Mit dem wachsenden Interesse an intratumoraler Immuntherapie ist es unerlässlich, Tumormodelle auszuwählen, die zugänglich und praktisch sind. Subkutane Tumore sind leicht zu etablieren, aber schwer zu visualisieren und zu manipulieren. In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur Erzeugung von intradermalen Tumoren, die eine verbesserte Sichtbarkeit und Zugänglichkeit bieten.
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Methodenartikel
Intradermale Tumorimplantation als robustes Modell für Studien zur intratumoralen Immuntherapie bei Murinkrebs
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Entwicklung reproduzierbarer Maustumormodelle ist entscheidend für die Bewertung von Krebsbiologie und Immuntherapiestrategien. Die intratumorale Immuntherapie behandelt etablierte Tumore mit immunstimulierenden Reagenzien, um die lokale Immunsuppression umzukehren und die systemische antitumorale Immunität anzuregen. Die meisten Krebsstudien an Mäusen stellen die Tumore im subkutanen Raum fest, was für die experimentelle intratumorale Immuntherapie aufgrund der Unsichtbarkeit intratumoraler Injektionen schwierig ist. Die intradermale Injektion von Tumorzellen bietet einen zuverlässigen Ansatz, um visualisierbare Tumore zu erzeugen, die eine genaue und reproproduzierbare intratumorale Injektion sowie die Überwachung der Wachstumskinetik und therapeutischen Reaktionen unterstützen. Hier präsentieren wir eine reproduzierbare Methodik zur Etablierung und Behandlung von intradermalen Tumoren unter Verwendung des Maus-B16F10-Melanom-Modells bei C57BL/6-Mäusen als Beispiel. Tumorzellsuspensionen werden intradermal injiziert, und 7–10 Tage nach der Tumorimplantation, sobald die Tumoren ~60 mm3 erreichen, kann eine intratumorale Injektion von immunstimulierenden Mitteln oder eine physikalische Behandlung wie Elektroporation oder Erhitzen direkt angewendet werden. Dies ermöglicht eine präzise Durchführung von Behandlungen und die Messung des Tumorwachstums mit Bremssätteln und vermeidet die Herausforderung der inhärenten Variabilität mehrerer Behandlungen subkutaner Tumore, die nicht sichtbar werden können. Indem dieser Artikel detaillierte Einblicke in diese Technik bietet, zielt er darauf ab, die Reproduzierbarkeit zu unterstützen und die präklinische Forschung in der intratumoralen Immuntherapie voranzutreiben.
Einleitung
Murine Tumormodelle sind ein unverzichtbares Werkzeug in der Krebsforschung. In einem optimalen Mausmodell wäre es möglich, Tumore zu induzieren, die menschlichen Tumoren sowohl auf genetischer als auch auf morphologischer Ebene1 nahe ähneln. Dies ermöglicht die Bewertung und Effizienz neuartiger therapeutischer Ansätze in verschiedenen Bereichen, einschließlich der intratumoralen Immuntherapie (ITIT). ITIT ist ein aufstrebendes Feld in der Krebsbehandlung, das darin besteht, immunstimulierende Wirkstoffe direkt in die Tumor-Mikroumgebung (TME) zu verabreichen. Diese lokalisierte Verabreichung kann die lokale Immunaktivierung stärken, das immunsuppressive Tumormikro-Umfeld umkehren und systemische antitumorale Immunreaktionen auslösen, bekannt als abskopalerEffekt 2. Die Effizienz, Genauigkeit und Konsistenz der intratumoralen Gabe hängen jedoch von der Fähigkeit ab, Injektionsparameter in verschiedenen Tumormodellen sichtbar zu machen und zu kontrollieren.
Die meisten präklinischen Krebsstudien verwenden eine subkutane Tumorimplantation. Dieser Ansatz hat jedoch Einschränkungen bei intratumoralen Therapien, da der Tumor während der Injektion nicht direkt sichtbar werden kann, es sei denn, eine Operation wird durchgeführt. Viele intratumorale Immuntherapie-Strategien erfordern eine präzise Abgabe von Reagenzien in kleine Maustumoren und erfordern oft die mehrfache Ausführung dieser Aufgabe. Ohne visuelle Bestätigung werden die Injektionsgenauigkeit und die Reagenzretention in subkutanen Tumoren zu schlecht kontrollierten Variablen. Dies könnte zu einer Fehlinterpretation oder Variation der experimentellenDaten führen.
