Method Article

Ein Hypoxie-Reoxygenierungs-Verletzungsmodell bei selbstassemblierenden menschlichen Kardioiden

DOI:

10.3791/70310

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March 17th, 2026

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1Division of Cardiology, Department of Medicine, Duke University School of Medicine, 2Department of Pathology, Duke University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Selbstassemblierende menschliche Herzorganoide (hCOs) sind ein aufkommendes System zur Modellierung der menschlichen Herzentwicklung und -erkrankungen. Hier wird eine Methodik zur Erzeugung und Verletzung von hCOs mit Hypoxie-Reoxygenierung sowie Details zu den erwarteten histologischen und funktionellen Ergebnissen nach der Verletzung dargestellt.

Abstract

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Ohne schnelle Revaskularisation führt eine ischämische Herzerkrankung zu irreversiblem Verlust der Kardiomyozyten, Narbenbildung und verminderter Herzfunktion. Die Fähigkeit, Hypoxie-Reoxygenierungsverletzungen zu modellieren und potenzielle therapeutische Interventionen im menschlichen Gewebe zu bewerten, ist ein unerfüllter Bedarf. Menschliche kardiale Organoide (hCOs) sind ein aufkommendes Modellsystem, aber der Beginn der Arbeit mit hCOs kann aufgrund ihrer geringen Größe, der Anforderungen an die Suspensionskultur und der Variabilität der Differenzierungseffizienz schwierig sein. Dieses Protokoll bietet einen benutzerfreundlichen Leitfaden zur Erzeugung und Wartung von menschenähnlichen, selbstassemblierenden hCOs; Methoden zur Verarbeitung und histologischen Analyse von hCOs; und ein Ansatz zur Verletzung von HCOs mit Hypoxie-Reoxygenierung, die die Fibrose und Apoptose bei menschlicher Ischämie/Reperfusion nachahmt. Dieses Protokoll bietet Hinweise zur Verwendung von hCOs als Ergänzung zu Tiermodellen von Ischämie-Reperfusionsverletzungen und könnte verwendet werden, um Faktoren zu identifizieren und zu testen, die die menschliche Myokarderholung fördern können.

Introduction

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Die ischämische Herzkrankheit ist weltweit eine der führenden Ursachen für Morbidität und Mortalität und betrifft allein in den Vereinigten Staaten mindestens 20,5 Millionen Menschen – 1,2,3. Ohne ausreichende Perfusion führt eine anhaltende Hypoxie zum Tod von Kardiomyozyten (CM) und zu einer Myokardialfunktionsstörung. Myokardischämie wird hauptsächlich durch Revaskularisation durch perkutane Intervention, thrombolytische Therapie oder koronare Bypass-Transplantation behandelt. Die Revaskularisation ist jedoch ein zweischneidiges Schwert und kann durch die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies 4,5 zusätzliche Verletzungen verursachen. Obwohl Reperfusionsstrategien äußerst erfolgreich waren, waren Ansätze zur Begrenzung des CM-Verlusts während ischämischer Verletzungen oder nach der Reperfusion schwer zu fassen. Obwohl viele Versuche, infarktisches Gewebe zu retten, in Tiermodellen der Ischämie-Reperfusion wirksam sind, konnten diese Therapien in Humanstudien weitgehend keinen nennenswerten Nutzen erzielen, was den Bedarf an menschlichen Modellen zur Bewertung von CM-schonenden oder auffüllenden Therapeutika 6,7,8,9,10,11,12 erhöht.

Menschliche Plattformen, die zur Modellierung der Herzverletzung verwendet werden, umfassen Primärgewebe und menschlich induzierte pluripotente Stammzellensysteme (hiPSC)-abgeleiteteSysteme 13,14. Da primäre Gewebe durch die Probenverfügbarkeit eingeschränkt sind, haben sich hiPSC-Systeme als dominierende menschliche Plattform für die Modellierung kardialer Erkrankungen etabliert, mit dem deutlichen Vorteil, genetisch behandelbar und skalierbar zu sein 15,16,17,18,19. Traditionelle 2D-hiPSC-abgeleitete Kardiomyozytenkulturen (hiPSC-CM) sind durch die Unreife der resultierenden CMs, das Fehlen komplexer Gewebearchitektur und die Unfähigkeit, die volle zelluläre Vielfalt im menschlichen Herzen15,20 zu reproduzieren, begrenzt. Um diese Schwächen zu beheben, werden immer mehr entwickelte 3D-Herzgewebe (EHTs) eingeführt: 20,21,22,23,24,25,26. EHT-Ansätze umfassen das Mischen vordifferenzierter Herzzellen zu Sphäroiden24 oder das Einsetzen differenzierter Herzzellen in Gerüste oder Formen 21,22,27. Obwohl EHTs heterotypische zelluläre Interaktionen besser modellieren können und eine relativ höhere Reife als 2D-Kulturen aufweisen, schränken die Anforderungen an maßgeschneiderte Gerüste oder Bioreaktoren zur Herstellung und Wartung von EHTs derzeit ihre Skalierbarkeitauf 21,27,28 ein.

Selbstassemblierende kardiale Organoide (hCOs), oder Kardioide, sind ein neues und leistungsfähiges in-vitro-Modellsystem für den Menschen 20,25,26,29. hCOs haben mehrere Vorteile. Erstens können sie mehrere Zelltypen umfassen, darunter Endothelzellen, Fibroblasten und Epikardzellen, ohne dass mehrere spezialisierte Differenzierungsprotokolle erforderlich sind. Zweitens findet der Großteil ihrer Differenzierung in 3D-Suspensionskulturen statt, wodurch die Anforderungen für spezialisierte Formen oder Gewebematrix 25,26,29,30 überflüssig werden. Schließlich besitzen hCOs eine stereotype kugelförmige Morphologie mit einer zentralen Kavität, was morphologische Analysen ermöglicht. Daher besitzen hCOs eine Skalierbarkeit ähnlich wie 2D-Kultursysteme, behalten jedoch einen Teil der Gewebekomplexität von EHTs. hCOs wurden für Arzneimitteltoxizitätstests, patientenspezifische Krankheitsmodellierung und zur Modellierung von Aspekten der Herzentwicklungverwendet: 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Obwohl vielversprechend, haben hCOs im Vergleich zu EHTs mehrere Einschränkungen, darunter die Unfähigkeit, den Kraftoutput direkt zu messen. Außerdem gibt es in den beschriebenen hCO-Modellen keine native Immunzellpopulation, obwohl es möglich ist, hCOs mit Makrophagen zu besiedeln. Dennoch sind hCOs ein aufkommendes und sich schnell entwickelndes menschliches Modellsystem 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.

