Charakterisierung tumorinduzierter Ataxie in einem vestibulären Schwannom-Mausmodell

Zusammenfassung

Wir entwickelten ein Panel von Verhaltensanalysen, um tumorinduzierte Ataxie zu untersuchen und Therapien zu evaluieren, die die neurologische Funktion in einem Mausmodell des vestibulären Schwannoms erhalten.

Zusammenfassung

NF2-bezogene Schwannomatose (NF2-SWN) ist ein autosomaldominantes Tumorprädispositionssyndrom, das durch Keimlinienmutationen im NF2-Tumorsuppressorgen verursacht wird. Die Krankheit ist durch die Entwicklung beidseitiger vestibulärer Schwannome (VSs) gekennzeichnet, die sich zunehmend vergrößern und zu Hörverlust, Ungleichgewichten und Ataxie-Symptomen führen, die die Lebensqualität der Patienten tiefgreifend beeinträchtigen. Derzeit sind keine von der FDA zugelassenen pharmakologischen Behandlungen verfügbar. Unter den neurologischen Defiziten bleibt die Ataxie eine besonders belastende, aber wenig erforschte Manifestation, hauptsächlich aufgrund des Mangels an robusten präklinischen Modellen für deren Bewertung. In dieser Studie entwickelten wir eine Reihe von Verhaltenstests, um systematisch tumorinduzierte Ataxie in einem orthotopen Mausmodell von VS-assoziiertem Hörverlust und Ataxie zu untersuchen. Diese Tests ermöglichen eine quantitative Messung von Gleichgewichts- und motorischen Koordinationsdefiziten, die durch die Tumorlast entstehen. Diese experimentelle Plattform ermöglicht mechanistische Studien der tumorinduzierten Kleinhirndysfunktion und bietet ein wertvolles Werkzeug für die präklinische Bewertung therapeutischer Strategien. Durch die Integration von Verhaltensanalysen mit Tumorbiologie- und Hörtests erleichtert dieser Ansatz die Charakterisierung sowohl tumorsuppressiver als auch neuroprotektiver Behandlungseffekte. Letztlich bieten diese Assays einen vielseitigen Rahmen, der auch auf andere neurologische Erkrankungen mit Ataxie angewendet werden kann, wodurch ihre Nützlichkeit über NF2-SWN hinaus erweitert wird.

Einleitung

NF2-bezogene Schwannomatose (NF2-SWN) ist ein seltenes, überwiegend vererbtes Tumorprädispositionssyndrom, das durch Mutationen im NF2-Tumorsuppressorgen verursacht wird, das das zytoskelettale Protein Merlin¹ codiert. Der Verlust der Merlin-Funktion stört die Signalwege, die Zellproliferation, Adhäsion und Überleben regulieren, wodurch betroffene Personen anfällig für die Entwicklung mehrerer gutartiger Tumoren des Nervensystems sind. Das Kennzeichen von NF2-SWN ist die Entstehung beidseitiger vestibulärer Schwannome (VSs) – nicht-maligne, von Schwannzellen abgeleitete Tumore, die entlang der vestibulocochlearen Nerven entstehen. Diese Tumore vergrößern sich allmählich, komprimieren benachbarte neuronale Strukturen und führen zu sensorineuralem Hörverlust, Tinnitus und Funktionsstörungen des Gesichtsnervs.

