Method Article

Räumliche Transkriptomik der frühen Zahnmorphogenese im formalinfixierten, paraffin-eingebetteten embryonalen Mausgewebe

DOI:

10.3791/70340

⸱

March 13th, 2026

 , 
1Section on Craniofacial Genetic Disorders, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Shriners Hospital for Children

In This Article

Summary

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Das aktuelle Protokoll beschreibt die Verwendung formalinfixierter, paraffin-eingebetteter Schnitte aus E13.5- und E15.5-Kraniofacialregionen von Mausembryonen zur Analyse der differenziellen Genexpressionsprofile mittels räumlicher Transkriptomik.

Abstract

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Der sich entwickelnde Zahn besteht aus vielfältigen und hochspezialisierten Zellpopulationen, die zusammenarbeiten, um eine korrekte Form und Funktion aufrechtzuerhalten. Die Aufklärung der Wechselwirkungen zwischen diesen Zellen und ihrer umgebenden Mikroumgebung ist entscheidend, um die regulatorischen Mechanismen der normalen Zahnentwicklung zu verstehen. Störungen in diesen Prozessen können zu angeborenen Störungen wie Zahnagenese, Dentinogenesis imperfecta und Amelogenesis imperfecta führen. Trotz der erheblichen Fortschritte, die durch die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bei der Aufdeckung der zellulären Heterogenität ermöglicht werden, erhält sie den räumlichen Kontext der Zellen innerhalb von Geweben nicht erhalten, was die Fähigkeit einschränkt, Genexpression mit Gewebearchitektur zu verknüpfen. Räumliche transkriptomische Technologien beheben diese Einschränkung, indem sie hochauflösende Genexpressionsprofilierung mit der Erhaltung der nativen Gewebearchitektur integrieren und so die in-situ-Lokalisierung molekularer Signaturen ermöglichen. Hier beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Sammlung, Fixierung und Paraffineinbettung von embryonalem kraniofaazialem Mausgewebe, das für nachgelagerte räumliche transkriptomische Anwendungen geeignet ist. Der Arbeitsablauf optimiert das Schneiden und die Handhabung formalinfixiertes, paraffin-eingebettetes Gewebes, um RNA-Integrität und Gewebemorphologie für eine hochauflösende räumliche Analyse zu erhalten. Diese Methode ist kompatibel mit Sequenzierungs- und bildbasierten räumlichen Transkriptomik-Plattformen und ermöglicht reproduzierbare räumliche transkriptomische Profilierung der frühen Zahnmorphogenese in Mausembryonen. Dieser Ansatz bietet wirkungsvolle Einblicke in die räumliche Organisation und funktionelle Dynamik kraniofazialer Strukturen sowohl in Entwicklungs- als auch in pathologischen Zuständen und bietet einen entscheidenden Rahmen für die Verbindung molekularer Mechanismen mit der Gewebemorphologie.

Introduction

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Die Zahnentwicklung beruht auf einer hochkoordinierten Abfolge morphogenetischer Prozesse während des frühen embryonalen Wachstums 1,2,3,4. Obwohl zahlreiche Schlüsselgene und Signalwege durch genetische und entwicklungsbezogene Studien identifiziert wurden, bleibt unser Verständnis darüber, wie diese Faktoren zusammenwirken und einzelne kraniofaciale Strukturen formen, begrenzt. Bemerkenswert ist, dass trotz erheblicher Fortschritte bei der Verbindung spezifischer genetischer Varianten sowohl mit syndromisc....

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Protocol

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Alle Tierverfahren wurden vom National Institutes of Health, dem National Institute of Child Health and Human Development Animal Care and Use Committee (ACUC) unter dem Animal Study Protocol #21-031 genehmigt.

1. Herstellung von Versuchstieren und Gewebesammlung

  1. Paaren gesunde, fruchtbare männliche und weibliche Mus musculus für zeitgesteuerte Paarungen. Identifizieren Sie trächtige weibliche Mäuse anhand eines vaginalen Plugs, der als embryonaler Tag (E) 0,5 bezeichnet wird.
  2. Trächtige weibliche Mäuse werden durch CO₂-Inhalation eingeschläfert, gefolgt von zer....

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Results

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Diese Methode beschreibt die Verarbeitung frisch dissektionierter embryonaler Mausköpfe, um FFPE-Proben von kraniofacialem Gewebe, einschließlich des sich entwickelnden Zahns, zu erzeugen, die leicht per Mikrotom zerschnitten werden können, während die RNA-Integrität erhalten bleibt (Abbildung 1). Dieses Protokoll wurde erfolgreich auf E13.5 (embryonaler Tag 13.5), E15.5 und E16.5 Mausembryoköpfe für hochauflösende, bildbasierte (Abbildu.......

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Discussion

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In dieser Arbeit präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung von FFPE-Blöcken von embryonalen Mausköpfen, die für den Einsatz mit hochauflösenden räumlichen RNA-Bildgebungsplattformen optimiert sind, einschließlich sequenzierungs- und bildgebender räumlicher Transkriptomik. Ein zentrales Ziel dieses Protokolls ist es, sowohl die Gewebemorphologie als auch die Integrität der Nukleinsäure über ganze Kopfabschnitte hinweg zu erhalten, mit besonderem Fokus auf die sich entw.......

