Bex-Plex ermöglicht die gleichzeitige Visualisierung von Proteinmarkern und Ribonukleinsäure-Transkripten für eine tiefe räumliche Profilierung intakten Gewebes

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Kombination iterativer Proteinfärbung (IBEX) mit RNAscope-In-situ-Hybridisierungstechnologie vor, um die tiefe räumliche Phänotypisierung intakter, fixierter gefrorener Gewebe für hochauflösende räumliche Profilierungen zu ermöglichen.

Abstract

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das eine gleichzeitige räumliche Profilierung von Protein- und Ribonukleinsäure-(RNA)-Markern mit Einzelzellauflösung in intakten Geweben ermöglicht. Eines der Kernprobleme bei soliden Tumortumoren ist die Unfähigkeit, die Reaktionsfähigkeit der Patienten auf therapeutische Interventionen vorherzusagen. Die Entschlüsselung dieser Komplexitäten erfordert quantitative Messungen zellulärer Verhaltensweisen, Interaktionen und Phänotypen in intakten Geweben. Insbesondere liefern Proteom und Transkriptom überlappende, aber nicht redundante Informationen, die für die Entwicklung rationaler Immuntherapeutika entscheidend sein können. Es gibt jedoch derzeit keine einfache und kosteneffiziente Möglichkeit, sowohl den transkriptionellen als auch den funktionellen Zustand aller Zellen im Tumormikroumfeld tief zu profilieren, während ihre kritischen räumlichen Lokalisierungsinformationen erhalten bleiben. Zu diesem Zweck haben wir erfolgreich die IBEX-Plattform (Iterative Bleaching extends Multixity) mit dem HiPlex RNAscope kombiniert, um gleichzeitig High-Plex-Proteinmarker und High-Plex-Ribonukleinsäure-(RNA)-Transkripte mit Einzelzellauflösung zu visualisieren. Dieser Ansatz beinhaltet einen modifizierten RNA-Zielabrufschritt, um die Kernmorphologie zu erhalten und eine genaue Bildausrichtung über Zyklen hinweg zu ermöglichen. "Bex-Plex" ermöglicht es uns, ein unverändertes IBEX-Protokoll auf fixiertem gefrorenem Gewebe durchzuführen, gefolgt vom HiPlex RNAscope-Protokoll, bei dem wir eine modifizierte RNA-Zielabnahme verwenden, um die nukleare Ausrichtung mit IBEX-Zyklen sicherzustellen. Dieses Protokoll ist für fixierte eingefrorene Gewebe optimiert und ermöglicht eine integrierte räumliche Analyse transkriptionaler und funktionaler zellulärer Zustände. Die Fähigkeit, auf dieser Einzelzellebene ein Profil zu erstellen, liefert nicht nur eine tiefe Informationsquelle über das Gewebe selbst, sondern kann auch Vorhersagen über die nuancierten zellulären Interaktionen ermöglichen, die die therapeutische Reaktionsfähigkeit antreiben, und so einen Rahmen für die Untersuchung räumlicher Biologie in Tumormikroumgebungen und verwandten Systemen schaffen.

Introduction

Seit ihrer Einführung im Jahr 2011 haben sich Krebsimmuntherapien, die die Unterdrückung zytotoxischer T-Zellen durch das Blockieren inhibitorischer Immunkontrollpunktmoleküle wie PDL-1 und CTLA-4 verringern, als Goldstandard für die Behandlung solider Tumoren¹ etabliert. Trotz großflächiger Anwendung bei Patienten variieren jedoch die klinischen Wirksamkeiten dieser Medikamente stark, da viele solide Tumorkrebsarten entweder intrinsisch mit diesen Therapien vorliegen oder schließlich Resistenzen dafür erzeugen². In vielen Fällen liegt dies an der extrem heterogenen Natur solider Tumore, selbst bei denselben Krebsarten Typ³. Ein tieferes Verständnis der Zellbeziehungen, die in soliden Tumoren auftreten, ist entscheidend, um verbesserte Behandlungsmethoden zu entwickeln. Daher steht die Identifizierung der genauen Mechanismen und Wechselwirkungen, die diese Resistenz erhöhen und aufrechterhalten, im Mittelpunkt der Krebsforschung. Hier wollen wir eine Methode entwickeln, die eine integrierte räumliche Analyse der Protein- und RNA-Expression in intakten Geweben ermöglicht, um diese komplexen zellulären Interaktionen besser zu charakterisieren.

Das Tumormikromilieu (TME) besteht aus den nicht-krebsartigen zellulären und strukturellen Komponenten, die das Tumorwachstum und die Immunantwort prägen, darunter krebsassoziierte Fibroblasten, infiltrierende Immunzellen, vaskuläre Komponenten und die extrazelluläre Matrix⁴. In letzter Zeit wurde deutlich, dass die Zusammensetzung und Organisation des TME stark beeinflusst, ob Tumore tolerant oder resistent gegen Immuninfiltration sind – einer der Hauptfaktoren für die Immuntherapie-Reaktion⁵. Bei vielen Krebsarten korreliert ein "Immunwüsten"-Phänotyp, gekennzeichnet durch eine geringe Anzahl von T-Zellen und das Vorhandensein hoch immunsuppressiver myeloider Populationen, mit einer schlechten Reaktion auf Checkpoint-Blockadetherapien ^6,7. Chemokin-Signale steuern viele dieser Rekrutierungsdynamiken. Zum Beispiel ziehen CXCL1 und CCL2 immunsuppressive myeloide Zellen an, während die CXCR3-CXCL9/CXCl10-Achse sowohl zytotoxische als auch regulatorische T-Zellen in den Tumor⁸ rekrutiert. Folglich kann die nischenspezifische Signalumgebung den Phänotyp und die Funktion der Zellen stark beeinflussen. Beispielsweise steuert bei Patienten mit Kolorektalkrebs die CCL5-CCR5-Achse die suppressive Funktion tumorassoziierter Makrophagen (TAMs), und das Blockieren dieses Signals verzerrt TAM zu einem antitumorogenen Phänotyp und korreliert mit verbesserten klinischen Wirkungen⁹. Darüber hinaus können direkte Interaktionen zwischen Immunzellen, krebsassoziierten Fibroblasten und/oder Tumorzellen über ICAM und PDL-1 eine Immunerschöpfung auslösen und die Antitumorimmunität^abschwächen. Zusammen unterstreichen diese Ergebnisse die Bedeutung räumlich aufgelöster Analysen, um zu verstehen, wie das TME die therapeutische Wirksamkeit beeinflusst.

Die Immunfluoreszenzbildgebung (IF) bleibt ein grundlegender Ansatz zur Visualisierung der Proteinexpression und Zell-Cell-Interaktionen im Gewebe. Das Fachgebiet hat sich von herkömmlicher 3-4-farbiger IF-Technologie zu hochinhaltsstarken Bildverarbeitungsworkflows entwickelt, die auf iterativem Färben und Bildgebung setzen. Bei diesen Methoden werden große Datensätze durch wiederholte Zyklen der Antikörpermarkierung, Bildgebung und Inaktivierung oder Entfernung von Fluorophoren generiert, sodass zusätzliche Marker gefärbt und abgebildet werden können¹¹. Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) wurde kürzlich als benutzerfreundliche und kostengünstige iterative Bildgebungsplattform^eingeführt. Kompatibel mit kommerziellen Antikörpern und herkömmlichen Mikroskopen, verwendet IBEX Lithiumborhydrid (LiBH₄), um die Fluoreszenz der am häufigsten verwendeten Farbstoffe zu löschen, ohne Gewebeepitope zu schädigen, wodurch bis zu 75 Parameter für ein einzelnes^{Gewebe 13} erfasst werden können. Die aus dieser zyklischen Färbung gewonnenen Bilder werden mit der Open-Source-Software SimpleITK ausgerichtet, um zusammengesetzte Datensätze zu erstellen, die für hochdimensionale räumliche Analysen geeignet sind.

