Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Messung der Stickstoffmonoxidproduktion in Maus-Tracheal-Epithelzellkulturen, die an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche differenziert wurden

108 Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/70311

⸱

3. Juli 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Quantifizierung der Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) in den Apithelkulturen der Luftwege, die an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) differenziert sind, indem Nitrit in apikalen Sekreten mittels eines triiodidbasierten chemilumineszenzbasierten Assays gemessen wird.

Zusammenfassung

Atemwegepithelkulturen, die an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) differenziert wurden, liefern ein physiologisch relevantes Modell zur Untersuchung der Stickstoffmonoxid-(NO)-Signalübertragung in ciliierten Zellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Quantifizierung der NO-Produktion durch Messung von Nitrit (NO₂⁻), einem stabilen Oxidationsprodukt von NO, in Proben, die aus ALI-differenzierten Mausa-Trachealepithelzellen entnommen wurden. Apikale Waschungen, Basalmedien und Zelllysate werden mit einem triiodidbasierten chemilumineszenzgetesteten Assay, der mit einem Stickstoffmonoxid-Analysator (NOA) gekoppelt ist, gesammelt und analysiert. Nach der Injektion in das Reaktionsgefäß wird Nitrit chemisch zu NO reduziert, das durch ozonbasierte Chemilumineszenz nachgewiesen wird. Die Signalintensität wird quantifiziert und mit einer Standardkalibrierungskurve in Nitrit-Pikomole umgewandelt, und die Werte werden auf den gesamten zellulären Proteingehalt normalisiert. Die Assay-Leistung wird mittels pharmakologischer Modulation von NO-Werten validiert. Nach der Behandlung mit dem NO-Spender Diethylentriamin NONOate (DETA-NONOate) und dem NO-Synthaseinhibitor N(ω)-Nitro-L-Arginin-Methylester (L-NAME) beobachten wir signifikante Unterschiede im Nitritgehalt zwischen den Bedingungen. Das robusteste und reproduzierbarste Signal wird in apikalen Washes beobachtet, entsprechend der Menge an NO, die aus dem Atemwegepithel freigesetzt wird. Diese Methode erkennt NO zuverlässig in Proben aus ALI-differenzierten Atemwegepithel und bietet eine genaue In-vitro-Plattform zur Quantifizierung der NO-Produktion und zur Modellierung von Krankheiten, die mit abnormalem NO-Stoffwechsel assoziiert sind.

Einleitung

Ein Markenzeichen mehrerer Atemwegserkrankungen, darunter Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), Mukoviszidose (CF) und primäre Ziliardyskinesie (PCD), ist die veränderte Homöostase des Stickstoffmonoxids (NO), die als Veränderungen der ausgeatmeten NO-Werte messbar ist, die bei diesen Erkrankungen stark variieren können, da sie bei COPD und Asthma 1,2 erhöht und bei CF und PCD3 stark reduziert sind. 4. Diese Krankheiten weisen häufig Auffälligkeiten in den beweglichen Flimmern der Atemwegspermien auf, den wichtigsten Effektoren der mucociliären Clearance5. Da NO und seine nachgelagerten Signalwege entscheidende Regulatoren der Ziliarbeweglichkeit sind, ist es entscheidend zu verstehen, wie die Produktion und Signalübertragung von NO in diesen Kontexten verändert werden, um Mechanismen der mukoziliären Dysfunktion zu erklären. Dementsprechend bietet eine Methode, die eine präzise Erkennung der NO-Produktion und -Freisetzung in den Atemwegepitheln ermöglicht, ein wertvolles Werkzeug zur Analyse der Regulation und physiologischen Rolle dieses Signalmoleküls. Solche Ansätze sind besonders nützlich in experimentellen Umgebungen, in denen die direkte Messung von NO aufgrund der kurzen Halbwertszeit und der schnellen Reaktivität schwierig ist.

NO reguliert die Biogenese und Funktion der Cilien der Atemwege, indem es die Polarität der ciliierten Zellen und das koordinierte Schlagen der beweglichen Flimmerilienbeeinflusst. Die Mechanismen, die keine Homöostase in den Atemwegen aufrechterhalten, sind jedoch weiterhin unvollständig verstanden. Atemwegsepithelkulturen, die an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) differenziert sind, bieten ein wertvolles In-vitro-System zur Untersuchung dieser Mechanismen. Derzeit wird dieses Modell weit verbreitet verwendet, um die Auswirkungen von Umweltschäden auf das Atemwegepithel 9,10,11 zu untersuchen und die Pathophysiologie von Atemwegserkrankungenzu erläutern. Im Vergleich zu konventionellen untergetauchten Kulturen13,14 reproduzieren ALI-differenzierte Epithelle die Architektur und Funktion des natürlichen Atemwegs genauer, einschließlich epitihelaler Polarisation, mukoziliärer Differenzierung und realistischem Gas-Flüssigkeitsaustausch, was sie besonders geeignet macht, um apikale NO-Freisetzung, Signalübertragung und verwandte Ziliarfunktion zu untersuchen. Dieses System eignet sich daher gut für Experimente, die darauf abzielen, NO-abgeleitete Metabolite, die in das Atemwegslumen freigesetzt werden, zu quantifizieren, insbesondere unter Bedingungen der epithelialen Differenzierung oder pharmakologischer Manipulation.

