Ein Workflow zur Visualisierung der konformationalen Dynamik von Proteinen aus Kryo-EM-Karten mit humaner Asparagin-Synthetase

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie 3D-Variabilitätsanalyse (3DVA) in CryoSPARC und Variabilitätsverfeinerung in Phenix durchgeführt werden kann, um die konformationale Heterogenität in Kryo-EM-Daten zu analysieren. Anhand menschlicher Asparagin-Synthetase als Beispiel wird beschrieben, wie man Variabilitätskarten erzeugt, Hauptkomponenten visualisiert und entsprechende atomare Modelle verfeinert.

Abstract

Dieser Artikel präsentiert einen umfassenden Workflow zur Analyse der konformationalen Heterogenität in Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-(Kryo-EM)-Daten mittels 3D-Variabilitätsanalyse (3DVA) in CryoSPARC und Variabilitätsverfeinerung in Phenix. Das Protokoll beschreibt, wie Variabilitätsabbildungen entlang der Hauptkomponenten, die aus Teilchenbildern abgeleitet sind, berechnet, Hauptmodi struktureller Variation visualisiert und entsprechende Ensembles atomarer Modelle anhand einzelner Variabilitätsrahmen verfeinert werden kann. Die resultierenden Ausgaben umfassen eine Reihe von 3D-Variabilitätskarten, verfeinerte multimodellbasierte atomare Strukturen, die diskrete Konformationszustände darstellen, sowie Visualisierungsdateien, die sich für vergleichende Strukturanalysen und Filmgenerierung eignen. Dieser Workflow ist weitgehend auf Kryo-EM-Rekonstruktionen im Auflösungsbereich (typischerweise ~2,0–6,0 Å) anwendbar, wobei konformationelle Heterogenität auf Backbone- und Seitenkettenebene sinnvoll interpretiert werden kann. Er eignet sich besonders gut zur Erfassung von kontinuierlichen Domänenbewegungen, Scharnierbiegbewegungen und koordinierten lokalen Umordnungen, die sich nur durch diskrete Klassifikation nicht leicht lösen lassen. Der kombinierte Einsatz von Variabilitätskarten und verfeinerten Modellensembles ermöglicht einen direkten strukturellen Vergleich von Konformationsextremen, unterstützt quantitative Analysen wie RMSF-Berechnungen (RMSF) und bietet einen Rahmen zur Verbindung dynamischer struktureller Merkmale mit biochemischen oder funktionalen Hypothesen. Humane Asparaginsynthetase (ASNS) wird als Beispiel verwendet, um die praktische Umsetzung des Workflows zu demonstrieren.

Introduction

Die Charakterisierung der konformationalen Heterogenität in makromolekularen Strukturen ist ein zunehmend wichtiger Aspekt der Einteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-(Kryo-EM)-Analyse. Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen praktischen Arbeitsablauf bereitzustellen, um dominante Modi struktureller Variabilität direkt aus Kryo-EM-Datensätzen mittels dreidimensionaler Variabilitätsanalyse (3DVA) in CryoSPARC¹ kombiniert mit der Variabilitätsverfeinerung in Phenix² zu extrahieren, zu visualisieren und zu verfeinern. Dieser Artikel soll die Leser dabei helfen, festzustellen, ob dieser rechnergestützte Ansatz für ihre Daten geeignet ist und die Arten von Ausgaben zu verstehen, die vom Workflow generiert werden.