Ergänzend zur Phänotypisierung auf Proteinebene können räumliche transkriptomische Methoden wertvolle Informationen über den transkriptionellen Zustand der Zellen in ihrer natürlichen Umgebung liefern. Bemerkenswert ist, dass die In-situ-Hybridisierung (ISH) eine beliebte Technik ist, um die Lokalisierung von DNA- oder RNA-Sequenzen in einem bestimmten Gewebe^zu identifizieren. RNAscope ist ein etablierter ISH-Ansatz, der Sonden mit einer einzigartigen Z-Chemie verwendet, um RNA-Transkripte gezielt in Einzelmolekülauflösung zu amplifizieren und mit vielen verschiedenen Probentypen^kompatibel ist. Als weit verbreitete und kommerziell verfügbare Plattform über Advanced Cell Diagnostics (ACD) bietet RNAscope validierte Sonden gegen eine Vielzahl von Zielen an, was das experimentelle Design für vielfältige Anwendungen vereinfacht.

Ein vollständigeres Bild der Zellidentität und -funktionen kann durch die Kombination von Protein- und RNA-Detektion innerhalb desselben Gewebes gewonnen werden. Kurzlebige sekretierte Proteine wie Zytokine und Chemokine haben traditionell keine zuverlässige Antikörperfärbung durch IHC, aber Informationen über ihre Expression können durch die Quantifizierung ihrer mRNA-Transkripte gewonnen werden. Frühere Versuche, RNA und Protein gemeinsam zu detektieren, wie konventionelle chromogene IHC oder TSA-OPAL, wurden durch nichtlineare Signalverstärkung und zeitaufwändige Antigenabrufprotokolle begrenzt¹⁵. Im Vergleich zu diesen Ansätzen ermöglicht die Bex-Plex-Methode eine gleichzeitige Detektion von High-Plex-Proteinen und RNAs, während der räumliche Kontext und die nukleare Morphologie für eine genaue Bildregistrierung erhalten bleiben.

Hier präsentieren wir "Bex-Plex", ein Protokoll, das die IBEX- und RNAscope-Plattformen integriert, um die gleichzeitige, quantifizierbare Charakterisierung der transkriptionellen und translationalen Zustände von Zellen innerhalb ihres natürlichen Gewebes zu ermöglichen. In Bex-Plex durchlaufen fest eingebettete OCT-Gewebe das Standard-IBEX-Protokoll, gefolgt von einem leicht modifizierten RNAscope HiPlex-Workflow, bei dem die Zielrückholung bei 60 °C mit einer Inkubationszeit von 1 Stunde stattfindet, im Vergleich zur ursprünglichen 99 °C Inkubation für 5 Minuten. Dies bewahrt die Architektur der Kerne und ermöglicht eine genaue Ausrichtung der fiduzialen Marker beim Registrieren der separaten Bilder aus den IF- und ISH-Zyklen zu einem einzigen. Dieses Protokoll eignet sich am besten für Studien, die eine gleichzeitige räumliche Analyse der Protein- und RNA-Expression in intakten Geweben erfordern, insbesondere wenn die Gewebeverfügbarkeit begrenzt ist oder die Erhaltung der räumlichen Architektur entscheidend ist, wie etwa bei Tumor-Mikroumgebungsanalysen oder Immunprofiling-Studien.

Mit weit verbreiteten Reagenzien und mit den meisten Bildverarbeitungsplattformen kompatibel kann Bex-Plex von jedem technisch geschulten Forschungspersonal durchgeführt werden, das mit fluoreszierender Bildgebung vertraut ist und Zugang zu einem herkömmlichen Mikroskop hat. Das hier vorgestellte Protokoll ist für fest eingefrorene Proben optimiert. Derzeit wurde das Protokoll in fixierten eingefrorenen Geweben validiert, und weitere Optimierungen könnten für die Anwendung auf andere Probentypen wie FFPE oder klinische Proben am Menschen erforderlich sein.

Dieser Arbeitsablauf ist für jeden Kontext, in dem Gewebe begrenzt oder wertvoll ist, wie etwa Gewebebiopsien oder Tierversuche mit begrenzter Stichprobe, sowie für die Phänotypisierung von Zellen, die mit dissoziativen Techniken schwer zu extrahieren sind. Bex-Plex liefert gleichzeitige, quantifizierbare Informationen über die transkriptionellen und translationalen Profile einzelner Zellen, während der räumliche Kontext erhalten bleibt – Daten, die einzigartig darauf ausgerichtet sind, Fragen zu den Beziehungen und dem Austausch zwischen den Zellen in ihrer ursprünglichen Umgebung zu beantworten.

Protocol

Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California, San Diego (Protokollnummer S24049) genehmigt. Männliche und weibliche Mäuse im Alter von 7 bis 12 Wochen auf einer C57BL/6-genetischen Grundlage und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen wurden für diese Experimente verwendet.

1. Gewebevorbereitung

1. Versuchsmäuse werden durch zugelassene primäre und sekundäre Maßnahmen (z. B. CO-2-Euthanasie und zervikale Verrenkung) eingeschläfert und interessierendes Gewebe in ergänzende Medien entnommen.
2. Bereiten Sie einen frischen Vorrat des Gewebefixierens vor, indem Sie eine 4%ige Lösung von Paraformaldehyd (PFA) auf entweder 0,5% oder 1% PFA in 1X PBS verdünnen. Verwenden Sie 0,5 % PFA für Gewebe mit geringerem Volumen wie Lymphknoten und 1 % PFA für Gewebe mit höherem Volumen wie Tumoren.
   VORSICHT: Paraformaldehyd ist brennbar und giftig, wenn es aufgenommen oder geschluckt wird. Behandle sie mit geeigneter PSA und vermeide Kontakt mit Haut oder Augen.
3. Gewebe in eine 24-Loch-Platte mit 2 ml Fixativ pro Bohrloch übertragen und über Nacht bei 4°C inkubieren.
   Hinweis: Inkubationszeiten von über 16 Stunden können zu Überfixierungsproblemen führen.
4. Füllen Sie die Schächte einer neuen 24-Schacht-Platte mit 1x PBS und übertragen Sie Gewebe von der Fixierungsplatte.
   Pausepunkt: Falls nötig, können Gewebe in 1X PBS bei 4°C bis zu 7 Tage aufbewahrt werden.
5. Entfernen Sie überschüssiges Fett oder Ablagerungen einzeln aus dem Gewebe mit einem Sektionsskop und Werkzeugen. Gib direkt ein kleines Volumen 1x PBS ins Gewebe, um beim Trimmen eine Dehydrierung des Gewebes zu verhindern.
6. Bereiten Sie eine 30%ige W/V-Saccharoselösung vor, indem Sie Pulverbrühe in 1x PBS verdünnen.
7. Die Gewebe werden in eine 24-Loch-Platte mit 2 ml 30 % Saccharose pro Brunnen übertragen und über Nacht bei 4°C zum Trocknen gebrütet. Das Gewebe ist ausreichend ausgetrocknet, wenn es auf den Boden der Brunnen sinkt.
8. Fülle beschriftete Kryomolds mit OCT und lege die Taschentücher einzeln in die Formen. Die Gewebeorientierung hängt vom Ursprung ab, aber unsere Standardempfehlung wäre, dass die größte Oberfläche parallel zum Kryomold unterhalb ist. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig im OCT untertaucht ist.
9. Auf Trockeneis für 10 Minuten zum Einfrieren legen und bei -80°C lagern.