Eine genaue Messung der NO-Konzentration ist unerlässlich, da sowohl übermäßige als auch mangelnde NO-Werte die Ziliarfunktion beeinträchtigen können. Derzeit sind fluoreszierende Sondenmethoden (z. B. Diaminofluoresceine, DAFs) zur Erkennung von NO nur halbquantitativ und werden durch pH-Sensitivität, Sauerstoffabhängigkeit und fehlende Spezifität begrenzt, da sie mit zellulären Oxidanten und Antioxidantien reagieren können, was zu semi-quantitativen Messungenführt. Darüber hinaus ermöglichen elektrochemische Sensoren (z. B. NO-empfindliche amperometrische Elektroden) die Echtzeitdetektion von NO16, können jedoch in komplexen biologischen Systemen aufgrund der NO kurzen Halbwertszeit, Interferenzen durch redoxaktive Spezies Biofouling der Elektrodenoberfläche und Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung stabiler Kalibrierungschwierig sein. Alternative chemilumineszenzbasierte Ansätze, einschließlich direkter Gasphasen-NO-Nachweis und reduktive Tests zur Zielsetzung verschiedener Stickoxidspezies, wurden ebenfalls beschrieben, deren Anwendung jedoch auf Atemwegepitelkulturen noch unerforscht ist. Diese Einschränkungen unterstreichen die Notwendigkeit sensibler, quantitativer Methoden, die zuverlässig niedrige Konzentrationen von NO-abgeleiteten Arten in kleinen biologischen Proben nachweisen können. Um diese Einschränkungen zu überwinden, etablierten wir ein Protokoll zur Quantifizierung von NO in apikalen Sekreten, die aus ALI-differenzierten Atemwegsepitheln mit einem Stickstoffmonoxid-Analysator (NOA) gesammelt wurden. Der NOA ist ein hochempfindlicher, chemilumineszenzbasierter Detektor, der traditionell zur Messung von NO-Metaboliten in chemischen Proben verwendet wird und neuerdings für die Analyse biologischer Proben wie Blut, Gewebehomogenate und Zellkultur-Supernatanten 7,18,19 angepasst wurde. NO ist ein hochreaktives Signalmolekül, das in Geweben unter normalen Sauerstoffwerten schnell zu Nitrit oxidiert wird, mit einer außergewöhnlich kurzen Halbwertszeit. Daher dient Nitrit als Endprodukt der NO-Oxidation als Indikator für die Gesamtproduktion NO in biologischen Systemen 20,21,22. Diese empfindliche und reproduzierbare chemilumineszenzfähige Methode ermöglicht den Nachweis von Nitrit/NO auf den Pikomolar-Niveaus23,24, was sie ideal macht, um kleine Veränderungen in biologischen Proben mit geringem Volumen zu messen, wie sie beispielsweise aus MTEC-ALI-Kulturen stammen. Dieser Ansatz eignet sich jedoch am besten für Bedingungen, in denen die Nitritankumulation die jüngste NO-Produktion widerspiegelt und durch Faktoren wie Probenhandhabung, Hintergrundnitritkontamination und Epitheldifferenzierungszustand beeinflusst werden kann. Daher sind geeignete Kontrollen und sorgfältiges experimentelles Design erforderlich, um eine genaue Interpretation der Ergebnisse sicherzustellen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Maryland überprüft und genehmigt (Protokoll # AUP–00004632).

HINWEIS: Das Protokoll erfordert etwa 2 Tage für die Isolierung der Mäuse-Trachealepithelzellen (MTEC), gefolgt von 7–10 Tagen für die Expansion, 5–6 Tage für die Proliferation in Transwell-Einsätzen, 21 Tage für die Differenzierung (Zeit für die Gewinnung ausreichender multiciliierter Zellen), 24 Stunden medikamentöse Behandlung und einen weiteren Tag für die Probenentnahme und NOA-Kalibrierung. Injektionen und Datenerfassung.

1. Vorbereitung von Medien und Lösungen

HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für Details zu den Medienbestandteilen.

