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Methodenartikel

Morphometrische Formanalysen: Die Analyse-Software-Werkzeugkaste zur Quantifizierung kraniofacialer Form bei Zebrafischen

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DOI:

10.3791/70345

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27. Februar 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Alcohol Research Center, University of Louisville, 2Department of Pediatrics, Section of Developmental Biology, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Quantifizierung der Kraniofacialform von Knorpelform mithilfe freier Software (tpsDigs2, MorphoJ und PAST), um Veränderungen der Gesichtsstruktur bei Zebrafischlarven zu messen.

Zusammenfassung

Fetale Alkoholspektrumstörungen (FASD) zeichnen sich durch eine unterschiedliche Reihe von körperlichen, kognitiven und verhaltensbedingten Beeinträchtigungen aus, die durch pränatale Ethanolexposition verursacht werden, einschließlich solcher, die das Gesichtsskelett betreffen. Ethanol-sensitive genetische Loci tragen zu diesem hohen Grad an Variation bei FASD bei, was die Analyse der Gesichtsform erschwert. Wir haben bereits gezeigt, dass wir diese Veränderungen der Gesichtsform durch Gen-Ethanol-Interaktionen bei Zebrafischen analysieren können. Zebrafische sind aus mehreren Gründen ein ideales Modell, um diese Variation zu analysieren; (i) 70 % der Gene sind Orthologe zwischen Menschen und Zebrafischen; (ii) die externe Befruchtung ermöglicht es Forschern, Zeitpunkt und Dosierung von Ethanolbehandlungen zu steuern; (iii) die Struktur ihres Gesichtsskeletts bei Wirbeltieren erhalten bleibt; (iv) durchscheinende Larven ermöglichen eine direkte Beobachtung von Veränderungen der kraniofacialen Skelettstruktur während der Entwicklung. Die Analyse der Form des kraniofazialen Skeletts kann jedoch schwierig sein, durch einfache lineare Messungen vollständig zu bestimmen, da diese keine Gesamtformänderungen erfassen. Darüber hinaus können Änderungen der Kopfgröße die Dateninterpretation erschweren. Um dem entgegenzuwirken, verfolgten wir einen morphometrischen Ansatz und analysierten die gesamte Gesichtsform anhand von Analysen der Hauptkomponenten mit Freeware-Software, tpsDigs2, MorphoJ und PAST. Die Kombination dieser Software ermöglicht einen paarweisen Vergleich der gesamten Gesichtsmorphologie. Hier skizzieren wir unseren Ansatz und unsere Analyse der Gesichtsform bei ethanolbehandelten Zebrafischmutanten und nutzen diese Programme, um eine Reihe komplementärer multivariater statistischer Analysen durchzuführen.

