Methodenartikel

Eine Technik zur Stabilisierung von Membranproteinen in Nanodiscs

DOI:

10.3791/70283

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30. April 2026

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1College of Biology, Hunan University, 2State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi Key Laboratory for Sugarcane Biology, Guangxi University, 3Jinshan Hospital, Zhongshan Hospital, Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie beschreibt das Verfahren zur Rekonstituierung des Membranproteins TWIK-bezogenen säuresensitiven K+ -Kanal 2 (Task2) in Nanodiscs. Die erfolgreiche Assemblierung wurde durch eine Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie bestätigt, die gut definierte zweidimensionale Klassendurchschnitte lieferte.

Zusammenfassung

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Viele Membranproteine zeigen bei der Extraktion in detergentbasierten Umgebungen eine schlechte Stabilität, Aktivitätsverlust und Probenheterogenität, was erhebliche Herausforderungen für die hochauflösende Kryo-Elektronenmikroskopie-Analyse darstellt. Die Nanodisc-Technologie adressiert diese Einschränkungen, indem Membrangerüstproteine (MSPs) und Phospholipide eingesetzt werden, um Zielproteine zu einer native ähnlichen Lipiddoppelschicht umzuwandeln. In dieser Studie wurde der humane Kaliumkanal Task2 exprimiert, gelöst und in Anwesenheit geeigneter Reinigungsmittel vor der Montage der Nanodisc gereinigt. Das resultierende Protokoll etabliert einen reproduzierbaren Workflow für die Task2-Nanodisc-Rekonstitution, wie durch wichtige Validierungsschritte demonstriert wird: eine klare Verschiebung der Größenausschlusschromatographie (SEC)-Profile, die die Partikelvergrößerung bestätigt, Komigration von Task2 und MSP auf SDS-PAGE sowie klar definierte 2D-Klassendurchschnitte mit sichtbaren sekundären Strukturmerkmalen. Eine erste 3D-Rekonstruktion bestätigt die Integrität des nanodisc-eingebetteten Proteins weiter. Durch die Verbesserung der Probenreinheit, Homogenität und Partikelqualität bietet dieser Ansatz eine robuste Grundlage für hochauflösende strukturelle Studien von Task2 und bietet einen methodischen Rahmen, der auf andere Membranproteine anwendbar ist.

Einleitung

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Membranproteine spielen eine entscheidende Rolle bei der zellulären Signaltransduktion, dem Transport von Metaboliten, der Aufrechterhaltung der Zellstruktur und den Immunantworten. Die Dysregulation von Membranproteinen ist mit verschiedenen Krankheiten verbunden, was sie zu wichtigen Zielen für die Arzneimittelentwicklungmacht. 1. Das Aufkommen der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) hatstrukturelle Studien großer und dynamischer Membranproteine ermöglicht. Eine Hauptherausforderung bei der Gewinnung hochauflösender Strukturen besteht darin, diese Proteine aus ihren nativen Lipiddoppelschichten zu extrahieren, während ihre natürlichen Konformationen und biochemischen Funktionen erhalten bleiben. Darüber hinaus stellen die hochdynamische Konformation der Membranproteine und die Komplexität des Antikörperscreenings zusätzliche Hindernisse für die gezielte Arzneimittelentdeckungmit sich 3,4. Traditionelle Methoden zur Membranproteinextraktion verwenden häufig Reinigungsmittel, um die Eigenschaften der hydrophoben Lipiddoppelschicht nachzuahmen. Dieser Ansatz stört jedoch häufig die Stabilität der Membranproteine, was zu einer Aggregation oder teilweisenEntfaltung führt. Zusätzlich können Reinigungsmittel essentielle Lipidmoleküle entfernen, die für die Stabilisierung der Proteinkonformation entscheidend sind, was potenziell die Proteinkonformation verändern oder sogar die Funktion beeinträchtigen kann, wodurch ihre Anwendung im Antikörperscreening und anderen nachgelagerten Anwendungen eingeschränktwird 6.