Bis heute war die Modellierung von Herzverletzungen mit hCOs begrenzt. Ein Kryoverletzungsmodell wurde beschrieben, aber die Verletzungen sind sehr variabel, und die Notwendigkeit, hCOs einzeln zu verletzen, begrenzt die Skalierbarkeitum 29. Dieses Manuskript beschreibt ein benutzerfreundliches Protokoll zur Erzeugung und Verletzung selbstassemblierender HCOs mit Hypoxie-Reoxygenierungs-(H/R)-Verletzungen. Im Vergleich zu anderen Protokollen zur Erzeugung von hCOs verwendet dieses Protokoll ein vereinfachtes Differenzierungsmedium und integriert die von Hofbauer et al.29 beschriebene 2D-3D-Mesoderm-Differenzierungsstrategie. Das Protokoll für H/R-Verletzungen kann jederzeit nach Beginn der HCOs durchgeführt werden, was typischerweise um den Differenzierungstag 8 (D8) zu D11 geschieht. Die H/R-Dauer kann zwischen 6 und 24 Stunden getitert werden, um das gewünschte Verletzungsniveau zu erreichen, das von minimalem bis nahezu vollständigem Blasenverlust reicht. Außerdem entwickeln HCOs stereotypisch einen kollagenen Kern mit Vimentin+- Zellen nach einer H/R-Verletzung, der ebenfalls mit der H/R-Dauer in der Schwere skaliert. Dieses hochdurchgängige, skalierbare hCO-Modell von H/R-Verletzungen kann potenziell den Bedarf für menschliche Modelle adressieren, um neue therapeutische Wege zur Förderung der CM-Genesung oder -Regeneration nach einer Verletzung zu entwickeln und zu testen.

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Protocol

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Alle Verfahren zum Umgang mit menschlichen Zelllinien sollten lokalen Biosicherheitsprotokollen folgen. Alle Experimente wurden mit der iPSC-Zelllinie DU11 durchgeführt, die aus gesunden neugeborenen männlichen Fibroblasten der iPSC-Kernanlage der Duke University gewonnen wird.

1. Erzeugung von hCOs

HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt ein Standardprotokoll zur Erzeugung von hCOs aus iPSCs (Abbildung 1). Alle in diesem Protokoll beschriebenen Schritte sollten in einer laminaren Flusshaube durchgeführt werden, um die Sterilität zu gewährleisten. Siehe Tabelle 1 für Rezepte zur Differenzierung von Medien.

TagBestandskonzentrationArbeitsschwerpunktVerdünnungsfaktorBasismedien
D010 mM CHIR9902110 μM CHIR990211:1000RPMI-1640, 2 % B27 minus Insulin
100 mg/mL Ascorbinsäure50 μg/mL Ascorbinsäure1:2000
10 mg/mL Activin A60 ng/mL Activin A1:167
D15 mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, 2 % B27 minus Insulin
100 mg/mL Ascorbinsäure50 μg/mL Ascorbinsäure1:2000
D25 mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, 2 % B27 minus Insulin
100 mg/mL Ascorbinsäure50 μg/mL Ascorbinsäure1:2000
10 mM Thiazovivin2 μM Thiazovivin1:5000
D35 mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, 2 % B27 minus Insulin
100 mg/mL Ascorbinsäure50 μg/mL Ascorbinsäure1:2000
D45mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, 2 % B27 minus Insulin
D6+N/AN/ARPMI-1640, 2 % B27 plus Insulin

Tabelle 1: Differenzierungsmedientabelle. Lagerkonzentrationen, Arbeitskonzentrationen und Verdünnungsfaktor für jeden Differenzierungsfaktor an den Differenzierungstagen 0–6. Bereiten Sie alle funktionierenden Lösungen zum Zeitpunkt der Fütterung frisch vor.

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Abbildung 1: Schaltplan der hCO-Differenzierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

