Räumliche Transkriptomik der frühen Zahnmorphogenese im formalinfixierten, paraffin-eingebetteten embryonalen Mausgewebe

Summary

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Verwendung formalinfixierter, paraffin-eingebetteter Schnitte aus E13.5- und E15.5-Kraniofacialregionen von Mausembryonen zur Analyse der differenziellen Genexpressionsprofile mittels räumlicher Transkriptomik.

Abstract

Der sich entwickelnde Zahn besteht aus vielfältigen und hochspezialisierten Zellpopulationen, die zusammenarbeiten, um eine korrekte Form und Funktion aufrechtzuerhalten. Die Aufklärung der Wechselwirkungen zwischen diesen Zellen und ihrer umgebenden Mikroumgebung ist entscheidend, um die regulatorischen Mechanismen der normalen Zahnentwicklung zu verstehen. Störungen in diesen Prozessen können zu angeborenen Störungen wie Zahnagenese, Dentinogenesis imperfecta und Amelogenesis imperfecta führen. Trotz der erheblichen Fortschritte, die durch die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bei der Aufdeckung der zellulären Heterogenität ermöglicht werden, erhält sie den räumlichen Kontext der Zellen innerhalb von Geweben nicht erhalten, was die Fähigkeit einschränkt, Genexpression mit Gewebearchitektur zu verknüpfen. Räumliche transkriptomische Technologien beheben diese Einschränkung, indem sie hochauflösende Genexpressionsprofilierung mit der Erhaltung der nativen Gewebearchitektur integrieren und so die in-situ-Lokalisierung molekularer Signaturen ermöglichen. Hier beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Sammlung, Fixierung und Paraffineinbettung von embryonalem kraniofaazialem Mausgewebe, das für nachgelagerte räumliche transkriptomische Anwendungen geeignet ist. Der Arbeitsablauf optimiert das Schneiden und die Handhabung formalinfixiertes, paraffin-eingebettetes Gewebes, um RNA-Integrität und Gewebemorphologie für eine hochauflösende räumliche Analyse zu erhalten. Diese Methode ist kompatibel mit Sequenzierungs- und bildbasierten räumlichen Transkriptomik-Plattformen und ermöglicht reproduzierbare räumliche transkriptomische Profilierung der frühen Zahnmorphogenese in Mausembryonen. Dieser Ansatz bietet wirkungsvolle Einblicke in die räumliche Organisation und funktionelle Dynamik kraniofazialer Strukturen sowohl in Entwicklungs- als auch in pathologischen Zuständen und bietet einen entscheidenden Rahmen für die Verbindung molekularer Mechanismen mit der Gewebemorphologie.

Introduction

Die Zahnentwicklung beruht auf einer hochkoordinierten Abfolge morphogenetischer Prozesse während des frühen embryonalen Wachstums 1,2,3,4. Obwohl zahlreiche Schlüsselgene und Signalwege durch genetische und entwicklungsbezogene Studien identifiziert wurden, bleibt unser Verständnis darüber, wie diese Faktoren zusammenwirken und einzelne kraniofaciale Strukturen formen, begrenzt. Bemerkenswert ist, dass trotz erheblicher Fortschritte bei der Verbindung spezifischer genetischer Varianten sowohl mit syndromischen als auch nicht-syndromischen Zahnerkrankungen die detaillierten molekularen Mechanismen der strukturspezifischen Morphogenese noch nicht^{vollständig definiert sind.} Diese Wissenslücke begrenzt weiterhin den Fortschritt gezielter therapeutischer Strategien für Zahnagenese oder andere Zahnaberrationen.

Die Einzelzell-mRNA-Sequenzierung (scRNA-seq) hat die Entdeckung bisher unbekannter Zelltypen sowohl in gesunden als auch in kranken Geweben sowie die Identifikation mehrerer Zellsubtypen auf Basis unterschiedlicher Genexpressionsprofile ermöglicht. Da scRNA-seq jedoch die Dissoziation von Geweben in einzelne Zellen erfordert, geht Information über die ursprüngliche räumliche Position jeder Zelle im Gewebe verloren. Daher erfassen diese Datensätze nicht, wie Zellen relativ zur Gewebearchitektur ^5,6,7 angeordnet sind. Darüber hinaus basieren vorhergesagte Zell-zu-Zell-Interaktionen auf dem Vorhandensein komplementärer Interaktionen von Transkripten, berücksichtigen jedoch nicht die tatsächlichen räumlichen Informationen, was wichtig ist, um festzustellen, ob solche Interaktionen in vivo stattfinden^.