  1. Hams F–12-Medien
    1. Bereiten Sie die Lösung in einer sterilen laminaren Flusshaube vor. Fügen Sie 5 ml 100× Penicillin/Streptomycin-Antibiotika und 0,5 ml Amphoterecin B (Fungizon) zu 500 ml Hams F12-Medium in einer sterilen Flasche hinzu.
    2. Rühren Sie die Flasche vorsichtig 5–10 Mal um, um das vollständige Mischen zu gewährleisten. Filtersterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22 μm-Filter unter sterilen Bedingungen und lagern Sie sie bei 4 °C.
      VORSICHT: Penicillin/Streptomycin und Amphotericin B sind antimikrobielle Wirkstoffe, die Reizungen oder allergische Reaktionen verursachen können. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe und Laborkittel.
  2. Pronase-Lösung
    1. Gib 15 mg Pronase zu 10 ml sterilem Ham's F12-Medium in einem sterilen Röhrchen, um eine 0,15%ige Pronase-Lösung zu erhalten. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie sie umdrehen oder auf und ab pipetten, bis die Pronase vollständig aufgelöst ist. Bereiten Sie frisch direkt vor der Verwendung vor.
  3. DNase-I-Lösung
    1. Fügen Sie 5 mg rohe Pankreas-DNase I zu 9 ml Hams F12-Medium und 1 ml 10 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung in einem sterilen Schlauch hinzu, um eine 0,5 mg/mL DNase-I-Lösung zu erhalten.
    2. Mische vorsichtig, indem du auf und ab pipettierst, bis die DNase I vollständig aufgelöst ist, um Blasenbildung zu vermeiden. Nach vollständiger Auflösung wird die Lösung in 1 mL sterile Mikrozentrifugenröhren eingelagert und bei -20 °C gelagert.
  4. Hams F12-Medien mit fetalem Rinderserum (FBS)
    1. Bereiten Sie die Lösung bei Raumtemperatur in einer sterilen laminaren Flusshaube vor. Fügen Sie 10 ml fetales Rinderserum (FBS) zu 40 ml Hams F12-Medium mit Antibiotika in einem sterilen konischen Röhrchen hinzu, um 20 % FBS im F12-Medium zu erhalten.
    2. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Rohr 5–10 Mal umkehren, bis die Lösung homogen ist. Filtersterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22 μm-Filter unter sterilen Bedingungen und lagern Sie sie bei 4 °C.
  5. MTEC-Erweiterungsmedien
    1. Bereiten Sie das MTEC-Expansionsmedium bei Raumtemperatur in einer sterilen laminaren Flusshaube vor, indem Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten in einer sterilen Flasche kombinieren.
    2. Gründlich mischen, indem Sie den Behälter sanft umdrehen oder umdrehen, bis alle Komponenten vollständig vermischt sind. Filtersterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Filter unter sterilen Bedingungen.
    3. Fügen Sie den ROCK-Inhibitor Y–27632 (5 mM Standardlösung) zu einer Endkonzentration von 10 μM und Notch γ–Sekretase-Inhibitor DAPT (10 mM Standardlösung) unmittelbar vor der Verwendung zu einer Endkonzentration von 5 μM hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Inversion.
  6. MTEC-Proliferationsmedien
    1. Bereiten Sie das MTEC-Proliferationsmedium bei Raumtemperatur in einer sterilen laminaren Flusshaube vor, indem Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten kombinieren.
    2. Gründlich durch sanfte Inversion oder Wirbeln vermischen, bis alle Komponenten vollständig vermischt sind. Filtersterilisieren Sie das Medium unter sterilen Bedingungen mit einem 0,22-μm-Filter.
    3. Unmittelbar vor der Anwendung wird der ROCK-Inhibitor Y–27632 (5 mM Lagerlösung) zu einer Endkonzentration von 10 μM und Retinsäure (5 μM Serienlösung) zu einer Endkonzentration von 0,05 μM hinzugefügt. Vor der Verwendung vorsichtig durch Inversion mischen.
  7. MTEC-Differenzierungsmedien
    1. Bereiten Sie das MTEC-Differenzierungsmedium bei Raumtemperatur in einer sterilen laminaren Flusshaube vor, indem Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten in einem sterilen Behälter kombinieren.
    2. Gründlich durch sanfte Inversion oder Wirbeln vermischen, bis alle Komponenten vollständig vermischt sind. Filtersterilisieren Sie das Medium unter sterilen Bedingungen mit einem 0,22-μm-Filter.
    3. Unmittelbar vor der Anwendung geben Sie Retinsäure zu einer Endkonzentration von 0,05 μM und mischen Sie vorsichtig invertiert.

2. Isolierung von Maus-Trachealepithelzellen (MTEC)

  1. Euthanasie drei erwachsene Mäuse (8–20 Wochen alt) durch Kohlendioxid (CO2) Inhalation in einer zugelassenen Euthanasiekammer gemäß den institutionellen IACUC-Richtlinien. Bestätigen Sie den Tod vor der Gewebeentnahme.
  2. Legen Sie das Tier dorsal (Brust nach oben) auf eine aseptische Oberfläche. Mit sauberer Zange hebt man die Haut vorsichtig an und schneidet sie mit einer chirurgischen Schere von der Unterlippe bis zum Bauch auf, um die Luftröhre freizulegen.
  3. Schieben Sie die Speicheldrüsen beiseite und entfernen Sie das Bindegewebe sowie den Trachealismuskel, um die Knorpelringe freizulegen. Seziere die gesamte Luftröhre und lege sie in eine Petrischale mit sterilem Ham's F12-Medium. Kombinieren Sie drei Luftröhren in einer Schale.
  4. Die Schale in eine laminare Flusshaube legen und die Luftröhren in eine andere Form mit frischem Schinken-F12-Medium legen. Entfernen Sie jegliches extratracheales Gewebe und schneiden Sie die Luftröhre längs durch das Lumen.
  5. Übertragen Sie alle Luftröhren in ein 50-mL Schraubverschluss-konisches Rohr mit steriler 10 mL 0,15%-Pronase-Lösung. Inkubieren bei 4 °C für 16–18 Stunden.

3. Zellisolierung und anfängliche Expansion

  1. Am nächsten Tag wird das Rohr mit den Geweben 10–15 Mal umgekehrt, um die Epithelzellen zu lösen, und 45 Minuten bei 4 °C inkubiert. Stoppen Sie die Pronase-Reaktion, indem Sie 10 ml Ham-Medium mit 20 % FBS hinzufügen und 10–15 Mal invertieren.
  2. Füge 10 ml Hams F12-Medium mit FBS zu drei 15-mL-Röhren hinzu. Mit einer Pasteur-Pipette wird das Trachealgewebe sequentiell vom 50-ml-Rohr auf das erste, zweite und dritte 15-ml-Rohr übertragen und in jedem Rohr 10–15 Mal umgedreht, um die trachealen Epithelzellen zu lösen. Entsorge das Gewebe nach der letzten Übertragung.
  3. Kombinieren Sie das gesamte Medium der drei 15-mL-Kegelröhren mit dem Medium im 50-mL-Rohr. Zentrifugiere bei 360 × g für 10 Minuten bei 4 °C. Entferne vorsichtig das Überdachungsmittel und gib 0,5 ml 0,5 mg/mL DNase-I-Lösung hinzu. Brüte 5 Minuten auf Eis.
  4. Zentrifugiere bei 360 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Entsorgen Sie vorsichtig das Überstandsmittel und suspendieren Sie das Zellpellet in 7–10 mL MTEC-Expansionsmedium.