Traditionelle experimentelle Techniken (z. B. Wasserstoff-Deuterium-Austausch, NMR-Spektroskopie, Massenspektrometrie) liefern wertvolle Informationen zu Proteinbewegungen ^3,4,5, sind jedoch oft durch Molekülgröße, Probenanforderungen oder experimentelle Komplexität begrenzt. Fortschritte im Kryo-EM haben eine hochauflösende Strukturbestimmung für große und heterogene Systeme ermöglicht, was eine Analyse der Konformationsvariabilität innerhalb von Teilchenpopulationen ermöglicht. Die 3D-Variabilitätsanalyse (3DVA), implementiert in CryoSPARC¹, zerlegt Kryo-EM-Partikeldatensätze in Hauptkomponenten, die dominante, kontinuierliche Modi struktureller Variation beschreiben. In Kombination mit der Variabilitätsverfeinerung in Phenix² erzeugt dieser Ansatz atomare Modelle, die diskreten Positionen entlang jeder Hauptkomponente entsprechen, was die Visualisierung und den Vergleich alternativer Konformierungen aus experimentellen Daten ermöglicht.

Dieses Protokoll eignet sich am besten für Kryo-EM-Datensätze, die mit nahezu atomarer bis mittlerer Auflösung (typischerweise ~2–6 Å) rekonstruiert werden. Bei höheren Auflösungen kann der Workflow Rückgrat-Umstrukturierungen und begrenzte Side-Chain-Variabilität^{erfassen 6}, während er bei niedrigeren Auflösungen eher geeignet ist, Bewegungen auf Domänenebene oder sekundärer Struktur^{zu identifizieren 2,7}. Die Methode eignet sich, um dominante, kontinuierliche Bewegungsmodi zu erfassen, die breit im Datensatz vorhanden sind, wie Scharnierbewegungen, Domänenatmung oder koordinierte Umstellungen zwischen Domänen oder Untereinheiten. Ausreichende Partikelzahlen und Winkelabdeckung sind unerlässlich, und die Interpretation kann in flexiblen oder schwach aufgelösten Regionen eingeschränkt sein, in denen die Seitenkettenpositionen unklar bleiben. Im Vergleich zu fokussierten Klassifikationsstrategien⁸ oder umfangreichen Unterklassifikationsstrategien stellt der 3D-Variabilitätsverfeinerungs-Workflow die konformationelle Heterogenität als kontinuierliche Trajektorien und nicht als diskrete Klassen dar. Dies macht die Methode besonders nützlich für die explorative Analyse von Enzymen, molekularen Maschinen und Multidomänenkomplexen, die voraussichtlich mehrere Konformationen probieren.

Humane Asparaginsynthetase (ASNS) wird als anschauliches Beispiel verwendet, um die Umsetzung des Protokolls zu demonstrieren. ASNS ist eine glutaminabhängige Amidotransferase, die aus zwei funktionellen Domänen besteht, die durch einen intramolekularen Ammoniaktunnel ^9,10 verbunden sind. Frühere Studien haben nahegelegt, dass Konformationsänderungen mit Resten wie Arg-142 zur Modulation dieses Tunnels⁶ beitragen. In diesem Artikel dient ASNS ausschließlich als repräsentatives System, um zu demonstrieren, wie 3DVA und Variabilitätsverfeinerung Variabilitätskarten, verfeinerte atomare Modellensembles und Visualisierungen erzeugen. Eine detaillierte mechanistische Interpretation wird den Abschnitten Ergebnisse und Diskussion überlassen. Obwohl Molekulardynamik-(MD)-Simulationen oft als ergänzender Ansatz zur Erforschung von Konformationslandschaften^11,12 verwendet werden, ist MD für dieses Protokoll nicht erforderlich. Vergleiche mit MD-Simulationen können als optionale nachgelagerte Analyse durchgeführt werden, aber der hier beschriebene Workflow (Abbildung 1) konzentriert sich ausschließlich darauf, konformationelle Heterogenität aus Kryo-EM-Daten zu extrahieren und zu visualisieren.