Die räumliche Transkriptomik-Technologie ermöglicht eine Hochdurchsatzprofilierung der Genexpression bei gleichzeitiger Beibehaltung räumlicher Informationen innerhalb von Gewebeschnitten ^8,9. Räumliche Transkriptomik-Technologien sind entweder bildgebungsbasiert 10,11,12 oder sequenzierungsbasiert ^12,13. Bildgestützte räumliche Transkriptomik-Ansätze verwenden FISH, um gezielte Genexpression mit zellulärer oder subzellulärer räumlicher Präzision zu erkennen und zu messen. Im Gegensatz dazu erfassen sequenzierungsbasierte Technologien die transskriptomweite Genexpression mit geringerer räumlicher Auflösung. Sequenzierungsbasierte räumliche Transkriptomik verwendet eine Strategie, um eine nahezu einzelzellige Auflösung mit vollständiger Transkriptomabdeckung (~20.000 Gene) zu erreichen, was unvoreingenommene explorative Analysen unterstützt, während bildbasierte räumliche Transkriptomik Genpanels (bis zu ~5.000 Genen) anvisiert und so eine präzise, hypothesenbasierte Analyse spezifischer Wege und zellulärer Interaktionen ermöglicht¹⁴.

Technologische Fortschritte in der räumlichen Transkriptomik ermöglichen nun die Analyse der Genexpression innerhalb der erhaltenen Gewebearchitektur. Formalinfixierte, paraffin-eingebettete (FFPE) und kryosektionsbasierte Arbeitsabläufe bieten komplementäre Ansätze für die räumliche Transkriptomik 15,16,17. FFPE bietet eine überlegene Erhaltung der Gewebearchitektur und ermöglicht eine genaue räumliche Kartierung der Genexpression in strukturell komplexen Geweben wie sich entwickelnden Zähnen und Gaumenschäfchen. In unserer und anderen Studien haben FFPE-Fixierung und Archivierung hochgenaue und reproduzierbare räumliche transkriptomische Daten^ergeben. Kryosektions-Workflows erhalten die RNA-Integrität, sind jedoch anfälliger für Gewebeverzerrung¹⁸. Daher wurde FFPE für diese Studie ausgewählt. Während der Erfolg von scRNA-seq weitgehend von der Erhaltung hoher RNA-Integrität abhängt, erfordert die räumliche Transkriptomik auch eine hochwertige Gewebemorphologie, um Genexpressionssignale genau auf spezifische histologische Merkmale zu lokalisieren.

Dieses Protokoll eignet sich am besten für FFPE-Maus-embryonale kraniofaciale Gewebe über frühe Entwicklungsstadien, wo die Erhaltung der feinen Gewebearchitektur für die räumliche transkriptomische Analyse entscheidend ist. Der Workflow wird wahrscheinlich suboptimal in überfixierten Proben, schlecht orientierten Paraffinblöcken oder Geweben mit beeinträchtigter RNA-Integrität funktionieren, was zu einer verminderten Signalqualität und einem Verlust räumlicher Auflösung führen kann. Die erfolgreiche Anwendung dieser Methode zeigt sich durch intakte Gewebemorphologie, minimale Schnittverzerrung und robuste, räumlich aufgelöste transkriptomische Signale, die mit histologischen Merkmalen übereinstimmen.

Protocol

Alle Tierverfahren wurden vom National Institutes of Health, dem National Institute of Child Health and Human Development Animal Care and Use Committee (ACUC) unter dem Animal Study Protocol #21-031 genehmigt.

1. Herstellung von Versuchstieren und Gewebesammlung

1. Paaren gesunde, fruchtbare männliche und weibliche Mus musculus für zeitgesteuerte Paarungen. Identifizieren Sie trächtige weibliche Mäuse anhand eines vaginalen Plugs, der als embryonaler Tag (E) 0,5 bezeichnet wird.
2. Trächtige weibliche Mäuse werden durch CO₂-Inhalation eingeschläfert, gefolgt von zervikaler Verrenkung. Positionieren Sie den Rücken des Tieres auf eine sterile, absorbierende Operationsfläche und desinfizieren Sie den Bauchbereich mit 70 % Ethanol entlang der vorgesehenen Schnittstelle.
3. Machen Sie mit einer sterilen chirurgischen Schere einen mittleren Bauchschnitt und öffnen Sie vorsichtig die Peritonealwand mit einer mikrochirurgischen Schere, um die Gebärmutterhörner freizulegen. Führen Sie die Gebärmutterkette vorsichtig nach außen mit einer stumpfen Pinzette. Isolieren Sie Embryonen, indem das Gebärmuttergewebe entlang des Myometriums freigesetzt und am Eileiter sowie am medianen Gebärmutterhornansatz abgetrennt wird.
4. Ganze Embryonen werden sofort in eiskalte, sterile 1x PBS in einer 10 cm großen Petrischale übertragen.
5. Trennen Sie vorsichtig jeden Embryo von der umliegenden Gebärmutter-, Amnion- und Chorionmembran und legen Sie ihn in eine frische 10 cm große Schale mit eiskaltem, sterilem 1x PBS.
6. Embryonale Köpfe werden in den gewünschten Entwicklungsstadien mit einer sterilen chirurgischen Klinge seziert und einmal in eiskalten 1x PBS gespült, bevor sie weiterverarbeitet werden.