Die Nanodisc-Technologie wurde erstmals von Sligar und Kollegen7 eingeführt. Diese sich selbst assemblierende Struktur wird typischerweise durch Apolipoprotein A1 (ApoA1)-Derivate, nämlich MSPs, zusammen mit synthetischen oder natürlichen Lipiden gebildet und so eine stabile Umgebung für Membranproteine 7,8,9 gebildet. Das MSP bildet eine scheibenförmige Struktur, indem es die hydrophoben Kanten der Lipiddoppelschicht umgibt. Diese Struktur hat eine hydrophobe Oberfläche, die mit den Acyl-Lipidschwänzen interagiert und das Membranprotein stabilisiert, sowie eine hydrophile Oberfläche, die nach außen zeigt, sodass das Membranprotein in wässrigen Lösungenlöslich bleibt. Nanodiscs dienen als vielseitige Plattform für Membranproteinstudien. Durch die Konservierung gereinigter Membranproteine in einer nahezu natürlichen Lipidumgebung überwinden sie die Einschränkungen traditioneller detergentbasierter Methoden und erhalten die Konformation und biologische Funktion der Proteine in vitro. Daher ist diese Methode zu einem mächtigen Werkzeug für strukturelle Studien von Membranproteinen geworden. Im Vergleich zu traditionellen detergentischen Umgebungen bietet die Lipiddoppelschicht in Nanoscheiben strukturelle Unterstützung für Membranproteine und stabilisiert deren natürliche Konformation – ein Merkmal, das für inaktivierungsanfällige Proteine wie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und Ionenkanäle11 entscheidend ist. Darüber hinaus bietet die hoch gleichmäßige Natur von Nanoscheibenpartikeln nach der Assemblage eine stärkere Unterstützung für die Gewinnung hochwertiger Kryo-EM-Daten und zuverlässiger kinetischer Daten zur Oberflächenplasmonresonanz/Bioschichtinterferometrie12.

In den letzten zehn Jahren ist die Nanodisc-Technologie zu einem leistungsstarken Werkzeug zur Untersuchung von Membranproteinen in natürlichen Lipidumgebungen geworden. So haben Vilela und Kollegen13 einen systematischen Rahmen für die Montage von Nanoscheiben geschaffen, indem sie die Rekonstitutionsbedingungen optimierten und die Qualität der Endkomponenten überprüften. Konkret kombinierten sie die Größenausschlusschromatographie (SEC) mit quantitativen Indikatoren (einschließlich Montageeffizienz und Spitzensymmetrie), um die Homogenität derProben 13 objektiv zu bewerten. Derzeit sind Nanodiscs zu einer vielseitigen Plattform geworden. Durch die Verwendung von Einzelteilchen-Kryo-EM zur Detektion der zusammengesetzten, nanodisc-rekonstituierten Proteine können hochauflösende Strukturen von Membranproteinen gewonnen werden, und ihre Anwendbarkeit ist fest etabliert. Das Doppelringdichte-Merkmal des MSP-Bandes ist der entscheidende strukturelle Beweis für eine erfolgreicheBindung 10,14,15. Darüber hinaus dienen Nanoscheiben als wertvolles Werkzeug sowohl für die funktionelle Analyse von Membranproteinen in Lipid-Doppelschicht-Umgebungen als auch für deren Anwendung in Lösungs-Kernresonanzstudien16,17.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Zusammensetzung des menschlichen Task2-Membranproteins in Nanodiscs. Human Task2 ist ein pH-gesteuertes Mitglied der Zwei-Poren-Domäne K+ (K2P) Kanalfamilie18,19. Wie andere K-2-P-Kanäle ist Task2 ein domänengetauschtes Homodimer, wobei jede Protomerkette vier transmembranüberspannende Helixe (TM1–TM4), zwei reentrante Porenhelixen (PH1 und PH2), zwei Selektivitätsfilter (SF1 und SF2) und zwei extrazelluläre Kappenformende Helixe (CH1 und CH2) enthält. Das Zielprotein war eine abgeschnittene Form von Task2, die die C-terminalen 166 Aminosäuren fehlte – eine Region, die voraussichtlich weitgehend unstrukturiert ist –, die die Proteinexpression und biochemische Stabilität verbessert. Das Molekulargewicht des rekombinierten Task2 beträgt etwa 72 kDa mit einem GFP-Tag. Es war vorher mit einem Waschmittel gelöst und gereinigt worden. Es wurde mit Lipiden und MSP in einem genau berechneten stöchiometrischen Verhältnis kombiniert. Nach der Reinigungsmittelentfernung mit Bio-Beads wurde die Probe durch Größenausschlusschromatographie (SEC) weiter gereinigt, um eine für Kryo-EM geeignete Präparat zu erhalten. Zweidimensionale (2D) Klassendurchschnitte wurden dann aus Einzelteilchen-Kryo-EM-Daten generiert, um die Probenintegrität zu validieren.