  1. iPSC-Wartung
    1. Decken Sie den Boden jeder Mulde einer 12-Well-Platte vollständig mit einer Basalmembranmatrix im Verhältnis 1:100 ab, verdünnt in kaltem DMEM/F12-Medien. Inkubieren Sie behandelte Platten bei 37 °C 1 Stunde lang, um die Polymerisation zu ermöglichen. Wenn sie nicht sofort verwendet werden, können die Platten mit einer Folie versiegelt und bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert und mindestens 60 Minuten bei 37 °C inkubiert werden.
  2. Differenzierungstag -3 (D-3): Platten iPSCs für die anschließende Differenzierung
    1. Bereiten Sie Basalmembran-matrixbeschichtete Platten wie in Schritt 1.1.1 beschrieben vor.
    2. Aspiratiere Wartungsmedien aus der iPSC-Kultur und gib genügend Zellabtrennungslösung hinzu, um die Zellen vollständig zu bedecken (~500 μL pro Bohrloch einer 12-Well-Platte oder 1 mL pro Bohrloch einer 6-Well-Platte). Inkubiere bei 37 °C für 5 Minuten.
    3. Gib jedem Brunnen ein gleiches Volumen iPSC-Wartungsmedium hinzu und klopfe vorsichtig auf die Platte, um die Zellen zu lösen. Kippen Sie die Platte zu sich hin und pipieren Sie vorsichtig auf und ab über den Boden des Brunnens, um die adhärenten Zellen weiter zu lösen, nicht mehr als dreimal. Verwenden Sie eine Pipette, um die Zellsuspension in ein 15-mL konisches Rohr zu bringen.
    4. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 3 Minuten bei Raumtemperatur in einer Schwing-Eimer-Zentrifuge. Aspiratieren Sie das Supernatant und lassen Sie die Zellen vorsichtig in 1 ml iPSC-Pflegemedium wieder suspendieren.
    5. Bewegen Sie 10 μL der Zellsuspension in ein neues 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr. Gib 10 μL Trypan Blue hinzu und rühre mit einer Pipette. Gib 10 μL der iPSC/Trypan-Blau-Mischung zum Hämozytometer und zähle lebende Zellen.
    6. Verdünnen Sie die Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 100.000–200.000 Zellen/mL im iPSC-Pflegemedium mit ROCK-Inhibitor (ROCKi). Fügen Sie jedem Brunnen einer 12-Well-Platte, die mit einer Basalmembranmatrix beschichtet ist, 1 ml/Brunnen der Zellsuspension hinzu.
      HINWEIS: Die Beschichtungsdichte vor der Differenzierung hängt von der Wachstumsrate einer bestimmten Zelllinie ab. Die Beschichtungsdichte muss möglicherweise für jede iPSC-Linie angepasst werden. Die ROCKi-Konzentration muss je nach verwendeter Marke und Formulierung möglicherweise getitriert werden.
  3. Differenzierung D-2: Austausch von Medien zur Entfernung von ROCKi
    1. Tausche Medien gegen 1 ml frisches iPSC-Wartungsmedium aus, ohne ROCKi. Die Zellen sollten beginnen, kleine Kolonien zu bilden. Die Kolonien sollten flach aussehen (Abbildung 2A). Wenn Zellen kopfsteinartig, dünn oder verlängert aussehen, ist dies ein Zeichen für spontane Differenzierung, und die Effizienz der Differenzierung kann beeinträchtigt werden.
  4. Differenzierung D-1: Inkubieren Sie weiterhin Zellen ohne Behandlung.
  5. Differenzierung D0: Beginn der Differenzierung und Mesoderm-Induktion
    1. Mit einem Mikroskop wird die Zelldichte überprüft, um eine Konfluenz von 70 % bis 90 % zu gewährleisten (Abbildung 2B) zum Zeitpunkt der Differenzierung. Bei Subkonfluenz füttere die Zellen mit iPSC-Wartungsmedium und warte 24 Stunden. Wenn die Zellen zu konfluent sind, spalten Sie die Zellen wie in Schritt 1.2
    2. Bereiten Sie 12 mL pro 12-Well-Platte D0-Mesoderm-Induktionsmedium vor (10 μM CHIR99021, 50 μg/mL Ascorbinsäure, 60 ng/mL Activin A in RPMI-1640 mit 2 % B27-Präparat minus Insulin (RB-)).
    3. Entfernen Sie das vorhandene Medium und ersetzen Sie durch 1 ml/Brunnen D0-Mesoderm-Induktionsmedium. Beachten Sie die Zeit des Medienaustauschs.
  6. Differenzierung D1: Spezifikation des kardialen Mesoderms
    1. Genau 24 Stunden nach der Zugabe des D0-Mesoderm-Induktionsmediums wird das Medium gegen das D1-Herzmesoderm-Spezifikationsmedium ausgetauscht (5 μM IWP2, 50 μg/mL Ascorbinsäure in RB).
  7. Differenzierung D2: hCO-Bildung
    1. Fügen Sie genügend Zelldissoziationsreagenz hinzu, um die Zellen zu bedecken, und inkubieren Sie bei 37 °C für 5 Minuten (Abbildung 2C). Fügen Sie jedem Brunnen ein gleiches Volumen D2-Herzmesodermmedium hinzu und pipieren Sie vorsichtig auf und ab, um die haftenden Zellen freizusetzen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-mL konisches Rohr.
    2. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 3 Minuten bei Raumtemperatur. Resuspendiere in 1 mL D2-Membran der kardialen Mesoderm-Spezifikation (5 μM IWP2, 50 μg/mL Ascorbinsäure in RB-).
    3. Nimm 10 μL Zellsuspension und gib 10 μL Trypanblau dazu. Zähle Zellen mit einer beliebigen Methode. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 100.000 Zellen/mL in D2-Herzmesoder-Spezifikationsmedien mit 2 μM Thiazovivin. Verwenden Sie 10 ml der Zellsuspension pro 96-Well-Ultra-Low-Befestigungsplatte.
    4. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein entsprechend großes Reagenzreservoir und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 100 μL an jede Bohrung einer ultraniedrigen Anheftungsplatte mit 96 Wellen zu übertragen, was eine Endkonzentration von 10.000 Zellen pro Brunnen erreicht.
    5. Um die hCO-Bildung in der Suspensionskultur zu induzieren, zentrifugieren Sie Platten mit 500 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation gibt es ein großes Pellet von Zellen (Abbildung 2D) – wenn dieses Pellet nicht begrenzt ist, wird die Zentrifugation wiederholt.
      HINWEIS: Nicht alle Zellen werden in das hCO integriert, das als abgegrenztes Zellpellet erscheint, wobei einzelne Zellen auf der Hellfeldmikroskopie sichtbar sind. Einige einzellige Ablagerungen in der Platte um das hCO sind normal.
  8. Differenzierung D3: Zugabe von Medien zur Verdünnung von ROCKi
    1. Bereiten Sie pro Platte 10 ml D3-Medium (5 μM IWP2, 50 μg/mL Ascorbinsäure in RB-) vor. Mit einer Mehrkanal-Pipette fügen Sie 100 μL D3-Medium zu jedem Brunnen hinzu, ohne ein Medium zu entfernen.
      HINWEIS: In diesem Stadium haben sich die hCOs zu einem dunklen, gut abgegrenzten Sphäroid verdichtet. Einzelne Zellen werden nicht sichtbar sein (Abbildung 2E).
  9. Differenzierung D4: Umstellung auf D4-Medien
    1. Entfernen Sie 100 μL D3-Medien und ersetzen Sie sie durch 100 μL D4-Medien (5 μM IWP2 in RB-). Um das Aspirationsrisiko zu verringern, kippen Sie die Platte zu sich hin in einem Winkel von etwa 45° und halten Sie eine Mehrkanalpipette in einem etwa 90° Winkel relativ zur Seitenwand der Platte. Stellen Sie die Mehrkanalpipette fest an die Seitenwand des Brunnens und saugen Sie langsam 100 μL Medien ab, wobei Sie die Pipettenspitzen intermittierend auf aspirierte HCOs überprüfen.
      HINWEIS: HCOs befinden sich in der Suspensionskultur, und das Aspirieren von hCOs während der Entfernung des Mediums ist üblich. Um das Aspirationsrisiko zu verringern, kippen Sie die Platte in einem Winkel von etwa 45° zu sich hin und halten Sie eine Mehrkanal-Pipette in einem etwa 90° Winkel relativ zur Seitenwand der Platte. Stellen Sie die Mehrkanal-Pipette fest an die Seitenwand des Brunnens und saugen Sie langsam 100 μL Medien an, wobei Sie intermittierend die Pipettenspitzen auf aspirierte HCOs überprüfen.
    2. Ersetze sie durch 100 μL D4-Medien.
  10. Unterscheidung D6: hCO-Wartungsmedium
    1. Entfernen Sie 100 μL des D4-Mediums und ersetzen Sie es durch 100 μL D6+-Medien (RPMI-1640 mit 2 % B27 Supplement (RB+)).
  11. Differenzierung D8
    1. Tauschen Sie weiterhin alle 2 Tage das Medium, indem Sie 100 μL entfernen und durch 100 μL frisches D6+-Medium ersetzen. hCOs sollten größer werden, glatte Kanten behalten und beginnen, sich um D6-11 zu schlagen, wenn sie erfolgreich differenziert sind (Abbildung 2F). hCOs werden weiterhin als dunkle, gut abgegrenzte Sphäroide erscheinen, und einzelne Zellen werden nicht sichtbar sein.