Patienten mit beidseitigen VS erleiden häufig fortschreitende Schäden am Vestibularnerv und am vestibulären Apparat des Innenohrs, was zu einer lähmenden vestibulären Dysfunktion führt, die sich in chronischem Ungleichgewicht, Ataxie und Ganginstabilität äußert, was die Mobilität und Lebensqualität stark beeinträchtigt³. Das Ausmaß der vestibulären Dysfunktion korreliert oft mit der Tumorbelastung und der Nervenbeteiligung. Diese Symptome bestehen oft auch nach Tumorkontroll- oder Hörerschutzmaßnahmen, was auf komplexe neurobiologische Mechanismen hinausgeht, die über mechanische Kompression^{hinausgehen 4,5}. Obwohl klinische Werkzeuge wie Schwindelbehinderungsinventarisierungen, Ganganalyse, Vestibulo-Okularreflex (VOR)-Tests und Posturographie zur Quantifizierung vestibulärer Beeinträchtigungen verwendet werden, sind die zugrunde liegenden Mechanismen der tumorinduzierten Ataxie weiterhin wenig verstanden³. Trotz Fortschritten im molekularen Verständnis und der Einführung gezielter Therapien wie Bevacizumab gibt es keine von der FDA zugelassene Behandlung, die sowohl Hör- als auch Gleichgewichtsfunktion bei Patienten mit NF2-SWN zuverlässig bewahrt. Die Behandlung der vestibulären Symptome bleibt weitgehend unterstützend und weist auf einen großen ungedeckten klinischen Bedarf hin.

Ein großes Hindernis für die Verbesserung des klinischen Managements der VS-assoziierten Ataxie ist das Fehlen präklinischer Modelle, die die bei Patienten beobachteten vestibulären und motorischen Koordinationsdefizite getreu reproduzieren. Die meisten vorhandenen VS-Tiermodelle konzentrieren sich auf Tumorwachstum oder Hörverlust, ohne die charakteristischen Balance- und Koordinationsstörungen zu wiederholen. Darüber hinaus sind standardisierte Verhaltenstests zur objektiven Beurteilung von Ataxie und vestibulärer Dysfunktion in präklinischen Einrichtungen nicht gut etabliert. Diese Lücke behindert mechanistische Untersuchungen und begrenzt die Bewertung von Kandidatentherapien, die auf die Erhaltung der vestibulären Funktion abzielen.

Hier berichten wir über die Entwicklung eines VS-Mausmodells, das messbare Ataxiephänotypen aufweist, zusammen mit einem Panel von Verhaltensanalysen, die speziell zur Quantifizierung tumorinduzierter Ataxie entwickelt wurden. Dieses Modell bietet eine dringend benötigte Plattform zur Untersuchung der Mechanismen hinter der VS-assoziierten vestibulären Dysfunktion und zur Bewertung der Wirksamkeit therapeutischer Interventionen, die darauf abzielen, Gleichgewicht, Koordination und allgemeine neurologische Funktion bei Patienten mit NF2-SWN wiederherzustellen.

Protokoll

Tierversuche wurden gemäß dem vom Institutional Animal Care and Use Committee von General Brigham (MGB) genehmigten Protokoll durchgeführt.

1. Tiermodell

1. Inokuliere Nf2^-/- Zellen (murine Nf2^{-/Schwann-Zellen}, die Gaussia-Luciferase-Reportergen, Gluc) in immunkompetente C57/FVB-Mäuse einsetzen. Mit einem stereotaktischen Injektionsgerät (Abbildung 1A) wird jede Maus mit 1 μL von 2.500 Tumorzellen in den CPA-Bereich der rechten Hemisphäre ^4,6 injiziert.
2. Verwenden Sie sowohl männliche als auch weibliche Mäuse (Verhältnis 1:1) im Alter von 8 bis 12 Wochen, um eine ausreichende statistische Stärke sicherzustellen und mögliche geschlechtsbedingte Unterschiede zu untersuchen. Hausmäuse in Gruppen von 4 pro Käfig unter einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Zyklus, wobei Futter und Wasser ad libitum verfügbar sind.
   HINWEIS: Da sich Schwannome in den vestibulären Nerven der Patienten entwickeln, haben wir das Cerebellopontine Angle (CPA)-Modell verwendet. Das CPA-Modell repapituliert die intrakranielle Mikroumgebung von VSs.
3. Sham-Gruppe: Zur Bewertung der Auswirkungen von Tierchirurgie und Tumorzellimplantation auf die Ataxie wird eine Sham-Operationsgruppe aufgenommen, in der Mäuse eine Scheinoperation und die Injektion von Kochsalzlösung in den CPA-Bereich unterzogen wurden.
4. Beziehen Sie eine nicht-tumortragende Gruppe von Mäusen als Kontrollgruppe ein.
5. Um den Tumorverlauf zu überwachen, verwenden Sie Nf2^-/- Zellen, die das Gaussia-Luciferase-Reporter-Gen (Gluc) exprimieren, und messen Sie alle 3 Tage nach der Einpflanzung den Plasmagluc.
6. Sammeln Sie kurz 13 μL Blut in die EDTA-Röhren, um Gerinnung zu verhindern. Übertragen Sie die Blutprobe auf eine 96-Well-Platte und messen Sie die zuvor beschriebene^{Gluc-Aktivität} 6,7,8,9.