4. Erweiterung und Differenzierung von MTEC

  1. Bereiten Sie eine mit Kollagen beschichtete T75-Zellkulturkolbe mit 10 ml Kollagen I (Rattenschwanz) bei 50 μg/mL vor und inkubieren Sie bei 37 °C 16–18 Stunden. Aspiriere die Kollagenlösung aus dem T75-Kolben und wasche den Kolben dreimal mit PBS (1×). Lass die Flasche vollständig trocknen.
  2. Säen Sie die Zellsuspension, bestehend aus 7–10 ml MTEC-Expansionsmedium, das die Zellen enthält, in den kollagenbeschichteten Kolben aus. Stellen Sie den Kolben in einen Inkubator bei 37 °C und 5 %CO2. Ersetze das Expansionsmedium alle 2 oder 3 Tage und überwache die Zellanzahl bis zur 70%igen Konfluenz.
  3. Bei 70 % Konfluenz wird 1 ml Accutase-Lösung hinzugefügt und 10–15 Minuten bei 37 °C inkubiert, um die Zellmonoschicht abzulösen. Die Zellen werden in 10 mL MTEC-Proliferationsmedium wieder aufgehängt. Zentrifugiere bei 1057 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
  4. Entsorgen Sie das Supernatant, lassen Sie die Zellen im Proliferationsmedium wieder suspendieren und zählen Sie die Zellen.
  5. Samen 2 × 105 Zellen in einem Volumen von 0,5 ml pro Transwell-Einsatz (12 mm Membrandurchmesser, 0,4 μm Membranporengröße) vorbeschichtet mit Kollagen. Fügen Sie 1,5 ml Medium in die Basalkammer jedes Einsatzes hinzu und setzen Sie das Transwell bei 37 °C in den Inkubator.
  6. Wechseln Sie das Medienmedium sowohl in der apikalen als auch in der Basalkammer am dritten Tag und ermöglichen Sie den Zellen, meist bis Tag 5 oder 6, eine 100%ige Konfluenz zu erreichen. Fügen Sie als Kontrollgruppe einen Einsatz ohne Zellen hinzu.
  7. Nach dem Zusammenfluss werden die Zellen apikal mit 0,5 ml MTEC-Differenzierungsmedium gewaschen. Initiieren Sie die Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI), indem Sie 0,75 ml Differenzierungsmedium nur der Basalkammer hinzufügen, wobei die Zellen in der apikalen Kammer der Luft ausgesetzt bleiben.
  8. Alle 2–3 Tage werden die Zellen an der apikalen Oberfläche mit einem Differenzierungsmedium gewaschen und das Basalmedium ersetzt. Lassen Sie die Zellen 21 Tage lang am ALI differenzieren.

5. Immunkennzeichnung und Bildgebung von ziliierten Epithelzellen

  1. An den ALI-Tagen 7, 14 und 21 fixieren Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA).
  2. Durchführung der Immunmarkierung von Zellen mit Anti-FoxJ1-Antikörpern, um FoxJ1 nachzuweisen, einem Transkriptionsfaktor, der für die motorile Ciliogeneseessentiell ist 25,26, und anti-acetylierten α–Tubulin-Antikörper zur Erkennung von acetyliertem α-Tubulin, einem strukturellen Marker der beweglichen Cilien, gemäß den veröffentlichten Protokollen 27,28,29.
    VORSICHT: PFA ist eine gefährliche Chemikalie, daher sollten Sie beim Fixieren der Zellen geeignete PSA (mindestens Nitrilhandschuhe und Laborkittel) tragen.
  3. Aufnahme von Bildern der immunmarkierten Zellen mittels konfokaler Mikroskopie mit einem 40×- oder 60×-Objektiv. Sammeln Sie Z-Stacks mit einer Tiefe von 10 μm und jeder Schrittgröße von 0,5 μm.
  4. Stellen Sie Laserleistung, Detektorverstärkung und Belichtungseinstellungen ein, um Signalsättigung zu vermeiden und vergleichbare Aufnahmeparameter über Proben hinweg beizubehalten.
  5. Quantifizieren Sie die FoxJ1-positiven oder acetylierten Tubulin-positiven Zellen als Prozentsatz der Gesamtzellen (DAPI-positiv) pro Interessenregion (ROI) mit dem Zellzähler-Plugin in FIJI-Bildgebungssoftware.
  6. In der GraphPad Prism-Software (V. 10.0) werden Diagramme erzeugt und statistische Analysen mit einem zweiseitigen Student's t-Test durchgeführt, nachdem die Datenverteilung mit dem Shapiro-Wilk-Test auf Normalität bewertet wurde.

6. Medikamentöse Behandlung des differenzierten Atemwegepithels

  1. Am ALI am 21. Tag bereiten Sie Differenzierungsmedium (3 mL für Zellen in drei Einsätzen) in einem sterilen Röhrchen bei Raumtemperatur vor.
  2. Fügen Sie 7,5 μL Diethylentriamin–NONOat oder DETA/NO aus einer 100 mM großen Lagerlösung (hergestellt in 10 mM NaOH) zum Differenzierungsmedium hinzu, um die Endkonzentration von 250 μM in 3 mL zu erreichen. Umgekehrt vorsichtig mischen und sofort verwenden.
  3. Fügen Sie 750 μL der in jede der drei Basalkammern differenzierter Zellen hinzu und inkubieren Sie 24 Stunden bei 37 °C.
  4. Bereiten Sie 1 mM Nω-Nitro-L-Arginin-Methylester (L–NAME) her, indem Sie 30 μL aus der 100 mM L-NAME-Lagerlösung (hergestellt in DMSO) in das MTEC-Differenzierungsmedium für ein Gesamtvolumen von 3 ml herstellen.
  5. Fügen Sie 750 μL der in jede der drei Basalkammern hinzu und inkubieren Sie 24 Stunden bei 37 °C.
  6. Fügen Sie 30 μL nur Dimethylsulfoxid (DMSO) (unbehandelte Gruppe) zu 3 ml Basalmedium (1 % v/v) hinzu.
  7. Fügen Sie 750 μL der in die Basalkammer mit drei Einsätzen (unbehandelt) hinzu.

