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Umwelt-DNA-Probenahme von Walbeobachtungsschiffen zur Überwachung von Walwalen

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DOI:

10.3791/70334

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10. April 2026

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1University of Iceland's Húsavík Research Center, Húsavík, Iceland, 2Applied Animal Ecology Research Unit, Department of Zoology, University of Innsbruck, 3Politecnico di Milano DICA Civil and Environmental Engineering Department, 4Department of Life and Environmental Science DISVA, Marche Polytechnic University, 5CetaceanWatching Lda, 6Tethys Research Institute, 7WasserCluster Lunz - Biologische Station GmbH

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen standardisierten Workflow zur Sammlung von Umwelt-DNA-Proben von Walbeobachtungsschiffen. Die Machbarkeit für Forscher und ausgebildete Bürgerwissenschaftler wird priorisiert, während Umweltbedingungen, Filtrationszeit, Trübung und Bordlogistik die praktischen Grenzen ihrer Anwendung definieren.

Zusammenfassung

Umwelt-DNA (eDNA) bietet einen nicht-invasiven Ansatz zur Überwachung von Walen, doch ihre weitverbreitete Anwendung von operativen Plattformen erfordert standardisierte und machbare Probenahme-Workflows. Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur Sammlung von eDNA von Walbeobachtungsschiffen, das für die Umsetzung durch Forscher und ausgebildete Bürgerwissenschaftler unter definierten Umwelt- und Logistikbedingungen entwickelt wurde. Der Ansatz integriert auf Flukeprints gezielte Meerwassersammlung, Bordfiltration mit selbsterhaltenden Filtern und nachgelagerte molekulare Analysen, um eine betrieblich machbare Datengenerierung unter realen Bedingungen zu unterstützen. Das Protokoll wurde während koordinierter Feldkampagnen im Jahr 2024 in drei Regionen des Nordatlantiks und des Mittelmeers (Island, Portugal und Italien) durchgeführt und umfassten mehrere Wale-Taxa. Die Methodenleistung wurde mit einem neu entwickelten, artspezifischen quantitativen PCR-Test bewertet, der auf mitochondriale DNA des Buckelwals (Megaptera novaeangliae) abzielt und konstante Nachweisraten unter variablen Umwelt- und logistischen Bedingungen zeigt. Durch praktische Anleitungen für die Feldimplementierung und Kontaminationskontrolle unterstützt dieses Protokoll reproduzierbare, eDNA-basierte Cetachon-Überwachung und erleichtert die grenzüberschreitende Vergleichbarkeit in marinen Biodiversitätsstudien.

Einleitung

Ein effektives Schutzmanagement der marinen Megafauna, einschließlich Wale und anderer weit verbreiteter Arten, ist für den Schutz der Biodiversität unerlässlich. Als Spitzenprädatoren und Ökosystemingenieure tragen Wale zur trophischen Regulierung, zum Nährstoffkreislauf und zur ökologischen Widerstandsfähigkeit in den Ozeanbeckenbei. Die Entwicklung umfassender ökologischer Erkenntnisse für diese hochmobilen Arten bleibt jedoch herausfordernd und beruht oft auf ressourcenintensiven Überwachungsprogrammen2. Konventionelle Ansätze wie Biopsieproben, Foto-Identifikation, passive akustische Überwachung, Satellitentelemetrie und Luftaufnahmen haben entscheidende Einblicke in die Ökologie der Walegeliefert 3,4,5,6,7, doch diese Methoden sind oft kostspielig, logistisch anspruchsvoll, räumlich eingeschränkt oder invasiv und unterliegen strenger ethischer und regulatorischer Kontrolle 8 . Daher sind Probenhäufigkeit, geografische Abdeckung und Möglichkeiten zur Beteiligung von Interessengruppen oft begrenzt, insbesondere bei der Untersuchung weit verbreiteter oder seltener Arten.

Umwelt-DNA-Entnahme (eDNA, definiert als genetisches Material, das von Organismen in ihre Umwelt abgegeben wird) hat sich als mächtiges, nicht-invasives Werkzeug zum Nachweis aquatischer Arten aus Wasserproben erwiesen 9,10. Artspezifische quantitative PCR-(qPCR)-Analysen, die mitochondriale DNA-Fragmente anvisieren, ermöglichen eine hochsensible und spezifische Detektion mariner Taxa, einschließlich Walen 11,12,14. Über die Präsenz-/Abwesenheitserkennung hinaus liefern die relative eDNA-Signalstärke und Ziel-DNA-Sequenzen wertvolle Informationen zu Nähe, relativer Häufigkeit und populationsbezogenen genetischen Mustern 15,16,17,18,19. Darüber hinaus enthalten Umweltproben, die in der Nähe von Walen gesammelt werden, häufig DNA von koexistierenden Taxa, darunter Beutearten, Symbionten und Parasiten, was breitere ökologische Assoziationenunterstützt. Zusammen zeigen diese Fortschritte das Potenzial eDNA-basierter Ansätze, traditionelle Methoden zu ergänzen und den Umfang der Walenforschung in marinen Systemen zu erweitern23,24.

Trotz dieser Vorteile steht die eDNA-basierte Überwachung der marinen Megafauna vor anhaltenden Herausforderungen im Zusammenhang mit repräsentativer Probenahme, räumlicher Abdeckung und methodischer Reproduzierbarkeit, insbesondere in offenen marinen Systemen, in denen DNA schnellverdünnt wird und Zielarten ausgedehnte Verbreitungsgebiete haben und niedrige Dichten haben. Um diese Einschränkungen zu adressieren, sind skalierbare, betrieblich machbare Stichprobenrahmenwerke erforderlich, die über breite räumliche und zeitliche Skalen hinweg angewendet werden können. Bürgerwissenschaftsinitiativen haben sich als wirksam erwiesen, um die ökologische Datenerhebung auszuweiten und gleichzeitig die öffentliche Beteiligung am Meeresschutz zu fördern, was sie zu einem vielversprechenden Weg für großflächige, eDNA-basierteÜberwachung macht. Walbeobachtungsfahrzeuge stellen eine untergenutzte, aber sehr geeignete Plattform für eDNA-Probenahmen dar und bieten regelmäßigen Zugang zu Lebensräumen von Walen über Jahreszeiten und Regionenhinweg 31, 32, 33. Die weltweite Walbeobachtungsindustrie unterstützt umfangreiche operative Netzwerke34, und frühere Studien haben die Machbarkeit gezeigt, Cetace-eDNA von anderen opportunistischen Plattformen wie kommerziellen Schiffen, Fähren35 zu sammeln, sowie durch gezielte Probenahme, die mit Foto-Identifikation und Verhaltensbeobachtungen kombiniert ist36,37. Die rasche Ausweitung der eDNA-Forschung hat zu erheblichen methodologischen Innovationen geführt, doch biologische Variabilität zwischen marinen Systemen und das Tempo technologischer Fortschritte erschweren die Bemühungen, Protokolle zu harmonisieren und Vergleichbarkeit zwischen Studien sicherzustellen. Standardisierte, aber dennoch anpassungsfähige Feldmethoden sind daher unerlässlich, insbesondere für groß angelegte multinationale Überwachungsinitiativen38.

Die eDNA-Detektion wird durch das gefilterte Wasservolumen, die Filtrationsstrategie, das Filtermaterial und die Porengröße beeinflusst. Das Filtern größerer Volumina erhöht in der Regel die eDNA-Erträge und die Nachweiswahrscheinlichkeit für Wirbeltierziele, einschließlich Walen 39,40,41,42. In produktiven oder trüben Gewässern kann die Filtrationseffizienz jedoch durch eine schnelle Filterverstopfungvon 43,44 eingeschränkt sein, was Abwägungen zwischen erreichbarem Volumen und betrieblicher Machbarkeit45,46 erfordert. Probenentnahmen aus Flukeprints – der Oberflächenstörung, die durch den Schlag eines Walschwanzes entstehen – hat sich durchweg gezeigt, dass sie die Nachweisbarkeit der eDNA bei Walen verbessern, da kürzlich abgestoßenes biologisches Material nahe der Oberfläche konzentriert ist: 24,41,42,47,48. Der Einsatz geschlossener, selbsterhaltender Filtersysteme reduziert Handhabungsschritte und Kontaminationsrisiken und eignet sich daher gut für Citizen-Science-Anwendungen 38,42. Zusätzlich minimiert die Einbeziehung biologischer Replikate und routinemäßige Feldkontrollen Erkennungsfehler und erhöht die Datenzuverlässigkeit 49,50,51.

