Fructus xanthii Extrakt lindert Arthrose durch Erhalt der Knorpelintegrität

Zusammenfassung

Dieses Studienprotokoll wurde entwickelt, um systematisch die potenziellen chondroprotektiven Effekte von Fructus Xanthii-Extrakt bei Arthrose durch integrierte Multi-Omics-Analysen und in vivo-Experimente zu untersuchen.

Zusammenfassung

Arthrose (OA) ist eine fortschreitende degenerative Gelenkerkrankung, bei der aktuelle pharmakologische und chirurgische Eingriffe hauptsächlich die Symptome lindern, anstatt die zugrunde liegenden pathologischen Veränderungen umzukehren, was den dringenden Bedarf an neuartigen Therapeutika unterstreicht. Dieses Protokoll zielte darauf ab, die potenziellen chondroprotektiven Effekte des Fructus-Xanthii-Extrakts gegen OA zu untersuchen. Zunächst wurde eine nicht-gezielte Metabolomik-Profilierung mittels ultraleistungsfähiger Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit hochauflösender Tandem-Massenspektrometrie (UHPLC-HRMS/MS) durchgeführt, um die chemischen Bestandteile des Extrakts zu charakterisieren. Eine integrierte Strategie, die Netzwerkpharmakologie und transkriptomisches Mining kombiniert, wurde anschließend angewandt, um bioaktive Komponenten und vermutete Ziele des Extrakts zu identifizieren, gefolgt von einer Kreuzanalyse mit OA-bezogenen, dysregulierten Genen, um Kernzielgene zu erhalten. Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalysen wurden durchgeführt, um die wichtigsten biologischen Prozesse und Signalwege, die durch den Extrakt moduliert werden, zu annotieren. Für die In-vivo-Validierung wurden Zebraknorpel-Verletzungsmodelle und Maus-OA-Modelle verwendet, um die chondroprotektiven Effekte des Extrakts zu bewerten. RNA-Sequenzierung (RNA-seq) wurde weiter verwendet, um transkriptomische Veränderungen in Chondrozyten nach der Behandlung zu analysieren, mit Fokus auf OA-assoziierte Signalwege und Genexpressionsprofile; Anschließend wurde der enzymgekoppelte Immunsorbent-Test (ELISA) durchgeführt, um die Expressionsniveaus von Schlüsselproteinen/-rezeptoren, die mit RNA-seq gescreent wurden, zu überprüfen und so die regulatorischen Effekte des Fructus-Xanthii-Extrakts auf Kern-OA-Ziele weiter zu bestätigen. Dieses integrierte Multi-Omics- und experimentelle Protokoll bietet einen systematischen Ansatz, um das Potenzial des Fructus-Xanthii-Extrakts als vielversprechender botanischer Kandidat für eine OA-Intervention zu erforschen.

Einleitung

Arthrose (OA) ist eine degenerative Gelenkerkrankung, die durch den fortschreitenden Abbau des Gelenkknorpels, subchondrale Knochensklerose, Synovialentzündung und Osteophytenbildung^{gekennzeichnet ist}. Laut der Global Burden of Disease (GBD)-Studie ist die Prävalenz von OA von 1990 bis 2020 in 204 Ländern und Gebieten stetig^{gestiegen, wobei} erwartet wird, dass sich dieser Trend zusammen mit der globalen demografischen Alterung^{beschleunigen wird}. Aktuelle Schätzungen zeigen, dass weltweit über 250 Millionen Menschen betroffen sind, was erhebliche Belastungen für das individuelle Wohlbefinden, Gesundheitssysteme und sozioökonomische Strukturen darstellt⁴. Die aktuellen Behandlungen zielen überwiegend auf die Linderung der Symptome ab, wobei nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente (NSAIDs) und intraartikuläre Viscosupplementation mit Hyaluronsäure (HA) die häufigsten Interventionen sind. Diese Ansätze bieten jedoch nur begrenzten klinischen Nutzen und sind mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden ^5,6. Dies unterstreicht den dringenden Bedarf an wirksamen krankheitsverändernden Arthrosemedikamenten (DMOADs).