Abbildung 1. Workflow-Überblick. Eine Konsens-Kryo-EM-Abbildung wird aus Einzelteilchendaten rekonstruiert und einer dreidimensionalen Variabilitätsanalyse (3DVA) unterzogen, um Variabilitätskarten entlang der Hauptkomponenten zu erzeugen. Variabilitätsverfeinerung (Phenix.varref) verwendet das Konsens-Atommodell, um entsprechende atomare Modelle zur Visualisierung und zum Vergleich zu erstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Protocol

1. Datenvorbereitung

1. Erstellung der Konsens-EM-Karte
   1. Verwenden Sie die Einteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), um die konsensusvolle 3D-Struktur des makromolekularen Komplexes zu bestimmen.
   2. Verglaste Proben auf Kryogittern und bilde mit einem Hochspannungs-Transmissionselektronenmikroskop mit einem direkten Elektronendetektor ab.
   3. Verarbeiten Sie die gesammelten Filme, um strahlinduzierte Bewegungen zu korrigieren, Bildparameter zu schätzen und Teilchenbilder auszuwählen.
   4. Führen Sie iterative Klassifikation und Verfeinerung der Teilchen durch, um eine Konsens-EM-Karte zu erzeugen.
   5. Führen Sie Datenverarbeitung mit CryoSPARC (v4 oder höher)¹³ durch, da eine 3D-Variabilitätsanalyse (3DVA) implementiert wird.
2. Generiere ein Konsensmodell
   1. Baue ein atomares Modell und verfeinere es anhand der Konsenskarte. Validiere die verbesserte Modellqualität anhand der Standardkriterien
      HINWEIS: Für ASNS wurde die Struktur mittels einer vorlagenbasierten Partikelauswahlstrategie bestimmt. Die von der Röntgenstruktur von DON-modifizierten menschlichen ASNS (PDB 6GQ3)⁹abgeleitete Vorlage wurde verwendet, um hochwertige Partikel in CryoSPARC¹³ effizient auszuwählen. Diese Teilchen durchliefen iterative Runden der 2D-Klassifikation, Ab-initio-Rekonstruktion sowie heterogener und nicht-uniformer Verfeinerung mit auferlegter C2-Symmetrie, was eine 3,5-Å-Konsensabbildung ergab. Das atomare Modell wurde erzeugt, indem die Kristallstruktur⁹ in die EM-Karte verwendet wurde, gefolgt von Realraum-Verfeinerungen in Phenix^14,15 und manueller Anpassung in Coot¹⁶, wodurch die endgültige Konsensstruktur ASNS wie^{beschrieben 6} entstand.

2. Durchführung von 3D-Variabilitätsanalysen (3DVA)

1. Verwenden Sie den Partikelstapel und die Maske (nicht eine finale, verfeinerte Karte) für eine endgültige Verfeinerung
   HINWEIS: Oft werden die Ergebnisse einer nicht-uniformen Verfeinerungsarbeit für 3DVA verwendet.
2. Erstelle einen 3D-Variabilitätsjob in CryoSPARC. Geben Sie den Partikelstapel und die Maske aus dem nicht-uniformen Verfeinerungsauftrag ein.
3. Setze die Anzahl der zu lösenden Modi: Anzahl der Hauptkomponenten (PCs) auf 5.
   HINWEIS: Da makromolekulare Strukturen im dreidimensionalen Raum existieren, sind in der Regel mindestens drei PCs erforderlich, um ihre wichtigsten räumlichen Bewegungsmoden zu beschreiben. Um sicherzustellen, dass zusätzliche, potenziell kleinere, aber funktional relevante Konformationsvariationen nicht übersehen wurden, wurden zwei weitere PCs hinzugefügt.
4. Stelle die Filterauflösung auf 4,0 Å und die Hochpassauflösung auf 20. Lassen Sie alle anderen Parameter als Standard. Fang den Job an.
   HINWEIS: Die "Filterauflösung" von 4,0 Å wurde so eingestellt, dass sie der Gesamtqualität des Datensatzes entspricht und gleichzeitig Überanpassung durch hochfrequentes Rauschen vermieden wird. Da die endgültige Konsensabbildung mit einer Auflösung von 3,5 Å bestimmt wurde, stellte die Anwendung einer etwas niedrigeren Filterauflösung (4,0 Å) sicher, dass sich die Variabilitätsanalyse auf echte strukturelle Bewegungen und nicht auf Rauschen nahe der Auflösungsgrenze konzentrierte.
5. Erhalten Sie eine Menge von Variabilitätsvolumina als Ausgabe (Abbildung 2A)