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Protokoll

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1. Herstellung von Lipidmaterial

  1. Lipidpräparation
    1. Bereite Lipidmischungen mit drei Phospholipiden vor: 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE), 2-oleoyl-1-palmitoylglycero-3-phosphocholin (POPC) und 1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylserin (POPS).
    2. Verwenden Sie vorgefertigte Lagerlösungen dieser Lipide in Chloroform, jeweils mit einer Konzentration von 25 mg/mL.
      HINWEIS: Persönliche Schutzausrüstung ist beim Umgang mit Chloroform erforderlich, und alle Verfahren müssen in einer Abzugshaube durchgeführt werden. Chloroform in einem speziellen Chemieschrank aufbewahren.
    3. Aufgrund der Flüchtigkeit von Chloroform sollte bei der Messung mit einer Mikrospritze überprüft werden, ob das Volumen der Lipidlösung dem ursprünglich aufgezeichneten Volumen vor jeder Anwendung entspricht. Wenn eine Verdunstung auftritt, füllen Sie die Lösung mit reinem Chloroform auf das ursprüngliche Volumen auf und mischen Sie gründlich.
      HINWEIS: Vor jeder Messung spülen Sie die Mikrospritze zweimal mit Chloroform.
    4. Bereiten Sie eine 100 μL Lipidmischung mit einem Massenverhältnis von DOPE:POPC:POPS = 2:1:1 HER. Basierend auf diesem Verhältnis kombiniert man 50 μL VDOPE, 25 μL VPOPC und 25 μL VPOPS. Messen Sie das entsprechende Volumen gemäß der berechneten Zahl. Gib es ins Glasreagenzglas und vermische gründlich.
    5. Stellen Sie das Glasreagenzglas in ein Wasserbad, um die Verflüchtigung von Chloroform zu reduzieren und die Umgebungstemperatur stabil zu halten.
  2. Lipidfilmvorbereitung
    1. Verdampfen Sie das Chloroform unter einem sanften Strom aus Stickstoffgas, bis die gesamte Flüssigkeit entfernt ist und sich am Boden des Reagenzglases ein transparenter, homogener, gelartiger Film bildet.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass am Boden des Glasröhrchens ein einheitlicher, trockener Lipidfilm sichtbar ist, ohne dass Flüssigkeitströpfchen zurückbleiben. Vermeiden Sie einen übermäßigen Stickstofffluss, da dies Blasen verursachen und das vollständige Trocknen des Chloroforms verhindern kann.)
    2. Gib etwa 2 ml n-pentan tropfweise in ein Glasreagenzglas ein. Anschließend verdampfen Sie das Lösungsmittel mit der in 1.2.1 beschriebenen Stickstofftrocknungsmethode, um einen trockenen, transparenten Lipidfilm zu erhalten. n-Pentan wird aufgrund seiner chemischen Trägheit und Kompatibilität mit organischen Lösungsmitteln in einem Glasreagenzglas verdampft. Glas vermeidet das Risiko von Kunststoffauswaschung oder -degradierung, das mit vielen Kunststofflabormaterialien verbunden ist, und erhält so die Lipidreinheit während der Filmbildung.
      HINWEIS: N-Pentane muss in einem speziellen Reagenzienschrank aufbewahrt und bei Verwendung mit Vorsicht in einer Abzugshaube mit geeigneter Schutzausrüstung behandelt werden.
    3. Löse den Deckel des Reagenzglases und setze es in einen Vakuum-Austrockner. Entfernen Sie den Desikator und halten Sie sie unter Vakuum, um eventuelle Restlösungsmittel zu entfernen. Platzieren Sie selbstanzeigendes Siliziumgel am Boden des Trockeners, um Feuchtigkeit aufzunehmen.
      HINWEIS: Verdampfen Sie Restchloroform und N-Pentan, sodass sie in einer Abzugshaube trocken werden.
  3. Lipidhydration und Lagerlösungsvorbereitung
    1. Entfernen Sie den Lipidfilm aus dem Vakuum-Desiccator und hydratisieren Sie ihn durch Zugabe von 250 μL detergent-freiem salzarmen Puffer (LSB) (Ergänzende Tabelle 1). Dies ergibt eine Endfettkonzentration von 10 mg/mL.
      HINWEIS: Ein kaliumionenbasierter Puffer wurde ausgewählt, da Task2 ein Kaliumionenkanal ist
    2. Nach dem Resuspendieren des Lipids wird das Lipid gleichmäßig in vier Glasröhren aufgeteilt und die Suspensionen mit Sonikation behandelt, bis sie klar und transparent sind, was auf eine erfolgreiche Liposomenbildung hinweist (ca. 1,5 Stunden). Führen Sie die Sonikation mit 60 % Amplitude durch, indem Sie einen Zyklus von 4 s an und 6 s aus verwenden.
    3. Sammeln Sie die geklärte Lipidlösung und aliquot 1,5 ml in einzelne Mikrozentrifugenröhren. Spülen Sie sofort den Kopfraum jedes Rohrs mit Stickstoffgas und lagern Sie es bis zur Nutzung bei -80 °C.