Die traditionelle chinesische Medizin (TCM) wird seit langem zur Behandlung von OA eingesetzt und basiert auf dem Konzept der "Knochen-Bi", einem Untertyp des "Bi-Syndroms^". In diesem Rahmen wird die Pathogenese von OA hauptsächlich auf einen Mangel an Leber- und Nierenessenz, eine Unzulänglichkeit von Qi und Blut sowie die anschließende Invasion durch Wind, Kälte und Feuchtigkeit⁸ zurückgeführt. Dementsprechend konzentrieren sich therapeutische Strategien darauf, Windfeuchtigkeit zu beseitigen, Kälte zu verbreiten und die Kollateralstoffe^zu befreien. TCM-Behandlungen sind bekannt für ihre multizielreichen Effekte, günstigen Nebenwirkungsprofile und klinisch signifikante Wirksamkeit¹⁰. Bemerkenswerte Formulierungen wie Buqi Tongluo Capsule (BQTL) und Fuzi Decoction (FZD) haben in der klinischen Praxis klare Anti-OA-Effekte gezeigt, während Du Huo Ji Sheng Tang (DHJST) OA-Symptome lindert, indem es den NLRP3-Inflammasom-Weg unterdrückt, was durch jahrhundertelange empirische Anwendung unterstützt wird. Ähnlich mildert die Shenjinhuoxue-Mischung (SHM) Schmerzen und Knorpeldegeneration durch die Herunterregulierung proinflammatorischer Mediatoren wie IL-1β und TNF-α 11,12,13. Auf Monomerebene wurde berichtet, dass Verbindungen wie Icariin (Cyanoside A, CyA) und Erianin, die aus Heilpflanzen gewonnen werden, die Chondrozytenproliferation fördern, die Entzündungsfreisetzung von Zytokinen hemmen und die Gelenkhomöostase^14,15 aufrechterhalten. Gemeinsam bietet TCM einen umfassenden therapeutischen Ansatz mit entzündungshemmenden, chondroprotektiven und symptomlindernden Eigenschaften. Die Komplexität seiner Mechanismen und die Fragen im Zusammenhang mit der Standardisierung erfordern jedoch fortlaufende, rigorose Forschung.

Die getrockneten, reifen Früchte von Fructus Xanthii (Compositae), allgemein bekannt als "Cang-Er-Zi", zeigen nachweislich eine Vielzahl pharmakologischer Wirkungen, darunter antimikrobielle, entzündungshemmende, antioxidative, analgetische, antineoplastische und immunmodulatorische Wirkungen¹⁶. Phenolsäuren, die aus Fructus Xanthii isoliert wurden, reduzieren effektiv die Synovialhyperplasie bei rheumatoider Arthritis (RA)¹⁷. Unter diesen wurde festgestellt, dass Chlorogensäure (CGA), ein repräsentatives Derivat der Caffeoylquinsäure, die Proliferation und Differenzierung von Osteoblasten stimuliert und gleichzeitig die RANKL-vermittelte Osteoklastogenese hemmt und so die skelettale Homöostase¹⁸ aufrechterhält. Andere im selben Extrakt identifizierte Phenolsäuren, wie Neochlorogensäure (5-CQA), Kryptochlorogensäure (CCA) und Protokatechusäure, weisen ebenfalls antimikrobielle, entzündungshemmende, antitumorale und antioxidative Eigenschaften^auf. Neben Phenolsäuren tragen verschiedene sekundäre Metaboliten, die in Cang-Er-Zi enthalten sind, zu diesen Bioaktivitäten ^bei. Die genaue Rolle und die zugrunde liegenden Mechanismen des Fructus-Xanthii-Extrakts bei OA sind jedoch weitgehend unerforscht.

Nicht-zielgerichtete Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Metabolomik zeichnet sich durch hypothesenfreie, hohe Durchsatz- und globale Abdeckungsfähigkeiten aus. Es ermöglicht die gleichzeitige Erkennung von Tausenden von Metabolitenmerkmalen, bietet einen panoramischen Überblick über metabolische Netzwerke und ermöglicht die systematische Entdeckung neuartiger Biomarker und abweichender Stoffwechselwege ohne vorherige Zielvorangabe^26,27. In Kombination mit hochauflösender Massenspektrometrietechnologie eignet sich dieser Ansatz für die umfassende Analyse verschiedener biologischer Probentypen (z. B. Serum, Synovialflüssigkeit, Urin, Knorpelgewebe usw.) und hat bedeutende Vorteile in der Arthroseforschung (OA) gezeigt. Einerseits kann es umfassend nach differenziellen Metaboliten suchen, die eng mit dem pathologischen Fortschreiten der OA verbunden sind (wie verschiedene Klassen von Metaboliten, die in Synovialflüssigkeit und Synovialgewebe identifiziert werden), und diese auf wichtige Wege wie Energiestoffwechsel, Knorpelreparatur, Osteogenese und Lipidstoffwechsel abbilden, wodurch das Verständnis der OA-Pathogenese vertieft wird. Andererseits hilft die Integration von Multi-Omics-Daten wie Transkriptomik und Proteomik, die Rolle der metabolischen Umprogrammierung bei Knorpeldegeneration, Entzündungsreaktionen und Gelenkstrukturschäden aufzuzeigen, wodurch entscheidende Belege für die Identifizierung früher diagnostischer Biomarker, die Bewertung des Krankheitsverlaufs und die Entwicklung gezielter metabolischer Interventionsstrategien (z. B. Regulierung von Gallensäure-, Tryptophan- oder Fettsäurestoffwechsel) bereitgestellt werden und ihr translationales Potenzial in Forschung zur präzisen OA-Typisierung und personalisierter Behandlung.