3. Durchführung einer 3D-Variabilitätsanzeige

1. Erstellen Sie in CryoSPARC einen 3D-Variabilitätsanzeige-Job, um die durch den 3DVA identifizierten kontinuierlichen Konformationsänderungen zu visualisieren.
2. Geben Sie den Partikelstapel und die durch den 3DVA-Job generierten Variabilitätsvolumen ein.
3. Wählen Sie Simple als Ausgabemodus (siehe unten).
4. Stelle die Filterauflösung auf 4,0 und die Hochpassauflösung auf 20. Lassen Sie alle anderen Parameter auf ihren Standardwerten. Fang den Job an.
5. Erhalten Sie 20 Variabilitätsabbildungen als Ergebnis (Rahmen 0 bis 19), die 5 Hauptkomponenten (PC) von 0 bis 4 entsprechen (Abbildung 2B)
   HINWEIS: Der "einfache Modus" im 3D-Variabilitätsanzeigeprogramm bietet eine einfache Visualisierung der Konformationsänderungen entlang jeder Hauptkomponente. Dieser Modus erzeugt lineare Trajektorien zwischen den durch 3DVA identifizierten Extremzuständen, was eine klare, direkte Interpretation der Bewegungen innerhalb der Teilchenpopulation ermöglicht.

4. Datenvorbereitung für Filme und Phenix 3D-Variablenverfeinerung

1. Laden Sie 3DVA-Variabilitätskarten herunter: Laden Sie die Zip-Dateien mit Variabilitätskarten für PCs 0-4 (insgesamt fünf Zips) von CryoSPARC herunter.
2. Verzeichnisse organisieren: Einen übergeordneten Ordner erstellen (z. B. 3DVA/). Innerhalb erstelle für jede Hauptkomponente einen Unterordner (comp0, comp1, comp2, comp3, comp4).
3. Verschieben Sie jeden Zip in den entsprechenden Ordner und entpacken Sie den Inhalt.
4. Bestätigen Sie, dass jeder Ordner 20 Variabilitätskarten enthält (Frames 0-19) und wiederholen Sie das für comp1-comp4.
   HINWEIS: Pflegen Sie separate Ordner für jede Hauptkomponente, um das Mischen von Frames auf PCs zu verhindern.

5. Schnelle Filme in UCSF Chimera vorbereiten (Optional) ¹⁷

1. Öffnen Sie das Werkzeug Volume Series: Starten Sie Chimera und gehen Sie dann zu Tools → Volume Data → Volume Series. Ein neues Volume Series-Fenster wird geöffnet.
2. Laden Sie die Karten: Klicken Sie auf Öffnen und wählen Sie die 20 Karten aus, die einer Hauptkomponente entsprechen (z. B. comp0).
3. Visualisierungsparameter anpassen: Volume-Viewer öffnen, die entsprechende Dichteschwelle einstellen und der Karte eine Farbe zuweisen.
   HINWEIS: In diesem Beispiel wurde Himmelblau verwendet (Abbildung 3).
4. Vorschaubewegung: Im Volume Series-Fenster setzen Sie die Abspielrichtung auf Oszillieren und klicken Sie dann auf Play, um einen kontinuierlichen Übergang von Bild 0 → 19 → 0 anzuzeigen.
5. Wiederholen Sie dies für zusätzliche Komponenten: Wiederholen Sie die Schritte 5.2-5.4 für andere Hauptkomponenten bei Bedarf.
6. Erzeugen Sie eine Filmdatei mit Kommandozeileneingabe: Exportieren Sie einen Film, indem Sie die Chimera-Kommandozeile öffnen und Supplementary Coding File 1 ausführen.
   HINWEIS: Die pro-komponentige, 20-Frame-MRC-Serie (z. B. compX_frame000-019.mrc) sind die Eingänge für die Phenix 3D-Variablenverfeinerung. Halte Komponentenordner getrennt (comp0-comp4), um Frames zwischen PCs zu vermeiden.