Die Intradermale Tumorimplantation bietet eine direkte, zugängliche, visualisierbare und reproduzierbare Alternative zur Tumorbeobachtung, -messung und intratumoralen Injektion und erhöht so die Konsistenz. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass intradermal implantierte Tumore, im Gegensatz zu subkutanen Injektionen, die Immunogenität erhöhen und die Tumorigenität von Tumorzellen unterdrücken4. Intradermal injizierte Tumore induzierten einen schnellen und starken dendritischen Zelltransport zu den Lymphknoten, was zu einer früheren und robusteren Aktivierung tumorspezifischer zytotoxischer T-Zellenführte 4. Die vorliegende Studie beschreibt ein detailliertes und reproduzierbares Protokoll zur Etablierung intradermaler B16F10-Melanomtumoren bei C57BL/6-Mäusen und zur Durchführung anschließender intratumoraler Behandlungen.
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Protokoll
Alle Verfahren wurden mit Zustimmung und in Übereinstimmung mitden Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt. Alle Tierbehandlungen wurden in der Tierklinik von Dartmouth durchgeführt. Weibliche C57BL/6 Mäuse im Alter von 6–8 Wochen wurden unter Standardbedingungen auf belüfteten Regalen mit Futter und Wasser untergebracht. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Rasierende Mäuse
HINWEIS: Alle Mitarbeiter müssen vor der Durchführung dieser Verfahren eine institutionelle Schulung im Umgang mit lebenden Tieren und Anästhesie absolvieren.
- Vor der intradermalen Injektion wird die Flanke jeder Maus wie unten beschrieben rasiert; Die rechte Flanke wurde für Injektionen und die beschriebenen Verfahren genutzt. Rasieren Sie die Mäuse am Tag vor der Injektion der Tumorzellen.
- Positioniere die Maus auf eine stabile Oberfläche. Mit linkem Daumen und Zeigefinger den Nackenbart an der Haut des Nackens fassen und die linke Körperseite vorsichtig in die Handfläche schieben, um die rechte Seite freizulegen. Verwenden Sie den Ring- und/oder kleinen Finger, um das linke Bein und den Schwanz zu halten, damit die rechte Flanke vollständig freiliegt.
- Rasieren Sie das Fell vom Hinterbein bis zu den unteren Rippen, um einen freien Bereich für die Injektion zu schaffen.
- Beide Flanken können rasiert werden, wenn zusätzlicher Übungsraum benötigt wird.
HINWEIS: Anfänger können Mäuse betäuben, wenn sie das Rasieren und das richtige Stoppelüben lernen.
2. Üben Sie Injektionen mit Farbstoff
HINWEIS: Die Praxis kann sowohl an lebenden (betäubten) als auch an eingeschläferten Mäusen sowie an beiden Geschlechtern durchgeführt werden. Männliche Mäuse haben typischerweise eine dickere und weniger biegsame Haut als Weibchen, was den Eingriff technisch anspruchsvoller macht. Aus diesem Grund ist das Üben an Männern nützlich, um die Fertigkeit zu entwickeln.
- Mischen Sie Lebensmittelfarbe mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einem 1,5-mL Eppendorf-Rohr, bis die Lösung dunkel erscheint (in dieser Studie wurde blaue Lebensmittelfarbe verwendet).
- Besorge Übungsmäuse und betäube sie gemäß den Richtlinien der institutionellen Tierpflege.
- Lege die betäubte Maus unter einen Nasenkegel und neige den Körper, um die rechte Flanke freizulegen. Bestätigen Sie die ausreichende Narkose, indem Sie sanft das Fußpolster kneifen und keine Reaktion feststellen.
- Gib 30 μL Farbstofflösung mit einer 29 G, 1/2" Nadel, in eine 0,3 ml Insulinspritze. Entferne alle Luftblasen.