2. Ataxietests

1. Führen Sie die vier Verhaltenstests in einer festen Reihenfolge durch, um die Variabilität zwischen Tieren zu minimieren. Führen Sie die Tests in folgender Reihenfolge durch: (1) Hintergliedmaßen-Klammertest, (2) Kantentest, (3) Gangbewertung und (4) Kyphose-Bewertung. Zwischen den Tests sollten Sie ein Mindestruheintervall von 2–5 Minuten einplanen, indem Sie die Maus wieder in ihren Heimatkäfig zurückbringen. Überwachen Sie das Tier während der Ruhephasen und gehen Sie erst dann zum nächsten Test über, wenn das normale Erkundungsverhalten wieder aufgenommen wird. Beenden Sie die Tests, wenn Anzeichen von übermäßigem Stress oder Müdigkeit festgestellt werden. Führen Sie den vollständigen Satz von vier Ataxie-Tests für eine Kohorte von 10 Mäusen innerhalb von etwa 45–60 Minuten durch, einschließlich der Ruheintervalle zwischen den Tests.
2. Hintergliedmaßen-Verschlusstest
   HINWEIS: Der Hintergliedmaßen-Clasping-Test bewertet neuromuskuläre Koordination, motorischen Tonus und Haltungskontrolle bei Mäusen. Mäuse mit Ataxie zeigen Hintergliedmaßenrückzug oder Umklammern zum Abdomen, was auf eine beeinträchtigte motorische Koordination^und Muskeltonusregulation hinweist.
   1. Greifen Sie die Maus sanft am Schwanzansatz und sorgen Sie für einen sicheren, aber leichten Halt, um Unbehagen zu vermeiden. Stützen Sie das Tier kurz auf dem Käfigdeckel oder der Hand, bevor Sie es heben, um die Erschreckreaktion zu verringern.
   2. Heben Sie die Maus langsam an, sodass sie mit vollständig ausgestrecktem Körper und frei von Hindernissen in der Luft schwebt. Halten Sie die Maus mindestens 10 cm über dem Käfig oder der Testfläche.
   3. Halten Sie die schwebende Position etwa 10 Sekunden lang und beobachten Sie die Position der Hintergliedmaßen und des Schwanzes, ohne das Tier zu drehen oder zu schwingen.
   4. Beurteile die Hintergliedmaßenhaltung wie unten beschrieben.
      1. Identifizieren Sie die normale Haltung, wenn beide Hintergliedmaßen nach außen und vom Bauch wegragen.
      2. Erkennen Sie eine abnormale Haltung, wenn sich ein oder beide Gliedmaßen zum Bauchbereich zurückziehen oder sich überkreuzen, was auf ein Verschließen der Hintergliedmaßen hinweist, das mit Ataxie oder neurologischer Beeinträchtigung verbunden ist.
   5. Zeichnen Sie das Verhalten mit einem vordefinierten Bewertungssystem auf oder nehmen Sie ein kurzes Video für eine blinde Post-hoc-Analyse auf.
      HINWEIS: Begrenzen Sie jede Prüfung auf ≤10 s, um Stress zu minimieren.
3. Kantentest
   HINWEIS: Der Kantentest bewertet Gleichgewicht, Koordination und Feinmotorik bei Mäusen. Er misst die Fähigkeit des Tieres, auf einer schmalen Kante zu laufen und sicher zum Haus-Käfig hinabzusteigen, ohne das Gleichgewicht zu verlieren. Mäuse mit Kleinhirndysfunktion oder vestibulärer Ataxie zeigen während dieser Aufgabe typischerweise Ausrutschen, Stürze oder eine instabile Haltung⁵.
   1. Stellen Sie den Käfig auf eine stabile, ebene Fläche in Bankgröße (~1 m).
   2. Verbinden Sie ein Ende des Testkäfigs (Abbildung 1C) mit dem Gehäusegehäuse (Abbildung 1D) und stellen Sie sicher, dass zwischen den Käfigen kein vertikaler Spalt oder ein Hindernis besteht, sodass die Maus ruhig und natürlich in ihren Stammkäfig hinabsteigen kann (Abbildung 1B), ohne zu springen oder zu fallen.
   3. Positionieren Sie eine Videokamera auf einem Stativ, das zur Kante in einem Winkel von 30° bis 45° zeigt, um sowohl seitliche Bewegung als auch Abstieg festzuhalten.
   4. Passen Sie die Beleuchtung so an, dass Blendung minimiert und die Gliedmaßen und der Schwanz der Maus gut sichtbar werden.