Protokollentwicklung und Validierung
Das eWHALE-Projekt52 ist eine transnationale Initiative, die Forscher, Walbeobachtungsbetreiber und Bürgerwissenschaftler in ganz Europa zusammenbringt, um die Meeres-Megafauna mithilfe von eDNA zu überwachen. Die Probenahmen haben mehrere Wal-Taxa im Nordatlantik und Mittelmeer gezielt und dabei ein Kernprotokoll mit regionsspezifischen Anpassungen zur Berücksichtigung lokaler Umwelt- und logistischer Bedingungen verwendet.

Hier präsentieren wir ein standardisiertes, von Anfang bis Ende Protokoll zur Sammlung von Walen-eDNA von Walbeobachtungsschiffen, verfeinert durch die Analyse von 308 Meerwasser-eDNA-Proben, darunter zwei Replikaten pro Probe und 21 Feldkontrollen, die während koordinierter Feldkampagnen 2024 in der Skjálfandi-Bucht (Island), den Azoren (Portugal) und dem Ligurischen Meer (Italien) gesammelt wurden. Die Methode integriert auf Flukeprints gezielte Meerwassersammlung, Bordfiltration mit selbsterhaltenden eDNA-Filtern und nachgelagerte molekulare Analysen.

Dieses Protokoll ist für die Umsetzung unter realen Bedingungen der Walbeobachtung durch ausgebildete Forscher und Bürgerwissenschaftler konzipiert, wobei die Filtration an Bord unter ruhigen bis moderaten Seebedingungen durchgeführt werden kann, ohne die Walbeobachtungsaktivitäten zu stören. Die Umsetzung erfordert die Koordination mit teilnehmenden Organisationen (z. B. Walbeobachtungsbetreiber, gemeinnützige Organisationen, Forschungseinrichtungen), um Stichprobennahmestrategien und Forschungsziele zu definieren. Während Kernparameter stabil bleiben müssen, um Reproduzierbarkeit und Kreuzstudienvergleichbarkeit zu gewährleisten, können protokollorientierte Anpassungen an Standorten mit hoher Trübheit, Schiffsbewegung oder Einschränkungen in Zeit, Raum oder Personal erforderlich sein. Solche Anpassungen umfassen Filtertyp, erreichbares gefiltertes Wasservolumen und Hilfsausrüstung. Sie müssen innerhalb jeder Stichprobenkampagne konsequent angewendet und transparent gemeldet werden. Detaillierte operative Leitlinien und logistische Überlegungen werden in den Protokollschritten und der Diskussion bereitgestellt, um die Datenqualität, Transparenz und regionale Vergleichbarkeit zu unterstützen.

qPCR-Assay-Design
Zur Bewertung der Protokollleistung wurde eDNA von Buckelwalen (Megaptera novaeangliae), einer gut untersuchten Zugart, die regelmäßig in der Skjálfandi-Bucht (Island) und saisonal auf den Azoren54 vorkommt, aus im Feld gesammelten Proben amplifiziert. DNA-Lyse, -extraktion und qPCR-Workflows wurden zunächst durch einen interlaboratorischen Ringtest mit vier teilnehmenden Laboren des eWHALE-Projekts optimiert, wodurch die Konsistenz und Anwendbarkeitüber Institutionen hinweg verbessert wurden.

Um das Vorhandensein von Buckelwal-eDNA zuverlässig nachzuweisen, wurde ein artspezifischer MGB (Minor Groove Binder) qPCR-Test entwickelt, der auf die mitochondriale ND5-Region abzielt und gemäß den festgelegten Richtlinien55 (Tabelle 1) validiert wurde. Oligonukleotidprimer und eine Sonde wurden mit Software zur DNA-Sequenzausrichtung und -Analyse56 erzeugt, mit dem Ziel, Spezifität und Amplifikationseffizienz zu maximieren (Supplemental File 1 – Supplemental Figure S1). Die Assay-Spezifität wurde in vitro mit Ziel- und Nichtzieltaxa (Balaenoptera acutorostrata, Delphinus delphis, Physeter macrocephalus, Homo sapiens) bewertet. DNA-Konzentrationen, die zur Erstellung von qPCR-Standardkurven verwendet wurden, wurden anhand eines gewebebasierten DNA-Standards 42,57,58,59,60 quantifiziert. Die Nachweisgrenze (LOD) des Tests, definiert als die niedrigste Konzentration, die in 95 % der Probereplikationen positive Amplifikationen liefert, wurdemit 11,61 bestimmt. Die Nachweise von Buckelwal-eDNA wurden für Feldproben ausgewertet, indem der Anteil positiver Reaktionen und die Signalstärke (d. h. Zyklusschwelle, Ct-Wert) für jede Probe über dreifache qPCR-Messungen geschätzt wurden, um die Amplifikationsvariabilität zu berücksichtigen und die Nachweiszuverlässigkeit zu verbessern. Die Artennachweise wurden anschließend mit bidirektionaler Sanger-Sequenzierung bestätigt, gefolgt von einer Bestätigung durch BLAST-Analyse63.

qPCR-Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) präsentiert. Die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen wurde mit dem nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Test und dem Welch-Zwei-Stichproben-T-Test bewertet. Unterschiede wurden bei p < 0,05 als signifikant angesehen. Alle Analysen wurden mit der statistischen Analysesoftware64 durchgeführt.

Protokoll

Ethik und regulatorische Einhaltung
Alle Beobachtungsmaßnahmen für Wale und die anschließende Wasserprobenentnahme müssen gemäß nationalen und regionalen Wildtiervorschriften durchgeführt werden. Führen Sie ausschließlich Probenahmen von autorisierten Schiffen durch, die mit gültigen Walbeobachtungs- oder Forschungsgenehmigungen betrieben werden. Halten Sie Mindestabstände zur Zielart gemäß den lokalen Vorschriften ein und vermeiden Sie jegliche Manöver, die ausschließlich zu Probenahmezwecken dienen. Walgewebeproben, die für die Assay-Validierung verwendet wurden, wurden unter den jeweiligen regionalen Genehmigungen entnommen und unter den eWHALE-Projektpartnern unter Einhaltung nationaler und institutioneller Vorschriften geteilt.

HINWEIS: Überprüfen Sie die folgenden Dokumente vor jeglicher Probenahme und sammeln Sie die notwendige Ausrüstung: Materialtabelle, eDNA-Probekit (Ergänzende Datei 1 – Ergänzende Abbildung S2), Materialien zur Entnahme von Umwelt-DNA-Proben (Abbildung 1) sowie eine Übersicht über die Probenahmeschritte und den Filterablauf an Bord (Abbildung 2).

1. Vorbereitung der eDNA-Probenahme

  1. Bereite Felddokumentationsmaterialien vor, einschließlich Felddatenblätter und laminierter Feldprotokolle (Supplemental File 2 und Supplemental File 3).
  2. Bereiten Sie Ersatzhandschuhe, Ersatzfilter (ein Filter pro Probenreplikat), einen wasserdichten Marker und einen speziellen Abfallbehälter vor (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Verwenden Sie geschlossene selbsterhaltende eDNA-Filter (1,2 μm Porengröße), um Handhabungs- und Kontaminationsrisiken zu minimieren65,66.
  3. Bereiten Sie eine oder mehrere starre Schaufel vor, die für den Schiffstyp und die Bordkonfiguration geeignet sind (Ergänzungsakte 1 – Ergänzende Abbildung S3).
    1. Markiere Eimer mit einem permanenten Marker auf 10 Liter. Bereite mehrere kleinere Eimer vor, wenn 10 Liter unpraktisch sind.
    2. Befestigen Sie ein Seil sicher am Eimer, wenn die Reichweite über Bord begrenzt ist.
      HINWEIS: Verwenden Sie Eimer mit Deckel, um das Überlaufen bei übermäßiger Gefäßbewegung zu minimieren (Abbildung 1B).
    3. Bereiten Sie einen sekundären eDNA-Behälter vor, um kleinere Mengen und eine zusätzliche Transportbox zu kombinieren, um bei Bedarf einen kontaminationsfreien Transport der Eimer zu gewährleisten (Abbildung 1C).
  4. Bereiten Sie eine tragbare peristaltische oder Vakuumwasserpumpe vor (Abbildung 1D). Lade die Pumpe vor dem Einsteigen vollständig auf und trenne dich direkt vor der Nutzung vom Strom.
  5. Weisen Sie vor der Abreise Probenahme-, Filtrations- und Datenerfassungsaufgaben zu.
    VORSICHT: Tragen Sie Handschuhe bei allen Ausrüstungshandschuhen und wechseln Sie die Handschuhe zwischen den Aufgaben.

