Methodenartikel

Stereotaktische Chirurgie bei Säuglingsmäusen und postoperative Pflege

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DOI:

10.3791/70335

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31. März 2026

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1Neurobiology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, Research Triangle Park

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, virale Vektoren im präpubertären Gehirn zu exprimieren, ist grundlegend für die Untersuchung der zellulären und schaltkreislichen Mechanismen der Gehirnentwicklung. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Durchführung stereotaxischer viraler Chirurgie am Säuglingsmaus an den postnatalen Tagen 11 oder 12 (P11-P12) und geben Richtlinien für die postoperative Versorgung.

Zusammenfassung

Das Verständnis der Entwicklungs-, zellulären und Kreislaufprozesse über die postnatale Zeit hinweg ist entscheidend, um die Komplexität der Gehirnentwicklung und deren Einfluss auf Verhaltens- und soziale Reifung zu erläutern. Der Übergang vom Säugling ins Erwachsenenalter beinhaltet bedeutende neurobiologische Veränderungen, darunter synaptische Beschneidung und Myelinisierung, die grundlegend für kognitive Fähigkeiten, Emotionsregulation und soziale Interaktionen sind. Die Untersuchung der Gehirnentwicklung bei präpubertären Mäusen ermöglicht es Forschern, kritische Phasen zu identifizieren, die ein gesundes Gehirnwachstum unterstützen, und zeitnahe Interventionen für neuroentwicklungsbedingte Störungen zu etablieren. Um die Gehirnfunktion präzise zu analysieren, ist die stereotaktische Chirurgie eine zentrale Technik in der neurowissenschaftlichen Forschung, die unvergleichliche Präzision bei der Zielerfassung von Hirnregionen bietet und die Abgabe viraler Wirkstoffe ermöglicht. Obwohl stereotaktische Operationen bei erwachsenen Mäusen in neurobiologischen Laboren weit verbreitet sind, gibt es nur sehr begrenzte Richtlinien für die Durchführung stereotaxischer Operationen bei präpubertären Mäusen sowie eine wichtige postoperative Betreuung, um sicherzustellen, dass das Kind erfolgreich an seine Mutter und Wurfgeschwister wiederangesiedelt werden kann. Hier beschreiben wir ein Protokoll für stereotaktische Chirurgie und virale Injektion bei Säuglingsmäusen (P11-P12), wobei wir die Verabreichung von Anästhesie und Analgesie, Überlegungen zur postoperativen Versorgung sowie Unterschiede zur stereotaxischen Chirurgie bei Erwachsenen hervorheben. Dieses Protokoll kann in jeder interessierenden Hirnregion implementiert werden, indem die gewünschten Zielkoordinaten aktualisiert werden, und kann für die Zielerfassung in späteren Phasen der postnatalen Entwicklung, etwa während der Juvenilphase, angepasst werden (P15-P30). Insgesamt bietet dieses Protokoll einen Einstiegspunkt für die Untersuchung der postnatalen Gehirnentwicklung und -funktion.

Einleitung

Säuglings- und Jugendalter sind entscheidende postnatale Phasen für die Gehirnentwicklung, gekennzeichnet durch Myelinisierung, Synaptogenese und synaptische Beschneidung, die die Verfeinerung der Schaltkreiseerleichtern 1,2. Das Auftreten sozialer Verhaltensweisen, einschließlich Paarung, Aggression und sozialem Spiel, tritt während der peripubertalen Phase auf (P28-40)3 und wird streng durch zirkulierende Steroidhormone 4,5 reguliert. Trotz bedeutender Fortschritte bei Werkzeugen zur Analyse der zellulären Grundlagen sozialer Verhaltensweisen bei Erwachsenen ist wenig über die neuronalen Mechanismen bekannt, die dem Entstehen sozialer Verhaltensweisen während der postnatalen Entwicklung zugrunde liegen. Gründe für das fehlende Verständnis der Entwicklung sozialer Schaltkreise sind 1) Herausforderungen bei der Durchführung von Operationen bei Säuglingsmäusen, einschließlich stereotaxischer Einrichtungen, die nicht für jüngere Mäuse eingerichtet sind, 2) das Ausbalancieren von Sicherheit und Wirksamkeit von Analgesie und Anästhesie während der Operation6 und 3) die Aufnahme von Säuglingen durch die Mutter nach der Operation. Darüber hinaus sind die aktuellen Methoden, die zur Bereitstellung genetischer Konstrukte zu frühen postnatalen Zeitpunkten verwendet werden, wie etwa bei der Utero-Elektroporation7, intracerebroventrikulärer viraler Injektion im neonatalen Mausgehirn(P0-P10) 8 oder rekombinase Treiber- und -responsive line-genetische Kreuzungen9, nicht ideal, da ihnen eine präzise Zielsetzung fehlt und sie sich auf embryonales oder P0-Targeting konzentrieren.