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Disclosures

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Acknowledgements

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Wir danken aufrichtig Dr. Sergey L. Leikin, Dr. Elena Makareeva (Sektion für Physikalische Biochemie, NICHD/NIH) und Dr. Jeremie Oliver Piña (Abteilung Molekularbiologie der Knochen und Zähne, NIDCR/NIH) für die Beratung zur Planung der Experimente und die technische Unterstützung. Wir danken Dr. Iben James, Dr. Vivek Mahadevan (Molecular Genomics Core, NICHD/NIH) für die technische Unterstützung bei der sequenzierungsbasierten räumlichen Transkriptomik. Wir danken Dr. Gustaf Wigerblad (Systemic Autoimmunity Branch, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Disease, NIAMS/NIH) für die technische Unterstützung für bi....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSThermo Fischer10010023Use  um während des Workflows Washes durchzuführen
50 mL konische Röhren (Ambion) RNAse-freiThermo FischerAM12502Verwendung zur Aufbewahrung von Proben in verschiedenen Lösungen
Fortschrittlicher OrbitalshakerVWR6683-470Verwendung zum Schütteln von Geweben in der Fixationslösung während der Inkubation
Alkohol, 70 %, Fisherbrand, HistoPrepFisher ScientificHC-1000-1GLVerwenden Sie es, um den gesamten Arbeitsbereich zu reinigen und zu desinfizieren
Automatisierter VakuumgewebeprozessorLeica BiosystemsASP300SVerwendung zum Klären, Dehydrieren, Rehydratieren und Wachsinfiltration von Proben
Deckglasdicke 1,5, 25 mm x 25 mm&nlffel;Corning2850-25Verwendung zur Montage von Objektträgern im Visium HD Workflow
Dako Bluing Puffer, einsatzbereitAgilant TechnologienCS70230-2Verwendung für H& E-Färbung
Eosin-Y mit PhloxinFisher Scientific22050198Verwendung für H& E-Färbung
Hämatoxylin, Mayer's, Fertige wässrige LösungAgilant TechnologienS330930-2Verwendung für H& E-Färbung
HistoCore Wasserbad Leica BiosystemsHIS2326Man hat die Abschnitte bei 40-43 °F schwimmen lassen; C zur Entfernung von Falten aus FFPE-Abschnitten 
Loupe browser  9.0.010X Genomics, Inc. Verwenden Sie zur Analyse von Visium HD-Daten 
Einwegklingen mit niedrigem Profil DB80LXLeica Biosystems14035843496Verwendung zur Sektion von FFPE-Blöcken 
Neutral gepuffertes Formalin 10 %Azer ScientificNBF-4-GVerwendet wird, um das Gewebe zu reparieren
RNaseZap RNase-DekontaminationslösungThermo FischerAM9782Verwendung zum Reinigen und Entfernen von RNase
Halbautomatisches rotierendes MikrotomLeica BiosystemsRM2245Verwenden Sie FFPE-Blöcke, wie in den Richtlinien angegeben.
Rutschwärmer mit AbdeckungPremiere XH2004Verwendung für die Inkubation von Objektträgern bei unterschiedlichen Temperaturen
Superfrost Plus Slides Fisher Scientific12-550-15 Verwendung zum Anfügen von Abschnitten für Vsium HD
Chirurgische Klinge Nr. 11Integra Miltex4-311Verwendung zur Bewertung von FFPE-Geweben
Surgipath ParaplastLeica Biosystems39601006Verwendung zur Gewebeinfiltration und Einbettung von Geweben
TISsue-Kultur DISH 100X20MM 500/CSFisher Scientific877222Verwendung zum Sammeln und Zerlegen von Proben in 1x PBS
UltraPure GlycerolThermo Fischer15514011Verwendung für die Visium HD Schiebemontage von Coverglass vor CytAssist
Visium CytAssist10X Genomics, Inc. PN-1000442Verwendung für Visium HD-Workflow-Experimente
Visium HD Räumliche RNA-Sequenzierung10X Genomics, Inc. 1000676Verwendung zur Durchführung räumlicher transkriptomischer Experimente
Xenium 5K In Situ RNA-Lokalisierung  10X Genomics, Inc. PN-1000724Verwendung zur Durchführung räumlicher transkriptomischer Experimente
Xenium-Analysator10X Genomics, Inc. PN-1000481Verwenden Sie Xenium- und Xenium-5K-RNA-Bildgebung  
Xenium Explorer 410X Genomics, Inc. Verwenden Sie zur Analyse von Xenium-Daten 
Xenium-in-situ-RNA-Lokalisierung10X Genomics, Inc. 1000672Verwendung zur Durchführung räumlicher transkriptomischer Experimente

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thesleff, I. From understanding tooth development to bioengineering of teeth. Eur J Oral Sci. 126 (1), 67-71 (2018).
  2. Bei, M. Molecular genetics of tooth development. Curr Opin Genet Dev. 19 (5), 504-510 (2009).
  3. Roth, D. M., et al.

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Spatial TranscriptomicsTooth MorphogenesisMouse Embryonic TissueFormalin Fixed TissueParaffin EmbeddingCraniofacial DevelopmentRNA IntegrityTissue MorphologyGene Expression ProfilingSingle Cell RNA Sequencing

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