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Abbildung 1: Feldarbeitsmaterialien zur Entnahme von Umwelt-DNA-Proben. (A) Toolkit mit selbsterhaltenden eDNA-Filtern, Abfallbehälter, Quetschflasche mit verdünntem Haushaltsbleichmittel (1:10), Handschuhen, Felddatenblatt und wasserdichtem Stift; (B) Beispiele für Eimertypen für eDNA-Probenahmen; (C) Beispiele für zusätzliche eDNA-Behälter zum Transport und Filtern großer Mengen sowie Behälter für den Transport von Eimern an Bord; (D) Beispiele für tragbare Pumpen zur Wasserfiltration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Konzeptuelles Diagramm der Umwelt-DNA-Probenahme an Bord von Walbeobachtungsbooten. Die Abbildung beschreibt geführte Schritte, einschließlich Wasserprobenentnahme und Filterung an Bord. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Gerätereinigung

  1. Ziehen Sie vor der Reinigung Einweghandschuhe an.
  2. Bereiten Sie eine Bleichlösung vor, indem Sie Haushaltsbleichmittel (5–6 % Natriumhypochlorit) 1:10 mit gereinigtem Wasser (~50 ml pro Fahrt) verdünnen.
  3. Tragen Sie die Lösung auf, indem Sie gleichmäßig auf allen Flächen auf alle Eimer, Deckel, Behälter und Pumpenschläuche spritzen. Halten Sie auf allen Oberflächen eine Mindestkontaktzeit von 2-5 Minuten für das Bleichmittel ein.
  4. Dreimal gründlich mit Leitungswasser abspülen (Abbildung 3).
  5. Die Materialien an einem sicheren Ort an der Luft trocknen und vor dem Einsteigen an einem sicheren und sauberen Ort aufbewahren.

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Abbildung 3: Schritte für Reinigungsgeräte. (A) Auftragen Sie die (1:10) verdünnte Haushaltsbleichlösung; (B) gleichmäßig mit DNA-freien Handschuhen verteilen; (C) dreimal gründlich mit Leitungswasser abspülen; und (D) den Prozess für zusätzliche Materialien wiederholen, falls zutreffend (z. B. eDNA-Behälter). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

3. Wasserprobenentnahme

HINWEIS: Halten Sie alle Sicherheitsvorschriften an Bord jedes Schiffes oder jeder Plattform ein, einschließlich des Nutzens von Schwimmwesten oder Schwimmüberalls, wenn erforderlich.

  1. Bringen Sie alle Materialien vor der Ankunft der Passagiere an Bord und lagern Sie sie in einem ausgewiesenen, sauberen Bereich.
  2. Koordinieren Sie den Zeitpunkt und die Positionierung der Probenahme des Schiffes mit der Besatzung.
  3. Beobachten Sie Oberflächenmuster, um Waltauchgänge vorherzusehen (Abbildung 4). Ziehen Sie vor dem Probieren neue Handschuhe an.
  4. Sammeln Sie so schnell wie möglich 20 Liter Meerwasser (nicht mehr als 10 Minuten Zeitraffer) aus dem Flukeprint nach den Waltauchen, um zwei 10-L-Probereplikaten zu erzeugen.
  5. Transportieren Sie das gesammelte Wasser zu einer ausgewiesenen Filterstation an Bord, wobei Sie Deckel oder einen zusätzlichen sterilisierten Behälter verwenden, um Verschüttungen (falls erforderlich) zu vermeiden.
  6. Notieren Sie die Artidentität, GPS-Koordinaten, Zeit und die Identifikation der Probe im Datenblatt.
  7. Wechseln Sie sofort nach der Meldung die Handschuhe.

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Abbildung 4: Auftauchsequenz des Buckelwals. (A) Walblase; (B) den Rücken durchwölben und den Schwanz vor dem Tauchen heben; (C) Flukeprint-Muster an der Oberfläche nach dem Tauchgang des Wals. Bildzugabe: Ocean Missions (A,B,C, 2024). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

4. eDNA-Filtration

  1. Öffnen Sie den Filterbeutel und befassen Sie den Filter nur an der Steckdose (Ergänzungsakte 1 – Ergänzende Abbildung S4).
  2. Stecken Sie den Einlass in den Schnorchel und verbinden Sie das Pumpenrohr mit dem Auslass (Abbildung 5A,B).
  3. Tauchen Sie den Schnorchel in die Wasserprobe ein, ohne das Filtergehäuse zu untertauchen (Abbildung 5C).
  4. Stellen Sie die Pumpe (siehe Materialtabelle für Pumpentypen) auf einen schnellen, gleichmäßigen Durchfluss ein.
  5. Filtern Sie kontinuierlich 10 Liter, während Sie die Durchflussstabilität überwachen (prüfen Sie Luftblasen, Risse, Risse oder Dichtungsversagen).
    HINWEIS: Die Filtration wird mit maximaler Dauer von 45 Minuten abgebrochen.
  6. Drehen Sie den Filter um und lassen Sie die Pumpe 30-60 Sekunden laufen, um das Restwasser zu entfernen. Bestätigen Sie, dass im Filtergehäuse keine sichtbare Feuchtigkeit mehr vorhanden ist.
  7. Schalte die Pumpe aus und trenne den Schlauch.
  8. Entsorgen Sie den Schnorchel im Abfallbehälter, legen Sie den Filter in den ursprünglichen Beutel und beschriften Sie ihn sofort.
  9. Bewahren Sie Filter an Bord in einem geschlossenen, starren Behälter oder in einer Kühlbox auf (bei Umgebungstemperatur > 20 °C), fernab von direktem Sonnenlicht und Passagierbereichen.
  10. Wechseln Sie die Handschuhe und wiederholen Sie die Filtration für die zweite Replikation.

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Abbildung 5: Schritte zur Einrichtung des Bordfiltersystems. (A) den Filtereinlass (weißer Teil) am Schnorchel (Rohr) anschließen; (B) das Pumpenrohr mit dem Filterauslass (gelber Teil) verbinden; und (C) einen Teil des Schnorchels in die Wasserprobe tauchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

5. Feldnegativkontrollen und Datenberichterstattung

  1. Filtere nach fünf Flukeprint-Proben eine Feld-Negativkontrolle.
  2. Verwenden Sie unmittelbar nach der Rückkehr ans Ufer und vor der Reinigung der Geräte Ziel-DNA-freies Wasser.
  3. Übertragen Sie alle Daten nach jeder Reise in die digitale eDNA-Probetabelle (Supplemental File 4).

6. Filterlagerung und Versand

  1. Lagern selbsterhaltende eDNA-Filter in einem sicheren, trockenen Behälter in einem schattigen Raum mit Umgebungstemperatur – oder im Kühlschrank, wenn die Umgebungstemperatur 20 °C überschreitet – nicht länger als 3 Monate vor dem Versand.
  2. Überprüfen Sie vor dem Versand die Filterbeutel visuell auf Feuchtigkeit.
  3. Beschriften und schicken Sie Filter in isolierten Behältern mit Eispackungen ins zugewiesene Labor.

7. Laboranalyse

HINWEIS: Führen Sie alle Laborverfahren in speziellen UV-sterilisierten Räumen mit ausreichender Belüftung und separaten Arbeitsbänken für PCRs durch, wobei DNA-freie Handschuhe und Schutzkleidung verwendetwerden 55,67,68.