Zebrafisch dient als ausgezeichneter Modellorganismus aufgrund mehrerer Vorteile: Sein Genom ist hochgradig mit dem des Menschen konserviert und teilt sich die Homologie mit etwa 70 % der menschlichen proteincodierenden Gene. Sie weist wichtige Merkmale auf, darunter schnelle Entwicklung, In-vitro-Fertilisation, transparente Embryonen, die eine bequeme In-vivo-Bildgebung ermöglichen, hohe Fruchtbarkeit und niedrige Wartungskosten 30,31,32,33^. In der Skelettforschung ermöglichen Zebrafische eine klare Visualisierung der Knochenbildung, der Mineralisationsprozesse und der Regenerationsfähigkeit und können zur Simulation pathologischer Zustände wie Osteoporose und Knorpelschäden eingesetzt werden. In der Untersuchung der Arthrose (OA), einer komplexen Ganzgelenkerkrankung, die durch Degeneration des Gelenkknorpels, Synovialentzündung und Veränderungen des subchondralen Knochens gekennzeichnet ist, bleibt die Anwendung des Zebrafischmodells jedoch relativ begrenzt.

Dieser Artikel stellt ein Protokoll vor, das UHPLC-HRMS/MS-basierte untargeted Metabolomics, Netzwerkpharmakologie, transkriptomisches Mining und in vivo experimentelle Validierung integriert, um das Potenzial von Xanthium sibiricum-Extrakt als geeigneten Pflanzenkandidaten für OA-Interventionen zu erforschen. Ziel ist es nicht nur, die bioaktiven Komponenten, potenziellen Ziele und Kernregulationswege des Xanthium sibiricum-Extrakts durch Multi-Omics-Integration und computergestützte Analyse zu identifizieren, sondern auch seine chondroprotektive Wirkung auf OA durch In-vivo-Modelle zu überprüfen und den regulatorischen Mechanismus am Chondrozytentranskriptom weiter zu klären.

Protokoll

Alle Experimente mit klinischen Proben und Mäusen wurden gemäß dem vom Ethikausschuss des Provinzmedizinischen Biotechnologie-Forschungszentrums Shandong genehmigten Protokoll durchgeführt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Isolierung und Kultur menschlicher Gelenkchondrozyten

Menschliche Gelenkknorpelproben wurden von Patienten entnommen, die sich einer arthroskopischen Operation oder einer totalen Gelenkarthroplastik am First Affiliated Hospital der First Medical University von Shandong unterzogen. Knorpelscheiben wurden innerhalb von 30 Minuten nach chirurgischer Exzision auf Eis ins Labor transportiert. Das Gewebe wurde gründlich mit eiskalten Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS; 3–5 Waschungen) gewaschen und anschließend mit steriler chirurgischer Schere fein zu etwa 1 mm³ Fragmenten zerkleinert. Es wurde eine sequentielle enzymatische Verdauung durchgeführt, beginnend mit der Vorverdauung mit 0,25 % Trypsin-EDTA für 30 Minuten bei 37 °C. Der Verdauungsprozess wurde überwacht, bis die Knorpelfragmente dünner, kleiner und durchsichtig waren, danach wurden die Knorpelfragmente durch Zentrifugation (200 × g, 5 min) bei Raumtemperatur gesammelt. Darauf folgte eine nächtliche Verdauung (8 Stunden, 37 °C) mit 0,2 % Typ-II-Kollagenase unter kontinuierlicher sanfter Bewegung. Der Verdauungsprozess wurde überwacht, bis alle makroskopisch sichtbaren Knorpelfragmente vollständig gelöst waren. Die freigesetzten Zellen wurden durch Zentrifugation (200 × g, 5 min) bei Raumtemperatur gesammelt, in vollständigem DMEM mit 10 % fetalem Rinderserum, 100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin ergänzt und in 75 cm große,^2-Kultur Kolben eingesät. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 %_CO2 gehalten. Adhärente Chondrozyten wurden mit 0,25 % Trypsin-EDTA abgelöst, und die Zellen wurden im Verhältnis 1:3 subkultiviert, wenn die adhärenten Zellen 80 % Zusammenfluss der Kulturkolbenoberfläche erreichten.