2. Gewebeschnitt

Hinweis: Alle Reagenzien und Labormaterialien, die für dieses Protokoll verwendet werden, müssen frei von RNase sein. Achten Sie darauf, Kontaminationen beim Umgang mit Objektträgern zu vermeiden.

1. RNase-freie Mikroskopobjektträger mit 15 μL Chromalum-Klebstoff beschichten und 1 Stunde bei 60 °C im Ofen inkubieren. Mit Chromaluminium beschichtete Objektträger können bis zu einem Monat bei RT (Raumtemperatur) gelagert werden, bevor sie verwendet werden.
2. Nimm die in OCT eingebetteten Gewebe aus dem -80°C Gefrierschrank und setze sie mindestens 20 Minuten in einen -20°C Kryostat/Kryotom, um das Gleichgewicht zu bringen.
3. Gewebe werden auf chromaluminiumbeschichtete Objektträger mit einer Dicke von 10–15 μm geschnitten.
4. Lagern Sie Objektträger mit geschnittenen Schnitten bei 4°C oder lassen Sie, falls sie am selben Tag färben, auf RT ausgleichen. Schnittobjektträger können bis zu 5 Tage vor der Verwendung bei 4°C aufbewahrt werden.

3. Proteinfärbung

1. In einem Tauchbecken sollte der Folie 5 Minuten lang in RNase-freiem 1X PBS eingeweicht werden, um überschüssiges OCT aus dem Gewebe zu entfernen.
2. Benutze einen hydrophoben Barrierenstift, um Boxen um die Taschentücher auf dem Objektträger zu zeichnen und 2 Minuten trocknen zu lassen.
3. Bereiten Sie eine Blocklösung aus 10 μg·mL⁻¹ Anti-Maus-FC-Rezeptorblock in RNase-freiem 1X PBS vor. Fügen Sie den Blockpuffer den Proben auf dem Objektträger hinzu und verwenden Sie genug, um eine Blase zu erzeugen, die das Gewebe vollständig bedeckt (100–150 μL·^Schnitt-1).
   Hinweis: Manchmal ist für schwierige Gewebe und/oder Marker die Zugabe von FBS oder BSA (typischerweise 1–2 %) zum Blockpuffer erforderlich.
4. Inkubieren Sie die Objektträger bei RT 1 Stunde in einer feuchten Färbebox und waschen Sie sie dann, indem Sie sie komplett in ein Tauchbecken mit RNase-freiem 1x PBS für 5 Minuten tauchen.
5. Bereiten Sie die primäre Antikörperfärbungslösung in RNase-freiem 1X PBS vor, mit 100–200 μL pro Gewebeschnitt. Standard-Antikörperverdünnungen liegen zwischen 1:50 und 1:200, es wird jedoch empfohlen, Einzelfärbungstitrationen durchzuführen, um den besten Verdünnungsfaktor für einen bestimmten Antikörper und/oder Gewebetyp zu bestimmen. Vortex- und Pulsspin bringen die Antikörper vor dem Pipetten, um fluoreszierende Aggregate zu verhindern.
6. Entferne die Objektträger aus der Wäsche und lasse die überschüssige Flüssigkeit vorsichtig mit einem absorbierenden Arbeitstuch aus den Ecken der Probenboxen ein, um eine Verdünnung der Antikörperlösung zu vermeiden.
7. Tragen Sie die Antikörperlösung auf die gleiche Weise auf wie die Blocklösung auf und bilden Sie eine Blase über dem Gewebe.
8. Stellen Sie die Objektträger horizontal in einen 37°C Ofen und inkubieren Sie 1 Stunde lang. Alternativ inkubieren Sie die Objektträger 3–4 Stunden in einer feuchten Box bei RT. Standardisierte IF-Protokolle, die bereits für das gewünschte Gewebe optimiert sind, können verwendet werden. Halten Sie während der Inkubation Folien in einer feuchten Umgebung, um eine Dehydrierung zu verhindern. (z. B. ein feuchtes Papiertuch am Boden des Beichttabletts verwenden).
9. Wasche die Folien, indem du sie für 2 Minuten in RNase-freie 1x PBS tauchst. Wiederhole das zweimal für insgesamt drei Waschen. Falls nötig für Ihr Färbepanel, bereiten Sie während dieser Zeit eine sekundäre Antikörperfärbungslösung in RNase-freiem 1X PBS vor. Standardantikörperverdünnungen liegen zwischen 1:500 und 1:1000, aber es wird empfohlen, Einzelfärbungstitrationen durchzuführen, um den besten Verdünnungsfaktor für einen bestimmten Antikörper und/oder Gewebetyp zu bestimmen.
10. Entfernen Sie überschüssiges PBS von den Objektträgern mit einem absorbierenden Arbeitstuch und geben Sie 100–200 μL sekundäre Antikörper-Färbungslösung zu jedem Gewebeschnitt. Stelle die Folien horizontal in einen Ofen bei 37°C und brüte sie 30 Minuten lang. Alternativ können Objektträger 1–2 Stunden in einer feuchten Box bei RT gefärbt werden.
11. Wasche die Folien, indem du sie für 2 Minuten in 1x RNase-freie PBS tauchst. Wiederhole das zweimal für insgesamt drei Waschen.
12. Verdünnen Sie den DAPI-Kernfarbstoff auf eine Endkonzentration von 0,2 μg·mL⁻¹ in RNase-freiem 1X PBS und fügen Sie jedem Gewebeschnitt 100–200 μL hinzu.
13. Inkubiere die Folien 10 Minuten bei RT in einer feuchten Box, dann einmal waschen, indem du sie in RNase-freie 1X PBS tauchst und kurz auf und ab tauchst.
14. Lösen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit einem saugfähigen Task-Tücher von den Objektträgern ab und geben Sie jedem Abschnitt 20–30 μL wässriges Antifade-Montagemedium hinzu. Setzen Sie vorsichtig einen Deckdeckel auf den Objektträger, achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen, und lassen Sie das Montagemedium 15–30 Minuten aushärten.
15. Stell dir die verfärbten Objektträger vor. Für eine detailliertere Erklärung der Paneldesign-Überlegungen und der Bildaufnahme für IBEX siehe die ursprünglich veröffentlichten IBEX-Protokolle^12,13.
    Pausenpunkt: Lagern montierte Objektträger bis zu 3 Tage im Dunkeln bei 4°C, empfehlen jedoch, sofort fortzufahren, um einen möglichen RNA-Abbau zu gewährleisten.