Hier bieten wir ein einfaches Protokoll für stereotaktische Operationen bei Mäussäulen (P11–P12) und postoperative Betreuung, um die erfolgreiche Wiedereingliederung mit der Mutter und den Wurfgeschwistern zu unterstützen. Dieses Protokoll nutzt das aktuelle stereotaktische Protokoll für erwachsene Mäuse10 und erfordert nur geringfügige Änderungen am stereotaxischen Aufbau. Wir geben zudem ausführliche Hinweise zur postoperativen Versorgung sowie zu erfolgreichen Anästhesie und Analgesie bei Mäussäuglingen. Wir wählten den Zeitpunkt P11-12 für die Operation, da eine zweiwöchige Inkubationszeit für die virale Expression besteht, sodass Mäuse ab P24, vor der peripubertalen Periode (P28-40)3, in vivo getestet werden können. Dieses Protokoll kann jedoch auch für stereotaxische Operationen zu späteren Zeitpunkten verwendet werden. Wir konzentrieren uns auf die sich entwickelnde mediale Amygdala (MeA), eine Amygdala-Unterteilung, die durch ihre Rolle in einer vielfältigen Gruppe sozialer Verhaltensweisen gekennzeichnetist 11,12. Wir untersuchen speziell die MeA-Subpopulation, die Foxp2 (MeAFoxp2)13, einen Forkhead-Box-Transkriptionsfaktor, exprimiert, da wir zuvor festgestellt haben, dass diese Zellen einzigartig für die in vivo Verarbeitung männlicher Sinnessignale bei männlichen Mäusen während der postnatalen Entwicklung14 verdrahtet sind. Zusätzlich ist die MeAFoxp2-Unterpopulation erforderlich, um die territoriale Aggression beiMännchen 14 bidirektional zu modulieren. Insgesamt ermöglicht das aktuelle Protokoll Neurowissenschaftlern, virale Wirkstoffe präzise in gezielte Hirnregionen in wichtigen postnatalen Entwicklungsstadien des Gehirns zu verabreichen, um die zellulären und Kreislaufgrundlagen sozialer und affiliativer Verhaltensweisen in der Jugend und im Erwachsenenalter zu untersuchen.

Protokoll

Dieses Verfahren wurde vom NIEHS Animal Care and Use Committee genehmigt und entsprach den Richtlinien des National Institutes of Health für die Nutzung und Pflege von Tieren. Geeignete persönliche Schutzausrüstung, darunter Handschuhe, Gesichtsmaske, Einwegkittel, Haarnetz und Schuhbezüge, wurden während der gesamten Operation und in Gegenwart von Tieren verwendet.

1. Vorbereitung und Anpassung des Maus-Stereotaxischen Apparats (Abbildung 1)

  1. Bereiten Sie das stereotaktische Gerät mit stereotaxischen Zubehörteilen für Mäusebabys vor, darunter ein Paar nicht-entrückter Ohrenstangen, einen modifizierten Gasanästhesiekopfhalter und eine Gaumenstange für P12-Säuglinge.
  2. Desinfizieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge mit einem Glasperlensterilisator (250 °C, 30 °C für kleinere Werkzeuge und 1 Minute für größere Werkzeuge). Lege nach der Sterilisation sterile Werkzeuge auf einen sterilen Vorhang. Sterile Werkzeuge sollten während der gesamten Operation auf dem sterilen Feld verbleiben.
  3. Legen Sie einen weiteren sterilen Vorhang über ein Heizkissen bei einer Temperatur von ~37 °C auf der stereotaxischen Anlage, um das Baby während der gesamten Operation auf einer kontrollierten Temperatur zu halten. Überwachen Sie die Temperatur des Heizkissens während des gesamten chirurgischen Eingriffs.