2. Zubereitung von Fructus Xanthii-Extrakt

Getrocknete reife Früchte von Xanthium strumarium L. (Fructus Xanthii) wurden aus natürlich vorkommenden Populationen Nordchinas gesammelt und von einem leitenden Pharmakognisten authentifiziert. Das Exemplar wurde im Herbarium der Ersten Medizinischen Universität Shandong deponiert. 20 g fein pulverisiertes Fructus Xanthii wurden in einen Extraktionsfingerhut gegeben, und eine umfassende Soxhlet-Extraktion wurde mit 95 % Ethanol (etwa 250 ml) durchgeführt, bis sieben bis acht Siphonzyklen abgeschlossen waren. Der ethanolische Extrakt wurde gefiltert, und das Filtrat wurde unter reduziertem Druck bei 45 °C mit einem Rotationsverdampfer auf Trockenheit konzentriert. Der resultierende Rückstand wurde in 60 ml doppelt destilliertem Wasser wieder suspendiert und nacheinander mit 60 ml Ethylacetat in einem separaten Trichter aufgeteilt. Die Mischung wurde kräftig geschüttelt und konnte 24 Stunden lang bei 4 °C Phasentrennung durchlaufen. Die wässrige Schicht wurde dann gesammelt, geliophilisiert und bei −80 °C bis zur weiteren Nutzung gelagert.

3. Standardisierter Arbeitsablauf für nicht-zielgerichtete LC-MS/MS-Metabolomik

1. UHPLC-HRMS/MS-basierte nicht-zielgerichtete Metabolomik-Analyse
   Nicht-gezieltes metabolomisches Profiling wurde auf einer ultra-leistungsstarken Flüssigkeitschromatographie-Hochauflösungs-Tandem-Massenspektrometrie-(UHPLC-HRMS/MS)-Plattform durchgeführt. Metaboliten wurden schnell abschreckend und mit einem gekühlten Methanol-Wasser-System extrahiert. Die chromatographische Trennung erfolgte auf einem UHPLC-System, das mit einer C18/T3-chromatographischen Säule (100 × 2,1 mm, 1,8 μm) ausgestattet war, die bei 40 °C gehalten wurde. Ein binärer Gradient (0–28 min), bestehend aus 0,1 % Ameisensäure in Wasser (A) und 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril (B), wurde mit einer Durchflussrate von 0,3 mL/min aufgebracht. Die massenspektrometrische Detektion erfolgte auf einem hybriden Quadrupol-Orbitrap-Instrument, das im polaritätsschaltenden voll-MS/datenabhängigen MS2-Modus (Full MS/dd-MS2) betrieben wurde, mit einem vollständigen Scanbereich von m/z 70–1.050 und einer Auflösung von 120.000 (FWHM bei m/z 200). Die Hochenergie-Fragmentierung der Kollisionsdissoziation (HCD) wurde bei 20, 40 und 60 eV durchgeführt, wobei der dynamische Ausschluss auf 10 s eingestellt war.
2. Rohdaten wurden mit ProteoWizard in das mzXML-Format umgewandelt. Peak Picking, Retentionszeit-Ausrichtung und De-Isotoping wurden auf XCMS Online unter Verwendung von HRMS-optimierten Parametern (ppm = 5, bw = 5, snthresh = 6) durchgeführt. Merkmale mit mehr als 50 % fehlenden Werten über die Proben hinweg wurden ausgeschlossen, und die verbleibenden Spitzenbereiche wurden auf den Gesamtionenstrom (TIC) normalisiert. Die Metaboliten wurden durch genaue Abgleiche von Masse, MS2-Spektren und Retentionszeit mit einer hauseigenen Referenzbibliothek annotiert, wobei eine Massenfehlertoleranz von ≤ 5 ppm und eine Dot-Produkt-Schwelle von ≥80 verwendet wurde.
   HINWEIS: Strenge Standardarbeitsverfahren wurden während des gesamten Arbeitsablaufs eingehalten. Die Proben wurden unmittelbar nach der Entnahme in flüssigem Stickstoff (−80 °C) gefroren, mit einer Trockeneiskette transportiert und mit randomisierten Extraktion-, Injektions- und Batchverfahren verarbeitet. Nach jeweils 10 Studienproben wurden gepoolte Qualitätskontrollproben (QC) eingefügt, um instrumentelle Drift zu überwachen.