  1. DNA-Lyse
    1. Beschrifte ein 2-mL-Reaktionsrohr pro Filter.
    2. Setzen Sie den Filter in eine 200-mL Erlenmeyer-Flasche und entsorgen Sie den Gummideckel (Abbildung 6A).
    3. Mit einer DNA-freien Zange falten Sie die Membran (Supplemental File 1 – Supplemental Abbildung S5) zu einem Dreieck und übertragen sie auf das 2-mL-Reaktionsrohr, wobei die Spitze nach unten ausgerichtet ist (Abbildung 6B-D).
    4. Fügen Sie jedem Reaktionsrohr 380 μL TES-Puffer und 20 μL Proteinase K (siehe Materialtabelle) hinzu, was zu 400 μL Lysepuffer führt (Abbildung 6E).
    5. Vortex kurz und inkubieren bei 56 °C für ≥3 Stunden mit Bewegung (Abbildung 6F).
    6. Zentrifugiere Röhren mit 18.626 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Ein klares bis leicht gefärbtes Lysat zeigt eine erfolgreiche Verdauung an.
      HINWEIS: Das Protokoll kann in diesem Stadium vorübergehend unterbrochen werden, wenn Lysate bei -20 °C gelagert werden.
  2. DNA-Extraktion
    1. Inkubieren Sie Lysate bei 56 °C für 10 Minuten vor der Extraktion.
    2. Pipettenextraktionsreagenzien in Waschplatten und Elutionsplatten, wobei negative Kontrollen und Pipettierungsfehler69 berücksichtigt werden (siehe Supplemental File 1-Supplemental Table S1).
    3. Fügen Sie pro Platte einen Extraktionsrohling mit TES-Puffer ein.
    4. Übertragen Sie 300 μL Lysat in jedes Bohrloch der Bindeplatte. Fügen Sie 300 μL Buffer AL und 300 μL Isopropylalkohol zu jedem Bohrloch hinzu. Verwenden Sie mehrere Bindeplatten, wenn das Gesamtvolumen des Lysats 300 μL übersteigt. Vortex und fügen Sie 30 μL magnetische Partikel für die Nukleinsäurebindung pro Bohrloch zur ersten Bindeplatte hinzu (Materialtabelle).
    5. Decke die Bindplatte mit einer Stababdeckung ab.
    6. Führen Sie das vorläufige DNA-Aufnahmeprogramm für zwei Bindplatten (insgesamt 400 μL Lysat; siehe Materialtabelle und Abbildung 7) und das automatisierte Extraktionsprotokoll auf einem magnetisch perlenbasierten Laborroboter durch.
    7. Entsorgen Sie die Extraktionschemikalien in ausgewiesenen Abfallbehältern.
    8. Übertragen Sie eluierte DNA in markierte 1,5-mL-Reaktionsröhren und lagern sie bei −20 °C.
      HINWEIS: Das Protokoll kann in dieser Phase vorübergehend gestoppt werden. Zusätzliche Schritte zur Entfernung von Inhibitoren können an diesem Punkt durchgeführt werden.
  3. qPCR
    1. Bereite und quantifiziere DNA-Standards der Zielspezies mithilfe von Gewebeextrakten und einem fluoreszenzbasierten, hochsensitiven dsDNA-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialtabelle). Erzeugen Sie eine achtpunktige Standardkurve durch serielle Verdünnung (1:10), beginnend bei 10 ng/μL11,55. Aliquot-Standards vor qPCR, um Frost-Tau-Zyklen zu minimieren.
      HINWEIS: Das Protokoll kann in dieser Phase vorübergehend gestoppt werden.
    2. Bereiten Sie alle qPCR-Reaktionen in dreifacher Form mit 96-Well-Platten vor.
    3. Fügen Sie pro qPCR-Platte eine No-Template-Kontrolle (molekulare Wasserqualität) und einen Extraktionsrohstoff hinzu.
    4. Bereiten Sie den Mastermix gemäß Supplemental File 1 – Supplemental Table S2 und Abbildung 8A vor.
    5. In einer DNA-Ladehaube werden die zuvor vorbereiteten DNA-Standards und 3 μL DNA-Extrakt zu jedem Brunnen mit dem Master-Mix hinzugefügt (Abbildung 8B).
    6. Versiegeln Sie die Platte mit einer Dichtfolie (Abbildung 8C).
    7. Zentrifugieren Sie mit 3.500 × g für 10 Sekunden und laden Sie es in den Echtzeit-quantitativen PCR-Thermocycler (Abbildung 8D,E).
    8. Führen Sie den Test unter optimierten Zyklusbedingungen durch, wie in Tabelle 2 angegeben, und erfassen Sie die Daten mit der Software des Herstellers (Materialtabelle)11.

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Abbildung 6: Arbeitsablauf für die DNA-Lyse. (A) Entfernen Sie die Gummikappe vom selbsterhaltenden eDNA-Filter und legen Sie sie in eine Erlenmeyer-Flasche; (B) Sterilisieren von zwei Paar Zangen, indem man dreimal entflammt; (C) Falten der Filtermembran; (D) Sie in ein 2-mL-Rohr einführen; (E) Lysepuffer und Proteinase K hinzufügen und (F) Proben bei 56 °C für 3 Stunden inkubieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 7: Materialien und Geräte zur DNA-Extraktion verwendet. (A) Binde-, Wasch- und Elutionsplatten, Verbrauchsmaterialien und Reagenzien zur Extraktionsvorbereitung; und (B) dem magnetisch perlenbasierten Laborroboter, der für die Probenverarbeitung verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 8: Arbeitsablauf für qPCR. (A) Mastermix in einem zuvor UV-sterilisierten Raum vorbereiten (unter einer funktionierenden Haube zur Herstellung von Mastermixen); (B) DNA-Standards, Extrakte und Kontrollen in einer DNA-Ladestation nach dem gezeigten Muster zu laden; (C) Versiegelungsplatte; (D) Zentrifuge; (E) in den Echtzeit-quantitativen PCR-Thermocycler einladen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse

Insgesamt wurden 2024 154 Flukeprint-Proben (308 eDNA-Filter) mit diesem optimierten Protokoll gesammelt, darunter 96 Filter in der Skálfandi-Bucht (Island; 9 Feldkontrollen und 76 Buckelwal-Replikate), die von März bis November aufgenommen wurden, 151 Filter auf den Azoren (Portugal; 12 Feldkontrollen und 15 Buckelwal-Replikate) im Juli sowie 61 Filter im Ligurischen Meer (Italien; 4 Feldkontrollen), die von Mai bis Oktober aufgenommen wurden. Alle Proben beinhalteten die Entnahme von bis zu 10 Litern Meerwasser (zwei Replikaten pro Flukeprint-Probe) mit selbsterhaltenden eDNA-Filtern (Tabelle 3). Während der Feldarbeit wurden zwei Arten von negativen Kontrollen gesammelt: gereinigtes Wasser, das nach der Bleichreinigung der Geräte gefiltert wurde, und Meerwasser, das beim Wiedereinlaufen in den Hafen(s)42 gesammelt wurde. Letzteres wurde absichtlich vor der Bleichreinigung gefiltert, um eine mögliche Kreuzkontamination mit der eDNA der Wale während der Probenahme zu beurteilen. Proben wurden von jedem Probenahmestandort in zwei Chargen an die Applied Animal Ecology Research Unit, Abteilung für Zoologie, Universität Innsbruck (Österreich), zur Laborverarbeitung geliefert.