   5. Heben Sie die Maus vorsichtig an der Basis des Schwanzes an und stützen Sie ihren Körper mit der anderen Hand. Platziere die Maus in die Mitte des Sims, sodass alle vier Pfoten auf der Oberfläche sind. Lass den Schwanz nur los, wenn die Maus ausgewogen und aufmerksam erscheint.
   6. Erlaube der Maus, frei auf dem Sims entlangzugehen, ohne äußere Aufforderungen. Nehmen Sie die Maus mindestens 10 Sekunden lang auf oder bis sie in den Käfig hinabsteigt.
   7. Beobachte seine Fähigkeit, auf dem Sims zu balancieren, ohne auszurutschen, und auf dem Sims entlang zum Käfig oder der Plattform zu gehen.
   8. Führe drei unabhängige Versuche pro Maus durch, mit einem Ruheintervall von ~2 Minuten zwischen den Versuchen. Reinigen Sie die Kantenoberfläche zwischen den Tieren mit 70 % Ethanol, um Geruchsspuren zu entfernen.
   9. Führen Sie alle Tests in einer ruhigen Umgebung mit gleichmäßiger Beleuchtung und minimalem Hintergrundrauschen oder Vibrationen durch. Vermeiden Sie es, den Test am selben Tag zu oft zu wiederholen, da Müdigkeit und Lerneffekte die Leistung beeinflussen können.
4. Gangbewertung
   HINWEIS: Der Gangbewertungstest bewertet die Lokomotorik-Koordination, das Schrittmuster und die Haltungsstabilität bei frei bewegenden Mäusen. Mäuse mit Ataxie zeigen oft verkürzte Schrittlänge, unsichere Bewegungen und unregelmäßige Pfotenposition, was auf Koordinations- und Gleichgewichtsdefizite hinweist.
   1. Eine gerade, flache Startbahn mit weißem Kopierpapier (8,5 × 11 Zoll) ausrichten. Stellen Sie den Hauskäfig ans Ende des Papiers, um die Maus zum Laufen über das Papier zu ermutigen.
   2. Bedecken Sie die Vorder- und Hinterpfoten leicht mit zwei kontrastierenden Farben (z. B. Blau für Vorderpfoten, Rot für Hinterpfoten) mit einem giftfreien Tintenpad (Abbildung 1E).
   3. Platziere die Maus am Startende der Landebahn und lass sie frei über das Papier laufen, ohne dass äußere Bewegungen nötig sind.
   4. Beobachten und messen Sie die folgenden Parameter:
      Schrittlänge: der Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Platzierungen derselben Pfote.
      Grundbreite: der seitliche Abstand zwischen linken und rechten hinteren Fußabdrücken.
   5. Führen Sie zwei bis drei Durchläufe pro Maus durch, wobei Sie zwischen den Tests eine Pause einlassen.
      HINWEIS: Verwenden Sie ungiftige, schnell trocknende Tinte und achten Sie darauf, dass nur die Pfotenpolster beschichtet sind. Setzen Sie das Papier nach jedem Versuch wieder ein, um Verschmieren zu vermeiden. Tragen Sie Tinte sparsam auf, um das Verwischen von Fußabdrücken zu vermeiden, da zu viel Tinte die Genauigkeit der Schrittmessungen verringert.
5. Kyphosebewertung
   HINWEIS: Die Kyphosebewertung bewertet die Wirbelsäulenausrichtung und Haltungsanomalien während der natürlichen Fortbewegung. Mäuse mit neurologischer oder muskulärer Dysfunktion zeigen oft eine anhaltende dorsale Krümmung oder Krümmung der Wirbelsäule⁵.
   1. Stellen Sie die Maus auf eine Oberfläche und lassen Sie sie mehrere Sekunden lang frei laufen oder erkunden. Vermeiden Sie es, das Tier zu erschrecken, da plötzliche Bewegungen die Körperhaltung vorübergehend verändern können.
   2. Nehmen Sie ein kurzes Video aus der Seitenansicht auf, um die Kofferraumkrümmung zu dokumentieren.
   3. Beobachten Sie die Haltung der Maus beim Gehen, wobei Sie sich auf die Ausrichtung der Wirbelsäule und die Krümmung des Rumpfes konzentrieren, wie unten beschrieben.
      1. Identifizieren Sie die normale Haltung, wenn die Maus einen geraden oder leicht gewölbten Rücken mit sanften Körperbewegungen beibehält.
      2. Identifizieren Sie eine abnormale Haltung, wenn die Maus Kyphose zeigt, gekennzeichnet durch eine ungewöhnlich gekrümmte oder gekrümmte Wirbelsäule, einen steifen Rumpf und verminderte Flexibilität beim Gang.