2. Fixierung und Verarbeitung des Gewebes

1. Embryonale Mausköpfe in den gewünschten Entwicklungsstadien zerlegen und über Nacht bei Zimmertemperatur in 10 % neutrales gepuffertes Formalin fixieren.
2. Nach der Fixierung entfern Sie das Formalin und spülen Sie die Proben mit 1x PBS, bevor sie in 70%igen Ethanol zur Lagerung umgefüllt werden. Führen Sie Gewebedehydrierung, -reinigung und Paraffininfiltration mit einem automatisierten Gewebeprozessor durch.
3. Embryoköpfe werden in Paraffin eingebettet, mit Ausrichtung entweder in der koronalen oder sagittalen Ebene.
4. Nach der Verhärtung des Wachses werden die Paraffinblöcke aus den Formen entfernt, in beschriftete luftdichte Behälter oder Zip-Lock-Beutel gelegt und bei 4 °C bis zum Teilen gelagert.
   HINWEIS: FFPE-Blöcke können mehrere Jahre vor dem Schnitt gelagert werden, ohne die Gewebeintegrität zu beeinträchtigen.

3. Verarbeitung von FFPE-Gewebe für die räumliche Transkriptomik

1. Desinfizieren Sie Arbeitsflächen und Instrumente mit 70 % Ethanol, gefolgt von einer Behandlung mit RNase-Dekontaminationslösung, um den RNA-Abbau zu minimieren.
2. Bereiten Sie ein Wasserbad mit deionisiertem Wasser vor und halten Sie es bei 40 °C, wobei Sie die Temperatur je nach Embryonalstadium oder Gewebe zwischen 40 °C und 43 °C anpassen.
3. Richte das Mikrotom ein, setze nach vorsichtigem Abwischen mit RNase-Dekontaminationslösung eine neue Klinge ein, sichere die Klinge und stelle den Abstand auf 10° ein.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die neue Klinge für das Schneiden verwendet wird, um präzise Gewebeschnitte zu erzielen. Die Änderung des Klingenwinkels des Mikrotoms kann die Schnittqualität erheblich beeinträchtigen, was die Gewebeintegrität, die Dickengleichmäßigkeit und die Erhaltung morphologischer Merkmale beeinträchtigt.
4. Entfernen Sie überschüssiges Paraffin rund um das eingebettete Gewebe und montieren Sie den FFPE-Block auf der Kaltstufe des Mikrotoms.
5. Bereiten Sie saubere Pinzetten und Pinsel vor der Anwendung mit einer RNase-Dekontaminationslösung vor und behandeln Sie sie.
6. Richten Sie die Paraffinblockfläche mit der Mikrotom-Klinge aus und führen Sie Schnittschnitte von etwa 12 μm vor, bis der interessierende Bereich erreicht wird (z. B. bis der mesiale Teil der Molaren in koronalen Schnitten sichtbar wird). Passen Sie die Positionierung von Block und Klinge bei Bedarf an, um symmetrische, richtig ausgerichtete Ganzkopf-Koronalabschnitte sicherzustellen.
7. Wenn eine RNA-Isolierung von Gewebeschnitten durchgeführt werden soll, wird 10 μm-Schnitte direkt in 1-mL Mikrozentrifugenröhren gesammelt und gemäß den Herstellerempfehlungen^19,20 für die DV200-Qualitätsbewertung verarbeitet.
8. Schneiden Sie Serienschnitte mit einer Dicke von 5 μm und überwachen Sie kontinuierlich die Nähe zum Interessengebiet durch Untersuchung von Prüfabschnitten auf einem normalen Objektträger unter einem Mikroskop.
9. Sobald Sie sich dem Interessenbereich nähern, schneiden Sie den Gewebebereich sorgfältig mit einer Skalpellklinge Nr. 11 ein, ohne vollständig durchzuschneiden, in zwei strategisch verteilten Bereichen, um das Krümmen oder Anhaften von Schnitten zu verhindern. Nach dem Schneiden entfernen Sie das anhaftende Paraffin mit den Borsten eines feinen Pinsels.
10. Lassen Sie Gewebeabschnitte bei 41 °C auf das Wasserbad schwimmen, um sanfte Entspannung und Glättung zu ermöglichen, bevor Sie sie auf einer Rutsche aufheben.