Prüf- und Kontrollleistung
Eine Teilmenge von 44 Filtern (30 Replikate, darunter 2 Feldkontrollen aus der Skjálfandi-Bucht, Island, und 14 Filter, darunter 1 Feldkontrolle aus den Gewässern rund um die Insel Faial und Pico, Azoren, Portugal) wurde auf Buckelwal-eDNA analysiert (Abbildung 9). Das Signal wurde in dreifachen qPCR-Reaktionen gemessen. Eine Probe (d. h. eDNA-Filter) galt als positiv, wenn eine von drei qPCR-Replikationen amplifiziert wurde. Die Nachweisgrenze (LOD) des Tests in dieser Studie wurde mit 0,0001 ng/μL berechnet (mittlerer CT des LOD = 35,8). Bei den 41 analysierten Filtern lieferten 20 (49 %) Amplifikationen, während 24 (58 %) keine Amplifikation zeigten. Keine Nachweise (kein Ct-Wert) spiegeln höchstwahrscheinlich entweder das Fehlen oder die extrem niedrigen Konzentrationen von Ziel-DNA wider. Nicht-Entdeckungen umfassten 5 von 13 Filtern von den Azoren (38 %) und 19 von 28 Filtern aus Island (68 %). Die Extraktionsrohlinge wurden mit dem MarVer3-Assay70 auf marine Wirbeltier-DNA getestet und zeigten keine nachweisbare Amplifikation, was auf keine Kreuzkontamination während der DNA-Extraktion hinweist. Feldkontrollen (NC) und qPCR-Kontrollen (NT) zeigten keine Verstärkungen, was das Fehlen von Kontamination während der Feldarbeit und des qPCR-Screenings bestätigt (Tabelle 4).

Unter den 20 positiven Filtern lieferten neun (22 %) mindestens einen Ct-Wert unterhalb der Nachweisgrenze des Tests (LOD; 0,0001 ng/μL) und wurden daher als zuverlässige Nachweise eingestuft. Dazu gehörten 4 von 8 Filtern von den Azoren (50 %) und 5 von 12 aus Island (42 %). Weitere 11 Filter (27 %) erzeugten einen oder mehrere Ct-Werte oberhalb des LOD, bestehend aus 4 Filtern von den Azoren (50 %) und 7 von Island (58 %), was auf plausible Nachweise hinweist (Abbildung 10). Die vergleichende Analyse zeigte einen geringfügig niedrigeren mittleren Zyklusschwellenwert (Ct) für die Azoren-Filter (34,7 ± 3,60; n = 8) im Vergleich zu den isländischen Filtern (36,9 ± 3,60; n = 10). Der Mann-Whitney U-Test zeigte, dass dieser Unterschied statistisch nicht signifikant war (U = 199,0, p = 0,204). Angesichts der umgekehrten Beziehung zwischen dem Ct-Wert und der Stärke des DNA-Signals deuten die Ergebnisse auf etwas höhere Konzentrationen der Ziel-Buckelwal-eDNA in den Azoren-Filtern hin (Abbildung 11).

Machbarkeitsbeschränkungen
Die Anzahl der Flukeprint-Proben pro Tour variierte je nach Reisedauer und Wetterbedingungen. Ungefähr zwei bis drei Proben (mit bis zu sechs eDNA-Filtern) wurden während dreistündiger Einsätze auf den Azoren entnommen, zwei bis vier Proben während ~8 Stunden in Italien (was bis zu acht Filtern ergab) und ein bis zwei Proben (was bis zu vier Filter ergab) während der 3,2-Stunden-Touren in Island. Die Filtrationsleistung war auf den Azoren und in Italien allgemein hoch. Auf den Azoren wurden innerhalb von 10–15 Minuten konstant 10 Liter Meerwasser gefiltert, während in Italien das gleiche Volumen in etwa 10 Minuten gefiltert wurde. In Island lagen die gefilterten Volumina zwischen 4,5 und 10 L (Mittelwert = 8,5 L), mit einer durchschnittlichen Filtrationszeit von ~40 Minuten aufgrund häufiger Filterverstopfungen, vermutlich aufgrund von Partikeln im Wasser im Untersuchungsbereich. Konkret wurden 10 L erfolgreich für 46 der 98 Filter (47 %) gefiltert, Volumina zwischen 7 L und 10 L für 31 Filter (32 %) und Volumina zwischen 4 L und 7 L für 21 Filter (21 %) (Supplemental File 1 – Supplemental Table S3).

Das Protokoll empfiehlt die Filtration einer feldnegativen Kontrollgruppe nach jeweils fünf Flukeprint-Proben. Unter operativen Walbeobachtungsbedingungen konnte dies jedoch in der beschriebenen Fallstudie aufgrund logistischer Einschränkungen, darunter begrenzte Filterverfügbarkeit, Zeitmangel und Versandverzögerungen, nicht vollständig erfüllt werden. Dadurch wurden die erreichbaren Kontroll-zu-Stichprobe-Verhältnisse auf 1:10,7 in Island (9/96), 1:12,6 auf den Azoren (12/151) und 1:15,3 in Italien (4/61) reduziert. Trotz dieser Abweichungen zeigten keine Feld- oder Labor-Negativkontrollen eine Amplifikation.

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Abbildung 9: Überblick über die Stichprobenstandorte. Schwarze Punkte auf der Karte zeigen Orte, an denen Proben von einem Buckelwal-Flukeprint in der Skjálfandi-Bucht (Island) und auf den Azoren entnommen wurden. Der Name des eDNA-Filters wird in der Nähe der entsprechenden Probenahmeregion angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 10: Nachweise aus einer Teilmenge von eDNA-Filtern von den Azoren und Island. qPCR-Mittelwerte und DNA-Signalstärke für positive Nachweise auf Azoren und Island (mindestens eine positive PCR-Replikation) mit SD und LOD. Die Balken sind nach der Signalstärke relativ zum LOD gefärbt: Dunkelblau = starkes Signal (Ct ≤ 35,8) gibt zuverlässige Erkennungen an, Hellblau = schwaches Signal (Ct > 35,8) gibt plausible Erkennungen an. SD-Fehlerbalken stellen die Variabilität zwischen PCR-Replikaten dar. Die rot gestrichelte Linie zeigt die LOD an (Ct = 35,8). Über jedem Balken werden mittlere Ct-Werte angezeigt. Abkürzungen: Ct = Zyklusschwelle; SD = Standardabweichung; LOD = Detektionsgrenze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 11: Mittlere Zyklusschwellenwerte für Buckelwal-DNA-Nachweise von den Azoren und Island. Schwarze Linien innerhalb der Boxdiagramme zeigen den Median an, rote Quadrate stehen für die mittleren Ct-Werte (SD), während Schnurrhaare die Minimal- und Maximalwerte für die Azoren und Island darstellen. Der Mann-Whitney U-Test zeigte, dass dieser Unterschied statistisch nicht signifikant war (U = 199,0, p = 0,204). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1: Primer- und Sondensequenzen für den ND5-gezielten qPCR-Test. Diese Sequenzen umfassen Vorwärts- und Rückwärtsprimer, MGB-Sondensequenzen (5′–3′), optimale Glühtemperatur und Assay-Nachweisgrenze (LOD). (*) LOD ist definiert als die niedrigste DNA-Konzentration (ng/μL) der DNA der Zielart, bei der ≥95 % der PCR-Replikationen eine positive Amplifikation erzielten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Optimierte Zyklusbedingungen für den Buckelwal-eDNA-qPCR-Test. Diese optimierten qPCR-Einstellungen betragen 95 °C für 10 Minuten (Enzymaktivierung), dann 40 Zyklen bei 95 °C für 15 Sekunden (Denaturierung) und 60 °C für 90 Sekunden (Glühen/Verlängerung). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Überblick über die Feldprobenkonfiguration. Überblick über Probenahmeregionen, Feldpartner, Gefäßtypen, Zielarten, Probezeiträume und Probenreplikaten auf den Azoren, Island und Italien. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: qPCR-Detektionszusammenfassung für Umweltproben und Kontrollen. Positive Erkennungen (gelb hervorgehoben), qPCR replizieren CT-Werte und Detektionsergebnisse werden angezeigt; Proben wurden als positiv klassifiziert, wenn mindestens eine der qPCR-Replikate eine Amplifikation zeigte. "Kein Ct" zeigt keine Verstärkung an, negative Kontrollen zeigten keine Verstärkung, und die M. novaeangliae-Standardverdünnungsreihe zur Definition der Prüfleistung und der LOD ist am unteren Rand der Tabelle enthalten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzungsakte 1: Enthält ergänzende Abbildungen und Tabellen, die zusätzliche Informationen zur Anwendung des Protokolls bieten, einschließlich des Primer-Design-eDNA-Probekits , Walbeobachtungsboottypen, Eigenschaften des selbsterhaltenden eDNA-Filters, Reagenzienvolumina für DNA-Extraktion und qPCR-Reaktionen sowie Unterschiede in den Filtrationsraten zwischen den Probenahmeregionen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsakte 2: Felddatenblatt, das bei der eDNA-Probenahme von Walen verwendet wird. Standardisiertes Formular zur Erfassung von Kreuzfahrtmetadaten, Walbeobachtungen sowie Stichproben- und Filterinformationen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 3: Schritt-für-Schritt-Feldprotokoll für die eDNA-Probenahme von Walwalen an Bord von Walbeobachtungsschiffen, einschließlich Reinigung von Geräten, Meerwassersammlung und -filtration an Bord, Probenberichterstattung und -lagerung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsakte 4: Tabellenkalkulation zur eDNA-Probenahme von Walen. Standardisiertes Formular zur Erfassung von Probenahmeinformationen nach der Probenentnahme und Bordfiltration. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Operative Machbarkeit und Feldimplementierung
Das hier vorgestellte Protokoll trägt zu einem standardisierten eDNA-Workflow bei, der die Erkennungsempfindlichkeit mit realen Einschränkungen in Einklang bringt. Durch die Integration von großvolumigen, auf Flukeprints ausgerichteten Probenahmen, Onboard-Filtration mit selbsterhaltenden geschlossenen Filtern und standardisierten Kontaminationskontrollmaßnahmen bietet das Protokoll einen reproduzierbaren Rahmen, der regionenübergreifend und in Probenahmekampagnen angewendet werden kann. Dieser Ansatz steht im Einklang mit der wachsenden Anerkennung von eDNA als kosteneffiziente und skalierbare Ergänzung zu herkömmlichen marinen Überwachungstechniken 9,10,22.