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Abbildung 2: Zeitleiste der hCO-Differenzierung. Zeitleiste der Organoid-Differenzierung. (A) iPSC-Kolonien 1 Tag vor Differentiationsinitiierung (D-1). Beachten Sie deutliche, flach wirkende Kolonien. (B) iPSCs am Tag der Differentiationsinitiierung (D0) bei ~90 % Konfluenz. (C) Organoid bei Differenzierung D2 unmittelbar nach der Organoidbildung in einer 96-Well-Ultra-Low-Haftplatte. Arrow bezeichnet ein Beispiel für nadelförmige IWP2-Kristalle. (D) Organoide bei Differenzierung D3. Beachten Sie eine signifikante Organoidverdichtung durch die Bildung von Zell-Zell-Übergängen; Einige nicht eingearbeitete Zellreste sind in diesem Stadium normal. (E) Organoide bei Differenzierung D10. (F) Pfeil zeigt eine iPSC-Kolonie mit verlängerten, dünnen Zellen mit Kopfsteinpflaster-Aussehen an, was auf eine mögliche spontane Differenzierung hinweist. Maßstabsleiste = 1000 μm für die Panels A-E, Maßstabsleiste = 400 μm für Panel F. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Erfassung und Fixierung von hCOs zur Immunfärbung

  1. Mit einer 1000-μl-Pipette ohne Spitze werden die HCOs in eine 1,7-mL Mikrozentrifugenröhre übertragen. Sobald alle HCOs übertragen sind, warten Sie, bis die HCOs zum Boden des Rohrs gesunken sind, und entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Medien. Wasche die HCOs einmalig mit PBS, warte ein paar Sekunden, bis die HCOs auf den Boden der Tube gesunken sind, und entferne vorsichtig überschüssiges PBS.
  2. Fixiere hCOs mit 4 % PFA für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Einige Antikörper benötigen möglicherweise eine Aceton- oder Methanolfixierung für optimale Leistung. Siehe die Herstellerrichtlinien.

3. Ganzmontage-Immunfärbung

  1. Übertragen Sie die gewünschte Anzahl fester HCOs auf ein 1,7-mL Mikrozentrifugenrohr. Entferne die fixierende Lösung und wasche mit PBS mit 0,1 % Tween-20 (PBS-T).
    1. Um HCOs zu waschen, entferne so viel wie möglich von dem überschüssigen Fixativ. Achte darauf, die HCOs am Boden des Rohrs nicht zu stören. Gib ~1 ml PBS-T hinzu und warte ein paar Sekunden, bis die HCOs auf den Boden des Rohrs gesunken sind, bevor du zum nächsten Schritt übergehst.
  2. Verdünnen Sie den primären Antikörper auf eine gewünschte Konzentration in einer Färbelösung (10 % neonatales Kalbserum, 1 % DMSO in 0,1 % PBS-T). Fügen Sie 50–100 μL primäre Antikörperlösung pro Mikrozentrifugenröhre hinzu (also genug Volumen, um alle HCOs in jedem Röhrchen abzudecken).
  3. Inkubiere 24 Stunden bei 4 °C auf einem Shaker/Rocker. Entfernen Sie überschüssige primäre Antikörper und führen Sie dann drei 1-stündige Waschgänge in PBS-T bei Raumtemperatur durch. Führen Sie über Nacht eine Abschlusswäsche in PBS-T bei 4 °C durch, um sicherzustellen, dass überschüssige Antikörper entfernt werden.
  4. Verdünnen Sie den sekundären Antikörper auf eine gewünschte Konzentration in der Färbelösung und fügen Sie 50–100 μL Antikörperlösung pro Mikrozentrifugenröhre hinzu (also genug Volumen, um alle HCOs in jedem Röhrchen abzudecken).
  5. Inkubieren Sie hCOs mit dem sekundären Antikörper 24 Stunden lang bei 4 °C auf einer Schüttelplattform. Entfernen Sie überschüssige sekundäre Antikörper und führen Sie dann drei 1-stündige Waschen in PBS-T bei Raumtemperatur durch. Führen Sie über Nacht eine letzte Waschung in PBS-T bei 4 °C durch, um sicherzustellen, dass alle überschüssigen Antikörper entfernt sind.
  6. Für die Ganzmontage-Bildgebung werden hCOs mit einer 1000-μL-Pipette mit abgeschnittener Spitze auf einen positiv geladenen Glasträger übertragen. Entferne überschüssiges PBS-T und gib ein paar Tropfen Montagemedium hinzu, um die HCOs zu bedecken. Legen Sie vorsichtig einen Deckel an, um die HCOs abzuflachen.
    HINWEIS: Um die 3D-Architektur des hCO zu erhalten, verwenden Sie eine Gummidichtung oder doppelseitiges Klebeband um die Ränder des Schlittens, um die Höhe des Deckelverschlusses zu erhöhen. Die Verwendung eines Clearing-Montagemediums kann hilfreich sein, um die Bildgebung durch das hCO zu verbessern, besonders wenn die hCOs nicht abgeflacht sind.

