Standardisierter Durchflusszytometrie-Assay mit getrockneten rekombinanten Antikörperpanels zur CAR-T-Zell-Charakterisierung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt, wie getrocknete rekombinante Antikörperpanels die Charakterisierung von Chimeric Antigen Receptor T (CAR T) Zellen vereinfachen, indem es die Variabilität reduziert und Arbeitsabläufe vereinfacht. Es ermöglicht eine reproduzierbare Bewertung kritischer Qualitätsmerkmale, einschließlich absoluter Quantifizierung von Chimeric Antigen Receptor T-Zellen, und ist über verschiedene Flowzytometrieplattformen hinweg kompatibel.

Zusammenfassung

Die Durchflusszytometrie wird häufig verwendet, um kritische Qualitätsmerkmale von Chimeric Antigen Receptor T (CAR T)-Zellen zu bewerten, einschließlich Viabilität, Phänotyp und Transduktionseffizienz. Konventionelle Flüssigreagenzien-Workflows erfordern mehrere Vorbereitungsschritte, was zu Variabilitäten und Unterschieden im betriebsabhängigen Umgang führen kann. Vorformulierte getrocknete Rekombinant-Antikörper-Panels bieten ein alternatives Format, das die Rekombinanten-Antikörper-Technologie mit einer einsatzbereiten Konfiguration kombiniert. Rekombinante Antikörper bieten eine definierte Spezifität und eine geringere Variabilität von Charge zu Charge, während das getrocknete Format die Vorbereitungsschritte reduziert und die Handhabung der Reagenzen vereinfacht. Hier präsentieren wir einen Schritt-für-Schritt-Workflow für die CAR-T-Zellanalyse mit getrockneten rekombinanten Antikörperpanels. Das Protokoll umfasst Probenfärbung, Datenerfassung und -analyse und wird von einer schematischen Übersicht des Arbeitsablaufs begleitet. Repräsentative Färbungsergebnisse werden dargestellt, um die Anwendung des Panels zu veranschaulichen, und Unterschiede in der Hands-on-Zeit im Vergleich zu einem herkömmlichen flüssigen Reagenz-Workflow werden hervorgehoben. Die bereitgestellten Beispiele zeigen, wie diese Panels genutzt werden können, um die multiparametrische Charakterisierung von CAR-T-Zellen zu vereinfachen. Insgesamt bietet diese Arbeit einen praktischen Rahmen für die Implementierung von getrockneten rekombinanten Antikörperpanels in der Durchflusszytometrie-basierten CAR-T-Zellanalyse.

Einleitung

CAR-T-Zelltherapien haben sich als bedeutender Fortschritt in der Krebsbehandlung etabliert, insbesondere bei hämatologischen Malignitäten. Dieser Ansatz nutzt das eigene Immunsystem des Patienten, indem T-Zellen modifiziert werden, um chimerische Antigenrezeptoren (CARs) zu exprimieren, die^{Krebszellen erkennen} und angreifen. Die hochkomplexe Infrastruktur und die arbeitsintensiven Herstellungsprozesse, die zur Herstellung von CAR-T-Zellen erforderlich sind, machen jedoch eine rigorose, standardisierte Charakterisierung unerlässlich, um sowohl Produktqualität als auch Patientensicherheit zu gewährleisten. Ein erheblicher Teil der Gesamtkosten der CAR-T-Therapie entsteht durch umfangreiche Laborarbeit und Qualitätskontrollverfahren (QC), von denen viele manuelle, mehrstufige Arbeitsabläufe erfordern. In diesem Kontext sind wichtige Charakterisierungsparameter – wie Transduktionseffizienz und Identitätstests – entscheidend für die Bewertung des therapeutischen Potenzials der modifizierten Zellen². Traditionelle flüssige Färbungsmethoden in der Durchflusszytometrie, die häufig für diese Bewertungen verwendet werden, stellen mehrere Herausforderungen dar. Variabilität beim Pipetten, Probleme mit der Reagenzstabilität und Operator-Bias können zu Inkonsistenzen und Ungenauigkeiten in den Daten führen, was die Zuverlässigkeit der Ergebnisse potenziell beeinträchtigt³.

