08 AI177743 (N.N.B.), Hartwell-Preis (N.N.B.); K08DK133687 (O.O.), Yale School of Medicine, Abteilung für Pädiatrie (O.O.); R01AI123204 (C.R.O.). Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und spiegelt nicht notwendigerweise die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wider. Abbildung 1 wurde in BioRender erstellt. Gawon, K. (2025) https://BioRender.com/7embw10.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific 15575-038 
1x RBC Lysis Buffer Invitrogen 3177165 
BCA Protein Assay Kit  Abcam ab287853 
BD Microtainer MAP MicrotubeFisher Scientific 22-253-270
Bel-Art Cryo-Safe -1° C Freeze Controller Millipore Sigma 41122800 
Rinderserum-Albumin (BSA)Sigma-Aldrich A9647-100G 
Brilliant Ultra Violet 496 Anti-Human CD3 Thermo Fisher Scientific 364-0038-42 
Brilliant Ultra Violet 661 anti-Human CD11c BD BioScience 612968 
Brilliant Vil750 Anti-Human CD14 BioLegend 367135 
Brilliant Violet 570 Anti-Human CD8a BioLegend 301038 
Brilliant Violet 711 Anti-Mensch CD56  BioLegend 318336 
cOmplete, Mini, EDTA-freier Protease-Inhibitor-CocktailMillipore Sigma 11836170001 
Kit zur Entfernung von toten Zellen;Miltenyi Biotec 130-090-101 
Dimethylsulfoxid (DMSO) Thermo Fisher Scientific BP231-100 
Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS), kein Kalzium, kein Magnesium & Nbsp;Thermo Fisher Scientific 14190144 
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco A5256801 
Fisherbrand Digital Vortex Mixer Thermo Fisher Scientific 02215418 
Fixationspuffer BioLegend 420801 
GlutaMAX-ErgänzungsmittelGibco 35050061 
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 
MS-Kolumnen Miltenyi Biotec 130-042-201 
NameGesellschaftKatalognummer
OctoMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-109 
Pazifikblau Anti-Mensch CD4 BioLegend 344619 
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific 15140-122 
RB780 Anti-Mensch CD33 BD Biosciences 755606 
Rierdge 3mm Metallpuncher Rierdge SDD231031PC-01 
RPMI 1640 MittelGibco 11875-093 
Spark UV 387 Anti-Human CD19 BioLegend 302289 
Tasso Collection KitsTasso N/A
Thermowissenschaftliche Schraubkappen-MikroröhrenThermo Fisher Scientific 14-755-287 
Whatman 309 ProteinsaverCytiva 41111700 
Zombie NIR Wirksamkeitskit BioLegend 423105 
Software und Pakete
Adobe Illustrator2024
bbknn1.5.1
FlowJo10.8.1
GraphPad-Prisma9.4.0
NameVersion
Scanpy1.9.1
Srublet0.2.3
kommerzielle Assays
Chrom-Einzelzelle 5' Trikot10X-GenomikPN-1000263
Olink  Enthüllen oder Ziel-96-EntzündungspanelOlinkhttps://olink.com/products/olink-target-96

Referenzen

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