2. Mauschirurgie, stereotaktische Platzierung, Nivellierung und Kraniotomie

  1. Missen Sie das Körpergewicht, um eine angemessene Analgesie-Dosierung zu erhalten.
  2. Setzen Sie die Maus in eine 3 % isoflurangefüllte Induktionskammer mit einer Sauerstoffflussrate von 0,9 L/min. Überprüfen Sie, ob die Atmung der Maus auf ~1 Atemzug pro Sekunde gesunken ist und ob nach dem Testen des Pedalrückzugsreflexes keine Reaktion auftritt. Stellen Sie den Isofluran-/Sauerstofffluss auf das stereotaktische System um und reduzieren Sie die Isoflurankonzentration auf 2 %.
    HINWEIS: Eine ausreichende Anästhesie muss durch das Ausbleiben von Reaktionen auf den Pedalrückzugsreflex alle 5 Minuten während des gesamten chirurgischen Eingriffs bestätigt werden. Beobachten Sie während der gesamten Operation sorgfältig das Atemmuster der Maus. Passen Sie die Isoflurankonzentration während der gesamten Operation so an, dass der niedrigste Prozentsatz verwendet wird, um die tiefe Anästhesie aufrechtzuerhalten und eine Anästhesieüberdosis zu vermeiden.
  3. Installieren Sie die Maus auf dem modifizierten stereotaxischen Gerät mit stereotaxischen Zubehör für Mäusebabys. Setze die nicht durchstichten Ohrstäbe an die Seite des Mauskopfes und richte das Ohrbügel-Lineal so aus, dass es auf beiden Seiten zum stereotaxischen Rahmenlineal gleich weit entfernt ist. Für P11-Säuglinge stellen Sie das stereotaktische Lineal auf 5 mm ein.
    HINWEIS: Säuglinge bei P11 haben in der Regel noch keine Augen offen, daher ist kein Augenschmiermittel erforderlich. Bis P12 haben manche Säuglinge die Augen offen. Wenn die Augen des Säuglings offen sind, sollte während der gesamten Operation eine Augensalbe aufgetragen und bei Bedarf erneut aufgetragen werden.
  4. Injizieren Sie 5 mg/kg Meloxicam über den subkutanen (s.c.) intraskapulären Weg mit einer 1-ml-Spritze und einer 27-G-Nadel.
  5. Verdünnen Sie 0,5 % Bupivacain (5 mg/ml) mit Kochsalzlösung auf 0,5 mg/mL (1:10) und injizieren Sie S.c. unter die Haut des Kopfes (also 0,05 mL bei einem 5-g-Säugling).
    HINWEIS: Die Schritte 2.6 bis 3.15 sollten mit sterilen Handschuhen ausgeführt werden.
  6. Führen Sie einen 1,5 cm langen Schnitt mit einer kleinen Schere entlang der Kopfmitte aus.
  7. Verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen, um das weiche Gewebe vorsichtig von der Schädeloberfläche mit Betadin zu entfernen.
  8. Platzieren Sie eine ausgezogene Glaskapillare (~0,8 mm Länge) in einen Glaspipettenhalter. Montiere den Halter am vertikalen stereotaxischen Arm.
    HINWEIS: Die Schritte 2.9 bis 3.10 sollten unter einem Seziermikroskop durchgeführt werden.
  9. Den vorder-hinteren Winkel der Schädeloberfläche ausgleichen:
    1. Bewegen Sie die Kapillare zum rostralen Zusammenfluss der dorsalen Nasennebenhöhlen (RCS) (Abbildung 2), wie in Chan et al.15 beschrieben.
    2. Unter einem Mikroskop mit 2-facher Vergrößerung werden die Koordinaten X (mediaal-lateral), Y (vorder-hinter) und Z (dorsal-ventral) Koordinaten nullgestellt, wenn die Kapillare den Schädel im RCS-Punkt leicht berührt, mit Hilfe der digitalen Anzeigetafel des stereotaxischen Instruments.
    3. Bewegen Sie die Kapillare auf Lambda (bei Y = -7,30 mm) und senken Sie die Kapillare so ab, dass sie den Schädel leicht berührt (Abbildung 2).
    4. Überprüfen Sie den Wert der Z-Koordinaten und richten Sie den vorder-hinteren Winkel im stereotaxischen Rig aus, um den Neigungswinkel des Kopfes zu ändern. Wiederholen Sie die Schritte 2.9.1 bis 2.9.3, bis der Unterschied im Wert der Z-Koordinate zwischen RCS und Lambda <0,02 mm beträgt.
  10. Den medial-lateralen Winkel der Schädeloberfläche ausgleichen:
    1. Verschiebe die Kapillare zum RCS-Punkt.
    2. Null die Koordinaten X (medial-lateral) und Y (vorder-hinter) Koordinaten, wenn die Kapillare leicht den Schädel im RCS-Punkt berührt.
    3. Um den Kopf mit den posterodorsalen MeA-(MeApd)-Koordinaten zu nivellieren, bewegt man die Kapillare auf X = +2,50 mm, Y = -4,20 mm und null Z (dorsal-ventral), wenn die Kapillare leicht den Schädel berührt.
    4. Bewegen Sie die Kapillare auf X = -2,50 mm, Y = -4,20 mm in der anderen Hemisphäre und senken Sie die Kapillare leicht, um den Schädel zu berühren.
    5. Überprüfen Sie den Wert von Z und stellen Sie die mediale-laterale Achse im stereotaxischen Rig ein, um den Neigungswinkel des Kopfes zu verändern. Wiederholen Sie die Schritte 2.10.1 bis 2.10.4, bis der Unterschied im Z-Wert zwischen der rechten und linken Hemisphäre <0,03 mm beträgt.
  11. Entfernen Sie den Kapillarhalter und montieren Sie einen Mikrobohrer mit einem Bohrer #75 in einen stereotaxischen Bohrhalter am vertikalen stereotaxischen Arm.
  12. Platzieren Sie die Bohrerspitze über dem RCS-Punkt, stellen Sie die X- (Medial-Lateral) und Y-Koordinaten (Vorder-Posterior) auf null. Bewegen Sie sich auf X = ±2,03 mm, Y = -4,20 mm, um das MeApd der P11-Säuglinge zu treffen.
  13. Bohren Sie eine 0,5 mm durchschneidende Kraniotomie durch den Schädel.
  14. Reinigen Sie die Schädeloberfläche sorgfältig mit steriler Kochsalzlösung mit feinen Arbeitstüchern und Wattestäbchen.
    HINWEIS: Tragen Sie regelmäßig sterile Kochsalzlösung auf, um die Schädeloberfläche hydratisiert zu halten.