4. Sektionierung und Einbettung

  1. Nach der Fixierung werden die HCOs über Nacht bei 4 °C mit 30 % Saccharose bestrichen, um Kryoschutz zu gewährleisten. Mit einer 1000-μL-Pipette ohne Spitze wird die gewünschte Anzahl von HCOs in eine 12 mm x 12 mm Kunststoffform übertragen. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Saccharoselösung und achten Sie darauf, keine HCOs zu aspirieren.
    HINWEIS: Es ist hilfreich, vor dem Überführen 30 % Saccharose in der Pipettenspitze hoch und unten zu pipetten, um zu verhindern, dass HCOs an der Seite der Spitze haften.
  2. Fügen Sie einen kleinen Tropfen OCT hinzu, gerade genug, um die HCOs abzudecken. Mit einer feinen Pinzette oder einer Pipettenspitze werden die hCOs in OCT vorsichtig so umpositioniert, dass die hCOs nicht zusammengeklumpt sind und keine hCOs in der Nähe der Schimmelränder sind. Stellen Sie sicher, dass sich alle hCOs so nah wie möglich am Boden des Schimmels befinden, um die Anzahl der in einer einzigen Kryosektion gefundenen hCOs zu maximieren.
  3. Friere diese erste OCT-Schicht ein, indem du die Form in einen Styroporkühler mit einer Schicht Trockeneis am Boden legst. Warte ein paar Minuten, bis der OCT ausgehärtet ist, und verschiebe dann die Form vom Trockeneis auf die Arbeitsplatte. Füge zusätzliches OCT hinzu, bis die Form gefüllt ist. Warte, bis die erste Schicht OCT vollständig geschmolzen ist, bevor du wieder auf Trockeneis umsteigst.
  4. Bewahren Sie gefrorene, eingebettete HCOs bei -80 °C auf, bis sie zur Kryosektion bereit sind.
  5. Wenn du fertig zum Schneiden bist, richte den hCO-Block so gut wie möglich aus und beginne mit dem Zuschneiden. Legen Sie regelmäßig einen Abschnitt auf einen geladenen Objektträger und inspizieren Sie jeden Abschnitt visuell auf HCOs. Wenn hCOs visualisiert werden, wird auf 6-μm-Schnitte umgestellt.
    HINWEIS: Die Verschleißrate von hCOs während der Einbettung und Sektionierung beträgt mindestens 10 %. Planen Sie entsprechend.

5. TUNEL- und immunfärbende Gewebeschnitte

  1. Verwenden Sie einen Pap-Stift, um einen hydrophoben Rand um Gewebeabschnitte zu ziehen, die gefärbt werden müssen. Wash-Slides einmal in PBS 0,1% Tween (PBS-T) auflösen, um OCT aufzulösen.
  2. Fügen Sie für 1 Stunde bei Zimmertemperatur Blockpuffer hinzu (10 % neonatales Kalbserum, 1 % DMSO, in PBS-T).
  3. Bereite eine primäre Antikörperlösung vor. Beginnen Sie mit der vom Hersteller empfohlenen Konzentration für die Immunfluoreszenz, wobei die Konzentration möglicherweise empirisch getitriert werden muss.
    HINWEIS: Alternativ kann die TUNEL-Färbung zu diesem Zeitpunkt nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt werden.
  4. Entferne den Blockpuffer vom Verschluss. Fügen Sie genügend primäre Antikörperlösung hinzu, um die hCO-Abschnitte abzudecken. Primären Antikörper über Nacht bei 4 °C oder 3 Stunden bei 37 °C inkubieren. Waschen Sie die Folien dreimal für jeweils 5 Minuten in einem Coplin Jar, gefüllt mit PBS-T, bei Zimmertemperatur.
  5. Bereiten Sie eine sekundäre Antikörperfärbungslösung in einem Blockpuffer vor, einschließlich DAPI oder eines anderen pannuklearen Markers. Fügen Sie genügend sekundäre Antikörperfärbungslösung hinzu, um hCO-Schnitte zu bedecken. Inkubieren Sie 1 Stunde lang geschützt vor Licht bei Zimmertemperatur.
  6. Wasche Folien 3 Mal für 5 Minuten in einem Coplin Jar, gefüllt mit PBS-T bei Zimmertemperatur. Montage mit einem Deckmantel und dem gewünschten Montagemedium.

6. Quantifizierung der nuklearen Kolokalisierung mit CardioCount

HINWEIS: CardioCount ist eine auf Deep Learning basierende Methode zur Bewertung von CM-Kernen aus Mikroskopiebildern40. Ursprünglich entwickelt, um den Zyklen von S-Zyklen zu untersuchen, funktioniert CardioCount gut bei mehreren nuklearen Färbungen, einschließlich TUNEL40.