4. Netzwerkpharmakologische Analyse

1. Netzwerk-pharmakologiebasierte Screening von Wirkstoffen und Zielvorhersage
   Die Wirkstoffe von Fructus Xanthii wurden aus der TCMID-Datenbank (https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php) und der HERB-Datenbank (http://herb.ac.cn/) abgerufen. Die gewonnenen Verbindungen wurden gemäß den empfohlenen ADME-Schwellenwerten für orale Bioverfügbarkeit ≥30 % und Arzneimittelähnlichkeit ≥0,18 gefiltert. Vorhergesagte menschliche Ziele der qualifizierten Verbindungen wurden aus den beiden Datenbanken gewonnen. Die Screening-Ergebnisse wurden erhoben und zusammengestellt, was zur Identifizierung von 15 Wirkstoffen und 151 einzigartigen Proteinzielen führte, die mit Fructus Xanthii assoziiert sind.
2. Integration transkriptomischer Daten und Identifikation von OA-assoziierten Kernzielen
   Differentiell exprimierte Gene (DEGs) im Knorpelgewebe zwischen normalen und Arthroseproben (OA) wurden aus den GEO-Datenbankdatensätzen GSE51588 (n = 5 normal, 6 OA) und GSE169077 (n = 10 normal, 40 OA) mit dem GEO2R-Webtool (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r) extrahiert. OA-upregulierte Gene wurden anhand der Kriterien log2-fache Veränderung >0,5 und einem angepassten p-Wert <0,05 definiert. Die Schnittmenge zwischen OA-hochregulierten Genen und den 151 Fructus-Xanthii-bezogenen Proteinzielen wurde mit dem R-Paket ggvenn visualisiert. Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke (PPI) der Schnittziele wurden mithilfe der STRING-Datenbank (https://string-db.org/) konstruiert. Die PPI-Netzwerkdaten wurden in Cytoscape importiert, und die Top 10 Hub-Gene wurden mit dem CytoHubba-Plugin mit dem MCC-Algorithmus für eine anschließende funktionelle Anreicherungsanalyse gescreent.

5. Bestimmung der maximal tolerierten Konzentration (MTC) bei Zebrafischen

Transgene Zebrafischlarven (Tg col2a1a:EGFP) wurden 2 Tage nach der Befruchtung (2 dpf) zufällig auf 6-Well-Platten mit einer Dichte von 30 Larven pro Bohrloch verteilt. Jede Welle wurde mit 3 ml Expositionsmedium ergänzt, das seriell verdünnten Fructus Xanthii-Extrakt enthält. Moribe- oder verstorbene Larven wurden täglich entfernt. Die Larven wurden 72 Stunden lang kontinuierlich bei 28 °C ausgesetzt, danach wurde die maximal tolerierte Konzentration (MTC) als höchste Konzentration bestimmt, bei der die Larvensterblichkeit 10 % nicht überschritt.

6. Etablierung des Zebrafisch-Knochenverletzungsmodells

Tg col2a1a: EGFP-Zebrafischlarven wurden 2 Tage nach der Befruchtung (2 DPF) vier Gruppen zugeordnet: Kontrollgruppe, Modell, Chondroitinsulfat (CS) positive Kontrolle und Behandlung mit Fructus Xanthii-Extrakt . Alle Gruppen außer der Kontrollgruppe wurden 24 Stunden lang Staphylococcus aureus (OD600 = 0,8, 1 × 10⁸ CFU/mL) ausgesetzt, um eine Knochenverletzung zu induzieren. Die erfolgreiche Modellbildung wurde bestätigt, indem unter einem Epifluoreszenzmikroskop eine Verringerung der knorpelspezifischen grünen Fluoreszenzintensität im kraniofacialen Bereich relativ zur Kontrollgruppe um mindestens 50 % verifiziert wurde.

7. Quantitative Bewertung der knorpelspezifischen Fluoreszenz bei Zebrafischlarven

Die Larven wurden kontinuierlich graduierten Konzentrationen von Fructus-Xanthii-Extrakt oder 1.000 μg/mL Natriumchondroitinsulfat A (positive Kontrolle) bei 28 °C für 72 Stunden ausgesetzt. Anschließend wurden 10 Larven zufällig aus jeder 6-Well-Replikation ausgewählt (n = 30 pro Gruppe). Die ausgewählten Larven wurden mit 0,016 % Tricain betäubt und seitlich auf 1 % niedrigschmelzenden Agarosepads positioniert. Fluoreszenzbilder wurden bei 2× Vergrößerung (Anregung 488 nm, Emission 525/50 nm) mit einem Stereomikroskop aufgenommen, das mit einer Fluoreszenzkamera ausgestattet war. Die knorpelspezifische EGFP-Intensität im kraniofazialen Bereich, einschließlich des ceratohyalen und Meckels Knorpels, wurde mit Bildanalysesoftware quantifiziert. Die Hintergrundkorrektur der integrierten Dichtewerte wurde durchgeführt, und die korrigierten Werte wurden zur statistischen Analyse der chondroprotektiven Wirksamkeit auf die Kontrollgruppe normalisiert.