Die Flowzytometrie ist eine grundlegende Technologie zur Charakterisierung und Qualitätskontrolle von CAR-T-Zellen, die eine detaillierte Analyse mehrerer Zellparameter ermöglicht. Der konventionelle Einsatz von flüssigen Reagenzien in diesem Prozess ist jedoch mit potenziellen Fallstroffeln verbunden ^4,5. Pipettiervariabilität kann erhebliche Fehler verursachen, insbesondere bei kleinen Volumina und mehreren Reagenzien. Außerdem sind flüssige Reagenzien im Laufe der Zeit anfällig für Abbau, was ihre Stabilität beeinträchtigen und zu inkonsistenten Färbungsergebnissen führen^{kann 6}. Operator-Bias, die durch manuelle Vorbereitung und Handhabung entsteht, verschärft diese Probleme weiter und führt potenziell zu Variabilitäten der Ergebnisse zwischen Laboren und sogar innerhalb von Läufen im selben Labor. Kritische Qualitätsmerkmale wie Zellviabilität, Transduktionsfrequenz, CD3^+-Anzahl und Identität sind für die sichere Freigabe von CAR-T-Produkten unerlässlich. Die Genauigkeit und Konsistenz dieser Messungen ist entscheidend, da sie direkt die therapeutische Wirksamkeit und Sicherheit der CAR-T-Zellen^beeinflussen. So ist beispielsweise eine genaue Einschätzung der Transduktionshäufigkeit entscheidend, um den Anteil der erfolgreich modifizierten T-Zellen zur Expression des CAR zu bestimmen, während CD3^+-Anzahl und -Prozentsatz Einblicke in die Gesamtzusammensetzung und Reinheit der T-Zellpopulation liefern.

Trockene Antikörperpanels bieten eine vielversprechende Lösung für diese Herausforderungen, indem sie eine konstante Abgabe von Reagenzien gewährleisten und die Aufbauzeit sowie das Fehlerrisiko reduzieren. Diese Panels bestehen aus mehreren Antikörpern, die aus vorgefertigten Cocktails getrocknet wurden. Nach dem Trocknen sind diese Paneele stabil und einsatzbereit, wodurch komplexe Vorbereitungsschritte entfallen und das Risiko menschlicher Fehler^{minimiert wird.} Wichtig ist, dass es nicht notwendig ist, diese getrockneten Platten vor der Verwendung wieder zusammenzusetzen – Zellsuspensionen können direkt zur getrockneten Antikörpermischung hinzugefügt werden. Die Einbindung rekombinanter Antikörper in diese getrockneten Formate bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen polyklonalen oder hybridom-abgeleiteten Reagenzien. Ihre molekular definierte Struktur sorgt für eine hohe Los-zu-Los-Konsistenz und Reproduzierbarkeit und reduziert die Variabilität zwischen Experimenten und Laboren. Eine auf menschlichem IgG1 basierende Fc-Region minimiert Kreuzreaktivität und Hintergrundfärbung. Folglich ist kein Fc-Blocking erforderlich, was die benötigte Zeit für die Durchführung des Flusszytometrischen Tests weiter verkürzt. Das getrocknete Format schützt die Reagenzien vor Abbau und bewahrt ihre Wirksamkeit über Zeit und Chargen hinweg. Diese Konsistenz ist entscheidend, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse in den Durchflusszytometrie-Assays⁸ zu erzielen.

Die Anwendbarkeit getrockneter Reagenzien-Formate erstreckt sich über verschiedene Phasen der Entwicklung und Überwachung der CAR-T-Zelltherapie. Bei der Qualitätskontrolle der Fertigung erleichtern getrocknete Reagenzien die Probenahme im geschlossenen System und gewährleisten so Sterilität und Konsistenz. Dies ist besonders wichtig in einem klinischen Umfeld, in dem die Integrität der Probe von größter^{Bedeutung ist}. Für die Produktcharakterisierung ermöglichen getrocknete Reagenzien eine genaue Bewertung absoluter Werte und Immununtergruppen, was für die Bestimmung der therapeutischen Qualität der CAR-T-Zellen entscheidend ist. Darüber hinaus sind getrocknete Reagenzien in der Forschung von unschätzbarem Wert für die längsführende Patientenüberwachung, da sie eine konsistente Verfolgung der CAR-T-Zellpersistenz über die Zeit ermöglichen, was entscheidend ist, um die langfristige Wirksamkeit und Sicherheit der Therapie zu verstehen.