4. Sequenzierungsbasierte räumliche Transkriptomik

1. Nehmen Sie Gewebeschnitte auf die empfohlenen Glasobjekte und stellen Sie sicher, dass alle interessanten Bereiche innerhalb eines Bereichs von 6,5 × 6,5 mm liegen. Wenn mehrere benachbarte Abschnitte auf denselben Schlitten gelegt werden, erwärmen Sie die Verschlüsse kurzzeitig auf einem Schlittenwärmer bei 40 °C, um die Haftung zu fördern und das Ablösen zuvor platzierter Abschnitte zu verhindern. Nachdem alle Schnitte positioniert sind, inkubieren Sie die Objektträger in einem überdachten Objektträgerwärmer bei 60 °C für 2 Stunden, um die Gewebehaftung zu verbessern.
   HINWEIS: Abschnitte, die über den Bereich von 6,5 × 6,5 mm hinausgehen, wurden nicht bearbeitet.
2. Nach der Inkubation wird eine Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbung mit einem standardisierten H&E-Färbungsprotokoll durchgeführt, bei dem deionisiertes Wasser anstelle von Leitungswasser ersetzt wird, um die RNA-Integrität zu erhalten.
3. Deckfolien mit 80 % Glycerol montieren und hochauflösende H&E-Bilder aufnehmen, wodurch ein hochwertigeres Referenzbild bereitgestellt wird, das das typische H&E-Bild ersetzt, das durch das Objektträger- und Gewebetransfersystem erzeugt wird.
4. Nach der Bildgebung werden die Deckfolien entfernt, indem die Objektträger einzeln in 50-ml-Röhren mit deionisiertem Wasser eingetaucht werden und die Objektträger für die Einsendung in die Kernanlage zur späteren Verarbeitung vorbereitet werden.

5. Bildbasierte räumliche Transkriptomik

HINWEIS: Der Hersteller lieferte²⁰ Dias, jede mit einem festgelegten abbildbaren Bereich (umrissene Linien) von 12 mm × 24 mm, mit einer verfügbaren Probeplatzierung von etwa 235 mm² (10,45 mm × 22,45 mm).

1. Positionieren Sie die Gewebeschnitte vollständig innerhalb dieses definierten Bereichs, wobei sichergestellt wird, dass Schnitte, einschließlich Restparaffin, sich nicht überlappen. Wenn Sie mehrere benachbarte Abschnitte platzieren, erwärmen Sie die Verkleidungen kurz auf einem Schlittenwärmer bei 40 °C, um die Haftung zu fördern und ein Ablösen zuvor montierter Abschnitte zu verhindern.
2. Nachdem alle Gewebeschnitte platziert sind, werden die Objektträger in einen überdachten Objektträgerwärmer gelegt und über Nacht bei 40 °C inkubiert, um eine ordnungsgemäße Haftung zu gewährleisten.
3. Nach der Inkubation folgen Sie dem^{Protokoll 19} des Herstellers, um die Objektträger zu verarbeiten und sie zur RNA-Sequenzierung in die Maschine zu laden; das Protokoll wird mit der aktuellsten Version abgeglichen, da die Prozedurdetails periodisch aktualisiert werden.
   HINWEIS: Alle während des Protokolls erzeugten gefährlichen Stoffe, wie Formalin, Ethanol und RNase-Dekontaminationslösungen, sollten gemäß institutionellen Sicherheitsrichtlinien und lokalen Vorschriften entsorgt werden, wobei geeignete chemische Abfallbehälter, Biohazard-Entsorgungsmethoden und Abzugshauben-Praktiken verwendet werden.

Results

Diese Methode beschreibt die Verarbeitung frisch dissektionierter embryonaler Mausköpfe, um FFPE-Proben von kraniofacialem Gewebe, einschließlich des sich entwickelnden Zahns, zu erzeugen, die leicht per Mikrotom zerschnitten werden können, während die RNA-Integrität erhalten bleibt (Abbildung 1). Dieses Protokoll wurde erfolgreich auf E13.5 (embryonaler Tag 13.5), E15.5 und E16.5 Mausembryoköpfe für hochauflösende, bildbasierte (Abbildu...