  1. Um CardioCount zu verwenden, laden Sie das CardioCount-Paket von GitHub herunter oder importieren Sie es in Google Colab (https://github.com/karraresearchgroup/CardioCount.git, https://drive.google.com/file/d/13iwp9JoHPhs2ONSFkZTGxbEXCGwBFVYx/, https://drive.google.com/drive/folders/1-f9h7MvCBsiCngJnV8-f_lplAJpUeeE3). CardioCount Version 1 läuft in einer Python-3-Umgebung.
  2. Exportieren Sie Bilder zur Quantifizierung als einzelne 512 x 512 Pixel .tif Dateien mit zusammengeführten roten, blauen und grünen Kanälen, wobei der rote Kanal ein CM-Nuklearmarker, Blau ein allgemeiner Nuklearmarker und Grün ein zyklierender Nuklearmarker (d. h. Ki67) oder ein apoptotischer Marker (z. B. TUNEL) ist. Erstelle für dieses Experiment einen Elternordner in Google Drive und lade zusammengeführte TIFFs als Unterordner hoch.
    HINWEIS: CardioCount wurde auf Kernfärbungen trainiert, die den Kern füllen. Zyklische Markierungen, die stärker punktiert sind, wie Aurora B oder PH3, sind möglicherweise nicht mit CardioCount kompatibel.
  3. Öffnen Sie das CardioCount-Notizbuch in Google CoLab. Starte Cell 1.1, um den Zugriff auf die Grafikeinheit (GPU) zu überprüfen. Starte Cell 1.2, um CoLab Notebook mit Google Drive zu verbinden.
  4. Starte Cell 1.3, um CardioCount und Abhängigkeiten in Google Colab zu laden. Bearbeite kfile, um den Pfadnamen zu lesen, wo der PRODUCTION_LVADMLPaper_Colab_Libraries-Ordner beim Download gespeichert wurde.
  5. In Zelle 2.0 bearbeite base_folder, um den Pfadnamen zum Elternordner zu lesen, der den Unterordner der zu analysierenden Bilder enthält. Starte Cell 2.0, um diesen Ordner mit CoLab zu verknüpfen.
  6. In Zelle 2.1.1 bearbeiten Sie orig_image_folder so, dass sie den Namen des Ordners mit den Bildern zur Analyse übereinstimmen. Bearbeiten Sie channel_to_remove, um grün zu lesen, und bearbeiten new_image_folder, um den Unterordner unter base_folder zu benennen, in dem alle Bilder mit dem grünen Kanal entfernt werden (rot/blau) gespeichert werden. Wiederholen Sie diesen Schritt, um den roten Kanal zu entfernen, und achten Sie darauf, new_image_folder den Unterordner mit den Bildern mit entferntem roten Kanal (grün/blau) zu unterscheiden.
  7. In Zelle 2.1.2 schneiden Sie Bilder auf 512 x 512 Bilder für die roten/blauen Bilder zu. Stellen Sie sicher, dass der uncropped_image_folder mit dem new_image_folder Namen übereinstimmt, der in Schritt 6.6 erstellt wurde. Für rote/blaue Bilder. Name destination_image_folder, um den Unterordner anzuzeigen, in dem zugeschnittene, rote/blaue Bilder gespeichert werden. Wiederhole diesen Schritt, um die grünen/blauen Bilder zuzuschneiden. Wiederholen Sie diesen Schritt abschließend, um die ursprünglichen 3-kanaligen, zusammengeführten Tiffs in base_folder zu beschneiden.
  8. Führe Zelle 2.2 aus, um Wahrscheinlichkeitskarten zu erzeugen. Name data_specific_folder der Name der roten/blauen und grünen/blauen Bilder, die in destination_image_folder aus Zelle 2.1.2 generiert wurden. Für model_dir geben Sie den Dateipfad in einen Ordner ein, der Segmentierungsmodelle enthält. Um rote Kerne zu segmentieren, verwenden Sie Modell erg_rb_opt und geben Sie 200 für die Epoche ein. Benenne probmap_directory_name um, um den Ordner zu benennen, in dem rote/blaue Wahrscheinlichkeitskarten gespeichert werden. Wiederhole diesen Schritt für grüne/blaue Bilder. Um grüne Kerne zu segmentieren, verwenden Sie Modell edu_mouse_bg_opt und geben Sie 100 für die Epoche ein.
  9. In Zelle 2.3.1 werden Objektabbildungen basierend auf den in Schritt 6.8 generierten Wahrscheinlichkeitsabbildungen erstellt. Die input_folder wird nach dem destination_image_folder aus Zelle 2.1.2 benannt, das rot/blaue Wahrscheinlichkeitskartenbilder enthält, die in Zelle 2.1.2 generiert wurden. Nenne die output_folder, in der rote/blaue Bilder mit Schwellenwert gespeichert werden. Setzen Sie Schwelle für das Vertrauensniveau der nuklearen Segmentierung (Bereich von 0,0–1,0). Führe Zelle 2.3.1 aus. Wiederhole diesen Schritt für grüne/blaue Bilder.
    HINWEIS: Die Schwellenwerte für das Vertrauensniveau bezüglich der Kerne sind vom Datensatz abhängig. Beginnen Sie mit einer Schwelle von 0,9 und stellen Sie höher, wenn Sie zu großzügig sind, und niedriger, wenn sie zu streng sind, basierend auf der zufälligen Inspektion von Wahrscheinlichkeitskarten.
  10. In Zelle 2.3.2 wird die Anzahl der Zellen in Objektabbildungen, die in Schritt 6.10 generiert wurden, gezählt und in eine .csv-Datei exportiert. Die count_folder wird nach dem output_folder aus Zelle 2.3.1 benannt, in dem rote/blaue Bilder mit Schwellenwert gespeichert werden. Um Objekte auszuschließen, die den Rand eines Bildes berühren, stellen Sie sicher, dass ignore_border_cells True lautet. Umbennen csv_path auf den Pfadnamen der base_folder, in der alle Unterordner gespeichert sind. Bearbeite den CSV-Namen, um die Anzahl der roten/blauen Objekte widerzuspiegeln. Wiederhole diesen Schritt für blaue/grüne Bilder.
  11. In Zelle 2.4 werden grün/rote doppelt positive Kerne gezählt. Umbennen img_folder auf den Namen des in Schritt 6.8 generierten Unterordners, der zugeschnittene, 3-Kanal-Bilder enthält. Umbennen childcell_folder in die output_folder von Zelle 2.3.1, in der rote/blaue Bilder mit Schwellenwert gespeichert werden. Benenne parentcell_folder aus Zelle 2.3.1 auf die output_folder um, in der grüne/blaue Bilder mit Schwellenwert gespeichert werden. Benenne dest_folder um, um den Ordner zu benennen, in dem doppelt positive Objektkarten gespeichert werden. Benennen Sie csv_path um, um den Pfadnamen und Dateinamen auf die base_folder zu benennen, in denen alle Unterordner gespeichert sind, und bearbeiten Sie den CSV-Namen, um die Anzahl der doppelt positiven Objekte widerzuspiegeln.
  12. Überprüfen Sie die genaue Segmentierung, indem Sie die roten, grünen und doppelt positiven Zählungen pro Bild mit dem Rohbild vergleichen.
    1. Wenn CardioCount konsequent die Anzahl der Kerne in einem Bild im Verhältnis zu dem überschätzt, was ein verblindeter Gutachter zählen würde, wiederholen Sie Schritt 6.9 mit höherer Vertrauensschwelle und die Schritte 6.10-6.11. Wenn CardioCount die Anzahl der Kerne in einem Bild im Verhältnis zu dem, was ein verblindeter Gutachter zählen würde, unterschätzt, wiederholen Sie Schritt 6.9 mit einer niedrigeren Konfidenzschwelle und die Schritte 6.10-6.11.
  13. Summieren Sie alle Zählungen für jedes hCO für rote Kerne, grüne und doppelt positive Kerne. Berechnen Sie % der zyklischen Kerne als (doppelpositive Kerne / Gesamtzahl roter CM-Kerne) x 100 für jedes Organoid.