3. Virale Injektion

  1. Füllen Sie eine neue Kapillare mit Mineralöl mit einer flexiblen Nadel aus Microfil.
  2. Schließen Sie die Kapillare an und ziehen Sie sie an den Nanoliter-Injektor.
  3. Entferne den Mikrobohrer und befestige den Nanoliter-Injektor am vertikalen stereotaxischen Arm.
  4. Entziehe mindestens die doppelte Menge des Virus, die für die Operation erforderlich ist (hier 400 nL), mit einer Rate von 10 nL/s.
    HINWEIS: Jedes interessierte AAV-Virus kann nach institutioneller Zulassung für eine virale Injektion verwendet werden. In diesem Protokoll verwendeten wir AAV2-DIO-mCherry (BSL-1, 2,5 E+13 vg/mL, 3 μl/Röhre, gelagert bei -80 °C und dann für die Operation auf Eis).
  5. Verschieben Sie die Kapillare zum RCS-Punkt und setzen Sie die X- und Y-Koordinaten auf null.
  6. Bewegen Sie die Kapillare zum Zielbereich des Gehirns, hier zum MeApd (Koordinaten: X = ±2,03 mm, Y = -4,20 mm, Z= -5,08 mm nach RCS).
  7. Senken Sie die Kapillare auf die Oberfläche des Schädels und stellen Sie dann die Z-Koordinate auf null.
  8. Schaffen Sie einen Weg, indem Sie die Kapillare auf die gewünschte Tiefe senken und die Kapillare wieder aus dem Gehirn herausziehen.
  9. Injizieren Sie ~8 nL Virus, um sicherzustellen, dass die Kapillare nicht verstopft ist, bevor sie wieder ins Gehirn eingeführt wird. Bei Verstopfung geben Sie sterile Kochsalzlösung in einen Task-Wipper und wischen Sie vorsichtig die Seiten und den unteren Teil der Kapillare ab, um die Verstopfung zu entfernen.
  10. Senken Sie die Kapillare noch einmal auf die gewünschte Tiefe und injizieren Sie die gewünschte Virusmenge (in diesem Fall 150 nL Virus) mit einer Geschwindigkeit von 20 nL/min.
  11. Wenn du fertig bist, warte 5 Minuten, bevor du die Kapillare langsam abziehst.
  12. Falls nötig, wiederholen Sie die Schritte 3.4-3.11, um das Virus in die kontralaterale Hemisphäre zu injizieren.
  13. Entferne die Kapillare vom Nanoliter-Injektor. Entsorge verwendete Kapillaren und Virusröhrchen in einem 50 ml konischen Rohr mit 10 % Bleichmittel.
    HINWEIS: Die einzelnen Labore sollten alle Richtlinien zur Abfallbehandlung, Verschmutzungsmanagement und zur Einhaltung der Biosicherheit ihres institutionellen biologischen und biologischen Sicherheitszweigs befolgen.
  14. Nähen Sie die Haut mit einer nicht absorbierbaren 7-0-Naht. Versuche, das Haar beim Nähen anzuheben, damit die Nähte verborgen bleiben.
    HINWEIS: In der Regel reichen 3–4 Nähte aus. In unseren Händen funktioniert eine 7-0-Naht am besten, um zu verhindern, dass der Damm die Nähte reißt, sobald das Kind in den Stammkäfig zurückgebracht wird.
  15. Wischen Sie die Nahtfläche mit 3 % Wasserstoffperoxid ab, gefolgt von Kochsalzlösung mit sterilen Wattestäbchen.
    HINWEIS: Die Operation dauert typischerweise zwischen 1 und 2 Stunden, abhängig von der Anzahl der injizierten Viren. Viren benötigen typischerweise mindestens 2 Wochen für eine vollständige Expression.