2. Überexpression und Reinigung von MSP

  1. Prokaryotische Expression von MSP
    1. Plasmidtransformation: Verwenden Sie das MSP1D1-Plasmid mit einem 7×His Tag, um die E. coli BL21 (DE3)-fähigen Zellen zu transformieren. Die Transformationsmischung auf Luria-Bertani (LB) Agarplatten mit Kanamycin (50 μg/mL) plattieren und über Nacht bei 37 °C inkubieren, um einzelne Kolonien zu erhalten.
    2. Kulturveramplifikation: Nehmen Sie einen einzelnen Klon aus, impfen Sie ihn in 5 ml LB-Medium mit Kanamycin und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 37 °C mit Schütteln. Inokulieren Sie die Kultur über Nacht in flüssiges LB-Medium im Verhältnis 1:100 und wachsen Sie dann bei 37 °C mit Schütteln, bis die optische Dichte bei 600 nm (OD600) 2,0–3,0 erreicht.
    3. Proteinexpressionseinduktion: Induzieren Sie die MSP-Expression durch Zugabe von Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von 0,5–1 mM. Die Zellen werden weiterhin 16–20 Stunden mit Schütteln bei 16 °C kultiviert.
  2. Zellstörung
    1. Pelletsammlung: Zentrifugieren Sie die Bakterienkultur bei 4 °C für 10 Minuten. Entsorgen Sie das Supernatant und behalten Sie das Zellpellet.
    2. Bakterienlyse: Resuspendieren Sie das Pellet aus 1 L Kultur in 100–150 ml Lysispuffer (ergänzende Tabelle 1). Homogenisieren Sie gründlich, bis eine gleichmäßige Suspension ohne sichtbare Klumpen erreicht ist. Fügen Sie PMSF zur Suspension hinzu, um Proteasen zu hemmen und Schäumbildung zu reduzieren.
    3. Sonikation: Verwenden Sie einen gekühlten Ultraschallzell-Disruptor, um die Bakterien zu brechen. Stelle die Leistung auf 35 % und führe Zyklen von 3 Sekunden Pulse an, gefolgt von 6 Sekunden-Pausen. Um Überhitzung zu vermeiden, sollten Sie nach jeweils 15 Minuten kumulativer Sonikationszeit ein 2-minütiges Ruheintervall einplanen. Machen Sie weiter, bis das Lysat klar und hellbraun ist.
    4. Klarstellung: Zentrifugieren Sie das Lysat bei 30.000 g für 45 Minuten bei 4 °C und sammeln Sie das Supernatant für die folgenden Schritte.
  3. MSP-Reinigung
    1. Ni-NTA-Harzvorbereitung: Nehmen Sie 3–5 ml Ni-NTA-Harz und packen Sie es in eine Gravitationssäule (Größe: 26,4×134,8 mm). Waschen Sie das Harz mit 3 Spaltenvolumen (CV) destilliertem Wasser und gleichen Sie es mit 3 CV Wash Buffer 1 aus (Ergänzungstabelle 1).
    2. Bindung von MSP an das Harz: Nach der Zentrifugation des Zelllysats wird das Supernatant mit dem ausgeglichenen Ni-NTA-Harz gemischt. Geben Sie Imidazol zu einer Endkonzentration von 5 mM und inkubieren Sie die Mischung bei 4 °C für 2 Stunden mit sanfter Rotation im Dunkeln.
    3. Waschen zur Entfernung von Verunreinigungen: Sequentiell Waschen mit Verläufen von Waschpuffer 1, Waschpuffer 2 (Ergänzende Tabelle 1) und Waschpuffer 3 (Ergänzungstabelle 1), wobei mindestens 50 ml jedes Puffers verwendet werden. Überwachen Sie die UV-Absorption bei 280 nm (A280) des Durchflusses und spülen Sie weiter, bis der Wert von A280 unter 0,01 fällt.
    4. Elution: Elutieren Sie das Zielprotein mit dem Elutionspuffer (Ergänzungstabelle 1) und sammeln Sie die Eluatfraktionen. Setzen Sie den Eluationsprozess fort und sammeln Sie Fraktionen, bis der A₂₈₀ des Eluats unter 0,01 fällt.
    5. Prozessüberwachung und Analyse: Proben aus wichtigen Reinigungsphasen – einschließlich Supernatant, Niederschlag, Durchfluss, Waschfraktionen und Eluationsfraktionen. Analysieren Sie sie mit SDS-PAGE, um die Reinigungseffizienz zu bewerten (ergänzende Abbildung 1).
    6. Dialyse für den Pufferaustausch: Übertragen Sie das gesammelte Eluat in das Dialyseschlauch und dialysieren Sie es gegen den Dialysepuffer (Ergänzungstabelle 1) bei 4 °C mit sanftem Rühren über die Nacht.
    7. Ultrafiltration und Konzentration: Die dialysierte Lösung wird mit einem Ultrafiltrationsgerät auf eine Endkonzentration von 2–5 mg/ml konzentriert. Das gereinigte und konzentrierte MSP ist nun bereit für den Einsatz in der Membranprotein-Nanodisc-Assemblierung.