4. Fluorophorbleichung und iterative Proteinfärbung

1. Tauchen Sie die Objektträger in RNase-freies 1X PBS ein, bis der Deckungsrutscher leicht ohne Kraft abrutscht. Je nachdem, wie lange der Deckdeckel montiert ist, kann dies bis zu 16 Stunden dauern.
2. Während die Objektträger einweichen, bereiten Sie eine 1 mg·mL^⁻1 Lösung von LiBH₄ in RNasefreiem DI H₂O vor, indem Sie vorsichtig mischen, bis sie vollständig gelöst sind, und warten Sie 10 Minuten, bis sie aktiviert ist. Die Aktivierung hat stattgefunden, wenn Blasen in der Lösung vorhanden sind und die Aktivität bis zu 4 Stunden anhält.
   Vorsicht: LiBH₄ ist wasserreaktiv, vermeiden Sie eine übermäßige Feuchtigkeitsbelastung von Pulver und entsorgen Sie Abfälle ordnungsgemäß.
3. Waschen Sie die Objektträger einmal für 2 Minuten in RNase-freiem 1X PBS, um eventuelle Rückstände des Befestigungsmediums zu entfernen, und pipieren Sie dann 100–150 μL der LiBH_4-Lösung auf jedes Gewebe. Inkubiere 15 Minuten in einer feuchten Box.
   Hinweis: Je nach verwendeten Fluorophoren zur Färbung muss diese Inkubationszeit möglicherweise verlängert werden (ausführlich in den IBEX-Methodenartikeln erläutert)^12,13.
4. Wasche die Folien einmal, indem du sie in RNase-freie 1X PBS tauchst und kurz auf und ab tauchst.
5. Färben Sie die Objektträger mit zusätzlichen Proteinmarkern, indem Sie die Schritte 3.5-3.15 befolgen. Es ist nicht notwendig, den Kernfarbstoff neu zu färben, da er nicht mit LiBH₄ bleicht. Wiederholen Sie die Proteinfärbung, falls nötig.
   Pausenpunkt: Montierte Objektträger können über Nacht bei 4°C gelagert werden, bevor der letzte Protein-/IBEX-Zyklus gebleicht und zur RNA überführt wird.
6. Gehen Sie sofort mit dem RNAscope HiPlex fort, nachdem Sie die Fluorophore aus dem letzten Zyklus gebleicht haben. Obwohl bis zu sechs Zyklen Standard-IBEX ohne Gewebe- oder Epitopverlust durchgeführt wurden, empfehlen wir nicht, für dieses Protokoll mehr als drei Zyklen Proteinfärbung zu überschreiten, da die Qualität der RNA-Transkripte über längere Zeiträume verschlechtern kann.

5. Präparatvorbereitung für das RNAscope HiPlex

1. Tauchen Sie die Objektträger vollständig in RNase-freies 1X PBS, bis der Deckmantel leicht ohne Kraft abrutscht. Je nachdem, wie lange der Deckdeckel montiert ist, kann dies bis zu 16 Stunden dauern. Waschen Sie einmal für 2 Minuten in RNase-freiem 1-PBS, um eventuelle Rückstände des Befestigungsmediums zu entfernen.
2. Bereiten Sie 200 ml 50 % Ethanol, 200 ml 70 % Ethanol und 400 ml 100 % Ethanol her.
3. Schalten Sie einen Hybridisierungsofen ein und stellen Sie ihn auf 60°C ein. Verdünnen Sie das 10-fache Zielrückholungsreagenz zu einem 1-fachen Arbeitsmaterial in RNase-freiem DI H_{2 O}und vorwärmen Sie es bis Schritt 5.8 in den Ofen.
   Hinweis: Das Versäumnis, das Ziel-Rückholreagenz auf 60 °C vorzuerwärmen, beeinflusst die nachgelagerte Aufnahme der Bilder aus den separaten Zyklen. Das Ziel-Rückgewinnungsreagenz muss während des gesamten Rückgewinnungsschritts bei 60 °C bleiben.
4. Tauchen Sie die Objektträger in 50 % Ethanol ein. Inkubiere für 5 Minuten bei RT.
5. Entfernen Sie die Objektträger aus dem 50%igen Ethanol und tauchen Sie sie in 70% Ethanol ein. Inkubiere für 5 Minuten bei RT.
6. Entferne die Objektträger aus dem 70%igen Ethanol und tauchen sie in 100% Ethanol ein. Inkubiere 5 Minuten bei RT und wiederhole das mit frischem, 100 % Ethanol.
7. Entferne die Folien aus dem 100%igen Ethanol und lasse sie 5 Minuten bei RT trocknen.
8. Fügen Sie 100–150 μL des 60°C 1X Target Retrieval Reagens zu jedem Gewebeschnitt hinzu und bringen Sie die Objektträger in den Hybridisierungsofen. Inkubiere bei 60°C für 1 Stunde.
9. Entferne die Objektträger und spüle sie 15 Sekunden lang in RNase-freies DI H2O. Zu diesem Zeitpunkt stellen Sie die eingestellte Temperatur im Ofen auf 40 °C ein.
10. Die Objektträger auf 100 % Ethanol umgeben und 5 Minuten inkubieren, dann mindestens 5 Minuten bei RT trocknen.
11. Protease III auf die Objektträger auftragen, 1–2 Tropfen pro Gewebeschnitt. Stellen Sie die Objektträger in den Hybridisierungsofen und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei 40 °C.
12. Tauchen Sie die Objektträger in RNase-freies DI_{H 2 O}ein und waschen Sie sie durch kurzes Hoch- und Abtauchen. Wiederhole das mit frischem destilliertem Wasser für insgesamt zwei Waschen.

6. RNAscope-Reagenzvorbereitung und Sondenhybridisierung

1. Bereiten Sie die RNAscope HiPlex-Sonden-Stocks und den HiPlex-Sondenverdünner vor, indem Sie sie für 10 Minuten in einem Ofen oder Wasserbad auf 40 °C erwärmen.
2. Kurz Pulse-Spin durch alle 50X-Probe-Stocks. Bereiten Sie eine funktionierende Sondenmischung vor, indem Sie jede einzelne Zielsonde mit dem RNAscope Probe Diluent auf 1X verdünnen. Planen Sie, pro Gewebe 50–100 μL Sondenmischung zu verwenden und sie vor der Anwendung durch Vortex gut zu mischen. Das RNAscope HiPlex-Protokoll kann bis zu 3 Zyklen mit je 4 Sonden aufnehmen (insgesamt 12 Sonden, die mit T1-12 bezeichnet werden). Für Hinweise zum Sondendesign konsultieren Sie das ursprünglich veröffentlichte RNAscope-Protokoll¹⁴.
3. Platzieren Sie die RNAscope HiPlex Amp 1–3 und HiPlex Fluoro T1-T4 Reagenzien bei RT, um das Gleichgewicht zu erreichen.
4. Nehmen Sie die mit Protease III behandelten Objektträger und pipettieren Sie 50–100 μL der Sondenmischung auf jeden Gewebeschnitt. Stellen Sie es horizontal in den Hybridisierungsofen und inkubieren Sie 2 Stunden bei 40 °C.
5. Wasche die Folien, indem du sie komplett in einen 1-fachen Waschpuffer für 2 Minuten tauchst. Wiederhole das mit frischem Puffer für insgesamt 2 Waschen.
   Pausenpunkt: Objektträger können über Nacht im 5-fachen SSC-Puffer bei RT gespeichert werden, wie im RNAscope-Protokoll von ACD beschrieben. Wenn dieser Pausenpunkt verwendet wird, beachten Sie, dass am nächsten Morgen zwei 2-minütige Waschphasen in einem 1-fachen Waschpuffer erforderlich sind.

7. Sondenverstärkung

Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien vor dem Auftragen auf die Objektträger auf RT ausgewogen sind.