7. Probenentnahme

HINWEIS: Für die NOA-Analyse ist es notwendig, Medien, apikale Wäsche und Zelllysatproben von drei Einsätzen zu sammeln.

  1. Am ALI-Tag 22 werden Proben aus den differenzierenden Atemwegsepithelen entnommen, beginnend mit 750 μL Basalmedium aus jedem der drei Einsätze pro Versuchsgruppe.
  2. Sammeln Sie Basalmedien, die in Inserts ohne Zellen inkubiert werden, um als Rohstoffkontrolle zu dienen und eine mögliche externe Nitritkontamination zu berücksichtigen.
  3. Sammeln Sie das Basalmedium aus drei Einsätzen und lagern Sie es sofort bei -20 °C bis zur Injektion in NOA.
  4. Um das Nitrit/NO im apikalen Schleim des Epithels zu sammeln, fügen Sie 50 μL vorgewärmten PBS-(1×)-Puffer (steril, aliquotiert und gefroren) auf die Zellen in jedem Einsatz und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 °C.
    HINWEIS: Während der 30-minütigen Inkubation der Zellen mit PBS zur Aufnahme apikaler Waschmittel kann PBS auch in der Basalkammer hinzugefügt werden, um die Hydratation auf beiden Seiten der Zellen aufrechtzuerhalten.
  5. Sammeln Sie das PBS, das den Schleim über dem Epithel enthält.
  6. Kombinieren Sie die PBS-Waschungen aus drei Einsätzen, um etwa 150 μL apikalen Schleim/PBS aus jeder experimentellen Bedingung zu erhalten, was für zwei NOA-Injektionen ausreicht.
  7. Lagern Sie die apikalen Waschproben bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C.
  8. Lagern Sie außerdem den PBS-Waschpuffer für die Verwendung als Blank-Kontrolle während der NOA-Injektionen.
  9. Waschen Sie die apikale und basale Seite der Zellen in drei Einsätzen zweimal mit 500 μL vorgewärmtem PBS.
  10. Fügen Sie 500 μL Accutase-Lösung apikal hinzu und inkubieren Sie 15–20 Minuten, bis sich die Zellen vollständig von den Membranen lösen.
  11. Nach vollständiger Ablösung geben Sie den Zellen serumfreies RPMI-1640-Medium (im Verhältnis 3:1 zu Accutase).
  12. Sammeln Sie die abgetrennten Zellen aus den drei Einsätzen in einem einzigen Schlauch.
  13. Drehen Sie die Zellen bei 3000 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
  14. Das Zellpellet wird in 50 μL Lyselösung (RIPA-Puffer + Halt 1× Proteaseinhibitor-Cocktail) erneut suspendiert und 45 Minuten auf Eis inkubiert.
  15. Lassen Sie das Lysat bei 14.800 × g für 20 Minuten bei 4 °C drehen und Supernatant sammeln.
  16. Verwenden Sie 3 μL Ganzzelllysat, um die Proteinkonzentration mittels des Bicinchoninsäure-(BCA)-Tests zu bestimmen.
  17. Verdünne die verbleibende Lysatlösung 1:1 im RIPA-Puffer, um genug Volumen für zwei 50-μL-NOA-Injektionen zu erzeugen.
  18. Lagern Sie die Lysate bei -80 °C, bis Sie sie bei -20 °C in den NOA einspritzen.
  19. Lagern Sie den RIPA-Puffer, mit dem das Zellpellet neu suspendiert wird, bei -20 °C, um es als Blank- und Kontaminationskontrolle für Lysatproben zu verwenden.