3. Ataxie-Testanalyse

HINWEIS: Führen Sie alle Verhaltensbewertungen durch einen Beobachter durch, der für experimentelle Gruppenzuweisung blind ist, um den Beobachter-Bias zu minimieren.

1. Wertung von Rand-Tests
   1. Vergebe eine Punktzahl von 3, wenn die Maus sanft über die Kante läuft, das Gleichgewicht hält und ohne Ausrutschen in den Käfig hinabsteigt.
   2. Setzen Sie eine Punktzahl von 2, wenn die Maus leichte Beeinträchtigungen zeigt, wie zögerlich oder ein leichtes Ausrutschen der Pfote, aber sich erholt und sicher hinabsteigt.
   3. Setzen Sie eine Punktzahl von 1 zu, wenn die Maus eine moderate Beeinträchtigung zeigt, einschließlich häufiger Ausrutscher, einer geduckten Haltung, übermäßiger Schwanznutzung zum Gleichgewicht oder einem verzögerten Abstieg.
   4. Bewerten Sie 0, wenn die Maus eine schwere Beeinträchtigung zeigt, nicht im Gleichgewicht bleibt, von der Kante fällt oder sich weigert, sich zu bewegen.
2. Wertung des Hinterbein-Klammertests
   1. Setzen Sie eine Punktzahl von 3 zu, wenn die Maus konsequent nach außen gespreizte Hintergliedmaßen zeigt, ohne Anzeichen von Klemmen.
   2. Vergeben Sie eine Punktzahl von 2, wenn die Maus eine leichte Beeinträchtigung zeigt, wie z. B. intermittierendes Zurückziehen eines Hintergliedmaßes.
   3. Setzen Sie eine Punktzahl von 1 zu, wenn die Maus eine moderate Beeinträchtigung aufweist, gekennzeichnet durch eine teilweise Rückziehung beider Hintergliedmaßen, die in der Nähe des Bauches gehalten werden.
   4. Vergeben Sie eine Punktzahl von 0, wenn die Maus eine schwere Beeinträchtigung zeigt, wobei beide Hintergliedmaßen während des größten Teils des Beobachtungszeitraums fest an den Bauch gedrückt sind.
3. Gangwertung
   1. Setzen Sie eine Punktzahl von 3 zu, wenn die Maus mit einem gleichmäßigen, koordinierten Gang geht und sich in geraden Linien bewegt.
   2. Vergeben Sie eine Punktzahl von 2, wenn die Maus leichte Beeinträchtigungen zeigt, wie langsames Gehen mit leichter Unsicherheit oder seitlicher Abweichung, Hinken zur Seite oder breite, kreisende Pfade.
   3. Setzen Sie eine Punktzahl von 1 zu, wenn die Maus eine moderate Beeinträchtigung zeigt, einschließlich deutlicher Gangstörung, Gehen mit nur zwei oder drei Pfoten, Schleifen eines Körperteils oder enge Kreise.
   4. Setzen Sie eine Punktzahl von 0 zu, wenn die Maus eine schwere Beeinträchtigung zeigt, sich nicht effektiv bewegen kann, stillsteht oder unkontrollierte Rollbewegungen zur Seite zeigt.
4. Kyphosis-Wertung
   1. Setzen Sie eine Punktzahl von 3 zu, wenn die Maus sowohl in Ruhe als auch beim Gehen flach und geradeaus rückwärts bleibt.
   2. Setzen Sie eine Punktzahl von 2 zu, wenn die Maus eine leichte Beeinträchtigung zeigt, mit einer leichten Krümmung des Rückens in Ruhe, die sich während der Bewegung aufrichtet.
   3. Vergeben Sie eine Punktzahl von 1, wenn die Maus eine moderate Beeinträchtigung zeigt, mit einem mäßig gekrümmten Rücken in Ruhe, der beim Gehen gebeugt bleibt.
   4. Setzen Sie eine Punktzahl von 0, wenn die Maus eine schwere Beeinträchtigung zeigt und während der gesamten Beobachtungsperiode stark gekrümmt ist, was die normale Bewegung einschränkt.