1. Gib 1–2 Tropfen des HiPlex Amp1-Reagens zu den Objektträgern und inkubiere sie 30 Minuten im Hybridisationsofen bei 40 °C. Wasche die Folien, indem du sie komplett in einen 1-fachen Waschpuffer für 2 Minuten tauchst. Wiederhole das für insgesamt 2 Waschen.
2. Geben Sie 1–2 Tropfen des HiPlex Amp2-Reagens zu den Objektträgern und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang im Hybridisierungsofen bei 40 °C. Wasche die Folien, indem du sie komplett in einen 1-fachen Waschpuffer für 2 Minuten tauchst. Wiederhole das für insgesamt 2 Waschen.
3. Gib 1–2 Tropfen des HiPlex Amp3-Reagens zu den Objektträgern und brüte sie 30 Minuten im Hybridisierungsofen bei 40 °C. Wasche die Folien, indem du sie komplett in einen 1-fachen Waschpuffer für 2 Minuten tauchst. Wiederhole das für insgesamt 2 Waschen.
4. Geben Sie 1–2 Tropfen des HiPlex Fluoro T1-T4-Reagens zu den Objektträgern und inkubieren Sie 15 Minuten im Hybridisierungsofen bei 40 °C. Wasche die Folien, indem du sie komplett in einen 1-fachen Waschpuffer für 2 Minuten tauchst. Wiederhole das für insgesamt 2 Waschen.
5. Geben Sie 3–4 Tropfen HiPlex-DAPI-Reagenz zu jedem Gewebeschnitt und inkubieren Sie 1 Minute bei RT.
6. Entfernen Sie das DAPI, indem Sie die Flüssigkeit mit einem saugfähigen Arbeitstuch von den Objektträgern abziehen. Fügen Sie jedem Abschnitt sofort 100 μL wässriges Antifade-Montagemedium hinzu (das kann dasselbe sein wie bei den IBEX-Färbeschritten). Setzen Sie vorsichtig einen Deckdeckel auf den Schlitten, achten Sie auf geringe Blasen, und lassen Sie die Montage mittlere 15–30 Minuten trocknen.
7. Fahren Sie mit der Bildgebung fort.
   Pausenpunkt: Montierte Objektträger können bis zu 3 Tage im Dunkeln bei 4 °C gelagert werden, empfehlen jedoch, schnell vorzugehen, um einen möglichen RNA-Abbau sicherzustellen.

8. Spaltung der Fluorophore und iterative RNA-Hybridisierung

1. Um die Deckelverschlüpfungen von den Folien zu entfernen, weiche mindestens 30 Minuten im 4-fachen SSC-Puffer bei RT ein. Wasche einmal, indem du die Objektträger komplett in frischen 4-fachen SSC-Puffer tauchst und kurz hoch- und runtertauchst.
2. Öffne eine frische Ampull mit Spaltlösung und stelle durch Verdünnen mit 4-fachem SSC-Puffer einen 10%igen Arbeitsstock her.
3. Platzieren Sie die Objektträger in eine feuchte Box und geben Sie 3–4 Tropfen der 10%igen Spaltlösung hinzu. 15 Minuten in RT inkubieren und dann die Objektträger komplett in 0,5 % PBST für 2 Minuten untertauchen. Wiederhole das mit frischem PBST für insgesamt 2 Waschen.
4. Um mit dem Bildgebungszyklus 2 des RNAscope-Panels fortzufahren, gleicht man das HiPlex-Fluoro-Reagenz T5-T8 auf RT aus.
5. Schalten Sie den Hybridisierungsofen ein und stellen Sie die Temperatur auf 40°C ein.
6. Gib das HiPlex Fluoro T5-T8-Reagenz zu den Objektträgern und inkubiere sie 15 Minuten lang im Hybridisierungsofen bei 40 °C. Wasche die Folien, indem du sie komplett in einen 1-fachen Waschpuffer für 2 Minuten tauchst. Wiederhole das für insgesamt 2 Waschen.
7. Lassen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit von den Objektträgern ein. Fügen Sie sofort 100 μL Montagemedium zu jedem Abschnitt hinzu und legen Sie vorsichtig einen Deckdeckel auf den Schlitten. Lassen Sie das Montagemedium 15–30 Minuten trocknen und beginnen Sie mit der Bildgebung.
8. Wiederholen Sie die Schritte 8.1–8.7 mit dem HiPlex Fluoro T9-T12-Reagenz, für insgesamt 3 RNAscope-Zyklen, falls angebracht. Beachten Sie, dass zwar 3 Zyklen mit dem RNAscope HiPlex-Protokoll möglich sind, die zusätzliche Zeit für die Proteinfärbung mit diesem Protokoll jedoch die RNA-Qualität beeinflussen kann. Daher sind 3 Zyklen je nach gezielten Transkripten nicht immer machbar.

9. Bildverarbeitung

1. Verarbeiten Sie die Rohdateien jeder Runde einzeln und führen Sie Bildverarbeitung mit konsistenten Parametern durch, einschließlich Hintergrundsubtraktionseinstellungen, Glättungsfiltern und Registrierungstransformationstyp. Kanäle sollten mit einem konsistenten Trennzeichen benannt werden (z. B. Zyklus 1: CD45 AF532, wobei ":" die Unterscheidung zwischen Zyklus und Marker/Fluor macht).
2. Starten Sie die SimpleITK-Software (https://github.com/niaid/sitk-ibex) und klicken Sie auf Imaris-Erweiterungen > SimpleITK > Affine-Registrierung des Z-Stacks mit gemeinsamem Kanal.
3. Laden Sie aus jedem der Multiplexzyklen eine Bilddatei hoch und geben Sie das Separatorzeichen für alle benannten Kanäle ein (z. B. ":").
4. Wählen Sie den Kanal aus, der für die Bildregistrierung verwendet werden soll, und das feste Bild, auf das alle anderen Bilder ausgerichtet werden. Es wird empfohlen, DAPI als treuhänderischen Marker zu verwenden, obwohl jeder gemeinsame benannte Kanal zwischen allen Zyklen verwendet werden kann.
5. Klicken Sie auf "Registrieren" und dann auf "Zusammengefasste Bild neu speichern und speichern".
6. Fahren Sie mit der Downstream-Analyse mit Ihrer bevorzugten Software fort. Weitere Informationen zur Bildverarbeitung und Registrierung finden Sie im ursprünglichen ^{IBEX-Protokoll 12,13}.

Results

Abbildung 1: Überblick über den Bex-Plex-Workflow.
Fixiertes gefrorenes Gewebe, das auf chromalumbeschichtete Objektträger geschnitten wurde, durchläuft bis zu 3 Zyklen Standard-IBEX, gefolgt von bis zu drei Zyklen RNAScope HiPlex, wobei der erste Zielrückgewinnungsschritt bei 60°C für 1 Stunde durchgeführt wird. Bilder aus separaten Zyklen werden anschließend registriert und mit einem fiduzialen Marker (z. B. DAPI) ausgerichtet, um einen Multiplex-Datensatz für die nachgelagerte Analyse zu erstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Wir nutzten das oben beschriebene Protokoll, um das Tumormikroumfeld (TME) eines musinen pankreas-duktalen Adenokarzinoms (PDAC)-Modells zu profilieren (Abbildung 1). Eine Tumorlinie, isoliert aus Kras^LSL-G12D/+; Trp53^L/+; Pdx1-Cre; Rosa26^YFP/YFP (KPCY)-Mäuse, die spontan Bauchspeicheldrüsenkrebs entwickeln und viele der wichtigsten Merkmale des menschlichen PDAC wiederholen, wurden subkutan in die Flanke der C57BL/6-Mäuse⁷ injiziert. Tumortragende Mäuse wurden anschließend mit einer Kombinationsimmuntherapie behandelt, bestehend aus Anti-PD-1 (i.p. 200 μg•^maus-1, RMP1-14) und Anti-CTLA-4 (i.p., 200 μg•maus-1, 9H10), die am 10. Tag nach der Einnistung verabreicht und alle 3 Tage bis zum Endpunkt des Experiments fortgesetzt wurde. Agonistisches Anti-CD40 (i.p., 100 μg•^maus-1, FGK45) wurde am Tag 13 nach der Implantation als einzelne Dosis verabreicht. Gemeinsam nennen wir dies "FPC", wie zuvor veröffentlicht7,16. Drei Tumore pro Versuchsgruppe wurden 16 Tage nach der Implantation gesammelt und fest eingefrorene Schnitte auf chromalunbeschichtete Objektträger für Bex-Plex montiert.