4. Postoperative Versorgung

  1. Nimm das Baby aus dem stereotaxischen Rahmen und setze es in einen sauberen Käfig auf ein Wärmekissen. Um Dehydrierung zu verhindern, wird die Injektion einer sterilen Kochsalzlösung empfohlen.
  2. Beobachte das Baby, bis es wieder mobil ist.
  3. Sobald das Baby sich im Gitter bewegen kann, setze die Damm für ~2 Minuten in einen neuen, sauberen Käfig.
  4. Setzen Sie das Baby in seinen ursprünglichen Stammkäfig zusammen mit seinen Wurfgeschwistern. Wischen Sie alle Jungtiere vorsichtig mit Nest- und Einstreu aus dem Stammkäfig ab und setzen Sie sie dann wieder ins Nest. Setzen Sie den Damm zurück in den Käfig.
  5. Überwachen Sie die Mutter und die Jungtiere genau. Bestätigen Sie, dass die Mutter ins Nest zurückkehrt und das chirurgische Baby pflegt, aber die Nähte nicht zieht.
  6. Wenn die Mutter nach 1 Stunde das chirurgische Baby nicht mehr aufnimmt, verwenden Sie eine Pflegemutter. Wenn eine Mutter bereits gezeigt hat, dass sie Jungtiere akzeptiert, verwenden Sie diese Mutter für nachfolgende Würfe (die Akzeptanz nach der Aufnahme von Säuglingen im ersten Wurf war 100 %).
  7. Vierundzwanzig Stunden nach der Operation überprüfen Sie die Schnittstelle und verabreichen Sie Meloxicam (5 mg/kg, s.c.).
  8. Nach erfolgreicher postoperativer Behandlung lassen Sie die chirurgische Maus bei der Mutter und den Wurfgeschwistern, bis sie mit P21 entwöhnt ist. Entfernen Sie alle sichtbaren Nähte innerhalb von 10–14 Tagen nach der Operation.
    HINWEIS: Bei den chirurgischen Mäusen werden keine signifikanten Unterschiede in Nahrungsaufnahme, Körpergewicht oder Fortbewegungsverhalten im Vergleich zu Wurfgeschwister-Kontrollen erwartet.
    Die Säuglinge werden mindestens zwei Tage nach der Operation täglich überwacht und dann mindestens zweimal wöchentlich. Humane Endpunktkriterien: Wenn das Säugling nach 2 Stunden nach der Operation nicht mehr gehfähig ist, wird es human eingeschläfert. Wenn das Säugling nach der Operation ein geringeres Körpergewicht und/oder eine geringere Fortbewegung zeigt, wird es humanerweise eingeschläfert.

Ergebnisse

Sicherheit der Kombination aus Isofluran, Bupivacain und Meloxicam bei Säuglingsoperationen
Die Sicherheit der Anwendung von Anästhesie und Analgesie bei Mäusjungen bleibt unklar6. Daher haben wir die Kombination aus Anästhesie und Analgesie bei Mäusen getestet, um die Überlebensrate zu bestimmen. Jungmäuse bei P11 (Körpergewicht = 6,09 ± 0,90 g, niedrigstes Körpergewicht 3,9 g; n=13) wurden zur Erstanästhesie in die Induktionskammer mit 3 % Isofluran in 0,9 L/min Sauerstoff gelegt. Sobald die Säuglinge betäubt waren und nicht mehr auf den Rückzugsreflex des Pedals reagierten, wurden sie in den stereotaxischen Apparat verlegt, und die Isofluran-Anästhesie wurde auf 1,5–2 % Isofluran in 0,9 L/min Sauerstoff mit einer Wärmplatte reduziert (41,23 ± 2,28 °C). Nach der Platzierung der Säuglinge in den stereotaxischen Apparat wurde Analgesie s.c. interscapular (5 mg/kg Meloxicam) sowie topische Anästhesie unterhalb der Kopfhaut (0,05 mg/mL Bupivacain) verabreicht. Dreißig Minuten später nahmen wir die Babys aus dem stereotaxischen Wagen und setzten sie in einen sauberen Käfig. Wir beobachteten eine Überlebensrate von 100 % (13/13) 30 Minuten nach der Analgesie. Außerdem beobachteten wir keine Komplikationen 24 und 72 Stunden nach der Operation oder im Erwachsenenalter. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Kombination von Lokalanästhesie mit einem nichtsteroidalen entzündungshemmenden Medikament für Mäusesäullinge sicher ist und Schmerzen sowie Belastungen reduziert.

Präzise und präzise virale Lieferung in die MeA
Um die Genauigkeit und Präzision der viralen Verabreichung während der stereotaxischen Operationen bei Säuglingen zu bestätigen, lieferten wir AAV2-hSyn-DIO-mCherry beidseitig in die MeApd von Foxp2cre+/- männlichen Mäusen bei P11 (Abbildung 3A). Die Mäuse wurden dann bei P21 entwöhnt. Bei P45 wurden Maushirne für die Immunhistochemie und Bildanalyse entnommen, wie zuvor von unserer Gruppe14 und anderen16 beschrieben (Abbildung 3B,C). Die Mäuse wurden betäubt und mit 30 ml 1× PBS perfundiert, gefolgt von 30 ml 4 % PFA bei 10 mL/min. Die Gehirne wurden über Nacht bei 4 °C in 4 % PFA postfixiert, in 30 % Saccharose kryogeschützt, in O.C.T. eingebettet und bei 50 μm auf einem Kryostat sektioniert. Jeder dritte Abschnitt wurde zur Immunhistochemie untersucht, wie zuvorbeschrieben 14. Frei schwimmende Abschnitte wurden mit 10 % normalem Eselserum blockiert, über Nacht mit dem primären Antikörper inkubiert, gewaschen, 4 Stunden lang mit dem sekundären Antikörper inkubiert, erneut gewaschen und mit DAPI-haltigem Medium montiert, bevor sie bedeckt wurden. Die Hirnschnitte wurden mit Foxp2-Antikörper und Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) gefärbt.