Frühere eDNA-Studien an Walen stützten sich weitgehend auf transektbasierte Meerwasserproben von großen Forschungsschiffen oder opportunistische Kleinmengenproben in der Nähe von Walsichtungen. Transektbasierte Ansätze ermöglichen eine breite räumliche Abdeckung, erfassen jedoch oft verdünnte und zeitlich entkoppelte DNA-Signale, was den Nachweis seltener oder vorübergehender Artenbegrenzt, selbst wenn die Probenahme nahe der Oberfläche erfolgt, und erfordern typischerweise spezialisierte Gefäße und Infrastruktur 25,37,72. Umgekehrt verbessert die Probenahme mit geringem Volumen in der Nähe von auftauchenden Walen die Begegnungsspezifität, bleibt aber aufgrund begrenzter Wassermengen und inkonsistenter Filtrationspraktiken anfällig für falsche Negative,72,73. Durch explizite Zielerfassung von Flukeprints und das Filtern großer Mengen an Bord erhöht der hier dargestellte Workflow die Wahrscheinlichkeit, niedrigkonzentrierte Wale-DNA zu erfassen, während es unter den zeitlichen und räumlichen Einschränkungen, die für Walbeobachtungen typisch sind, machbar bleibt. Der Einsatz von geschlossenen, selbsterhaltenden Filtern minimiert die Handhabungs- und Kontaminationsrisiken weiter, eliminiert den Bedarf an im Feld eingesetzten Konservierungspuffern und vereinfacht die Logistik unter eingeschränkten Bedingungenan Bord 42,66.

Um die Vergleichbarkeit der Kreuzstudien sicherzustellen, müssen innerhalb einer Probenahmekampagne folgende Parameter festgelegt bleiben: Aufnahme von Meerwasser direkt aus sichtbaren Walfischflossen; zwei 10-L-biologische Replikate pro Flukeprint; der Einsatz von selbsterhaltenden eDNA-Filtern sorgt für die Onboard-Filtration während standardisierter Kontaminationskontrollmaßnahmen, einschließlich regelmäßiger Feld-Negativkontrollen bei einer definierten Mindestfrequenz; und artspezifische qPCR-Screening, die in dreifacher Ausführung mit geeigneten Kontrollen durchgeführt wird. Weitere Parameter können variieren, ohne den methodischen Rahmen zu beeinträchtigen, vorausgesetzt, sie werden konsequent und transparent berichtet, darunter Wassersammelausrüstung und -handhabung, Filterporengröße, Pumpentyp und Rohrkonfiguration, Filtrationsdauer und erreichbares gefiltertes Volumen unter Verstopfungsbedingungen, Probenlogistik an Bord sowie kurzfristige Lagerungsbedingungen vor dem Versand. Da viele Verarbeitungsschritte in eDNA-Studien variabel bleiben, wird eine rigorose Berichterstattung aller Probenahme- und Analyseschritte dringend empfohlen.

Die Machbarkeit dieses Protokolls ist am höchsten unter ruhigen bis moderaten Seebedingungen (≤ Beaufort 3), mit geringer bis mittlerer Trübung, wenn an Bord Zeit und Raum die Verarbeitung von zwei eDNA-Filtern pro Flukeprint und einem gefilterten Wasservolumen von 10 L pro Filter erlauben. In der Praxis können ausgebildete Wissenschaftler bis zu Beaufort 3 beproben, aber Bürgerwissenschaftler sollten aufgrund von Schiffsbewegungen und Turbulenzen nur unter ruhigen Bedingungen arbeiten (Beaufort 1-2), obwohl Walbeobachtungen auf Beaufort 3 gelegentlich stattfinden. Die Filtration sollte so bald wie möglich nach der Wasserentnahme beginnen, um den DNA-Abbau zu minimieren47,74. Probenahmestrategien, die die durch den Propeller induzierte Verdünnung der Oberflächen-eDNA minimieren, wie etwa Proben von der Leeseite und der unteren Seite des Schiffs, unterstützen zusätzlich die Zielgenauigkeit und zuverlässige Nachweise47. Das Vermeiden von Rückwärtsmanövrieren und das Verhindern von Seilen (an Eimern befestigt) an Kontakt mit Meerwasserproben verringert das Kontaminationsrisiko weiter, was mit den Best Practices der aquatischen eDNA38 entspricht. Je nach Schiffskonfiguration und Logistik (z. B. Schiffshöhe, Bewegung und verfügbarer Bordplatz) werden bei konsequenter Anwendung zwei Probenahmestrategien unterstützt: (i) unabhängige Entnahme und Filtration von zwei 10-Liter-Replikaten mit zwei separaten Eimern oder (ii) Entnahme einer einzelnen 20-Liter-Wasserprobe, die in einen versiegelten sterilen Behälter für sicheren Transport an Bord umgefüllt und anschließend in zwei 10-Liter-Replikate zur Filtration aufgeteilt wird. Ein Filtervolumen von 10 Litern pro Filter stellt einen praktischen Kompromiss zwischen Nachweiswahrscheinlichkeit und Filtrationsaufwand unter Walbeobachtungsbedingungen dar.

Größere Volumina erhöhen die Wahrscheinlichkeit, seltene oder niedrig konzentrierte eDNA zu erfassen, und reduzieren in Walenstudien häufig falsch-negative Ergebnisse39, 40, 75, während sie in Kombination mit selbsterhaltenden Filtern und großen Porengrößen operativ machbar bleiben42. Erhöhte Partikellasten, Schiffsbewegungen, begrenzter Deckplatz oder Zeitdruck können die Filtrationseffizienz und erreichbare Volumina verringern und somit die Anwendbarkeit des Protokolls einschränken. In solchen Fällen können protokollspezifische Anpassungen erforderlich sein, wie reduzierte Wassermengen oder alternative Filterporengrößen, die in Stichprobenkampagnen konsequent angewendet werden sollten, um die Datenvergleichbarkeit zu gewährleisten. Reisezeit, Zeitpunkt der Walbegegnungen und die Filtrationskapazität bestimmen die erreichbaren Probenzahlen. Bei Standard-3-Stunden-Walbeobachtungstouren können in der Regel ein bis zwei Flukeprint-Proben (gelegentlich drei) durchgeführt werden, ohne den Betrieb oder das Bürgerwissenschaftserlebnis zu stören. Bei längeren Expeditionen skaliert die Probenkapazität mit dem täglichen Walbeobachtungsaufwand (z. B. ~8 Stunden pro Tag in unserer Fallstudie in Italien). In der Praxis könnte die eDNA-Probenahme an allen drei Orten während der Spitzentouristenaktivität durchgeführt werden.