Abbildung 2: Repräsentative IBEX + RNAscope (Bex-Plex) Ergebnisse.
(A) Kombinierte IBEX- und RNAscope-Färbungen in Tumorabschnitten des pankreatalen ductalen Adokarzinoms (PDAC) zeigen die Kodetektion von Protein- und RNA-Zielen sowie die Ausrichtung von Fluoreszenzkanälen. Skalenbar, 10 μm. (B) Quantifizierung der Immunkompartimente von T-Zellen (CD3+ CD11b-), Makrophagen (CD11b+ CD68+) und myeloiden (CD11b+ CD68- Ly6G +/-) Immunkompartimenten basierend auf Proteinmarker-Kanalintensitäten. Diagramme zeigen die mittlere Zelldichte für jeden Zelltyp nach Behandlungsgruppe, n=3 Tumore. (C) Quantifizierung von Pdl1 - und Il10-Transkriptexprimierenden Zellen in den zuvor durch das Protein identifizierten Immunkompartimente. Diagramme zeigen die mittlere Zelldichte nach Behandlungsgruppe, n=3 Tumore. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ein Zyklus der Proteinfärbung wurde an drei mit FPC behandelten und drei isotyp-behandelten Tumoren durchgeführt, um die Auswirkungen auf myeloide Linienzellen zwischen den Behandlungsgruppen zu bewerten. Sieben Parameter wurden erfasst, wobei wir uns hier auf drei interessante Marker konzentrieren: CD11b, Ly6G und CD68 (Abbildung 2A). Nach der Bildaufnahme wurden die Fluorophore aus der Proteinfärbung gebleicht und eine Runde RNAscope mit Sonden gegen Il10 und Pdl1 durchgeführt (Abbildung 2A). Die separaten Bilder wurden dann mit DAPI als Fiducial ausgerichtet (Abbildung 2A). Die quantitative mittlere Fluoreszenzintensität von CD11b, CD68, Ly6G und CD3 zeigte einen Trend zu weniger Makrophagen und myeloiden Zellen in FPC-behandelten Tumoren im Vergleich zu Kontrollgruppen (Abbildung 2B). Quantitative Vergleiche wurden über alle Stichproben hinweg durchgeführt, und die Daten werden als Mittelwerte präsentiert. Darüber hinaus zeigte die Anzahl der Zellen, die Pdl1, Il10 oder eine Kombination beider Transkripte sowohl im Makrophag- als auch im myeloiden Kompartiment exprimieren, einen Abwärtstrend bei der FPC-Behandlung im Vergleich zu Kontrollgruppen (Abbildung 2C). Diese Ergebnisse deuten auf eine mögliche Verringerung immunsuppressiver Zellpopulationen nach der Behandlung hin, was mit den erwarteten biologischen Reaktionen übereinstimmt.

Abbildung 3: Optimierung der Zielrückgewinnungsbedingungen für die Kernkonservierung.
(A) Repräsentatives Bild eines Gewebes nach RT-Zielabnahme mit Kernschwellung und undeutlicher Morphologie. Beispiele für nukleare Größen werden durch gelbe Umrisse angezeigt. Skalenbar, 40 μm. (B) Repräsentatives Bild eines Gewebes nach modifizierter Zielabnahme mit verbesserter Kernmorphologie bei angepassten Temperaturbedingungen. Beispiele für nukleare Größe werden durch gelbe Umrisse angezeigt. Skalenbar, 40 μm. (C) Mittleres Kernvolumen, bestimmt durch DAPI-basierte Segmentierung an Geweben, die RT-Zielrückgewinnung (nicht vorgewärmt), 60°C vorgewärmte Zielrückholung oder unter Standard-IF-Bedingungen ohne Zielrückgewinnung durchlaufen haben. Diagrammstäbe zeigen den Mittelwert an, und Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. P < 0,0001 durch gewöhnliche Einweg-ANOVA (Sternchen bezeichnen die statistische Signifikanzschwelle); n= 1639 Zellen pro Bedingung. (D) Heatmaps, die die Korrelationswerte zwischen drei Bildern vor und nach der Bildausrichtung darstellen. Korrelationswerte werden für eine erfolgreiche Registrierung und eine Registrierung, die aufgrund von Unterschieden auf nuklearer Ebene nicht übereinstimmte, angezeigt.

Wichtig ist, dass bei der Durchführung von Bex-Plex ohne die beschriebene modifizierte Zielgewinnung die Kerne mit undeutlichen Kanten im Vergleich zu den Kernen eines Gewebes vergrößert wirkten, bei denen die modifizierte Zielgewinnung korrekt durchgeführt wurde (Abbildung 3A und B). Die Verwendung des Raumtemperatur-Zielrückgewinnungsregents führte zu einem Anstieg des mittleren Kernvolumens um 33 % basierend auf DAPI-Färbung im Vergleich zur Zielrückgewinnung mit einem Reagenz, das auf 60 °C voraufgewärmt war (Abbildung 3C). Kernmengenmessungen wurden aus repräsentativen Feldern über Proben hinweg mittels DAPI-basierter Segmentierung gewonnen. Außerdem unterschied sich bei 60°C mit vorgewärmtem Rückgewinnungsreagenz das mittlere Kernvolumen nach der Standard-IF-Färbung nicht signifikant vom mittleren Kernvolumen ( Abbildung 3C). Da DAPI der effektivste Parameter als Referenz für die Bildausrichtung ist, verdeutlicht dieser Vergleich (Abbildung 3) die entscheidende Bedeutung der modifizierten Rückgewinnungsparameter zur Erhaltung der nuklearen Morphologie. Eine korrekte Bildregistrierung wird durch einen Ausrichtungskorrelationsscore angezeigt, der nahe bei 1 liegt und die Ähnlichkeit zwischen Bildern verschiedener Zyklen anzeigt (Abbildung 3D, vor vs. erfolgreich).