8. Induktion von OA bei C57BL/6J-Mäusen

Männliche C57BL/6J-Mäuse (6–8 Wochen alt, 20–22 g) wurden unter spezifischen, pathogenfreien (SPF) Bedingungen bei 22 °C ± 2 °C mit einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus untergebracht. Die Mäuse durften sich eine Woche lang akklimatisieren und wurden dann zufällig in drei Gruppen (n = 8 pro Gruppe) anhand einer Zufallszahlentabelle eingeteilt: (1) Schein-gesteuerte Kontrollgruppe, (2) ACLT-induzierte OA (ACLT) und (3) ACLT plus Fructus Xanthii-Extrakt-Intervention (ACLT + Fructus Xanthii-Extrakt ). Alle chirurgischen Eingriffe wurden unter sterilen Bedingungen gemäß einem zuvor validierten Protokoll durchgeführt.

Die Mäuse wurden mit intraperitonealem Natriumpentobarbital (50 mg/kg) (nach institutionell genehmigten Protokollen) betäubt, und ein medialer parapatellarer Schnitt wurde angefertigt, um die rechte Kniegelenkkapsel freizulegen. Das vordere Kreuzband wurde unter einem Operationsmikroskop durchschnitten, um eine Gelenkinstabilität zu induzieren, danach wurden die Gelenkkapsel und die Haut schichtweise mit 6-0-absorbierbaren Nähten geschlossen. Sham-operierte Mäuse unterzogen sich identischen Arthrotomieverfahren ohne Banddurchtrennung. Die Gelenkstabilität wurde bewertet, und die erfolgreiche Modellbildung wurde durch den Drawer-Test oder durch Beurteilung des Ausmaßes der Gelenkverletzung in histologischen Schnitten der Modellgruppenmäuse bestätigt.

Postoperative Analgesie mit Buprenorphin (0,1 mg/kg, subkutane Injektion) wurde drei aufeinanderfolgende Tage verabreicht. Die Behandlungsmittel wurden einmal täglich per Gavage verabreicht. Die ACLT- + Fructus-Xanthii-Extraktgruppe erhielt 100 μL 1.000 μg/mL Fructus-Xanthii-Extrakt, verdünnt in normaler Kochsalzlösung, während die anderen beiden Gruppen 100 μL normales Kochsalzmittel als Vehikelkontrolle erhielten. Acht Wochen nach der Operation wurden die Mäuse durch CO-2-Erstickung gefolgt von zervikaler Verrenkung eingeschläfert, und die Kniegelenke wurden für histologische Analysen entnommen.

9. Histopathologische Färbung

1. Histologische Vorbereitung und Färbung des Kniegelenkgewebes
   Die operierten Kniegelenke wurden in der postoperativen Woche 8 en bloc entfernt und 48 Stunden lang mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C fixiert. Die fixierten Gelenke wurden 14 Tage lang in 10 % Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; pH 7,4) entkalkt, durch eine graduierte Ethanolserie dehydriert und in Paraffin eingebettet. Serielle sagittale Schnitte (5 μm) wurden aus den eingebetteten Gelenken hergestellt, und die folgenden histologischen Färbungsverfahren wurden durchgeführt.
   1. Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbung
      Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbungen wurden durchgeführt, um die allgemeine Gewebearchitektur, die Knorpelintegrität und die Synovialhyperplasie zu beurteilen.
   2. Safranin-O/Fast Green Lackierung
      Eine Safranin-O/Fast Green-Färbung wurde durchgeführt, um Proteoglykane im Knorpelgewebe nachzuweisen. Die gefärbten Schnitte wurden mit einem Lichtmikroskop mit einer Digitalkamera untersucht, und die Bilder wurden mit 10× und 20× Vergrößerungen aufgenommen.
2. OARSI-basierte semi-quantitative Bewertung der Knorpeldegeneration
   Für die halbquantitative Bewertung der Knorpeldegeneration wurden die gefärbten Schnitte retrospektiv neu bewertet und gemäß dem Osteoarthritis Research Society International Osteoarthritis Knorpelhistopathologie-Bewertungssystem bewertet, das den Schwere der Knorpelschäden anhand des Grades (0–6; Ausmaß des Knorpelverlusts) und dem Stadium (0–4; räumliche Schadensverteilung) der Gelenkknorpeldegeneration bewertet.
   Für alle Bewertungen wurde eine Post-hoc-Blinding-Strategie verfolgt. Alle Abschnitte wurden durch Entfernen der ursprünglichen Gruppenbeschriftungen de-identifiziert und mit anonymen Seriennummern neu codiert. Zwei erfahrene Pathologen bewerteten die Abschnitte unabhängig voneinander, ohne Kenntnis der Gruppenzuteilung zu wissen. Zwischen den beiden Wertungsergebnissen wurde eine Kreuzvalidierung durchgeführt. Wenn der Punktunterschied ≥1 betrug, wurden die unterschiedlichen Abschnitte gemeinsam von den beiden Pathologen neu bewertet, um einen Konsenswert zu ermitteln. Die endgültigen Konsenswerte wurden für die anschließende statistische Analyse verwendet, um die Objektivität, Robustheit und Reproduzierbarkeit der histopathologischen Ergebnisse sicherzustellen.