Die Vorteile der Verwendung getrockneter Antikörperplatten in der Durchflusszytometrie sind vielfältig, wobei einer der wichtigsten die Fähigkeit ist, Pipettierungsfehler zu reduzieren, indem ein vollständig vorkonfiguriertes Panel bereitgestellt wird, anstatt dass einzelne Reagenzien manuell aufgehängt und kombiniert werden müssen. Im Gegensatz zu einzelnen getrockneten Antikörpern – die noch rekonstituiert und pipettiert werden müssen und daher hauptsächlich eine längere Haltbarkeit bieten – entfallen vormontierte getrocknete Platten mehrere manuelle Vorbereitungsschritte. Dies vereinfacht den Arbeitsablauf und minimiert die Möglichkeit für betriebsabhängige Variabilität erheblich. Dadurch wird der gesamte Prozess weniger fehleranfällig, weniger zeitaufwendig und weniger auf umfangreiche technische Ausbildung angewiesen, sodass er für ein breiteres Spektrum von Laboren zugänglich^ist. Darüber hinaus sorgt das stabile, gebrauchsfertige Format getrockneter rekombinanter Antikörperpanels für eine konsistente und zuverlässige Testleistung über Bediener und Standorte^{hinweg 9}.

Um das Potenzial der getrockneten Reagenzientechnologie in der Durchflusszytometrie voll auszuschöpfen, ist es unerlässlich, ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für deren Anwendung zu entwickeln. Dazu gehören Richtlinien für das Färben von getrockneten Platten, die Beschaffung und automatisierte Analyse, um sicherzustellen, dass alle Aspekte des Prozesses standardisiert und auf Genauigkeit und Effizienz optimiert sind. Durch die Bereitstellung eines klaren und umfassenden Protokolls können Labore konsistente und zuverlässige Ergebnisse erzielen, was die sichere und effektive Freisetzung von CAR-T-Zellprodukten^ermöglicht. Hier stellen wir ein Protokoll bereit, das die Vorteile getrockneter Antikörperpanels nutzt, um die Einschränkungen traditioneller flüssiger Färbungsmethoden zu beheben und so die Zuverlässigkeit, Effizienz und Reproduzierbarkeit zu erhöhen – Schlüsselmerkmale zur sicheren und wirksamen CAR-T-Zelltherapien (Abbildung 1).

Protokoll

Alle menschlichen Proben wurden von gesunden, anonymen Freiwilligen entnommen, nachdem schriftliche informierte Zustimmung eingeholt worden war. Alle Verfahren wurden vom Ethikausschuss der Ärztekammer Nordrhein (#2020272) genehmigt und gemäß den erforderlichen ethischen und biosicherheitsrechtlichen Vorschriften durchgeführt.

1. Probenentnahme und -vorbereitung

1. Entnehmen Sie aseptisch Proben des Chimeric Antigen Receptor T (CAR T) aus den Verarbeitungsbeuteln zur Qualitätskontrolle der Herstellung.
2. Verarbeiten Sie die Proben zügig, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Lagern Sie die Proben bei 2–8 °C, geschützt vor Licht, bis zur Verfärbung.
3. Bestimmen Sie vor der Färbung die Zellzahl jeder Probe.
4. Stellen Sie jede Probe auf eine Konzentration von bis zu 10^{6 nukleierten} Zellen pro 100 μL mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)/2 mM EDTA/0,5 % BSA-Puffer, pH 7,2, an.
   1. Falls nötig, zentrifugieren Sie die Proben bei 300 × g für 5 Minuten. Aspiriere das Supernatant vollständig.
   2. Setzen Sie die Zellen auf die entsprechende Konzentration wieder auf.

2. Getrocknete Paneelbeizung

HINWEIS: Zwei vorformulierte getrocknete Antikörperpanels werden verwendet, um Proben zu färben: der getrocknete rekombinante Immune Cell Composition (ICC) Cocktail, human, und der getrocknete rekombinante CAR T Transduction Cocktail, human. Die CAR-Verfärbung für das CAR T Transduktionspanel ist entscheidend. Eine zuverlässige Trennung von CAR-negativen und CAR-positiven Zellen ist für eine genaue Bestimmung der Transduktionsfrequenz erforderlich. Das Waschen kann die Zellrückgewinnung durch Zellverlust während der Zentrifugation und Aspiration verringern. Daher werden No-Wash-Protokolle im Allgemeinen bevorzugt, wenn eine genaue Zellkonzentration erforderlich ist.