8. NOA-Kalibrierung und Probeninjektionen

  1. Bereiten Sie Triiodidreagenz her, indem Sie 400 mg Kaliumiodid und 250 mg Jod in 28 ml Gletscheressigsäure und 8 ml ultrareines Wasser auflösen.
  2. Führen Sie die Triiodid-Reagenzpräparation in einer chemischen Dampfhaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz) durch.
    VORSICHT: Jod und Gletscheressigsäure sind gefährlich und können Haut und Augen reizen und zerstören.
  3. Lagere bei Raumtemperatur und verwende sie innerhalb von 2 Wochen nach der Zubereitung.
  4. Bereiten Sie 1 mM Lagerlösung aus Natriumnitrit in nitritfreiem Wasser vor.
  5. Lagere die Brühlösung bis zur Anwendung bei -20 °C.
  6. Bereiten Sie unmittelbar vor den Injektionen frische Arbeitsstandards (0,125–4,0 μM) in PBS vor.
    HINWEIS: Für die NOA-Kalibrierung verwenden Sie steriles, dicht verschlossenes PBS, um eine Nitritkontamination zu minimieren.
  7. Schalten Sie das Stickstoff-(N2)-Trägergas ein und leiten Sie den Gasfluss durch das System ein.
  8. Bauen Sie das Glasspülgefäß zusammen und geben Sie 4 ml Triiodidreagenz mit 20 μL Antischaumstoff, verdünnt 1:10, in das Gefäß ein.
  9. Decken Sie es sicher mit einem Septum ab, das durch den Schraubverschluss gehalten wird, um eine luftdichte Abdichtung zu gewährleisten.
  10. Gib 10 ml Natriumhydroxid (NaOH) in den NaOH-Sip.
  11. Auf dem Anzeigebildschirm des NOA-Instruments (nCLD 88) wählen Sie Messung, Gas und Reichweite auswählen.
  12. Stellen Sie das Instrument auf MR2:50,00 ein, was einem Messbereich zwischen 0 und 50 Teilen pro Milliarde NO entspricht, und wählen Sie Schnell für die Filtereinstellung.
  13. Stellen Sie den Stickstoffgasdruck an, bis sich der Reaktordruck zwischen 27–29 psi (186–200 kPa) stabilisiert.
  14. Öffnen Sie die eDAQ-Chart-Software auf dem Computer, der mit der NOA verbunden ist.
  15. Stellen Sie den Aufnahmebereich auf 10/s und die Spannung auf 10 V ein.
  16. Navigiere zu Einrichtung > Kanaleinstellungen und wähle Kanal 1 aus.
  17. Stelle die Anzeigeskala in der NOA-Software auf 2:1 ein.
  18. Starten Sie die Datenerfassung auf dem NOA-Gerät und in der Software.
  19. Beobachte den Basisstand, bis er sich stabilisiert.
  20. Injizieren Sie 10 μL PBS durch das Septum in das Reinigungsgefäß mit einer Hamilton-Spritze, um die Basisstabilität zu bestätigen.
  21. Zeichnen Sie das chemilumineszente Signal für jede Injektion auf.
  22. Injizieren Sie 10 μL des 0,125 μM Nitritstandards in das Spülgefäß.
  23. Wiederholen Sie das zweimal für jeden Nitritstandard, um doppelte Messungen zu erhalten, die später gemittelt werden.
  24. Annotieren Sie jede Injektion im Kommentar-Tab (z. B. 10 μL 0,5 μM Nitrit).
  25. Wischen Sie die Spritze an einem fusselfreien Gewebe ab und spülen Sie 3–4 Mal mit sterilem, nitritfreiem Wasser, um überschüssiges Triiodid zu entfernen.
  26. Wiederholen Sie diesen Reinigungsschritt nach jeder Injektion.
  27. Lassen Sie das Signal zwischen den Injektionen (20–30 s) zum Ausgangswert zurückkehren.
  28. Öffnen Sie das Fenster Flussanalyse .
  29. Überprüfen Sie die Spitzen- und Zeitwerte für jede Injektion in der Analysetabelle.
  30. Markiere jeden Gipfel und passe die Auswahl an, um die Fläche unter der Kurve (AUC) zu berechnen.
  31. Schalte das Display von S auf C, um den Kalibrierungsmodus zu aktivieren.
  32. Geben Sie die bekannten Nitritmengen für jeden Standard in der Menge-Spalte ein.
  33. Klicken Sie auf die Schaltfläche Kalibrierungskurve , um die Standardkurve zu erzeugen.
  34. Überprüfen Sie, ob die Kalibrierungskurve die Akzeptanzkriterien erfüllt (R2 ≥ 0,99).
  35. Taue biologische Proben auf, die zuvor aus ALI-Kulturen auf Eis gesammelt wurden.
  36. Injizieren Sie 50 μL blankzellfreies Medium in das Reinigungsgefäß.
  37. Injizieren Sie 50 μL jeder Basalmedienprobe in das Reinigungsgefäß.
  38. Zeichnen Sie das Chemilumineszenzsignal für jede Injektion auf.
  39. Führen Sie für jede Probe doppelte Injektionen (jeweils 50 μL) durch.
    HINWEIS: Die 50-μL-Injektionen führen häufig zu Blasenbildung. Um dieses Problem zu begrenzen, ersetzen Sie das Triiodidreagenz regelmäßig durch Anti-Schaumstoff im Reinigungsgefäß.
  40. Annotieren Sie jede Probe im Kommentar-Tab vor der Injektion.
  41. Injizieren Sie 50 μL zellfreies PBS (apikales Blank) in das Reinigungsgefäß.
  42. Injizieren Sie apikale Wash-Proben (zwei 50-μL-Injektionen pro Probe) und zeichnen Sie die entsprechenden Signalspitzen auf.
  43. Injizieren Sie den RIPA-Puffer zweimal, gefolgt von Lysatproben (zwei 50-μL-Injektionen pro Probe) und nehmen Sie die entsprechenden Signalspitzen auf.
    HINWEIS: Lassen Sie die chemilumineszente Spur immer bis zum Ausgangspunkt zurückreichen und stabilisieren. Warte 20–30 Sekunden und injiziere dann die nächste Probe.
  44. Am Ende der Probeninjektionen öffnen Sie das Fenster Flussanalyse .
  45. Markiere jeden Stichprobengipfel, um die Fläche unter der Kurve (AUC) zu berechnen.
  46. Bestimmen Sie die Nitritkonzentrationen für jede Probe anhand der Kalibrierungskurve, die aus Standardlösungen erzeugt wird.