3. Aktivierung von Bio-Perlen

  1. Wiegen
    1. Wiegen Sie etwa 250 mg Bio-Beads in ein 50-mL Zentrifugenrohr mit einer analytischen Waage.
  2. Methanol-Waschanlagen
    1. Fügen Sie 25–30 ml Methanol in das Rohr hinzu. Die Mischung im Dunkeln gründlich drehen oder vortexen lassen und dann 20 Minuten inkubieren. Entsorge das Supernatant vorsichtig nach der Inkubation.
    2. Wiederhole diesen Schritt mit der Methanol-Waschmethode insgesamt dreimal.
      HINWEIS: Aufgrund der Flüchtigkeit von Methanol muss dieses Verfahren in einer Abzughaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden. Sammeln Sie gebrauchtes Methanol und behandeln Sie es als biologische Abfallflüssigkeit.
  3. Wässrige Waschbecken
    1. Fügen Sie den Perlen 25–30 mL ddH2Ohinzu. Schütteln oder drehen Sie das Rohr, um zu mischen und 20 Minuten zu inkubieren.
    2. Entsorge das Supernatant. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal.
  4. Gleichgewicht mit LSB
    1. Gib 25–30 ml waschmittelfreies LSB zu den Perlen. Schütteln oder drehen Sie das Rohr auf einem rotierenden Tisch, um es 20 Minuten lang zu mischen und auszubrüten.
    2. Entsorge das Supernatant. Wiederhole diesen LSB-Gleichgewichtsschritt dreimal, um die Perlen vollständig zu konditionieren.
  5. Aliquotierung und Speicherung
    1. Teilen Sie die aktivierten Bio-Beads gleichmäßig in drei 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhren auf. Stellen Sie sicher, dass die Perlen mit einer kleinen Menge LSB angefeuchtet bleiben.
    2. Wickle die Schläuche in Alufolie zum Schutz vor Licht und lagere sie auf Eis für den sofortigen Gebrauch.