10. RNA-Sequenzierung (RNA-Seq)

Primäre humane Gelenkchondrozyten (Durchgänge 2–3) wurden in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen pro Bohrloch eingesät. Die Zellen wurden 24 Stunden lang am Serum entlassen und dann in zwei Gruppen eingeteilt (n = 3 pro Gruppe): (1) Kontrollgruppe: Die Zellen wurden nur mit Vehikel behandelt (0,1 % DMSO); (2) Fructus-Xanthii-Extraktgruppe: Die Zellen wurden mit 1.000 μg/mL Fructus-Xanthii-Extrakt in DMSO gelöst behandelt.
Die Zellen wurden 24 Stunden lang behandelt, danach wurde die gesamte RNA gemäß dem Protokoll des Herstellers mit Trizol-Reagenz extrahiert. RNA-Integrität (RIN ≥7,0) und Konzentration wurden mit einem RNA-Analysator bewertet. Strängspezifische cDNA-Bibliotheken wurden mit einem RNA-Sequenzierungsbibliotheks-Vorbereitungskit vorbereitet und auf einer High-Through-Next-Generation-Sequenzierungsplattform (NGS) im Paired-End-150-bp-Modus (PE150) sequenziert. Die Qualitätskontrolle der rohen FASTQ-Dateien erfolgte mit FastQC, gefolgt von Adapter- und Qualitätstrimming mit Trimmomatic vor der nachgelagerten Analyse.

11. RNA-seq-Datenverarbeitung

Differentiell exprimierte Gene werden durch Fructus Xanthii-Extrakt herunterreguliert (vs. Kontrollgruppe; p < 0,05 und logFC < −0,5) wurden aus dem RNA-seq-Datensatz extrahiert und mit den Top 10 Hub-Zielen überschnitten. Die resultierenden Kernziele, die mit Fructus-Xanthii-Extrakt und Arthrose assoziiert sind, wurden mit dem Ggvenn-Paket visualisiert.

12. ELISA

Primäre humane Gelenkchondrozyten an den Passagen 2–3 wurden in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen pro Bohrloch ausgesaat. Die Zellen wurden 24 Stunden lang in serumfreiem Medium inkubiert, um die Ruhe zu induzieren. Die Zellen wurden anschließend in folgende drei Gruppen unterteilt (n = 3 pro Gruppe):
(1) Blanke Kontrolle: Zellen wurden nur mit Fahrzeug (0,1 % DMSO) behandelt; (2) Positive Kontrolle: Die zelluläre Entzündung wurde mit IL-1β induziert, gefolgt von einer Behandlung mit Vehikel (0,1 % DMSO); (3) Fructus-Xanthii-Extraktgruppe : Zelluläre Entzündung wurde mit IL-1β induziert, gefolgt von einer Behandlung mit 1000 μg/mL Fructus-Xanthii-Extrakt, gelöst in 0,1 % DMSO. Zellkultur-Supernatanten wurden nach 24 Stunden Inkubation gesammelt und bis zur Nutzung bei −80 °C gelagert. Die Werte von MMP1 und PGR in den Kultursupernatanten wurden mit kommerziell erhältlichen enzymgebundenen Immunsorbent-Assay-Kits (ELISA) bestimmt, die spezifisch für humanes MMP1 bzw. PGR sind. Die Tests wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

13. Statistische Analyse

Alle statistischen Analysen wurden mit Analyse- und Grafiksoftware durchgeführt, und die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) präsentiert. Die Normalität der Daten wurde mit dem Shapiro–Wilk-Test bewertet, die Homoskedastizität mit dem Levene-Test. Gruppenübergreifende Vergleiche wurden mittels Ein- oder Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, gefolgt von Tukey- oder Šidák-Post-hoc-Tests, je nach Zweck. Paarweise Vergleiche wurden mit einem zweiseitigen Schüler-t-Test durchgeführt. Nichtparametrische Daten wurden mit dem Mann–Whitney-U-Test analysiert. Ein zweiseitiger P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Qualitätsbewertung und metabolische Landschaft nicht-zielgerichteter LC-MS/MS-Daten

QC-Proben zeigten eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit, was durch stark überlappende TIC-Chromatogramme sowohl im positiven als auch im negativen Ionenmodus angezeigt wurde, wobei die Retentionszeitdrift über die gesamte Analysecharge unter 0,05 Minuten blieb. Rohdaten wurden XCMS-basierter Vorverarbeitung unterzogen, die Spitzenerkennung, Integration und Ausrichtung der Speicherzeit umfasste...