9. Datenerhebung, Normalisierung und Analyse

  1. Exportieren Sie die Daten, einschließlich Peak-Höhe (V), Fläche unter der Kurve (V.s) und mittlerer Fläche unter der Kurve, aus der Flow Analysis-Funktion in der eDAQ-Software in eine Excel-Datei. Die exportierte Datei tabuliert die Höhe (V) zur Zeit (s) der Signalspuren für das gesamte NOA-Experiment.
  2. Bestimmung der in die NOA injizierten Pikomole (pmol) von Nitrit, indem man die Nitritkonzentration (μM) mit dem Injektionsvolumen (μL) multipliziert.
  3. Mitteln Sie die Picomole (pmol) von Nitrit, gemessen in Kontrollen (zellfreie Medien, PBS-Waschpuffer oder RIPA-Puffer).
  4. Subtrahieren Sie die entsprechenden Kontrollwerte vom pmol, das bei jeder 50-μL-Probeinjektion gemessen wird.
  5. Bestimmen Sie die Gesamt-Pikomole (pmol) an Nitrit in jeder Probe, indem Sie das im injizierte Teil der Probe gemessene pmol mit dem genauen Gesamtprobenvolumen multiplizieren. Verwenden Sie 750 μL für das Medium, 150 μL für die apikale Waschung und etwa 90–100 μL für das Lysat.
  6. Zusätzlich multiplizieren Sie nur für Lysate den Gesamtnitrit-pmol mit 2, um den Verdünnungsfaktor zu berücksichtigen.
  7. Normalisieren Sie das für jede Probe erhaltene pmol Nitrit, indem Sie diese Werte durch die gesamte Proteinmenge (μg) im Lysat der entsprechenden Probe teilen, die zuvor durch den BCA-Test gewonnen wurde.
  8. Mittlere die Nitritwerte (pmol/μg) aus doppelten Injektionen für jede Probe.
  9. Diagrammieren Sie normalisierte Nitritwerte (pmol/μg des Gesamtproteins) für jede Probe mit der GraphPad Prism-Software.
  10. Bewerten Sie die Datenverteilung auf Normalität mit dem Shapiro-Wilk-Test.
  11. Führen Sie statistische Analysen mit einem zweiseitigen Schüler-T-Test durch.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Quantifizierung von Stickstoffmonoxid (NO) in Maus-Trachealepithelzellkulturen (MTEC), die an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) differenziert wurden. Primärzellen werden gemäß den etablierten Protokollen27,28 isoliert und differenziert. Im Verlauf von 21 Tagen bei ALI werden die Zellen zu einem pseudogeschichteten Atemwegepithel mit ciliierten Zellen27,28

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Mehrciliierte Zellen im Atemwegepithel sind entscheidend für NO Synthese und Signalgebung, was wiederum für die Regulierung des Ziliarschlags, der Mucoziliärbeseitigung und der Atemwegshomöostaseunerlässlich ist. NO ist ein hochreaktives Molekül, und selbst kleine Veränderungen der NO-Werte sind mit Atemwegserkrankungenassoziiert 1,2,3,4.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken Dr. Mark T. Gladwin (Dekan und Professor an der University of Maryland School of Medicine) für die Beratung beim Studiendesign. Wir danken außerdem dem Confocal Microscopy Core der University of Maryland School of Medicine (Baltimore, MD) für den Zugang zu konfokalen Mikroskopie-Ressourcen. Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss 5R01HL168775 des National Institutes of Health (NIH) an Dr. Paola Corti unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)ThermoFisher Scientific62248verdünnt 1:2000 für Immunfärbung
50 mL Zentrifugenrohrfilter (0,22 µm)CellTreat229710Zur Herstellung steriler Lösungen
500 mL FiltereinheitenThermoFisher Scientific566-0020Zur sterilen Medienzubereitung
AccutaseSigmaA6964
Amphoterecin BThermoFisher Scientific15290026
Bovines HypophysenextraktThermoFisher Scientific13028014
Bovines SerumalbuminSigmaA7906
Cholera ToxinSigmaC8052
Kollagen IThermoFisher ScientificA1048301
Konfokales MikroskopNikonW1 Spinning Disk Ti2 invertiertes Mikroskop mit Hamamatsu sCMOS-Kamera
Corning Transwell-EinsätzeSigmaCLS3460
Diethylentriamin NONOate (DETA-NONOate)Cayman Chemical82120
DMEM/F-12-MediumThermoFisher Scientific11330032
DNAse ISigmaDN25
Fetales bovines SerumSigmaF4135
Halt 1X ProteasehemmercocktailThermoFisher Scientific1860932
Ham's F1-12 NährstoffmischungThermoFisher Scientific11765054
InsulinlösungSigmaI0516
IsoproterenolhydrochloridSigmaI6504
Keratinozyten-serumfreies MediumThermoFisher Scientific17005042
Muriner epidermaler WachstumsfaktorSigmaE4127
N(G)-Nitro-L-Argininmethylester (L-NAME)SigmaN5751
NuSerumCorning355100
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333
Phosphatpufferlösung (PBS)ThermoFisher Scientific10010023
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23227
PronaseSigma10165921001
RetinsäureSigmaR2625
Rho-Kinase-Inhibitor (Y-27632 Hydrochlorid)Cayman ChemicalTOM-C837Z37
RIPA-PufferSigmaR0278
RPMI-1640-MediumThermoFisher Scientific11875093
Natriumnitrit SigmaS2252
TransferrinSigmaT8158
α-Acetylierte Tubulin-Antikörper (Maus)SigmaT6793verdünnt 1:200 für Immunfärbung
α-FoxJ1-Antikörper (Maus)ThermoFisher Scientific14-9965-80verdünnt 1:200 für Immunfärbung
α-MouseCy3-SekundärantikörperThermoFisher ScientificA10521verdünnt 1:1000 für Immunfärbung
γ-Sekretase-Inhibitor IX (DAPT)SigmaD5942