4. Zusammenbau der Nanodisc

  1. Herstellung von Lipid und MSP
    1. Lipid-Stock-Klärung: Holen Sie einen Aliquot des vorgefertigten Lipidbestands und tauen Sie ihn auf. Zentrifugieren Sie das Rohr sofort bei 7.000 x g für 5 Sekunden bei 4 °C, um den Inhalt am Boden aufzusammeln.
    2. Ultraschall in einem Wasserbad durchführen und alle 5–10 Minuten die Klarheit und Temperatur überwachen, um Überhitzung zu vermeiden. Führen Sie die Sonikation mit 60 % Amplitude durch. Ultraschallen Sie den Lipidstock, bis der Lipidstock klar und transparent ist.
    3. MSP-Auftauen: Ein Aliquot der hergestellten MSP-Lösung in einem Eiswasserbad auftauen.
  2. Bereiten Sie den Puffer nach dem stöchiometrischen Verhältnis vor.
    1. Quantifizieren Sie das Membranprotein: Isolieren Sie das gereinigte Membranprotein (Task2), das in 0,025 % DDM/0,005 % CHS löslich ist, mittels Größenausschlusschromatographie (SEC). Injizieren Sie ein Probenvolumen von 500 μL bei einer Durchflussrate von 0,5 mL/min in eine Superose 6 Increase-Säule (Cytiva). Sammeln Sie die Spitzeneluation bei 14,8 mL und konzentrieren Sie sie (Abbildung 1). Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem NanoDrop.
    2. Berechnen Sie die molare Proteinmenge: Berechnen Sie die molare Menge (n) des Zielmembranproteins mit der Formel: n = C × V, wobei C die molare Konzentration und V das Volumen ist.
    3. Bestimmung des MSP- und Lipidvolumens: Berechnen Sie die erforderlichen Mengen an MSP- und Lipidstocklösungen basierend auf einem molaren stöchiometrischen Verhältnis des Zielproteins : MSP : Lipid = 1 : 5 : 250.
    4. Bereite die Mastermischung vor: Basierend auf den Berechnungsergebnissen werden die entsprechenden Mengen Lipid und MSP kombiniert, um eine 300-μL-Mastermischung herzustellen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Waschmittel in dieser Mischung enthalten ist, um eine Konzentration zu halten, die mit der in der Proteinlösung übereinstimmt und so eine vorzeitige Aggregation verhindert wird.
  3. Reinigungsmittelentfernung und Nanodisc-Montage
    1. Erstbebrütung mit Rekonstitutionsmischung: Den vorbereiteten Mischpuffer (Ergänzungstabelle 1) 10 Minuten auf Eis bebrüten. Dann werden langsam 50 μL der Mischung zur konzentrierten Proteinlösung gegeben und sanft durch Pipetterung vermischt, um die Homogenität zu gewährleisten.
    2. Gleichgewicht der Protein-Lipid-Mischung: Legen Sie die kombinierte Mischung für 1 Stunde auf Eis. Wenden Sie das Rohr alle 15 Minuten vorsichtig um, um es gründlich zu vermischen.
    3. Erste Inkubation mit Bio-Beads: Zentrifugieren Sie die Mischung kurz bei 7.000 x g für 5 Sekunden bei 4 °C, um die Proteinlösung am Boden des Rohrs zu sammeln. Nehmen Sie einen Aliquot der voraktivierten Bio-Beads, aspirieren Sie das Rest-LSB, geben Sie die Proteinlösung zu den Perlen und inkubieren Sie 1 Stunde lang im Dunkeln, um eine lichtinduzierte Zerstörung des Zielproteins zu verhindern.
    4. Zweite Inkubation mit Bio-Perlen: Zentrifugieren Sie die Mischung bei 7.000 x g für 5 Sekunden bei 4 °C und übertragen Sie vorsichtig den Überstandsstoff auf einen zweiten Aliquot von Bio-Perlen (von dem auch das LSB aspiriert wurde) und mischen Sie es gut durch sanfte Inversion im Dunkeln für 4–8 Stunden oder über Nacht.
    5. Abschließende Inkubation mit Bio-Beads: Holen Sie die Proteinlösung nach der nächtlichen Inkubation ab, zentrifugieren Sie sie kurz und übertragen Sie das Supernatant in den dritten und letzten Teil der voraktivierten Bio-Beads. Inkubieren Sie mit Rotation bei 4 °C im Dunkeln für 1 Stunde.
    6. Nach einer kurzen Zentrifugation wird das Überstandsmittel in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr übertragen und 10 Minuten lang mit 17.000 x g bei 4 °C zentrifugiert, um etwaige Aggregate zu entfernen.
      HINWEIS: Entsorgen Sie verbrauchte Bio-Perlen als biologische Abfälle.
    7. Reinigung von Nanodiscs: Reinigen Sie die Nanodisc-Task2-Komplexe durch Größenausschlusschromatographie (SEC): Injizieren Sie ein Probenvolumen von 500 μL bei einer Durchflussrate von 0,5 mL/min in eine Superose 6 Increase-Säule und sammeln Sie die Peak-Eluation bei 15 mL (Abbildung 2).
    8. Konzentration des Endprodukts: Sammeln Sie die Spitzenfraktionen aus der SEC-Elution und konzentrieren Sie sie auf eine End-Nanodisc-Task2-Konzentration von 1,2–1,5 mg/mL, geeignet für die Vorbereitung von Kryo-EM-Proben.