Eine erfolgreiche Umsetzung des Protokolls zeigt sich durch erhaltene Kernmorphologie, ein starkes und spezifisches RNA-Signal sowie eine genaue Ausrichtung von Protein- und RNA-Kanälen. Im Gegensatz dazu können suboptimale Ergebnisse eine nukleare Verzerrung, schwaches oder diffuses RNA-Signal sowie eine Fehlausrichtung zwischen Bildgebungszyklen umfassen (Abbildung 3D, vor vs fehlgeschlagen). Wie in Abbildung 3C gezeigt, sollte die Kernmorphologie während des gesamten Protokolls beibehalten bleiben und sowohl qualitativ als auch quantitativ erkennbar sein. Vor der Implementierung von Bex-Plex sollten Nutzer die Grundwahrheit für ihr interessiertes Gewebe durch separate Protein- und RNA-Färbungen ermitteln. Dies gewährleistet nicht nur eine optimierte Protein- und RNA-Färbung für die Zielgewebe, sondern liefert auch relevante räumliche Muster, die bei der Kombination für Bex-Plex beibehalten werden sollten. Zum Beispiel kolokalisiert CD11b sowohl mit CD68 als auch mit Ly6G und zeigt zellmembranlokalisierte Färbung (Abbildung 2A). Dies ist zu erwarten, da CD11b ein pan-myeloider Zellmarker ist und CD68 sowie Ly6G Marker für die myeloiden Makrophagen- und Neutrophilen-Myeloid-Untergruppen. Der erfolgreiche RNA-Nachweis zeichnet sich durch deutliche Punktationssignale aus, die auf einzelne Zellen lokalisiert sind, während suboptimale Ergebnisse als schwache oder diffuse Färbung auftreten können. Das RNA-Sondensignal sollte je nach Transkriptfunktion eine Lokalisierung im und um den Kern zeigen. Strukturelle Proteinmarker wie Vimentin könnten einbezogen werden, um die zelluläre Auflösung der Transkriptlokalisierung zu verbessern, indem Zellmembranen in komplexen Geweben freigelegt werden. Negative oder Kontrollproben werden voraussichtlich nur minimale Hintergrundfärbungen zeigen und kein unspezifisches Sondensignal, was die Spezifität sowohl des Protein- als auch der RNA-Detektion bestätigt.

Discussion

Der Bex-Plex-Workflow integriert die iterative Proteinfärbungsplattform IBEX mit RNAscope-in-situ-Hybridisierung , um den gleichzeitigen Nachweis von Proteinen und RNA-Transkripten mit Einzelzellauflösung zu ermöglichen. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, eine reproduzierbare Methode für eine integrierte räumliche Analyse der Protein- und RNA-Expression in intakten Geweben bereitzustellen. Die Fähigkeit, sowohl die Protein- als auch die RNA-Expression im selben Gewebe zu messen, brachte zuvor technische Herausforderungen mit sich: hohe Kosten, komplexe Antigenrückgewinnungsschritte, begrenzte Multiplexkapazität, Auflösungsbeschränkungen (nicht-einzelzellig), nichtlineare Signalverstärkung und umfangreiche bioinformatische Pipelines für die nachgelagerte Verarbeitung ^17,18,19. Im Vergleich zu bestehenden Ansätzen wie Multiplex-Immunfluoreszenz, OPAL/TSA-Färbung und räumlichen Transkriptomik-Plattformen ermöglicht Bex-Plex reproduzierbare, quantitative und High-Plex-Simultanerkennung, während räumlicher Kontext und nuklearer Morphologie für eine genaue Bildausrichtung erhalten bleiben. Zusätzlich kann Bex-Plex in einer Standardlaborumgebung ausgeführt werden und erzeugt Daten mit einer Einzelzellauflösung, die einfach zu verarbeiten ist. Die Nutzung dieses Protokolls, um ein umfassendes Verständnis der Zell-Zell-Interaktionen in verschiedenen Gewebekontexten, wie etwa im Tumormikroumfeld, zu gewinnen, wird entscheidend sein, um wirksamere Immuntherapien zu entwickeln und die Patientenergebnisse über Krankheitszustände hinweg zu verbessern.

Unsere Methode wird an fixierten Geweben durchgeführt, die in OCT eingebettet sind, und folgt dem Standard-IBEX-Workflow ohne Modifikation, gefolgt von einem leicht veränderten RNAscope HiPlex-Protokoll. Ein wesentlicher Unterschied ist der Zielrückgewinnungsschritt zu Beginn des RNA-Hybridisierungsprozesses: Anstelle von 99 °C des Herstellers für 5 Minuten erfolgt die Rückgewinnung bei 60 °C für 1 Stunde. Diese Anpassung bewahrt die Kernarchitektur, die für eine genaue Bildausrichtung zwischen Protein- und RNA-Zyklen unerlässlich ist. Wichtige Schritte dieses Protokolls sind die Aufrechterhaltung einer konstanten Zielabruftemperatur, effizientes Fluorophorbleichen mit LiBH₄ sowie die Minimierung des RNA-Abbaus durch schnelle Verarbeitung und Einsatz von RNase-freien Reagenzien. Es ist äußerst wichtig, den Einsatz vorgewärmter Zielrückgewinnungsreagenzien bei 60°C sicherzustellen; Das Nichttun kann selbst mit dem veränderten Inkubationsschritt zu einer Kernschwellung führen.

Obwohl gezeigt wurde, dass 15 Minuten Inkubation mit LiBH₄ ausreichen, um viele häufig verwendete Fluorophore zu inaktivieren, wird empfohlen, diesen Prozess für jeden Proteinzyklus individuell zu überprüfen, bevor das gesamte Bex-Plex-Protokoll ausgeführt wird. In den ersten IBEX-Veröffentlichungen ist gut beschrieben, dass nicht alle IBEX-kompatiblen Flurophore gleich bleichfähig^sind. Außerdem hat unser Labor beobachtet, dass einige hochhäufige strukturelle Marker wie Vimentin eine längere Bleichzeit benötigen können. Die Bestätigung, dass die verwendeten Fluorophor- und Marker-Kombinationen ausreichend bleichen, sollte ein Überlaufen von Restsignalen in nachfolgende Protein- und RNA-Zyklen verhindern. Die IBEX-Community-Seite bietet ausgezeichnete Ressourcen für IBEX-kompatible Paneldesigns und ist speziell darauf ausgerichtet, die Belastung für neue Nutzer zu verringern, indem sie die Antikörperwirksamkeit und die Fluorophor-Bleichung mal²⁰ anzeigt. Darüber hinaus sollten iterative Färbungen und Bleichen die Qualität der RNA-Transkripte nicht beeinträchtigen, jedoch ist es wichtig, die Proteinzyklen so schnell wie möglich abzuschließen und RNAse-freie Reagenzien zu verwenden, um jeglichen RNA-Abbau im Laufe der Zeit zu minimieren. Ein Versäumnis bewirkt die Probe-Hybridisierung und führt zu einem verminderten Signal für alle durchgeführten RNAscope-Zyklen, insbesondere bei Transkripten mit geringer Häufigkeit. Häufige Probleme, die während des Protokolls auftreten, sind schwaches RNA-Signal, unvollständige Fluorophorbleichung und Fehlausrichtung zwischen Bildzyklen, die durch Optimierung der Färbungsbedingungen und Bildparameter gemildert werden können.