- Mit der nicht-dominanten Hand kneifen und dehnen Sie vorsichtig das Bein und die Haut, um eine glatte, straffe Oberfläche zu schaffen (vermeiden Sie, die Haut nach oben zu heben). Führe die Nadel mit dem Abschrägen nach oben in die Dermis in einem flachen, parallelen Winkel zur Haut ein. Halten Sie die Nadel unter der Oberfläche sichtbar, um die Dermalplatzierung zu überprüfen.
HINWEIS: Teste während des Trainings verschiedene Handgriffpositionen, um die Hautspannung stabil zu halten und gleichzeitig die Finger vom Nadelweg fernzuhalten. Führe die Nadel ~2 mm in die Haut ein. Um den Rückfluss zu verringern, führen Sie die Nadel ~3 mm ein und ziehen Sie sie dann leicht zurück, um vor der Injektion eine "Tasche" zu schaffen. Das hilft, den Farbstoff an der Injektionsstelle zurückzuhalten. - Langsam alle 30 μL der Farblösung injizieren, bis sich unter der Hautoberfläche eine kleine, deutliche "Blase" bildet
HINWEIS: Das Fehlen sichtbarer Blasen deutet darauf hin, dass die Injektion subkutan statt intradermal verabreicht wurde. Das Aufrechterhalten der Schräge in einer nach oben gerichteten Position hilft, eine genaue Dermalplatzierung zu gewährleisten und verhindert eine zu tiefe Injektion. - Übe weiter, bis sich konsequent Intradermale Blasen bilden. Bis zu sechs bis acht Injektionen pro Seite können durchgeführt werden.
- Nach Abschluss der Übungsinjektionen werden die Mäuse gemäß den genehmigten Protokollen des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) eingeschläfert5.
3. Vorbereitung von Tumorzellen für die Injektion
HINWEIS: Führen Sie alle zellbezogenen Schritte in einer sterilen Kapuze durch. Seien Sie sich bewusst, dass verschiedene Maustumorlinien unterschiedlich wachsen.
- Taue die Tumorzellen (B16F10, verwendet in dieser Studie) einige Tage vor intradermalen Injektionen auf.
- Kulturzellen auf 70%–80% Konfluenz reduzieren, während ausreichend frisches Medienmedium erhalten bleibt
HINWEIS: Vermeiden Sie 100%ige Konfluenz, die die Proliferation stoppt und das Tumorwachstum beeinträchtigt. - Entnehmen und bereiten Sie Zellen mit 7 x 106 Zellen /mL entweder in 1x PBS, serumfreiem RPMI oder einem anderen für den Zellwachstum verwendeten Medien vor.
HINWEIS: Das im Labor verwendete B16F10-Tumormodell verwendet 2 x 105 Zellen in 30 μL. Das Injektionsvolumen von 30 μL ist angemessen, aber die Anzahl der Zellen kann bei Bedarf angepasst werden, um das gewünschte Tumormodell zu etablieren. Die Zellen setzen sich ab und sammeln sich am Boden des Röhrchens, sodass die Zellkonzentration regelmäßig vorsichtig gemischt wird, um die Zellkonzentration konstant zu halten. - Lassen Sie die Zellen nach der Verarbeitung auf Eis und injizieren Sie schnell. Eine längere Lagerung auf Eis verringert die Lebensfähigkeit der Zellen, was die Anzahl der lebenden Zellen verringern und die Tumorbildung negativ beeinflussenkann 6.
HINWEIS: Die Zellen werden sofort im Labor entnommen und verwendet. Die Injektionen erfolgen innerhalb von 20–60 Minuten nach der Bearbeitung der Zellen und dem Eislegen. Nutze einen Partner, wenn du mit großen Kohorten arbeitest, um die Zeit auf dem Eis zu minimieren.
4. Intradermale Injektionen
- Betäuben Versuchsmäuse.
HINWEIS: Im Labor wird eine Anästhesie mit Isoflurangas verwendet, aber injizierbare Anästhetika können verwendet werden. - Nach der Anästheseinleitung wird die Maus unter einen Nasenkegel gelegt und der Körper so positioniert, dass die rechte Flanke vollständig freigelegt wird.
- Wenden Sie die Zellsuspension vorsichtig um, um eine gleichmäßige Mischung zu gewährleisten.