5. Überprüfen Sie, ob die Nanodisc-Montage erfolgreich ist

  1. SDS-PAGE-Analyse: Aliquot-Proben aus den SEC-gereinigten Fraktionen.
    1. Analysieren Sie die Proben mit 12 % SDS-PAGE, um das Vorhandensein wichtiger Komponenten (z. B. MSP und Zielmembranprotein) zu bestätigen, was auf eine erfolgreiche Nanodisc-Assemblierung hinweist (Abbildung 3).
  2. Vorbereitung und Analyse von Cryo-EM-Proben.
    1. Konzentrieren Sie die erfolgreich zusammengesetzte Probe auf eine Endkonzentration von 1,2–1,5 mg/mL für die Kryo-EM-Probenvorbereitung.
    2. Beginnen Sie damit, die Probe bei 17.000 x g und 4 °C für 10 Minuten zu zentrifugieren. Einen 3-μL-Tropfen auf frisch glühend entladene Quantifoil R1,2/1,3 Goldgitter (300 Mesh, löcheriger Kohlenstoff) abgeben.
    3. Inkubiere bei 4 °C bei 100 % Luftfeuchtigkeit 5 Sekunden. Das Gitter in einem Vitrobot Mark IV für 4 Sekunden abtupsen und in flüssigem Ethan mit flüssiger Stickstofftemperatur einfrieren.
    4. Sammeln Sie Super-Resolution-Filmstapel mit EPU-Software auf einem Titan Krios G4 Cryo-EM, der mit 300 kV arbeitet und mit einem Falcon G4i Direktelektronendetektor ausgestattet ist.
    5. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 2,78 S ein, was einer Pixelgröße von 0,73 Å (165k ×) entspricht und einer gesamten akkumulierten Dosis von etwa 50 e⁻/Å2 pro EER-Filmstack entspricht.

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Ergebnisse

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Eine erfolgreiche Vorbereitung des Lipidmaterials zeigte sich durch die Bildung einer klaren, transparenten Lösung nach der Sonikation. Für das MSP ergab die Nickelaffinitätschromatographie ein hochreines Produkt mit etwa 3 mg/mL. Die Montage der Nanoscheiben wurde von SEC bestätigt, das ein charakteristisches Elutionsprofil zeigte (Abbildung 2). Im Vergleich zum Task2-SEC-Profil, das vor der Nanodisc-Assemblierung erhalten wurde (Abbildung 1), verschiebt si...

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Diskussion

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Die Methode wird vorgestellt, um detergent-lösliche Membranproteine mittels Reinigungsmittelentfernung in Nanodiscs umzuwandeln, wodurch eine nativere Lipid-Doppelschichtumgebung entsteht. Der Erfolg dieses Montageprozesses hängt von mehreren Schlüsselfaktoren ab. An erster Stelle steht das genaue stöchiometrische Verhältnis zwischen Membranprotein, MSP und Lipiden. Falsche stöchiometrische Verhältnisse können zu einer Proteinaggregation oder einem erfolglosen Zusammenbau führen. Beispie...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

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Die Autoren danken dem Personal des Kryo-EM-Zentrums der Universität Henan sowie Professor Wei Wang für ihre fachkundige Unterstützung. Die Finanzierung erfolgte durch die National Natural Science Foundation of China (Zuschüsse 32371261 an B.L. und 32301011 an R.Z.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BioperlenBio-Rad1523920
CholesterylhemisuccinatAnatraceCH210
ChloroformSinoreagensVerwendung in einer Abzugshaube
DOPEAvanti850725P
MethanolSinoreagens
n-Dodecyl-beta-D-maltosidAnatraceD310
n-pentanAdamasVerwendung in einer Abzugshaube
POPCAvanti850457P
POPSAvanti840034P
SECBio-RadFolgen Sie dem Protokoll des Herstellers für die ordnungsgemäße Anwendung
SnakeSkin DialyseschlauchThermo68011
Superose  6 Erhöhung10/300 GLCytiva29091596
Ultrafiltrations-Spin-Säulen Amicon Ultra-15MilliporeUFC905008