Um die Zieleffizienz zu bestätigen, bestimmten wir die Ko-Expression von mCherry+- und Foxp2+- Zellen in der MeA und beobachteten 90,2 % ± 2,1 Überschneidungen zwischen den Populationen, was darauf hinweist, dass die mCherry-Expression auf cre-abhängige Weise auf Foxp2+-Zellen beschränkt ist (Abbildung 3D). Dieses Ergebnis unterstreicht die hohe Effizienz der viralen Injektion mit diesem Protokoll. Darüber hinaus untersuchten wir die Genauigkeit der viralen Injektionen, indem wir den Prozentsatz der mCherry+-Zellen im MeApd relativ zum Gesamtprozentsatz von mCherry in allen Regionen analysierten. Wir beobachteten, dass 93,7 % ± 1,4 der mCherry+- Zellen innerhalb des MeApd lagen, was darauf hindeutet, dass die räumliche Expression des Virus auf unser Interessengebiet beschränkt ist (Abbildung 3E).

Abbildung 1
Abbildung 1: Vorbereitung für stereotaxische Chirurgie bei Säuglingen. (A) Stereotaktische Anlage. (B) Nicht platzende Ohrbarren. (C) Gasanästhesie-Kopfhalter und Gaumenstange für P12-Säuglinge. (D) Perlensterilisator. (E) Wärmepad-Controller. (F) Stereotaktischer Arm. (G) Nanoliter-Injektor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2
Abbildung 2: Wichtige Wahrzeichen im P11-Mausschädel. (A) Schematische Darstellung wichtiger Orientierungspunkte im Schädel des Säuglings. (B) Der Kopf des Säuglings wird durch spezielles stereotaxisches Zubehör gesichert, darunter nicht platzende Ohrenstangen, ein modifizierter Gaskopfhalter und eine Pelletstange für P12-Mäuse. Abkürzung: RCS = Rostraler Zusammenfluss der Nebenhöhlen, SSS = Sinus sagittaler Sinus superior, RRV = Rostral-Rhinalvenen, SOS = Sinus superior olfaktoris. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Zielgerichtete bilaterale virale Expression im MeApd nach stereotaxischer Operation bei Säuglingen. (A) Schaltplanische Darstellung des MeApd (koronale Ansicht). (B) Repräsentatives histologisches Bild der beidseitigen Expression des Foxp2-Antikörpers (grün) und mCherry+- Zellen (Magenta) in Foxp2cre+/- adulten männlichen Mäusen. (C) Vergrößerte Ansicht des MeA sowohl von zusammengeführten als auch von einzelnen Kanälen. Weiße Pfeile stehen für ko-labelte Foxp2-Antikörper und mCherry+- Zellen. (D) Injektionseffizienz. (E) Injektionsgenauigkeit. (D,E) n=3 Mäuse, linke und rechte Hemisphäre/Maus. Abkürzungen: MeApd = posterodorsale mediale Amygdala; MeApv = posteroventrale mediale Amygdala. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

MethodenVorteileNachteileReferenz
In Utero ElektroporationGrößere PlasmidtransfektionEs fehlt an präziser Zielerfassung, Toxizität, man muss hochqualifiziert seinWang et al., Methoden Mol Biol. (2013).
Intracerebroventrikuläre virale InjektionSchnell, einfach, wirtschaftlichFehlende präzise Zielerfassung, Risiko für KindstötungKim et al., J Vis Exp. (2014).
Stereotaktische Mikroinjektion bei P0Präzise Zielerfassung, geringeres Risiko für mütterliche AbstoßungZelltoxizität durch Virus, nicht ideal, um postpubertäre Zeitpunkte zu untersuchenChen, et al., J Vis Exp. (2018).
Rekombinase-Linien-genetische KreuzungNicht-invasivKeine präzise Zielerfassung, teuerRobertson et al., Nat Neurosci. (2013).

Tabelle 1: Zusammenfassung der früheren Methoden zur Untersuchung zellulärer und zirkulärer embryonaler und postnataler Entwicklung bei Nagetieren.

Diskussion

Die Untersuchung der neuronalen Mechanismen, die sozialen Verhaltensweisen während der postnatalen Entwicklung zugrunde liegen, ist unerlässlich, um nicht nur deren Entstehung zu verstehen, sondern auch, wie diese Mechanismen durch Umweltfaktoren oder bei neuroentwicklungsbedingten Störungen gestört werden können. Unsere Studie beschreibt ein detailliertes Protokoll für stereotaktische Operationen, um das Virus präzise und effizient in die Gehirne von P11-12-Säuglingsmäusen zu übertragen. Daher ermöglicht dieses Protokoll die Manipulation, Aufzeichnung und Schaltungsuntersuchung molekular definierter neuronaler Subpopulationen vor und nach der Pubertät mittels einer viralen Strategie. Wir heben präoperative und postoperative Modifikationen und Pflege hervor sowie eine sichere Kombination aus Anästhesie- und Analgesiemitteln, die von Mäusbabys gut vertragen werden.