Discussion

In dieser Arbeit präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung von FFPE-Blöcken von embryonalen Mausköpfen, die für den Einsatz mit hochauflösenden räumlichen RNA-Bildgebungsplattformen optimiert sind, einschließlich sequenzierungs- und bildgebender räumlicher Transkriptomik. Ein zentrales Ziel dieses Protokolls ist es, sowohl die Gewebemorphologie als auch die Integrität der Nukleinsäure über ganze Kopfabschnitte hinweg zu erhalten, mit besonderem Fokus auf die sich entw...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Thermo Fischer	10010023	Use  um während des Workflows Washes durchzuführen
50 mL konische Röhren (Ambion) RNAse-frei	Thermo Fischer	AM12502	Verwendung zur Aufbewahrung von Proben in verschiedenen Lösungen
Fortschrittlicher Orbitalshaker	VWR	6683-470	Verwendung zum Schütteln von Geweben in der Fixationslösung während der Inkubation
Alkohol, 70 %, Fisherbrand, HistoPrep	Fisher Scientific	HC-1000-1GL	Verwenden Sie es, um den gesamten Arbeitsbereich zu reinigen und zu desinfizieren
Automatisierter Vakuumgewebeprozessor	Leica Biosystems	ASP300S	Verwendung zum Klären, Dehydrieren, Rehydratieren und Wachsinfiltration von Proben
Deckglasdicke 1,5, 25 mm x 25 mm&nlffel;	Corning	2850-25	Verwendung zur Montage von Objektträgern im Visium HD Workflow
Dako Bluing Puffer, einsatzbereit	Agilant Technologien	CS70230-2	Verwendung für H& E-Färbung
Eosin-Y mit Phloxin	Fisher Scientific	22050198	Verwendung für H& E-Färbung
Hämatoxylin, Mayer's, Fertige wässrige Lösung	Agilant Technologien	S330930-2	Verwendung für H& E-Färbung
HistoCore Wasserbad	Leica Biosystems	HIS2326	Man hat die Abschnitte bei 40-43 °F schwimmen lassen; C zur Entfernung von Falten aus FFPE-Abschnitten
Loupe browser  9.0.0	10X Genomics, Inc.		Verwenden Sie zur Analyse von Visium HD-Daten
Einwegklingen mit niedrigem Profil DB80LX	Leica Biosystems	14035843496	Verwendung zur Sektion von FFPE-Blöcken
Neutral gepuffertes Formalin 10 %	Azer Scientific	NBF-4-G	Verwendet wird, um das Gewebe zu reparieren
RNaseZap RNase-Dekontaminationslösung	Thermo Fischer	AM9782	Verwendung zum Reinigen und Entfernen von RNase
Halbautomatisches rotierendes Mikrotom	Leica Biosystems	RM2245	Verwenden Sie FFPE-Blöcke, wie in den Richtlinien angegeben.
Rutschwärmer mit Abdeckung	Premiere	XH2004	Verwendung für die Inkubation von Objektträgern bei unterschiedlichen Temperaturen
Superfrost Plus Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Verwendung zum Anfügen von Abschnitten für Vsium HD
Chirurgische Klinge Nr. 11	Integra Miltex	4-311	Verwendung zur Bewertung von FFPE-Geweben
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Verwendung zur Gewebeinfiltration und Einbettung von Geweben
TISsue-Kultur DISH 100X20MM 500/CS	Fisher Scientific	877222	Verwendung zum Sammeln und Zerlegen von Proben in 1x PBS
UltraPure Glycerol	Thermo Fischer	15514011	Verwendung für die Visium HD Schiebemontage von Coverglass vor CytAssist
Visium CytAssist	10X Genomics, Inc.	PN-1000442	Verwendung für Visium HD-Workflow-Experimente
Visium HD Räumliche RNA-Sequenzierung	10X Genomics, Inc.	1000676	Verwendung zur Durchführung räumlicher transkriptomischer Experimente
Xenium 5K In Situ RNA-Lokalisierung	10X Genomics, Inc.	PN-1000724	Verwendung zur Durchführung räumlicher transkriptomischer Experimente
Xenium-Analysator	10X Genomics, Inc.	PN-1000481	Verwenden Sie Xenium- und Xenium-5K-RNA-Bildgebung
Xenium Explorer 4	10X Genomics, Inc.		Verwenden Sie zur Analyse von Xenium-Daten
Xenium-in-situ-RNA-Lokalisierung	10X Genomics, Inc.	1000672	Verwendung zur Durchführung räumlicher transkriptomischer Experimente