6. Modellgenerierung durch Variabilitätsverfeinerung in Phenix

HINWEIS: Phenix.varref kann aus jedem Verzeichnis ausgeführt werden, solange die vollständigen Pfade zu den Eingabekarten und dem Modell angegeben sind. Zur organisatorischen Klarheit wird jedoch empfohlen, die Verfeinerung in einem eigenen Unterverzeichnis für jeden PC durchzuführen.

1. Kopieren Sie die endgültige verfeinerte Konsensmodelldatei in das Unterverzeichnis, das zu jedem PC gehört.
2. Innerhalb jedes Unterverzeichnisses führen Sie Phenix.varref aus der Kommandozeile mit folgender Syntax aus:
   phenix.varref consensus_model.pdb *frame_*.mrc resolution=4 nproc=20 models_per_map=50
3. Stelle die Auflösung auf 4,0 Å ein, um der effektiven Auflösung der 3DVA-Karten zu entsprechen
4. Setzen Sie nproc auf die Anzahl der verfügbaren Prozessoren (20 in diesem Beispiel, aber dies kann je nach verfügbaren Rechenressourcen variieren)
5. Setze models_per_map auf 50 Modelle (Standard).
   HINWEIS: Für jede Karte werden 50 Modelle generiert, deren Fixierungen an die Auflösung der 3DVA-Daten angepasst sind. Das am besten geeignete Modell für jede Karte wird automatisch beibehalten. Die resultierende Ausgabedatei enthält 20 verfeinerte Modelle, die den 20 Variabilitätskarten entsprechen. Die Ausgabe besteht aus einem PDB-Bündel mit 20 verfeinerten Modellen sowie einzelnen Kartendateien.
6. Wenden Sie während der Variabilitätsverfeinerung keine zusätzliche Kartenschärfung an. Verwenden Sie die von CryoSPARC generierten Variabilitätskarten (gefiltert bei 4,0 Å) direkt als Eingaben für phenix.varref.

7. Visualisierung

1. Öffnen Sie das PDB-Bundle in ChimeraX¹⁸ , um alle 20 verfeinerten Modelle gleichzeitig zu laden.
2. Verwenden Sie das Modelle-Panel, um einzelne Frames oder spezifische interessante Modelle selektiv zum Vergleich und zur Analyse anzuzeigen (Abbildung 4). Alternativ kann jedes verfeinerte Modell auch einzeln in ChimeraX oder Chimera geöffnet werden.

8. Datenvorbereitung für die Analyse

HINWEIS: Durch das Ausführen der obigen Syntax wird ein PDB-Bundle erzeugt, das 20 Variablenmodelle und jede einzelne Abbildung enthält. Für die meisten Analysen sind nur zwei Modelle erforderlich – entsprechend dem Bild 0 und Bild 19 –, da sie die beiden extremen Konformationszustände entlang der ausgewählten Hauptkomponente (PC) darstellen.