Es ist unerlässlich, die Zeit zwischen der Proteinfärbung und der RNA-Probe-Hybridisierung auf weniger als 5 Tage zu begrenzen. Bei der Durchführung von Bex-Plex auf mehreren Objektträgern wird dringend empfohlen, jeweils einen Objektträger zu verarbeiten, um die Variabilität des RNA-Abbaus zu verringern. Ebenso sollte die Zeit zwischen der Probe-Hybridisierung und der Bildgebung begrenzt werden. Obwohl wir bis zu 3 Tage nach der Verstärkung erfolgreich abgebildet haben, wird eine längere Lagerung nicht empfohlen. Wenn das Signal nach mehreren Zyklen der Färbung oder Hybridisierung reduziert ist, kann es notwendig sein, die Geschwindigkeit während des gesamten Protokolls zu erhöhen. Idealerweise empfehlen wir, so schnell wie möglich zu arbeiten, da Verzögerungen die RNA-Integrität verringern und die Amplifikation verringern können. Weitere Ansätze umfassen die Reduzierung der Anzahl der durchgeführten Proteinzyklen, um sie leichter in die Zeitrahmen des Protokolls einzufügen, oder die Änderung des RNA-Probe-Paneldesigns, um Ziele mit höherer Häufigkeit einzubeziehen. Bevor IBEX und RNAscope kombiniert werden, validieren Sie die Antikörper- und Sondenpanels für jeden Zyklus separat, um die erwartete Signalqualität für jeden Zyklus zu bestimmen. Im Falle einer Kernanschwellung nach der Zielgewinnung ist es möglich, dass das Ziel-Rückgewinnungsreagenz nicht richtig vorgewärmt wurde. Stellen Sie sicher, dass das Rückgewinnungsreagenz nach dem Verdünnen und Vorwärmen auf 60 ^°C nicht abkühlen darf und dass die Temperatur während der 1-stündigen Inkubation auf der Rutsche konstant bleibt. Schließlich, wenn Bildregistrierung und Ausrichtung ohne Kernschwellung fehlschlagen, bedeutet das, dass es eine Diskrepanz bei Bildaufnahmeparametern wie Bittiefe, Voxelgröße oder Z-Position über Zyklen hinweg gab. Im Falle solcher Fehler kann es notwendig sein, das Protokoll mit Anpassungen dieser Einstellungen zu wiederholen, damit sie konsistent bleiben. Diese Fehlerbehebungsstrategien sind unerlässlich, um Reproduzierbarkeit und Konsistenz zwischen den Experimenten sicherzustellen.

Die von Bex-Plex erzeugten Daten ermöglichen einen tiefgehenden Überblick über die räumliche Landschaft von Geweben auf einer zuvor unerreichbaren Ebene. Eine wesentliche Einschränkung dieses Protokolls ist jedoch, dass die Gesamtzahl der möglichen iterativen Proteinzyklen aufgrund der allmählichen RNA-Degradation über die Zeit geringer ist als bei IBEX allein. Obwohl bis zu 6 Zyklen Standard-IBEX durchgeführt wurden, empfehlen wir nicht mehr als 3 Zyklen Proteinfärbung für Bex-Plex. Dennoch berücksichtigt das Protokoll die maximale Anzahl von RNAscope-Zyklen, und dieses Multiplex-Tiefenniveau ist für die meisten Anwendungen ausreichend.

Weitere Einschränkungen sind Variabilität zwischen Gewebetypen sowie mögliche Autofluoreszenz- oder Färbungsartefakte, die die Signalinterpretation beeinflussen können. Empfindlichere Gewebe können weniger Zyklen aufrechterhalten, und verschiedene Gewebetypen können einzigartige Eigenschaften haben, die die Färbung beeinflussen. Diese Einschränkungen können durch Einzelzyklus-Färbungen von Protein oder RNA bewertet und vor der Durchführung von Bex-Plex behandelt werden. Das Schneiden auf chrom-alum-beschichtete Objektträger verbessert die Gewebehaftung und die strukturelle Integrität erheblich, aber Autofluoreszenz ist bei allen immunfluoreszenzbasierten Techniken eine Rolle. Darüber hinaus wurde das Protokoll derzeit nicht in FFPE- oder humanen klinischen Proben validiert und erfordert weitere Optimierungen für solche Anwendungen. Da IBEX und RNAscope jedoch überwiegend an formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Geweben durchgeführt werden, ist es möglich, dass Bex-Plex auf diese Probentypen ausgeweitet werden kann. Eine erfolgreiche Implementierung erfordert eine weitere Optimierung der Antigenrücknahme und möglicherweise gezielte Rückgewinnungsschritte zur Erhaltung der RNA-Qualität.

Insgesamt bietet Bex-Plex eine einfache, kostengünstige und breit zugängliche Methode für High-Plex-Raumanalysen. Diese Methode eignet sich besonders gut für Anwendungen wie die Analyse von Tumor-Mikroumgebungen, Immunzellprofilierung und räumliche Kartierung von Signalwechselwirkungen. Diese integrierte Sichtweise verbessert die Fähigkeit, Mechanismen der Immunregulation, Tumorheterogenität und therapeutische Responsivität in einer Vielzahl experimenteller Modelle zu hinterfragen. Bex-Plex ist von unschätzbarem Wert für Kontexte, in denen es notwendig ist, das Übersprechen zwischen Zellen im intakten Gewebe zu untersuchen, etwa im Tumormikroumfeld oder in anderem Gewebe während Entzündung und Homöostase. Insbesondere wird die Fähigkeit, räumliche Dynamiken der Zytokin-Signalübertragung durch das Untersuchen der Transkripte kurzlebiger Moleküle in Verbindung mit phänotypischen Proteinmarkern zu erkennen, ein tieferes Verständnis der zellulären Interaktionen über Krankheitszustände hinweg ermöglichen. Zukünftige Verbesserungen könnten eine Erhöhung der Multiplexkapazität, die Integration mit automatisierten Bildanalyse-Pipelines und die Anpassung für klinische Biopsieproben durch Erweiterung des Arbeitsablaufs um FFPE-Gewebe umfassen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml Microzentrifugenröhrchen	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 proof EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC Puffer	Invitrogen	AM9765
24-Well-Platten
Alexa Fluor 488 anti-Maus CD11b Antikörper	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 anti-Maus CD3e Antikörper	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 anti-Maus Ly6G Antikörper	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 anti-Maus CD68 Antikörper	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm Fixierungs- und Permeabilisierungslösung	BD	554722
Chrome alum gelatin	Fisher	NC1692262
Konfokalmikroskop (z.B. Leica Stellaris)
Kryokuvetten	VWR	25608-922
Kryostat (z.B. CryoStar NX50 Kryostat)	Thermofisher Scientific	957100
Kryostatklingen (z.B. Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Seziermikroskop (z.B. Zeiss SteREO Discovery.V8)
Sezierwerkzeuge
Trockeneis
Tauchbecken für Objektträgerfärbung (z.B. Simport Scientific EasyDip Slide Staining Jars)	Fisher Scientific	22-038-489
Fluomount-G	Fisher	OB10001
Beheiztes Wasserbad
Histologie-Pinsel (z.B. Ted Pella Kamelhaarpinsel)	Fisher Scientific	NC2023341
Hybridisierungsofen (z.B. HybEZ II Hybridisierungssystem)	ACD	321710
Bildanalysesoftware der Wahl
ImmEdge Hydrophobe Barriere PAP Stift	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
Lithiumborhydrid	STREM Chemicals	93-0397
Mikropipetten (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Mini-Mikrozentrifuge (z.B. Corning LSE Mini-Mikrozentrifuge)	Corning	6770
Mouse BD Fc Block	BD	553142
Nr. 1,5 Deckglas	VWR	48393-241
Pipettenspitzen (P-10, P-20, P-200, P-1000)
RNAscope HiPlex Sonde, mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex Sonde, mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 Reagenzien-Kit v2 (inklusive Detektions-Kit, Cleaving-Standardlösung, Proteasereagenzien, Zielabruf-Reagenzien und Waschpuffer)	ACD	324409
RNAscope Protease III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITK Software: https://github.com/niaid/sitk-ibex
Objektträger-Färbetablett/Luftfeuchtigkeitskammer
Saccharose Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus Mikroskop-Objektträger	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Tween-20, Molekularbiologie-Qualität	Promega	H5152
UltraPure DNase/RNase freie Wasser	Fisher Scientific	10977023