7. Hypoxie-Reoxygenierungsverletzung

  1. Bereite Hypoxie-Medien vor (119 mM NaCl, 12 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgSO4, 0,5 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2, 20 mM Natriumlaktat und 5 mM HEPES, pH = 6,4)5.
  2. In eine Zellkulturkolbe werden 5 ml Hypoxie-Medium pro 96-Well-hCO-Platte übertragen. Setze die Zellkulturflasche in die Hypoxiekammer und spüle sie 3 Minuten lang mit anoxischem Gas (5 % CO2, 95 % N2). Inkubieren Sie bei 37 °C mindestens 1 Stunde, bevor Hypoxie eingeleitet wird.
  3. Entfernen Sie alle Medien aus den HCOs. Beginnen Sie damit, ~150 μL mit einer Mehrkanalpipette aus allen Wells zu entfernen. Anschließend wird mit einer 200-μL-Pipette vorsichtig das verbleibende Material aus einzelnen Bohrlöchern entfernt, ohne die HCOs zu stören.
    HINWEIS: Die Entfernung aller Medien aus allen Brunnen ist entscheidend, um eine reproduzierbare Verletzung zu erreichen.
  4. Fügen Sie jedem Brunnen 50 μL Hypoxie-Medium hinzu. Setze die hCO-Platte in die Hypoxiekammer und spüle sie 3 Minuten lang mit anoxischem Gas (5 % CO2, 95 % N2). Stelle die Hypoxie-Kammer für 6 Stunden in den Inkubator bei 37 °C.
  5. Um die Reoxygenierung einzuleiten, entfernen Sie HCOs aus der Hypoxiekammer und geben Sie 150 μL vorgewärmtes RB+-Medium zu. Erlauben Sie mindestens 3 Stunden Reoxygenierung bei 37 °C, bevor Sie flussabwärts Assays durchführen.

8. Laktatdehydrogenase-Freisetzungstest

  1. Sammeln Sie 20 μL Medien aus Brunnen mit verletzten und nicht verletzten hCOs zum gewünschten Zeitpunkt nach Einleitung der Reperfusion. Verdünnen Sie 1:10 in 180 μL LDH-Speicherpuffer (200 mM Tris-HCl (pH 7,3), 10 % Glycerol, 1 % BSA). Lagern Sie bei -20 °C, bis sie zum Testen bereit sind. Pipette mehrmals auf und ab, um das Medium vor der Sammlung zu mischen
  2. Auftauen Sie gefrorene Medien. Fügen Sie 45 μL LDH-Speicherpuffer in einen Brunnen einer schwarzen Wandplatte mit klarem Boden mit 96 Bohrungen für jede zu prüfende Medienprobe hinzu. Füge 5 μL 1:10 verdünntes Medium zu jedem Brunnen hinzu, um eine endgültige Verdünnung von 1:100 zu erreichen. Bereiten Sie das LDH-Detektionsreagenz vor, indem Sie 50 μL LDH-Detektionsenzymmischung und 0,25 μL Reduktasesubstrat für jede zu prüfende Probe mischen.
  3. Fügen Sie 50 μL LDH-Erkennungsreagenz zu jedem Bohrloch mit einem 1:100-Verdünnungsmedium hinzu. Inkubiere bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht, für 60 Minuten. Test auf biolumineszente Signale auf einem kompatiblen Kennzeichenleser.

9. Kalziumbildgebung

  1. Bereiten Sie eine Kalziumfarbstofffärbungslösung mit phenolrotfreiem RPMI-1640, 0,04 % Pluron, und 5 μM Cal520-AM vor. Schützen Sie Proben vor Licht.
  2. Entfernen Sie 100 μL Medium aus jedem für die Kalziumbildgebung vorgesehenen Brunnen. Gib 100 μL Calciumfarbungslösung hinzu und inkubiere bei 37 °C, vor Licht geschützt, für 30 Minuten.
  3. Entfernen Sie 100 μL Medium aus jedem Bohrloch mit Calciumfarbstoff und ersetzen Sie durch 100 μL Phenol-rotfreies RPMI-1640. 30 Minuten bis 1 Stunde bei 37 °C inkubieren, damit die Farbe ausspülen kann.
  4. Mit einem Mikroskop mit kontinuierlicher Bildaufnahme/Streaming-Funktion wird die 96-Well-Ultra-Low-Befestigungsplatte in die Arbeitsposition gesetzt. Bei einem 10x-Ziel identifizieren Sie die Basis eines hCO und achten Sie auf Cal520-Transients.
  5. Erfassen Sie 30 Sekunden Aufnahmen von Kalziumtransienten bei Raumtemperatur. Bei Verwendung eines konfokalen Mikroskops ist es nicht möglich, das gesamte hCO durchzubilden. Wählen Sie eine Fokalebene nahe der Basis des hCO, wo Zellkonturen während Kalziumtransienten sichtbar sind.