Ein zentraler und herausfordernder Bestandteil der stereotaxischen Chirurgie bei Säuglingen ist die erfolgreiche Wiedereinführung des Babys in seinen Stammkäfig mit seiner Mutter und den Wurfgeschwistern. Um eine angemessene Säuglingspflege nach der Wiedereinführung in den Käfig sicherzustellen, sollte die Mutter das Baby abholen und pflegen (ohne Überpflege), und etwaige Anzeichen möglicher Vernachlässigung sollten genau überwacht werden. Durch den Schnitt und die Nähte des Säuglings kann die Mutter den Kopfbereich überpflegen, was möglicherweise zum Reißen und Entfernen der Nähte führen kann. Dies wäre nachteilig und deshalb ist es deshalb entscheidend, das Verhalten der Mutter gegenüber dem Säugling nach der Operation zu überwachen, um das Überleben zu sichern. Um die Aufnahme des Säuglings nach der Operation zu erhöhen, empfehlen wir, nach dem Nähen Wasserstoffperoxid und Kochsalzlösung zu verwenden, um verbliebene Blutreste von Haut und Fell zu entfernen, sowie dünnere Nähte (7-0) als bei Erwachsenen (5-0). Diese beiden Strategien führten dazu, dass die Mutter postoperative Mäusesäulen akzeptierte.

Darüber hinaus gibt unsere Studie Hinweise zur sicheren Anwendung von Anästhesie und Analgesie bei Säuglingsoperationen. Dies ist entscheidend, da Neugeborene und Mäusesäuglinge Analgesie und Anästhesiedosen nicht so gut vertragen wie Erwachsene, was zu schädlichen Atem- undHerzfolgen führen kann. Wir beobachteten, dass Isofluran, eine orale Anästhesie, und die Kombination aus Meloxicam und Bupivacain-Analgesie, subkutan verabreicht (intrakukulär bzw. unter der Haut des Kopfes), von den Säuglingen gut vertragen wurden und zu einem langfristigen Überleben führten. Darüber hinaus haben wir bereits gezeigt, dass der stereotaktische chirurgische Eingriff bei Säuglingsmäusen zwei Wochen nach der Operation zu ähnlichen Untersuchungszeiten für Artgenossen bei jungen Mäusen führte, im Vergleich zu altersgleichen Kontrollen, die keine Operation14 unterzogen hatten. Daher zeigen diese Ergebnisse eine ausreichende Genesung und keine offensichtlichen motorischen Defizite nach der Operation bei Mäusjungen. Bemerkenswert ist, dass wir während der gesamten Operation nicht die Sauerstoffzufuhr im Blut gemessen haben. Der Sauerstoffspiegel im Blut sollte mit einem Pulsoximeter überwacht werden, um Hypoxie17 zu verhindern.

Ein weiterer entscheidender Bestandteil dieses Protokolls ist die Verwendung des stereotaxischen Koordinatensystems, das auf dem Lambda und dem RCS an der sagittalenMittellinie 15 basiert. RCS ist ein Meilenstein, der durch die Verbindung der oberen sagittalen Sinus und der superioren olfaktorischen Sinus entlang der sagittalen Mittellinie definiert ist. Dieses Wahrzeichen zeigt nach globaler Ausrichtung des Kopfes eine durchgehend geringere Positionsvariabilität als andere dorsale Orientierungspunkte. Dies ist der Fall, da der erhöhte Abstand zwischen RCS/Lambda im Vergleich zu Bregma/Lambda die Stabilität und Reproduzierbarkeit der horizontalen Winkelung15 zwischen Tieren erhöht.

Frühere Methoden zur Untersuchung der neuronalen Entwicklung konzentrierten sich auf virale Strategien zu embryonalen und P0-Zeitpunkten oder auf genetische Kreuzungen für relevante Schicksalskartierungszellen (Tabelle 1). Techniken wie die In-utero-Elektroporation und intracerebroventrikuläre virale Injektionen weisen keine präzise Zielerfassung auf. Durch gezielte virale Injektionen bei P018 wird dieses Problem überwunden, indem ein virales Konstrukt präzise in eine relevante Region injiziert wird. Virale Konstrukte können jedoch nach mehreren Wochen zytotoxisch werden, was zum Zelltod führt. Daher ist es möglicherweise nicht ideal, ein virales Konstrukt in das Gehirn des Neugeborenen zu injizieren, um longitudinale pubertale Studien durchzuführen, die bis ins Erwachsenenalter andauern könnten. Daher reduziert unser Ansatz, bei dem die virale Injektion eineinhalb Wochen nach der Geburt erfolgt, das Risiko einer Zelltoxizität während der Pubertät.

Trotz der Vorteile unseres Ansatzes bleiben mehrere Überlegungen bestehen. Erstens müssen die bei Mäusjungen verwendeten Gehirnkoordinaten von denen bei Erwachsenen abgewandelt werden. Zum Beispiel verwenden wir bei P11-Mäusen folgende Koordinaten, um das MeApd zu zielen: X= +2,03 mm, Y= -4,20 mm, Z= -5,08 mm; während die bei Erwachsenen verwendeten Koordinaten X = +2,15 mm, Y = -5,00 mm und Z = -5,10 mm sind. Leider gibt es weniger Brain Atlas-Referenzen für präpubertäre Mäuse19 als für adulte Mäuse (Allen Mouse Brain Atlas, mouse.brain-map.org und atlas.brain-map.org)20,21. Um daher eine korrekte virale Zielsetzung in anderen Hirnregionen außerhalb des MeA erfolgreich zu erreichen, müssen Forscher eine fundierte Koordinatenschätzung erhalten und Koordinatentests durchführen. Zweitens muss die Inkubationszeit von AAVs berücksichtigt werden. Die optimale Inkubationszeit für die AAV-Expression in vivo beträgt mindestens 2–3 Wochen. Da in unserem Protokoll stereotaktische Operationen bei Säuglingsmäusen ab P11 durchgeführt werden, können Forscher erst nach der Operation ab P25 mit der Untersuchung beginnen, nach der optimalen AAV-Inkubationszeit.