1. ICC Cocktail (No-Wash-Protokoll)
   1. Geben Sie 100 μL der präparierten Zellsuspension direkt in das getrocknete ICC-Antikörperrohr. Mischen Sie durch Pipetten auf und ab und/oder einen kurzen Vortex, um das Pellet vollständig aufzulösen. Inkubieren Sie 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur (19–25 °C).
   2. Bestätigen Sie, dass das getrocknete Antikörperpellet vollständig aufgelöst ist. Gehen Sie direkt zur Erwerbung ohne Wash vor.
2. CAR T Transduktionscocktail (Waschprotokoll)
   1. Fügen Sie 100 μL der vorbereiteten Zellsuspension in das getrocknete CAR-T-Transduktionsrohr ein.
   2. Fügen Sie das entsprechende Volumen des CAR-Detektionsreagens hinzu (z. B. 2 μL). Mischen Sie durch Pipetten auf und ab und/oder einen kurzen Vortex, um das Pellet vollständig aufzulösen. Inkubieren Sie 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur (19–25 °C). Bestätigen Sie, dass das getrocknete Antikörperpellet vollständig aufgelöst ist.
   3. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml Puffer hinzufügen. Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten. Entferne das Überdachte vollständig.
3. Sekundärfärbung (falls erforderlich)
   1. Führen Sie eine zweite Wäsche durch (siehe Schritt 2.2.3) für biotin-markierte CAR-Detektionsreagenzien, um freie biotinkonjugierte Reagenz zu entfernen und Hintergrundfärbungen zu reduzieren.
   2. Setzen Sie die Zellen in 98 μL Puffer wieder auf. Fügen Sie 2 μL Phycoerythrin-(PE)-markierten sekundären Antikörper hinzu. Vortex kurz zum Mixen. Inkubieren Sie 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur (19–25 °C).
   3. Waschen Sie die Zellen, um ungebundene sekundäre Antikörper zu entfernen (siehe Schritt 2.2.3).
4. Endgültige Vorbereitung auf den Erwerb
   1. Stellen Sie das Volumen aller gefärbten Proben (CAR T Transduction Cocktail und ICC Cocktail) mit Puffer auf 300–500 μL ein. Schützen Sie die Proben vor Licht und halten Sie sie bei 2–8 °C.
   2. Führen Sie die Aufnahme innerhalb einer Stunde durch, um die Fluorophorstabilität zu erhalten und die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

3. Durchflusszytometrische Erfassung und Datenanalyse

1. Bereiten Sie das Durchflusszytometer vor und primen Sie, um sicherzustellen, dass Kalibrierung und Instrumenteeinstellungen optimiert sind.
2. Schalten Sie die Laser ein und spülen Sie das Fluidsystem. Lassen Sie mindestens 30 Minuten ein, damit sich die optische Bank aufwärmt.
3. Während des Aufwärmens führe ein Reinigungsprogramm mit einer 1%igen Hypochloritlösung durch.
4. Verwenden Sie Kalibrierungsperlen, um die Lasereinstellungen anzupassen.
5. Bereiten Sie einzeln gefärbte Kontrollen zur Kompensation mit passenden Antikörpersets vor.
   1. Für Perlen: Füge ein passendes Volumen an positiven und negativen Kontrollperlen hinzu.
   2. Für Zellen: 100 μL Zellsuspension hinzufügen.
   3. Für biotin-konjugierte Reagenzien: Fügen Sie ein Rohr mit 98 μL Puffer plus 2 μL PE-markierten sekundären Antikörper ein.
   4. Überprüfen Sie, ob die Kompensationsreagenzien mit dem Antikörpercocktail (Chargennummern) übereinstimmen.
6. Kontrollraum 10–20 Sekunden inkubieren, 5 Sekunden Vortex und dann 10 Minuten im Dunkeln bei 19–25 °C inkubieren.
7. Proben mit 600 μL Puffer verdünnen und gründlich mischen.
8. Richten Sie die Kompensation mit Single-Stained-Kontrollen ein.
9. Stellen Sie FSC- und SSC-Spannungen an und definieren Sie Schwellenwerte, um Trümmer auszuschließen.
10. Nehmen Sie mindestens 50.000–100.000 lebende Lymphozyten pro Probe auf.
11. Führen Sie Gating durch, um die Lebensfähigkeit zu bewerten, die CD3-Expression und die CAR-Expression zu bewerten.
12. Zur absoluten Quantifizierung bestimmen Sie den Anteil der CAR-positiven T-Zellen (f₍CAR T₎).
13. Definieren Sie totale Leukozyten (N₍total₎) als lebensfähige CD45⁺, Einzelzellen nach Ausschluss von Trümmern.
14. Messung der Gesamtzahl der Leukozyten erfolgt durch direkte Zählung aus ICC-gefärbten Proben, sofern das Instrument sie unterstützt, oder mit Zählkugeln oder einem Hämatologie-Analysator.
15. Berechnung der CAR-T-Zellkonzentration:
    