1. Öffnen Sie das PDB-Bündel in ChimeraX, wählen Sie Modell 1.1 (Frame 0) und Modell 1.20 (Frame 19) und speichern Sie jedes Modell als separate PDB-Datei (Abbildung 4).
2. Bearbeiten Sie die resultierenden PDB-Dateien, um interessierende Rückstände zu isolieren. Dies kann manuell oder mit Phenix.pdb.tools erfolgen.
3. Vergleichen Sie die beiden modifizierten PDB-Dateien, um Konformationsänderungen in Rückgrat- oder Seitenketten zu identifizieren.
4. Um die beiden PDB-Modelle zu vergleichen, überlagern Sie die modifizierten Strukturen mithilfe der MatchMaker-Funktion in Chimera.
   HINWEIS: Für eine zuverlässige Ausrichtung benötigt MatchMaker in der Regel mindestens 10–15 überlappende Rückstände. In unserem Fall wurden nur 6 Residuen analysiert; eine erfolgreiche Superposition wurde jedoch durch die Nutzung der homodimeren Natur von ASNS erreicht – während in Kette A nur 6 Reste verblieben, war Kette B intakt und diente als Referenz für die Ausrichtung.

Results

Dieser Abschnitt präsentiert repräsentative Ausgaben, die durch die 3D-Variabilitätsanalyse (3DVA) und den Workflow zur Variabilitätsverfeinerung generiert werden, und gibt Hinweise zu deren Interpretation. Humane Asparaginsynthetase (ASNS) wird als illustrativer Datensatz verwendet, um erfolgreiche Ergebnisse, gemeinsame Artefakte und vergleichende Analysen zu demonstrieren, die durch das Protokoll ermöglicht werden. Der vollständige Satz der von 3DVA abgeleiteten Variabilitätskarten und die entsprechenden verfeinerten ...

Discussion

Kritische Protokollschritte und Entscheidungspunkte
Die effektive Nutzung dieses Protokolls hängt von mehreren wichtigen Schritten im Workflow ab. Die Qualität des Partikelstapels und der Maske, die für die endgültige Cryo-EM-Verfeinerung verwendet werden, ist entscheidend, da die 3D-Variabilitätsanalyse (3DVA) direkt auf diesen Eingängen arbeitet und nicht auf einer nachbearbeiteten Karte. Die Auswahl der Anzahl der Hauptkomponenten (PCs) sollte die Größe des Datensa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC v4.4+	Structura Biotechnologie	https://cryosparc.com	Software für die Kryo-EM-Verarbeitung
Phenix v1.24+	Phenix-Konsortium	https://phenix-online.org	Software zur Verfeinerung der Variabilität
UCSF Chimera	Ressource für Biocomputing, Visualisierung und Informatik, UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/	Software für molekulare Visualisierung
UCSF ChimeraX	Ressource für Biocomputing, Visualisierung und Informatik, UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Software für molekulare Visualisierung
CPPTRAJ	AMBER Molekulardynamik-Softwaresuite	https://amberhub.chpc.utah.edu/cpptraj/	Python-Werkzeuge zur RMSF-Berechnung
Linux Workstation (hauseigenes GPU-basiertes System)
Workstation-Case	Supermicro	https://www.supermicro.com	Workstation-Gehäuse: Supermicro CSE-743TQ-1200B-SQ 1200W 4U Server Super Chassis
CPU	Intel	https://www.intel.com	CPU: XEON E5-2690V3 x2
Mother Board	Supermicro	https://www.supermicro.com	Motherboard: Supermicro Extended ATX DDR4 LGA 2011 Motherboard X10DAI-O
Erinnerung	Entscheidend	https://www.crucial.com	Speicher: Crucial 64GB Kit (16GBx4) DDR4 2133 (PC4-2133) DR x4 ECC Registriert. 288-Pin-Serverspeicher CT4K16G4RFD4213 / CT4C16G4RFD4213 x2
Festplatte	Western Digital	https://www.westerndigital.com	HDD: WD RE 4TB Unternehmensfestplatte
RAID CONTROLLER	LSI-Logik	https://www.broadcom.com	RAID-CONTROLLER: LSI-LOGIK MegaRAID SAS 9271-8i Kit
GPU	NVIDIA	https://www.nvidia.com	Quadro M6000 Grafikkarte mit 24 GB GDDR5-Speicher