10. Kalziumtransientanalyse (Abbildung 3)

  1. Die Kalziumtransientanalyse kann mit verschiedenen Peak-Analyse-Software durchgeführt werden. Nachfolgend finden Sie Anweisungen zur Analyse mit dem Spiky ImageJ Plugin41 (https://pccv.univ-tours.fr/ImageJ/Spiky/).
  2. Füge fünf 2 x 2 Pixel Areas of Interest (ROIs) dem ROI-Manager über sichtbare Zellen in jedem hCO hinzu. Achten Sie darauf, dass sich ROIs nicht mit Zellkernen oder Zellgrenzen überschneiden, da die Bewegung des hCO die Transientenanalyse beeinflussen kann.
  3. Unter Messungen analysieren > auswählen Sie mittlere graue Intensität. Im ROI-Manager wählen Sie Multi-Measure , um die mittlere Grauintensität bei allen ROIs und allen Frames der Aufnahme zu erfassen.
  4. Speichere eine .csv Datei mit der Mean Gray Intensity für alle ROIs. Bewahre alle ROI-Positionen für jedes Bild für spätere Referenzen auf.
  5. Füge in einer neuen Tabelle eine Spalte für Zeit(en) hinzu. Berechnen Sie die Zeit jedes Frames, indem Sie die 30 S durch die Gesamtzahl der Frames teilen und dann mit der Frame-Nummer multiplizieren. Speichern Sie dies als bearbeitetes .csv.
  6. Öffne die bearbeitete .csv-Datei in Fiji und öffne das Spiky-Plugin. Wählen Sie unter Analyseoptionen die gewünschten Analyseparameter aus.
  7. Plotzeit(en) auf der X-Achse und mittlere Grauintensität für ROI #1 auf der Y-Achse. Wählen Sie Peaks analysieren und bestätigen Sie die korrekte Annotation von Baseline, Peak Start/Ende und Peakamplitude. Wenn die falsche Anzahl von Spitzen identifiziert wird, ändern Sie die Parameter in den Analyseoptionen, einschließlich der minimalen Spitzenamplitude vom Ausgangswert, und beginnen Sie mit der Spitzengrenze, bis die Spitzenidentifikation erfolgreich ist.
  8. Speichere alle Zwischendateien. Schläge pro Minute (bpm) können berechnet werden, indem man 60 durch den Durchschnitt des Peak-to-Peak-Intervalls für jeden ROI teilt.
  9. Wiederholen Sie die obige Analyse für alle ROIs pro hCO.

figure-protocol-3
Abbildung 3: Kalziumtransientanalyse. (A) Das rote Feld zeigt den Button an, mit dem das Dropdown-Menü zur Auswahl von Analyseparametern geöffnet wird. (B) Das rote Feld zeigt den Button an, um Zeit (s) vs. Mean Gray Intensity anhand eines ROI innerhalb eines repräsentativen, unverletzten hCO zu zeichnen. (C) Das rote Feld zeigt den Knopf zur Auswahl der Spitzenanalyse an. (D) Repräsentative Kalzium-Transienten-Spuren- und Spitzenanalyse aus einem unverletzten hCO. Rote Dreiecke zeigen das maximale Maximum an, rosa Quadrate die maximale Steigung für den Peak Upstroke und Downstroke, das grüne Feld zeigt den Beginn des Peaks an und das blaue Feld die Basislinie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das obige Protokoll sollte gut geformte hCOs ergeben, die zwischen den Differenzierungstagen 7-12 (D7-12) zu schlagen beginnen. Wenn die hCOs nach Tag 25 reifen, ist es möglich, dass spontane Wehen ohne elektrische Stimulation nicht mehr sichtbar sind. H/R-Verletzungen können jederzeit nach Beginn der HCOs auftreten – typischerweise führen wir Verletzungen bei 15 Tage alten (D15) HCOs oder später durch.

Bestätigung der Verletzung
Wie beim m...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Erzeugung und Verletzung selbstassemblizierender hCOs mit H/R präsentiert. Ischämische Herzerkrankungen sind durch pathophysiologische Umstrukturierung gekennzeichnet, einschließlich Kardiomyozytentod, fibrotischer Remodellierung, elektrischer Funktionsstörung und funktionellem Abbau. Diese Störungen werden im hCO-Modellsystem beobachtet, darunter erhöhte TUNEL+ CMs, eine Erhöhung der LDH-Freisetzung, eine Vergrößerung der Viment...

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wird von R01 HL157277 (RK), AHA 24PRE1186062 (LP), F30 HL175908-01 (LP) und dem Duke University Medical Scientist Training Program T32 5T32GM145449-03 (LP) unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Accutase-LösungSigma-AldrichA6964-500ML
Antikardialer Troponin-T-AntikörperAbcamEPR20266
B-27 Supplement (50X), serumfreiGibco17504044
B-27-Präparat ohne InsulinGibcoA1895602
BioTek Synergy Neo2 PlattenleserBioTek
Cal-520, AMAAT Bioquest21131
CardioCount V1Karra-LaborPMID: 38984052
Zelllinie (Homo sapiens, männlich) – DU11 iPSC-LinieDuke University Stammzellkern
Geladene Objektträger, weißes GlasVWR89500-496
CHIR 99021Tocris4423
CloneRSTEMCELL-Technologien5888
Corning 96-Wells Clear Ultra Low Attachment MikroplattenFisher7007
Einweg-Pipetter-ReservoirsVWR89094-678
DMEM/F-12, HEPESGibco11330057
EVOS-FluoreszenzmikroskopEVOS
Geltrex Reduced Growth Factor Basal-Membran-Matrix, LDEV-frei, Stammzell-qualifiziertGibcoA1413302
Human Activin: Ein rekombinantes ProteinPEPROTECH INC/Life Technologies120-14E-50UG
IWP-2STEMCELL-Technologien72124
L-Ascorbinsäure (Kristallin/zertifiziertes ACS)Fisher ScientificA61-100
Maus-Anti-VimentinDSHBAMF-17b
mTeSR PlusSTEMCELL-Technologien100-0276
Multiwell-Zellkulturplatten – 12 BrunnenVWR10062-894
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
ReLeSRSTEMCELL-Technologien100-0483
RPMI 1640 MittelGibco11875119
RPMI 1640 Medium, kein rotes PhenolGibco11835-030
ThiazovivinSTEMCELL-Technologien72254
Tissue-Tek O.C.T.-CompoundSAKURA FINETEK USA INC (VWR)25608-930
Zeiss Spinning Disk KonfokalmikroskopZeiss

References

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