    HINWEIS: Beispielberechnung mit Werten aus Abbildung 2 und Abbildung 3
    ​
    
16. Wenden Sie diese Methode für die Quantifizierung von CAR-T-Zellen über verschiedene Instrumente und Arbeitsabläufe an.

Ergebnisse

Auf CAR⁺-T-Zellproben wurden getrocknete rekombinante Antikörperpanels angewendet, um Flusszytometrie-Färbungsabläufe zu demonstrieren. Wie in Abbildung 1 dargestellt, eliminiert das Ersetzen herkömmlicher flüssiger Reagenzien-Workflows durch vorformulierte getrocknete Antikörperplatten mehrere Vorbereitungsschritte – darunter die Kennzeichnung des Röhrchens (zur Anzeige der Antikörperzusammensetzung des Panels; jedes Rohr benötigt weiterhin die entsprechende Probenidentifikation), Reagenzkombinationen und manuelles Mischen – wodurch der Färbeprozess vereinfacht wird. Röhrchen enthalten ein Etikett, das mit kompatiblen Zytometern gescannt oder manuell ausgelesen werden kann, was flexible Möglichkeiten zur Probenidentifikation bietet.

Repräsentative Beispiele zeigen, dass das Panel zur Zusammensetzung von getrockneten Immunzellen die Identifikation wichtiger Leukozyten-Subsets ermöglicht (Abbildung 2), während das getrocknete CAR-T-Transduktionspanel die Visualisierung von CAR-exprimierenden T-Zellen und die Bewertung der Transduktion ermöglicht (Abbildung 3). Für diese Panels ist keine Fc-Blockierung erforderlich, und für alle Antikörper im Panel ist nur eine einzige Isotyp-Kontrolle erforderlich. Diese Beispiele verdeutlichen die Anwendung getrockneter Panels für die multiparametrische Analyse von CAR-T-Zellen und zeigen, wie der Workflow effizient mit weniger manuellen Schritten durchgeführt werden kann. Die Zusammensetzung der in dieser Studie verwendeten getrockneten Antikörperpanels ist in Tabelle 1 dargestellt.

Abbildung 4 zeigt die Verkürzung der Vorbereitungszeit für ein repräsentatives Experiment bei Verwendung getrockneter Paneele sowohl für weniger erfahrene als auch für erfahrene Nutzer. Das getrocknete Format vereinfacht die Färbungsverfahren, minimiert die manuelle Handhabung und bietet praktische Anleitungen für die Umsetzung und Schulung von Arbeitsabläufen. Wichtig ist, dass die Verwendung getrockneter Antikörpercocktails Immunzell-Subset-Frequenzen ergab, die mit denen herkömmlicher Flüssigcocktails vergleichbar sind (Abbildung 5). Außerdem sind getrocknete Antikörperplatten bei Raumtemperatur stabil und können während ihrer einjährigen Haltbarkeit unter Umgebungsbedingungen gelagert werden, im Gegensatz zu herkömmlichen flüssigen Antikörpern, die typischerweise eine kalte Lagerung benötigen. Diese Stabilität unterstützt wiederholte Nutzung, Langzeitstudien und vereinfachte Bestandsverwaltung.

Abschließend zeigen die bereitgestellten Beispiele, wie getrocknete rekombinante Antikörperpanels verwendet werden können, um die multiparametrische Charakterisierung von CAR-T-Zellen zu straffen. Insgesamt bietet diese Arbeit einen praktischen Ansatz zur Implementierung von getrockneten Antikörperpanels in der auf Flusszytometrie basierenden CAR-T-Zellanalyse mit vereinfachter Handhabung, reduzierten Vorbereitungsschritten und anpassungsfähigen Panelkonfigurationen.