Erfolg der eDNA-Amplifikation und Kontaminationskontrolle
Umweltproben, insbesondere solche, die in nährstoffreichem Wasser gesammelt werden, können PCR-Inhibitoren enthalten, die in der Lage sind, Amplifikation zu unterdrücken und falsch-negative Ergebnisse76 zu erzeugen. Obwohl in früheren Analysen von isländischen Proben im selben Projekt42 keine Hemmung festgestellt wurde, sorgte die Einbeziehung eines Inhibitor-Entfernungsschritts für einen konsistenten Amplifikationserfolg (siehe Materialtabelle) und entspricht den Best-Practice-Empfehlungen für aquatische eDNA-Workflows14,55.

Konsistente qPCR-Nachweisleistung in verschiedenen Regionen zeigt, dass das Protokoll unter unterschiedlichen Umweltbedingungen zuverlässig eDNA von Walen erfasst. Geringfügige CT-Variationen spiegeln wahrscheinlich regionale Unterschiede in Temperatur, Trübheit und Produktivität wider, die die Freisetzung, Abbau und Verteilung von eDNA beeinflussen75,76. Der Nachweisgrenzwert des Tests (0,0001 ng/μL) liegt innerhalb des Sensitivitätsbereichs, der für andere validierte Wal-Assays im Rahmen des eWHALE-Projekts 14,11,42 gemeldet wurde. Die Nachweisraten stimmten mit zuvor veröffentlichten Flukeprint-basierten Untersuchungen überein, was den Einfluss von Artenverhalten und Oberflächenhäufigkeit auf den Nachweiserfolg 41,42,47 unterstreicht. Gewebebasierte DNA-Standards wurden für die qPCR-Quantifizierung verwendet, was eine gängige Praxis in der marine eDNA-Forschung widerspiegelt 57,72,77,78,79. Obwohl dieser Ansatz Varianz in der absoluten Quantifizierung 11,61,80,81,82,83 einführen kann, insbesondere bei niedrigen und heterogenen Umweltproben 84,85, spiegelt er die reale Probenkomplexitätwider 55,86. Der Einsatz synthetischer Standards kann die quantitative Reproduzierbarkeit und die Vergleichbarkeit zwischen Studien verbessern und wird für zukünftige Anwendungen empfohlen 11,87.

Mögliche Kontaminationsquellen umfassen Kreuzprobenübertragung sowie das Einführen menschlicher oder nicht-zielbezogener Umwelt-DNA während der Handhabung, was zu falsch-positiven Nachweisenführen kann 88. Eine strenge Kontaminationskontrolle ist während der gesamten Feld- und Laborverarbeitung unerlässlich, insbesondere unter den für Bürgerwissenschaften typischen eingeschränkten Bedingungen. Routinemäßige Handschuhwechsel, der Einsatz von DNA-freier Ausrüstung, geschlossene Filtersysteme, standardisierte Schulungen, die routinemäßige Einbeziehung von Feld- und Laborkontrollen, Dokumentation potenzieller Kontaminationsereignisse sowie die Validierung des Tests nach etablierten Rahmenbedingungen sind entscheidend für die Sicherstellung der Datenzuverlässigkeit und Artennachweis 11,31,49,51,55,89 . Obwohl der Kunststoffverbrauch eine unvermeidliche Einschränkung der feldbasierten molekularen Probenahme darstellt, wurde der Verbrauch wo möglich minimiert, und teilweise biologisch abbaubare Filtrationsmaterialien wurden66 verwendet.

Einschränkungen, Skalierbarkeit und zukünftige Auswirkungen
Filterverstopfungen bleiben eine wichtige Einschränkung in trüben oder produktiven Umgebungen wie der Skjálfandi-Bucht (Island), wo organische Substanz und Planktondichte wahrscheinlich die Filtrationseffizienzum 43,90 senkten. Die Aufzeichnung der Filtrationsdauer, Indikatoren für Filterverstopfungen wie verminderten Durchfluss, sichtbare Luftblasen im Filter oder Pumpenbelastung sowie die Begrenzung der Filtrationszeit auf etwa 45 Minuten pro Replikat unterstützen die nachgelagerte Interpretation und den Vergleich. Die Verwendung eines sterilisierten Schwimmgeräts zum Aufhängen des Filters oder schwerkraftgespeister Filtrationsbeutel kann die Handhabungszeit während der Filtration potenziell verkürzen, wobei letztere mit selbsterhaltenden eDNA-Filtern und großen Volumina (≥1 L)91 möglicherweise nicht kompatibel sind. Filter mit größerer Porengröße (≥ 5 μm) können die Filtrationsraten weiter verbessern, wobei die taxonspezifische Detektionseffizienz während der Pilotprobenahme für cetacean eDNA 45,92 bewertet werden sollte.

Wichtige Überlegungen vor der umfassenden Probenahme umfassen: die Priorisierung der Filterung an Bord gegenüber der verzögerten Verarbeitung, die Aufrechterhaltung konstanter Wassermengen und Filterkonfiguration, Durchführung von Pilotproben zur Optimierung der Filtration unter lokalen Bedingungen sowie die Abstimmung des Probeaufwands mit der Kapazität des Schiffs und der Fahrtdauer. Digitale Dateneingabetools, die strukturierte Praxisaufnahmen durch Bürgerwissenschaftler ermöglichen, werden fürzukünftige Anwendungen empfohlen.

Die erfolgreiche Anwendung dieses Workflows von Anfang bis Ende zeigt Robustheit unter operativen Einschränkungen und hebt gleichzeitig Einschränkungen in Bezug auf Raum, Zeit, Wetter und Kontaminationsrisiken hervor, die in Citizen Science-Kontexten innewohnen10,94. Trotz dieser Einschränkungen stellen Walbeobachtungsschiffe eine leistungsstarke und wenig genutzte Plattform für die eDNA-Überwachung von Walen dar, wenn standardisierte Ausbildung und Überwachung bereitgestellt werden. Die Integration dieses Workflows mit etablierten Werkzeugen zur Überwachung von Walen wie Fotoidentifikation, passiver Akustik und Biopsieprobenentnahme kann genetische Nachweise mit Verhaltens- und demografischen Daten verknüpft werden. Während sich diese Studie auf artspezifische, qPCR-basierte Detektion konzentriert, könnten zukünftige Anwendungen DNA-Metabarcoding oder populationsgenetische Analysen integrieren und so den ökologischen und schutzwertigen Wert der eDNA-Überwachung bei Walen weiter erhöhen.

Da eDNA-basierte Ansätze weiterhin florieren, bietet dieser Arbeitsablauf eine skalierbare Grundlage zur Integration genetischer Überwachung in bestehende Programme zur Meeresbeobachtung und -naturschutz, insbesondere in Wal-Hotspots und sensiblen Ökosystemen.

Offenlegungen

Belén García Ovide ist Gründer und Geschäftsführer von Ocean Missions, einer gemeinnützigen Organisation mit Schwerpunkt auf Meeresschutz und mit Sitz in Húsavík, Nordost-Island. Ocean Missions koordiniert die Probenahmen von Walbeobachtungsschiffen in Island sowie von arktischen Expeditionsschiffen. Sie ist außerdem Vertreterin von North Sailing, einem Walbeobachtungsunternehmen in Húsavík, im Rahmen des eWHALE-Projekts. Diese Zugehörigkeiten beeinflussten weder das Studiendesign, die Datenerhebung, die Analyse noch die Interpretation der Ergebnisse.