- Ziehen Sie 30 μL Zellsuspension in eine 0,3 mL Spritze mit einer 29 G, 1/2" Nadel. Entfernen Sie Luftblasen.
- Mit der nicht-dominanten Hand dehnen Sie das Bein und die Haut vorsichtig zur Seite, damit es glatt und straff ist (nicht nach oben heben). Führe die Nadel mit Abschrägung nach oben in die Dermis in einem flachen parallelen Winkel ein. Die Nadel sollte unter der Haut sichtbar bleiben, was zeigt, dass sie nicht zu tief ist.
HINWEIS: Die Nadeltiefe sollte ~2 mm in die Haut hineingehen. Um Rückfluss der Zellen zu vermeiden, wird die Nadel ~3 mm in die Haut eingeführt und leicht zurückgezogen, um eine "Tasche" für die Zellen zu schaffen. Das reduziert den Rückfluss erheblich. - Sehr langsam alle 30 μL Zellsuspension injizieren, bis sich unter der Haut eine kleine, sichtbare "Blase" bildet. Warte 5–10 Sekunden, bevor du die Nadel entfernst.
HINWEIS: Das zu schnelle Entfernen der Nadel kann dazu führen, dass die Lösung durch den Druck aus der Haut herauskommt. - Wiederhole das für jede Maus. Ersetzen Sie die Spritzen nach jedem Käfig (4–5 Mäuse), um eine Stumpfung der Nadel zu verhindern.
- Überwachen Sie alle Mäuse, bis sie vollständig von der Narkose genesen sind.
- Überwachen Sie Mäuse auf Tumorbildung.
5. Intratumorale Injektionen
HINWEIS: Tumore sind in der Regel 7–10 Tage nach der Einnistung bereit für die Behandlung, sobald sie die passende Größe erreicht haben. Die im Labor verwendete geeignete Größe beträgt ~50 mm3 oder mehr nach der Formel: Volumen = (Länge/2) * (Breite*Breite)7,8.
- Bereiten Sie alle Behandlungslösungen im Voraus vor (z. B. wurde in dieser Studie 1x PBS verwendet). Lagern Sie Lösungen auf Eis oder bei Raumtemperatur, je nach Bedarf der jeweiligen Behandlung.
- Führen Sie die Anästhesie gemäß den institutionellen Richtlinien ein.
- Setzen Sie die Maus unter einen Nasenkegel, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten, und positionieren Sie sie so, dass der Tumor freiliegt.
- Ziehen Sie das erforderliche Volumen (z. B. 30 μL verwendet) mit einer 29 G, 1/2" Nadel in eine 0,3 mL Insulinspritze. Entfernen Sie Luftblasen.
HINWEIS: Das Volumen variiert je nach bevorzugter Behandlung und optimierten Bedingungen. - Führen Sie die Nadel horizontal in den Tumor ein und bewegen Sie sich zum Zentrum der Tumormasse.
HINWEIS: Vermeiden Sie das Einführen von oben oder in einem steilen Winkel, da dies dazu führen kann, dass die Injektion zu tief oder ins umliegende Gewebe eingereicht wird. Die beschriebene Behandlung wurde als Einzelinjektion verabreicht. Die Dosierung und Häufigkeit hängen alle von der bevorzugten Behandlung und den optimierten Bedingungen ab. Bei kleinen Tumoren reicht eine einzige Dosis aus, um die Behandlung zu verteilen, aber bei größeren Tumore können mehrere Injektionen erforderlich sein, um die Behandlung gleichmäßig über die Tumormasse zu verteilen. - Injizieren Sie die Behandlung langsam und stetig. Halte 10 Sekunden inne, bevor du die Nadel langsam zurückziehst, um Rückfluss oder Leckage zu minimieren. Einige Tumore haben einen hohen inneren Druck, und es sollte darauf geachtet werden, dass die Injektion nicht durch das Nadelloch austritt.
- Wiederhole das Verfahren für jede Maus. Ersetzen Sie die Spritzen nach jedem Käfig mit 4–5 Mäusen und beim Wechsel der Behandlungsgruppe, um Kreuzkontaminationen zu verhindern.