Abbildung 1: Vergleich des manuellen Färbe-Workflows und getrockneter rekombinanter Antikörperpanels. Der traditionelle manuelle Arbeitsablauf (Top) umfasst mehrere Vorbereitungsschritte, darunter das Etikettieren von Röhrchen, das Kombinieren und Mischen von Reagenzien sowie das Hinzufügen von Proben, was den praktischen Aufwand erhöhen kann. Im Gegensatz dazu verwendet der Workflow des getrockneten rekombinanten Antikörperpanels (unten) vorgemischte, abgetrocknete Panels, die nur die Zugabe der Probe erfordern. Dieser optimierte Ansatz reduziert manuelle Schritte und vereinfacht den Färbungsprozess, was die Effizienz des Arbeitsablaufs und die praktische Umsetzung verdeutlicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Durchflusszytometrische Analyse einer Leukaphereseprobe, gefärbt mit dem getrockneten rekombinanten Antikörperpanel "Immune Cell Composition Cocktail". (A) Ablagerungen wurden durch Gating auf FSC versus SSC ausgeschlossen, um alle Zellen einzubeziehen. (B) Doublets wurden mit einem FSC-A- statt FSC-H-Gate entfernt. (C) Leukozyten wurden durch Gating auf CD45^+-Zellen identifiziert, was den Ausschluss von Resterythrozyten ermöglichte. (D) Tote Zellen wurden mittels 7-AAD-Färbung ausgeschlossen. (E,F) CD3^+-Zellen wurden identifiziert und basierend auf CD56-Expression weiter in (E) T-Zellen und (F) NKT-Zellen klassifiziert. (G) T-Zellen wurden anschließend in CD4^+- und CD8^+-Teilmengen unterteilt. (H) Innerhalb der CD3-Population wurden die Monozyten durch die CD14-Expression und B-Zellen durch die CD19-Expression definiert. (I) Die übrigen CD14^–/CD19^– Zellen wurden in SSC High/CD16^– Eosinophile, SSC High/CD16⁺ Neutrophile und SSC low/CD56⁺/CD16⁺ Zellen unterteilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Flowzytometrische Analyse von CD19 CAR T-Zellen (FMC63), gefärbt mit dem getrockneten rekombinanten Antikörperpanel "CAR T Transduktion Cocktail". (A) Ablagerungen wurden durch Gating auf FSC versus SSC ausgeschlossen, um alle Zellen einzubeziehen. (B) Doublets wurden mit einem FSC-A- statt FSC-H-Gate entfernt. (C) Leukozyten wurden durch Gating auf CD45^+- Zellen identifiziert. (D) Tote Zellen wurden aufgrund der 7-AAD⁻ -Färbung ausgeschlossen. (E,F) CD3^+- Zellen wurden identifiziert und anschließend in CAR^+- und CAR⁻ -Populationen aufgeteilt. (G) CAR⁺ und (H) CAR⁻ Zellen wurden weiter in CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen-Untermengen unterteilt. (I) Innerhalb der CD3⁻ -Population wurden Restmonozyten durch CD14-Expression definiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Zeitersparnisse mit getrockneten Antikörperpanels über alle Erfahrungsstufen hinweg. Für unerfahrene (links) und erfahrene Nutzer (rechts) wurde die Zeit für die Durchführung eines Flowzytometrie-Experiments (trockenes rekombinantes Antikörper-Panel "Immune Cell Composition Cocktail", technische Trilikate) vom Beginn des Experiments bis zum Beginn der Inkubation eingeschätzt, einschließlich Handhabung, Pipetterung und Dokumentation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Durchflusszytometrieanalyse von lysiertem Vollblut, Überlagerung einer Probe, die mit dem getrockneten rekombinanten Antikörperpanel "Immune Cell Composition Cocktail" (blau) gefärbt ist, und einer mit denselben Antikörpern gefärbten Probe in flüssigem Format (orange). (A) Schmutz wurde durch Gating auf FSC versus SSC ausgeschlossen, um alle Zellen einzubeziehen. (B) Doublets wurden mit einem FSC-A- statt FSC-H-Gate entfernt. (C) Leukozyten wurden durch Gating auf CD45^+-Zellen identifiziert, wodurch Resterythrozyten ausgeschlossen wurden. (D) Tote Zellen wurden mittels 7-AAD-Färbung ausgeschlossen. (E) CD3^+-Zellen wurden identifiziert. (F) Diese Zellen wurden dann basierend auf CD56-Expression in T-Zellen und NKT-Zellen klassifiziert. (G) T-Zellen wurden anschließend in CD4^+- und CD8^+-Teilmengen unterteilt. (H) Innerhalb der CD3-Population wurden die Monozyten durch die CD14-Expression und B-Zellen durch die CD19-Expression definiert. (I) Die übrigen CD14^–/CD19^– Zellen wurden in SSC High/CD16^– Eosinophile, SSC High/CD16⁺ Neutrophile und SSC low/CD56⁺/CD16⁺ Zellen unterteilt. (J) Frequenzen, die mit flüssigen Antikörpern und getrockneten Reagenzien-Panels gewonnen wurden, wurden verglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Zweck	V1 VioBlue	V2 VioGreen	B1 FITC	B2 PE	B3 7-AAD PerCP-Vio 700	B4 PE-Vio770	R1 APC	R2 APC-Vio770
Bestimmung der Zelllebensfähigkeit und Zusammensetzung der Immunzellen	CD45	CD4	CD3	CD56/CD16	7-AAD	CD19	CD14	CD8
Bestimmung der Transduktionseffizienz von CAR-T-Zellen	CD45	CD4	CD3	CAR-Detektionsreagenz	7-AAD	/	CD14	CD8