Referenzen

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  1. Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nat. Rev. Drug Discov. 10 (8), 579-590 (2011).
  2. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  3. Dodd, R., Schofield, D. J., Wilkinson, T., Britton, Z. T. Generating therapeutic monoclonal antibodies to complex multi-spanning membrane targets: overcoming the antigen challenge and enabling discovery strategies. Methods. 180, 111-126 (2020).
  4. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. MAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  5. Kotov, V., et al. High-throughput stability screening for detergent-solubilized membrane proteins. Sci. Rep. 9 (1), 10379(2019).
  6. Barrera, N. P., Zhou, M., Robinson, C. V. The role of lipids in defining membrane protein interactions: insights from mass spectrometry. Trends Cell Biol. 23 (1), 1-8 (2013).
  7. Bayburt, T., Grinkova, Y., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Lett. 2 (8), 853-856 (2002).
  8. Carlson, J. W., Jonas, A., Sligar, S. G. Imaging and manipulation of high-density lipoproteins. Biophys. J. 73 (3), 1184-1189 (1997).
  9. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).
  10. Vinogradova, O. Nanodiscs and solution nuclear magnetic resonance. Curr. Opin. Struct. Biol. 93, 103067(2025).
  11. Popot, J. L. Amphipols, nanodiscs, and fluorinated surfactants: three nonconventional approaches to studying membrane proteins in aqueous solutions. Annu. Rev. Biochem. 79, 737-775 (2010).
  12. Li, S. Detergents and alternatives in cryo-EM studies of membrane proteins. Acta Biochim. Biophys. Sin. 54 (8), 1049-1056 (2022).
  13. Vilela, F., Sauvanet, C., Bezault, A., Volkmann, N., Hanein, D. Optimizing transmembrane protein assemblies in nanodiscs for structural studies: a comprehensive manual. Bio Protoc. 14 (21), e5099(2024).
  14. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid nanodiscs as a tool for high-resolution structure determination of membrane proteins by single-particle cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  15. Grant, A. J., Schmidt-Krey, I. Nanodisc-reconstitution for single particle cryo-EM structure determination of membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 93, 103072(2025).
  16. Yokogawa, M., Fukuda, M., Osawa, M. Nanodiscs for structural biology in a membranous environment. Chem. Pharm. Bull. 67 (4), 321-326 (2019).
  17. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  18. Enyedi, P., Czirják, G. Molecular background of leak K+ currents: two-pore domain potassium channels. Physiol. Rev. 90 (2), 559-605 (2010).
  19. Reyes, R., et al. Cloning and expression of a novel pH-sensitive two pore domain K+ channel from human kidney. J. Biol. Chem. 273 (47), 30863-30869 (1998).
  20. Notti, R. Q., Walz, T. Native-like environments afford novel mechanistic insights into membrane proteins. Trends Biochem. Sci. 47 (7), 561-569 (2022).
  21. Pocanschi, C. L., Kleinschmidt, J. H. The thermodynamic stability of membrane proteins in micelles and lipid bilayers investigated with the ferrichrom receptor FhuA. J. Membr. Biol. 255 (4-5), 485-502 (2022).
  22. Hiotis, G., Notti, R. Q., Bao, H., Walz, T. Nanodiscs remain indispensable for cryo-EM studies of membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 92, 103042(2025).
  23. Nakao, K., et al. Home is where the lipids are: a comparison of MSP and DDDG nanodiscs for membrane protein research. Soft Matter. 21 (33), 6596-6602 (2025).
  24. Dalal, V., et al. Lipid nanodisc scaffold and size alter the structure of a pentameric ligand-gated ion channel. Nat. Commun. 15 (1), 25(2024).
  25. Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. J. Am. Chem. Soc. 131 (22), 7484-7485 (2009).
  26. Tao, X., Zhao, C., MacKinnon, R. Membrane protein isolation and structure determination in cell-derived membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 120 (18), e2302325120(2023).
  27. Zhang, S., et al. One-step construction of circularized nanodiscs using SpyCatcher-SpyTag. Nat. Commun. 12 (1), 5451(2021).
  28. Ren, Q., et al. DeFrND: detergent-free reconstitution into native nanodiscs with designer membrane scaffold peptides. Nat. Commun. 16 (1), 7973(2025).

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