Diskussion

OA ist eine weit verbreitete degenerative Gelenkerkrankung und weltweit eine der Hauptursachen für Behinderungen³⁶. Seine Pathogenese ist komplex und multifaktoriell und umfasst biochemische, zelluläre und molekulare Veränderungen in Gelenkgeweben. Einst als einfaches "Verschleiß"-Phänomen des Gelenkknorpels angesehen, wird OA heute weithin als chronische Ganzgelenkerkrankung anerkannt, die durch Knorpelabbau, Synovialentzündung, Osteophytenbildung und Subchondral...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
4% PFA	Biosharp, China	BL539A	pH 7,4, steril
C57BL/6 Mäuse	Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd, China	N/A	Männlich, 8-10 Wochen alt, 20-25g
Chondroitinsulfat	MCE, Amerika	HY-B2162	Reinheit ≥98%
ClusterProfiler (R-Paket)	Bioconductor	Freier Zugriff	Integriert in R v4.2.2
Kollagenase, Typ II, Pulver	Gibco, Amerika	17101015	≥125 U/mg
Cytoscape	Cytoscape Consortium	Freier Zugriff (https://cytoscape.org/)	v3.9.1 (mit CytoHubba)
Cytoscape	Cytoscape Consortium	Freier Zugriff	Version 3.9.1
DESeq2 (R-Paket)	Bioconductor	Freier Zugriff	Integriert in R v4.2.2
DMEM, hohe Glukose	Gibco, Amerika	11965092	Steriles Medium
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, China	10009218	Analytische Qualität, 95%
Ethylacetat	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, China	10009418	Analytische Qualität
Fötales Rinderserum (FBS)	Cellmax, China	SA102.02	Hitzeinaktiviert
Fluoreszenzmikroskop	Nikon, Japan	Eclipse Ti2-U	Ausgestattet mit GFP-Filter (488nm Anregung) & Digitalkamera
GEO-Datenbank	NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r	GEO2R Analysetool
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC, Amerika	Kommerziell	Version 9.5.1
Hämatoxylin-Eosin(HE) Färbesatz	Solarbio, China	G1120	Bereitstellungsfähiger Satz
HERB Datenbank	Chinesische Akademie der Wissenschaften	http://herb.ac.cn/	V2.0
Human MMP-1 ELISA-Kit	Yamei Biotechnology, China	HJ088	Für Menschen, 96-Well-Platte
Human Progesteron-Rezeptor (PR) ELISA-Kit	Shanghai Enzyme-Linked Biotechnology Co., Ltd., China	ml05997	Für Menschen, 96-Well-Platte
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	Freier Zugriff	Version 1.53t
Lichtmikroskop	Olympus, Japan	BX53	10×/20× Objektive & Digitalkamera
Lyophilisator	Christ, Deutschland	Alpha 1-4 LDplus	Gefriertrocknungssystem
Modifizierter Safran-O und Fast Green Färbesatz	Solarbio, China	G1371	Für Knochen-/Knorpelfärbung
Neutrales Balsam	Solarbio, China	G8590	Einbettungsmedium
Penicillin-Streptomycin	Gibco, Amerika	15070063	100×, steril
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sparkjade, China	CR0013-500ML	pH 7,2-7,4, steril
R-Software	R Foundation for Statistical Computing	Freier Zugriff (https://www.r-project.org/)	v4.4.1 (mit ggvenn)
Serumfreies Zelleinfriermedium	Biosharp, China	BL203B	Sterilan
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 25923	Standardstamm
STRING-Datenbank	STRING Consortium	https://string-db.org/	Proteininteraktionsanalyse
TCMID-Datenbank	Shaanxi Qinling Qiyao Collaborative Innovation Center	https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php	V3.0
Tg(col2a1a:EGFP) Zebrafische	Zebrafish International Resource Center (ZIRC)	N/A	Larven (2 dpf), AB-Stamm
TRIzol Reagenz	Thermo Fisher, Amerika	15596018CN	Für die Gesamt-RNA-Extraktion
Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot	Gibco, Amerika	25200056	Sterilösung
Ultra-hochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPLC)	Thermo Fisher, Amerika	Q Exactive Focus	Gekoppelt mit HRMS/MS
XCMS-online	Scripps Research Institute	Freier Zugriff	Webbasierte Plattform