Tabelle 1: Zusammensetzung getrockneter rekombinanter Antikörperpanels, die für die CAR-T-Zellanalyse verwendet werden. Diese Tabelle listet die in jedem getrockneten Panel enthaltenen Antikörper auf und gibt das Zielantigen, Klon, Fluorochrom und die typische Menge pro Tube an. Es werden zwei Panels gezeigt: das "Immune Cell Composition"-Panel zur Identifikation der wichtigsten Leukozyten-Subsets und das "CAR T Transduction"-Panel zur Detektion der CAR-Expression und der Charakterisierung der T-Zell-Subsets. Die Informationen bieten eine Referenz für die Implementierung von Workflows und optionale Anpassungen mit zusätzlichen flüssigkeitskonjugierten Antikörpern.

Diskussion

Getrocknete rekombinante Antikörperpanels bieten einen reibungslosen, praktischen Arbeitsablauf für die Charakterisierung von CAR-T-Zellen im Labor. Das vorformulierte Format reduziert Vorbereitungsschritte und vereinfacht die Handhabung, wodurch die operatorabhängige Variabilität begrenzt und die konsistente Ausführung multiparametrischer Durchflusszytometrieverfahren^{unterstützt 8}. Repräsentative Beispiele veranschaulichen die Verwendung dieser Panels zur Identifizierung von Leukozyten-Untergruppen, zur Erkennung der CAR-Expression und zur Bewertung von T-Zell-Untergruppen. Die Panels können auch mit zusätzlichen flüssigkeitskonjugierten Antikörpern ergänzt werden, um zusätzliche Marker oder Immunteilgruppen einzubeziehen, was eine flexible Anpassung an spezifische experimentelle Bedürfnisse oder Analysen mit höheren Parametern ermöglicht.

Eine genaue CAR-Detektion ist entscheidend für die zuverlässige Bestimmung der Transduktionsfrequenz¹. Eine klare Trennung von CAR-negativen und CAR-positiven Populationen hängt von entsprechend optimierten Färbungsbedingungen ab, insbesondere wenn die CAR-Ausdruckswerte variieren. Kontrollen wie Fluoreszenz-minus-eins (FMO)-Proben können eine genaue Gating unterstützen. In einigen Fällen können Waschmaßnahmen die Diskriminierung verbessern, indem ungebundene Antikörper entfernt werden; Diese Schritte können jedoch die Zellrückgewinnung durch Zellverlust während der Zentrifugation und Aspiration verringern. Daher können No-Wash-Workflows bevorzugt werden, wenn eine genaue Zellquantifizierung erforderlich ist.