Referenzen

  1. Alcázar–Navarrete, B., Ruiz Rodríguez, O., Conde Baena, P, Romero Palacios, P. J., Agusti, A. Persistently elevated exhaled nitric oxide fraction is associated with increased risk of exacerbation in COPD. Eur Respir J. 2018;51(1):1701457.
  2. Krantz, C., Janson, C., Alving, K., Malinovschi, A. Nasal nitric oxide in relation to asthma characteristics in a longitudinal asthma cohort study. Nitric Oxide 2021;106:1–8.
  3. Thomas, S. R., Kharitonov, S. A., Scott, S. F., Hodson, M. E., Barnes, P. J. Nasal and exhaled nitric oxide is reduced in adult patients with cystic fibrosis and does not correlate with cystic fibrosis genotype. Chest 2000;117(4):1085–9.
  4. Shapiro, A. J. et al. Nasal nitric oxide measurement in primary ciliary dyskinesia. A technical paper on standardized testing protocols. Ann Am Thorac Soc. 2020;17(2):e1–e12 .
  5. Legendre, M., Zaragosi, L. E., Mitchison, H. M. Motile cilia and airway disease. Semin Cell Dev Biol. 2021;110:19–33.
  6. Li, D., Shirakami, G., Zhan, X., Johns, R. A. Regulation of ciliary beat frequency by the nitric oxide–cyclic guanosine monophosphate signaling pathway in rat airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000;23(2):175–81.
  7. Rochon, E. R. et al. Cytoglobin regulates NO-dependent cilia motility and organ laterality during development. Nat Commun. 2023;14(1): 8333.
  8. Mikhailik, A. et al. nNOS regulates ciliated cell polarity, ciliary beat frequency, and directional flow in mouse trachea. Life Sci Alliance 2021;4(5):e202000981.
  9. Schamberger, A. C., Staab–Weijnitz, C. A., Mise–Racek, N., Eickelberg, O. Cigarette smoke alters primary human bronchial epithelial cell differentiation at the air–liquid interface. Sci Rep. 2015;5:8163.
  10. Gindele, J. A. et al. Intermittent exposure to whole cigarette smoke alters the differentiation of primary small airway epithelial cells in the air–liquid interface culture. Sci Rep. 2020;10(1):6257.
  11. Ghosh, B. et al. Effect of sub-chronic exposure to cigarette smoke, electronic cigarette and waterpipe on human lung epithelial barrier function. BMC Pulm Med. 2020;20(1):216.
  12. Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. Air-liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: promises, challenges and future directions. Adv Nanobiomed Res. 2021;1(6):2000111.
  13. Bessa, M. J. et al. In vitro toxicity of industrially relevant engineered nanoparticles in human alveolar epithelial cells: Air-liquid interface versus submerged cultures. Nanomaterials (Basel) 2021;11(12):3225.
  14. Allouche, Y. et al. Comparison of submerged and air liquid interface exposure: limitations and differences in the toxicological effects evaluated in bronchial epithelial cells. Environ Res. 2025;279(Pt 2):121856.
  15. Li, J., LoBue, A., Heuser, S. K., Leo, F., Cortese-Krott, M. M. Using diaminofluoresceins (DAFs) in nitric oxide research. Nitric Oxide. 2021;115:44–54.
  16. Jiang S. et al. Real–time electrical detection of nitric oxide in biological systems with sub–nanomolar sensitivity. Nat Commun. 2013;4:2225. 
  17. Brown M. D, Schoenfisch M. H. Electrochemical nitric oxide sensors: Principles of design and characterization. Chem Rev. 2019;119(22):11551–75.
  18. Corti, P. et al. Globin X is a six-coordinate globin that reduces nitrite to nitric oxide in fish red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2016;113(30):8538–43.
  19. Zhao, X. J. et al. Mechanisms for cellular NO oxidation and nitrite formation in lung epithelial cells. Free Radic Biol Med. 2013;61:428–37.
  20. Lundberg, J. O. Weitzberg E, Gladwin MT. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2008;7(2):156–67.
  21. Rochon, E. R., Corti, P. Globins and nitric oxide homeostasis in fish embryonic development. Mar Genomics 2020;49:100721.
  22. Giordano, D., Verde, C., Corti, P. Nitric oxide production and regulation in the teleost cardiovascular system. Antioxidants (Basel) 2022;11(5):957.
  23. MacArthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S–nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007;851(1–2):93–105.
  24. Basu, S., Ricart, K., Gladwin, M. T., Patel, R. P, Kim-Shapiro, D. B. Tri-iodide and vanadium chloride based chemiluminescent methods for quantification of nitrogen oxides. Nitric Oxide 2022;121: 11–19.
  25. Brody, S. L., Yan, X. H., Wuerffel, M. K., Song, S. K., Shapiro, S. D. Ciliogenesis and left-right axis defects in forkhead factor HFH-4-null mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000;23(1): 45–51.
  26. Jain, R. et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2010;43(6): 731–9.
  27. Eenjes, E. et al. A novel method for expansion and differentiation of mouse tracheal epithelial cells in culture. Sci Rep. 2018;8(1): 7349.
  28. You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002;283(6): L1315–21.
  29. Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. Br J Pharmacol 1996;118(6):1433–40. 
  30. Rochon, E. R., Corti, P., Gladwin, M. T. Hemoglobin α in Pulmonary Endothelium: Ironing Out Nitric Oxide Signaling. Am J Respir Cell Mol Biol. 2017;57(6):639–41.
  31. van Faassen, E. E. et al. Nitrite as regulator of hypoxic signaling in mammalian physiology. Med Res Rev. 2009;29(5):683–741. 

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

MedizinAusgabe 233Ausgabe 233AlleAusgabeLeerer WertAusgabe
Messung der Stickstoffmonoxidproduktion in Maus-Tracheal-Epithelzellkulturen, die an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche differenziert wurden
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.