- Überwachen Sie die Mäuse nach der Anästhesie, bis sie ihre Mobilität und normale Atmung wiedererlangen. Überwachen Sie weiterhin täglich die Behandlungsreaktion und die allgemeine Gesundheit.
HINWEIS: Beachten Sie, dass verschiedene Zelllinien zu unterschiedlichen Zeiten das Ulcieren von Tumoren verursachen können. Jedes Experiment und jedes IACUC-Protokoll hat klar definierte Endpunkte und Ausschlusskriterien. Im Labor liegen die Endpunkte für Mausexperimente bei 1500 mm3 und auftretende Ulzerationen werden akzeptiert und nicht aus der Studie ausgeschlossen.
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Ergebnisse
Beim Üben von Injektionen mit Farbstoff kann eine erfolgreiche intradertale Verabreichung ohne Euthanasie der Maus durch die Bildung einer sichtbaren "Blase" an der Injektionsstelle überprüft werden. Eine richtig durchgeführte intradermale Injektion erzeugt eine große, gut definierte und erhöhte "Blase" (Abbildung 1A–F). Kleine oder flache Bläschen deuten darauf hin, dass die Injektion teilweise subkutan sein könnte. Wenn sich keine "Blase" ...
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Diskussion
Der Erfolg dieses Protokolls (Abbildung 4) hängt davon ab, dass eine konstante intradermale Injektionstiefe und eine präzise Nadelplatzierung gewährleistet ist, um die Zugabe in die Dermis statt in die subkutane Schicht zu gewährleisten. Ist der Nadelwinkel zu steil oder der Injektionsdruck zu hoch, können Farbstoffe oder Tumorzellen über die Haut in den subkutanen Raum abgelagert werden. Nach der Injektion hilft ein kurzes Pausieren, bevor die Nadel langsam...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.
Danksagungen
AS erkennt das Immunology Training Grant, T32 AI007363. KSK dankt der Schlumberger Foundation dankbar für ihre Unterstützung durch das Faculty for the Future-Programm.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL Natural Centrifuge Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 150 cm2 Zellkulturflasche | Corning | 430825 | |
| Fluriso | Vet One | 13985-528-60 | Isofluran |
| Lebensmittelfarbe | Durkee | zur Praxis | |
| Insulinspritze 0,33 x 12,7 mm | Exel | 26018 | |
| Mini Arco | Wahl | 08787-450A | Scheren zum Rasieren der Mäuse |
| PBS, 1X ohne Kalzium & Magnesium | Corning | 06325002 | pH 7,4 +/- 0,1 |
| RPMI 1640, 1x | Corning | 12225004 | |
| SomnoFlo Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Narkosemaschine |
Referenzen
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- Silihe Kamga, K., Fiering, S. Intratumoral immunotherapy prior to cancer surgery a promising therapeutic approach. Front Immunol. 16, 1545000 (2025).
- Carlson, P. M., et al. Depth of tumor implantation affects response to in situ vaccination in a syngeneic murine melanoma model. J Immunother Cancer. 9 (4), e002107 (2021).
- Bonnotte, B., et al. Intradermal injection as opposed to subcutaneous injection enhances immunogenicity and suppresses tumorigenicity of tumor cells. Cancer Res. 63 (9), 2145-2149 (2003).
- Garber, J. C., et al. . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 109, 20.1.1-20.1.43 (2015).
- Mao, C., Beiss, V., Ho, G. W., Fields, J., Steinmetz, N. F., et al. In situ. vaccination with cowpea mosaic virus elicits systemic antitumor immunity and potentiates immune checkpoint blockade. J Immunother Cancer. 10 (12), e005834 (2022).
- Ho, G. W., et al. Intratumoral expression of IL-12 and CD40 ligand (CD154) from plasmids generates antitumor responses that eliminate tumoral T regs. Sci Rep. 15 (1), 24439 (2025).
- Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
- Chen, X. Emerging adjuvants for intradermal vaccination. Int J Pharm. 632, 122559 (2023).
- Hickling, J. K., Jones, K. R., Friede, M., Zehrung, D., Chen, D., et al. Intradermal delivery of vaccines: potential benefits and current challenges. Bull World Health Organ. 89 (3), 221-226 (2011).
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Nachdrucke und Genehmigungen