Danksagungen

Wir möchten alle Personen würdigen, die an der Feldarbeit und Laborarbeit beteiligt sind, nämlich:

i) Aidan Mabey, Matteo Tosato, Anouk Adolph, Jeanne Laporte, Romi Neerot und Isabell Österle, die an Proben in der Skjálfandi-Bucht, Island, beteiligt waren; ii) Dania Tesei, Michael Costa, Rita Norberto, Marlene Schwandt, Rita Leitão, Ricardo Ventura, Martijn Schouten, Giada Viscontini, Katharina Leeb, Anthony Le Floch, Francisco Nunes, Renato Cardoso, Faustine Darius, Monique Schouten, Laura Biet auf den Azoren (Portugal); iii) Sandra Schallhart, Jana Robertson in Österreich; und iv) Sabina Airoldi, Mario Gabualdi, Marina Costa, Morgana Vighi, Nino Pierantonio, Roberto Raineri für die Datenerhebung im Pelagos-Schutzgebiet (Italien).

Diese Forschung wurde von Biodiversa+, der European Biodiversity Partnership, im Rahmen des BiodivProtect-Aufrufs 2021-2022 für Forschungsanträge finanziert, kofinanziert von der Europäischen Kommission (GA Nr. 101052342) und mit den Förderorganisationen: 1) The Icelandic Center for Research (RANNÍS), (Zuschussnummer 229030), 2) Ministerium für Universitäten und Forschung (MUR), aus dem FIRST- und IGRUE-Sonderkonto im Zusammenhang mit der europäischen Partnerschaft Biodiversa+ Call 2021 – eWHALE-Projekt, 3) den Österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF) [doi: 10.55776/I6389] und den Publikationsfonds der Universität Innsbruck.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alternative eDNA-Filter: SterivexTM /WaterraMerck Millipore/Waterra Pumps LimitedSVHVL10RC/NA0,45 &Mikro; M Porengröße. Erfordern eDNA-Erhaltungspuffer 
AW1, AW2, AE-PufferQiagen   19081, 19072, 19077Pufferlösungen, die zur DNA-Reinigung während der Extraktion verwendet werden
Bleichlösung (1:10)DM - Denk mit, HygienereinigerAngepasstOberflächendekontamination. Alle Schritte in Laborprozessen
EimerBootsgeschäfte, Angelausrüstung, AmazonSteif. Gummi oder hartes Plastik (&ge 10 L). Eine oder mehrere, abhängig von der Stichprobenaufstellung und der Logistik an Bord
Reinigungsreagenz, Express PCR ExoSAP-IT75001.1.EAPCR-Produktvorbereitung für die Sanger-Sequenzierung
KühlboxWohnraumIsolierter starrer Behälter oder Kühlbeutel
Einweghandschuhe, Large (L) und Medium (M) Größen,
puderfrei		Kimberly-Clark43431, 55090Einweghandschuhe aus Nitril oder Latex, 100-Einheiten-Packung. Benötigter Betrag: 1 Box pro 10 - 15 Fahrten
DNA-Standards (3 & mu; L) NAAngepasstDNA-gewebsabgeleitete serielle Verdünnung (8 Punkte, 10 ng/& Mikro; L) vom Buckelwal. Kalibrierung in qPCR
DNA-sichere LaborkleidungFalano, PP-Gesamtwertung081-2900Alle Schritte in Laborprozessen.
eDNA-BehälterWohn- oder BaumärkteNADeckel, langlebig, transparent (&ge 10 L). 
Elutionsplatte, Stabdeckel, Waschplatten, BindeplatteQiagen19581, 997004, 1031656, 302570Kunststoffe, die für die DNA-Extraktion verwendet werden 
Ethanol (8:10)Endure, ACS ISO KlingelungVerschiedeneBanksterilisation. Alle Laborschritte
Felddatenblätter
Fluoreszenzbasierter HochsensitivitätstestThermo Fisher ScientificQ32851Qubit dsDNA Hochsensitivitätstest (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)
Hochgeschwindigkeitszentrifuge (24.000 U/min)Hettich Zentrifugen Trennt DNA-haltiges Supernatant von Ablagerungen. DNA-Lyse
EispacksWohngeschäfteKühlung der Proben im Schiffscontainer
IPC-Vorwärts- und RückwärtszündhütchenIntegrierte DNA-TechnologienNAMaßgeschneidertes Produkt zur Amplifikation der DNA der Zielart
IPC PrimeTime qPCR ProbesIntegrierte DNA-TechnologienNAMaßgeschneidertes Produkt zur Amplifikation der DNA der Zielart
Laminarströmungshaube Kendro Laboratory ProdukteVFS1206Sterile Umgebung für Reagenzienpräparate in der qPCR-Vorbereitung
Laminiertes, illustriertes Feldprotokoll  Angepasst
Lysis-PufferQiagen79216DNeasy-Lysepuffer AL. Alternative zu TES-Puffer + Proteinase K
Magnetische Perle; basierter DNA-RoboterKingFisher Apex 96 PCR-Kopf5400910Software: BindIx PC 
Magnetische Partikel zur Nukleinsäurebindung (30 & Mikro; L)Qiagen67563MagAttract-Partikel. Erleichtert die DNA-Bindung an magnetische Perlen bei der DNA-Extraktion
Master-Mix (5 & mu; L)EMM, Lebenstechnologien4396838TaqMan Umwelt-Mastermix (2.0)
Mini Plate Spinner Zentrifuge LabnetC1000Flüssigtropfen und Kondensation aus PCR und Mikroplatten abspritzen
OneStep-96 PCR-Inhibitor-EntfernungssetZYMO-ForschungD6035Reinigung und Entfernung von Schadstoffen in eDNA-Extrakten 
PCR-PlattenBio-RadHSP9601Hartschale 96-Well
Pipetten + sterile gefilterte SpitzenPipetten: BIOHIT, Filtertipps: Biozym Safe  Seal Tipps  ProfiVerschiedeneManuelle oder elektronische Pipetten können mit unterschiedlichen maximalen Lautstärken verwendet werden
Plate Spinner Zentrifuge NANAEntfernt Blasen vor qPCR 
Proteinase KAvantor VWRA4392.0010Verdauung von Proteinen, um die DNA-Freisetzung während der Lyse zu unterstützen
Gereinigtes WasserMilliQNARNase-freies Wasser, verwendet für Negativkontrollen und Reinigungslösungen;
Reaktionsröhren (2 mL)Eppendorf30120094DNA-Lyse
Echtzeit-quantitativer PCR-ThermocyclerAnalytikjenaNAQTower 3G-Plattform. Ampifiziert und quantifiziert DNA in Echtzeit
SeileBootsfahrt, Baumärkte, FischerhäfenNAStarkes Material (z. B. Polyethylen oder Zopfseil). Länge mindestens doppelt so hoch wie das Gefäß
Dichtfolie, Klebstoff, optischBio-RadMSB1001Mikroversiegelung 'B'. Versiegeln Sie die PRC-Platte vor der PCR
Selbsterhaltende eDNA-FilterSmith-Root 11579-251.2 &Mikro; M Porengröße. Menge pro Stichprobenkampagne: je nach Bedarf
SchiffscontainerLabore, Apotheken, AmazonVerschiedeneStyroporisoliert
Software zur biologischen Sequenzausrichtung und -analyseBiografie-BearbeitungVersion 7Benutzerfreundlicher Editor für biologische Sequenzausrichtung und Analyseprogramm für Windows 95/98/NT
QuetschflascheLabore, ApothekenVerschiedeneGefüllt mit Haushaltsbleichmittel (1:10)
Statistische AnalysesoftwareR-Studio-Team. (2023)Version 4.2.1
Sterilisierte, DNA-freie HandschuheSempercare  Ausgabe79712Alle Schritte in den Laborprozessen. 
TES-PufferBenutzerdefiniertes Produkt, äquivalent zum DNeasy-Lysis-Puffer
Giftiger AbfallbehälterSichere Entsorgung gefährlicher Abfälle. Alle Schritte
UV-Lampe SterilAIRSterilisation der Haube zur qPCR-Vorbereitung
Vortex-genie 2 Vortex Mixer Thermo Fisher Scientific50728002Homogenisiert und mischt Reagenzien. DNA-Lyse, Extraktion
AbfallbehälterWohngeschäfteKleiner starrer Behälter
Wasserpumpe (peristaltisch/vakuum)Eijkelkamp; Solinst/Smith-Root 12.34.SB; 410/12099Tragbare Pumpen
Wasserdichter MarkerVerschiedene

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