Während der Ansatz idealerweise ein CAR-spezifisches Detektionsreagenz verwendet, das die extrazelluläre Domäne des entwickelten CAR erkennt, können alternative Reagenzien wie Antikörper, die konservierte Linkerregionen zwischen Antigenbindungs- und Signaldomänen angreifen, ebenfalls eingesetzt werden. Diese Alternativen ermöglichen die Erkennung von CAR-exprimierenden Zellen und können in Arbeitsabläufe integriert werden, bei denen CAR-spezifische Reagenzien nicht verfügbar sind, mit entsprechender Optimierung.

Die Integration mit automatisierten Erfassungs- und Analysesystemen, einschließlich Express-Modus, kann die Datenerfassung und -analyse weiter optimieren, den Praxisaufwand reduzieren und eine konsistente Ausführung von Arbeitsabläufen zwischen Bedienern ermöglichen.

Obwohl diese Arbeit die Methode veranschaulicht, wurde keine formale Testvalidierung für regulierte Fertigung oder Freisetzungstests durchgeführt. Eine Multi-Center-Validierung wurde noch nicht durchgeführt, sodass die Reproduzierbarkeit in verschiedenen Laboren noch bestätigt^ist. Der Ansatz basiert auf vorformulierten Panels, was die Flexibilität für hochspezialisierte Anwendungen einschränken kann. Individuell getrocknete Paneeloptionen können jedoch so gestaltet werden, dass sie bestimmte Marker oder Kombinationen enthalten, was maßgeschneiderte Arbeitsabläufe ermöglicht und die Einschränkungen von Standardpaneelen überwindet. Kostenüberlegungen werden weitgehend durch reduzierte Praxis und optimierte Verfahren ausgeglichen, was besonders in Hochdurchsatz-Workflows vorteilhaft sein kann.

Zukünftige Arbeiten könnten sich auf quantitative Leistungsbewertungen, formale Validierung für den regulierten Einsatz und die Ausweitung auf multizentrische Studien konzentrieren, um die Konsistenz von Arbeitsabläufen zwischen Laboren zu bewerten. Das maßgeschneiderte Paneldesign stellt eine praktische Möglichkeit dar, die Markerabdeckung zu erweitern, einzigartige experimentelle Fragestellungen zu adressieren oder sich an longitudinale Immunüberwachungsstudien anzupassen.

Zusammenfassend bieten getrocknete rekombinante Antikörperpanels eine flexible und praktische Grundlage für die CAR-T-Zell-Flusszytometrie. Sie reduzieren Vorbereitungsschritte, vereinfachen Arbeitsabläufe und unterstützen flexible Versuchsdesign, einschließlich individueller Panelkonfigurationen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
(Optional) Biotin Antibody, PE, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-951	Nur erforderlich, wenn ein Biotin-konjugierter CAR-Detektionsreagenz verwendet wird.
(Optional) CAR T Cell Express Mode Package	Miltenyi Biotec	160-002-376	Software-Add-on für MACSQuant Analyzer; ermöglicht automatisierte Gating und Datenanalyse, obwohl auch manuelle Analyse möglich ist.
CAR-Detektionsreagenz der Wahl, im PE-Kanal erkennbar, z. B. CD19 CAR-Detektionsreagenz, human, Biotin	Miltenyi Biotec	130-129- 550	Alternative Optionen: CD19 CAR FMC63 Idiotyp-Antikörper, PE, REAfinity (130-127-342); CD22 CAR-Detektionsreagenz, human, Biotin (130-126-727); BCMA CAR-Detektionsreagenz, human, PE (130-133-888)
Durchflusszytometer, z. B. MACSQuant Analyzer 16	Miltenyi Biotec	130-109-803	StainExpress-Röhrchen sind mit allen gängigen Durchflusszytometern kompatibel.
StainExpress CAR T Transduktions-Cocktail, human	Miltenyi Biotec	130-127-638	Benutzerdefinierte konfigurierte Trockenantikörper-Panels können über Ihren lokalen Miltenyi Biotec-Vertreter oder das technische Support-Team angefordert werden.
StainExpress Immunzell-Zusammensetzungs-Cocktail, human	Miltenyi Biotec	130-127-637	Benutzerdefinierte konfigurierte Trockenantikörper-Panels können über Ihren lokalen Miltenyi Biotec-Vertreter oder das technische Support-Team angefordert werden.