Insgesamt bietet dieses Protokoll detaillierte Leitlinien für Forscher, um Hirnregionen von Interesse bei Säuglingsmäusen mit hoher Präzision mithilfe viraler Vektoren zu identifizieren. Dieser Ansatz ist äußerst vorteilhaft, da er äußerst flexibel ist: Jeder kommerzielle oder maßgefertigte AAV-Konstrukt kann eingespritzt werden. Daher ermöglicht es die Untersuchung molekular definierter interessierender Zellsubpopulationen sowie deren anatomische Schaltkreise, neuronale Dynamik und zelluläre Rolle vor und nach der Pubertät während eines kritischen Zeitfensters, das mit dem Entstehen sozialer Verhaltensweisen übereinstimmt. Darüber hinaus ist dieser Ansatz erfolgreich und zielt nicht nur die Amygdala, wie hier gezeigt, sondern auch andere subkortikale Strukturen wie den Hypothalamus und kortikale Regionen.

Offenlegungen

Die Autoren müssen keine Interessenkonflikte angeben.

Danksagungen

Wir danken Dr. Andrew Gorman, Dr. Donna Webb und David Goulding von der Comparative Medicine Branch (CMB) am National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS/NIH) für wertvolle Diskussionen über Best Practices in der Anästhesie und Analgesie bei Nagetieroperationen. Wir danken auch allen Mitgliedern des CMB am NIEHS für ihre bestmögliche Fürsorge für die Tierproben und allen Mitgliedern der Neurobehavioral Circuits Group. Diese Arbeit wurde vom Intramuralen Forschungsprogramm des National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health (NIEHS/NIH) (ZIA ES103403) (J.E.L.) unterstützt. Die Beiträge der NIH-Autoren gelten als Werke der US-Regierung. Die in diesem Artikel präsentierten Ergebnisse und Schlussfolgerungen sind die der Autoren und spiegeln nicht notwendigerweise die Ansichten des NIH oder des US-Gesundheitsministeriums wider.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
#75 BohrerBohrbohrerstadt10WS75-850FL
27-G-NadelCovetrus60757
3 % WasserstoffperoxidSwanNDC 0809-0871-43
32 % ParaformaldehydElektronenmikroskopiewissenschaften15714
AAV2-hSyn-DIO-mCherryAddgene50459-AAV2
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey (1:1000) Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immunforschung711-545-152
Analytisches GleichgewichtSartorius1102--15
BetadineAvrio ApothekeNDC 67618-155-15
BupivacainHospiraNDC 0409-1163-18
KryostatLeicaCM1950
Sezierendes MikroskopZeiss2149-629
AugensalbeDechra VeterinaryPuralube
Fluoromount-Montagemedium mit DAPIThermo Fisher Scientific00-4959-52
Foxp2-Antikörper (1:1000)Atlas-Antikörper/Cosmo-BioHPA000382
Foxp2cre+/- MäuseDas Jackson-Labor30541
Gasanästhesie-Kopfhalter und Gaumenstange für P12-WelpenDavid Kopf Instrumente1934–C
GlasperlensterilisatorFisher Scientific10-000-632
GlaskapillareWeltpräzisionsinstrumente504949
GlaspipettenhalterDavid Kopf Instrumente1975-1.2-A
WärmekisseKent Scientific  GesellschaftRT-0520
IsofluranePiramal IntensivmedizinNDC 66794-017-10
MeloxicamPivetal VeterinärversorgungNDC 46066-937-13
MikrobohrerDavid Kopf InstrumenteBohrmaschine Modell 1911
Microfil-Flexible NadelWeltpräzisionsinstrumenteMF28G67-5
Mikroskop-ObjektträgerThermo Fisher Scientific12-550-15
MineralölSigma-AldrichM5904-500ML
Nanoliter-InjektorWeltpräzisionsinstrumenteNANOLITER2020
Nicht absorbierbare NahtAD-ChirurgieS-N718SP13
Nicht-Rapture-OhrstäbenDavid Kopf Instrumente1921-A
Normales EselserumJackson ImmunoResearch017-000-121
O.C.T.-KomplexSakura4583
Stereotaktische AnlageDavid Kopf Instrumente1900
Steriler WattestäbchenULINES-21102
Sterile AbdeckungBusse Hospital Einwegprodukte696
Sterile KochsalzlösungHospiraNDC 0409-1966-02
Steriles WasserHospiraNDC 0409-4887-24
SucroseFisher ChemicalS5-500
SpritzeFisher Scientific50-252-2568

Referenzen

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