4. Zuverlässigkeitsbewertung zwischen Ratern

1. Trainieren Sie Beobachter vor der formellen Bewertung mit repräsentativen Beispielvideos, um die Interpretation der Bewertungskriterien zu standardisieren.
2. Um den Beobachter-Bias zu minimieren, werden alle Verhaltenstests unabhängig von zwei geschulten Beobachtern bewertet, die auf Behandlungsgruppe und experimentellen Zeitpunkt blind sind.
3. Quantifizieren Sie die Inter-Rater-Zuverlässigkeit für jeden Verhaltenstest mit Cohens Kappa-Koeffizienten. Interpretiere Kappa-Werte wie folgt: <0,40, schlechte Übereinstimmung; 0,40–0,60, moderate Einigkeit; 0,60-0,80, wesentliche Übereinstimmung; und >0,80, nahezu perfekte Übereinstimmung.
4. Beseitigen Sie eventuelle Bewertungsabweichungen durch gemeinsame Überprüfung der aufgenommenen Videos und erreichen Sie einen Konsenswert^{von 5}.

Ergebnisse

CPA-Tumorwachstum verursacht Ataxie im VS-Mausmodell

Zur Bewertung tumorinduzierter Ataxie haben wir zwei experimentelle Kohorten eingerichtet. Zunächst wurden die Mäuse zur Bewertung der Auswirkungen von Tierchirurgie und Tumorzellimplantation auf die Ataxie einer Scheinoperation und einer Injektion von Kochsalzlösung in den CPA-Bereich unterzogen. Ataxie-Symptome bei Mäusen der Scheingruppe wurden mit denen unoperierter Kontrollmäuse verglichen. In der zweiten Kohorte wurden...

Diskussion

Die hier beschriebenen Verhaltenstests bieten einen robusten und quantitativen Rahmen zur Bewertung von Ataxie und motorischen Koordinationsdefiziten in Mausmodellen von VS und verwandten vestibulären Störungen. Adaptiert aus etablierten Protokollen für neurodegenerative Krankheitsmodelle wie Morbus Huntington und spinocerebellare Ataxias¹⁰, eignen sich diese Tests hervorragend zur Charakterisierung tumorinduzierter vestibulärer Dy...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fetales Rinderserum	ThermoFisher	A5670701
GloMax 96 Mikroplatten-Luminometer	Promega	GM3000
McKesson Blue Procedure Unterpolster	McKesson	75402
Schwann-Zellwachstumssupplement	ScienCell	1752