Einleitung

Fetale Alkoholspektrumstörungen (FASD) sind durch eine breite Palette von Entwicklungsstörungen gekennzeichnet, darunter Verhaltens-, neurologische und körperliche 1,2. Zu diesen körperlichen Defekten gehören kraniofaciale Defekte wie Kieferhypoplasie 3,4,5,6. Während Zeitpunkt und Dosierung der Ethanolexposition zur komplexen Ätiologie von FASD beitragen, spielt der genetische Beitrag eine bedeutende Rolle in der FASD-Ätiologie 6,7,8,9,10,11,12. Diese Kombination von Faktoren erschwert die Untersuchung von Gesichtsdefekten bei menschlichen Kohorten. Um die Auswirkungen der pränatalen Ethanolexposition auf die Entwicklung zu untersuchen, verwenden wir das Zebrafischmodell. Zebrafische dienen als starkes Modell für FASD, da sie 70 % der Genorthologe mit Menschen teilen, 82 % der bekannten krankheitserregenden Gene 13,14,15,16. Neben der genetischen Konservierung besitzen Zebrafische: (i) eine hohe Fruchtbarkeit, die es ermöglicht, mehrere Zebrafischlarven gleichzeitig zu produzieren, (ii) werden extern befruchtet, was eine direkte Untersuchung ethanolsensitiver Entwicklungsprozesse ermöglicht, (iii) weisen eine stark konservierte und stereotype kraniofaciale Entwicklung von Wirbeltieren auf und (iv) sind durchscheinende Embryonen/Larven, die die Sichtbarkeit von Skelettstrukturenermöglichen 17. Wir haben bereits gezeigt, dass Mutationen in vielen verschiedenen Zebrafischgenen Embryonen gegenüber ethanolbedingten Gesichtsdefekten sensibilisieren, und diese Defekte können subtil und schwer am Auge 10,18 zu erkennen sein. Außerdem beobachteten wir, dass ethanol-behandelte Wildtyp-Larven im Vergleich zu unbehandelten Wildtyplarven auch leichte Veränderungen im kraniofacialen Bereich aufweisen, wobei auch diese Veränderungen mit Auge10 schwer zu erkennen sind. Obwohl diese Veränderungen bei visueller Beobachtung unentdeckt bleiben, konnten wir diese ethanolbedingten Veränderungen der Gesichtsform mithilfe morphometrischer Analysen zeigen, die auf 2D-Bildern des Viscerocranium10 verfügbar sind.

Die Fläche ist eine komplexe 3D-Struktur, die mit herkömmlichen linearen Messungen schwer zu messen ist. Diese einzelnen linearen Maße berücksichtigen nicht die relative Position jeder gemessenen Struktur und deren Einfluss auf die anderen gemessenen Strukturen der Fläche. Morphometrische Analysen beheben diese Schwächen, indem sie Formkonfigurationen über Orientierungspunkte verwenden, die die relative Position aller gemessenen Strukturen berücksichtigen, und sogar die Gesamtgrößenunterschiedevon 18, 19 und 20 berücksichtigen. Dieser Ansatz führt zu Daten, die genauer sind, eine höhere Auflösung haben und viel leichter sichtbar werden können, was Ergebnisse liefern kann, die mit herkömmlichen linearen Messungen 18,19,20 nicht beobachtet werden können. Darüber hinaus können morphometrische Ansätze direkte Vergleiche zwischen und innerhalb von Gruppen mittels multivariater statistischer Methoden anstellen. Hier beschreiben wir die Nutzung der kostenlosen morphometrischen Software tpsUtil, tpsDigs221, MorphoJ20 und Paleontological Statistics (PAST)22, in Kombination mit 2D-Bildern des Viscerokratiums in unbehandelten und ethanolbehandelten Wildtyp- und Larvenheterozygoten für das Knochenmorphogenetisches Protein (Bmp)-Gen bmp7a. Obwohl diese Programme hauptsächlich in paläontologischen und ökologisch ausgerichteten Bereichen eingesetzt werden, bieten sie in Kombination eine gründliche Analyse der Gesichtsform. Letztlich zeigen wir in diesem Protokoll, wie man diese frei verfügbaren Softwareanwendungen nutzen kann, um Veränderungen der Form des kraniofacialen Knorpels im Zebrafischmodell zu quantifizieren.

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Protokoll

Alle in diesem Verfahren verwendeten Zebrafischlarven wurden nach den von der University of Louisville23 genehmigten IACUC-Protokollen aufgezogen und gezüchtet.

HINWEIS: In dieser Studie wurden der Zebrafischstamm bmp7aty68a24 und Wildtyp-Geschwister (alle im AB-Hintergrund) verwendet, wobei adulte Fische bei 28,5 °C mit einem 14/10-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten wurden. Verwenden Sie die passenden Linien entsprechend den gewünschten experimentellen Ergebnissen. Verwenden Sie Wasser, das durch Umkehrosmose sterilisiert wurde. Geschlecht als biologische Variable gilt nicht für die untersuchten Entwicklungsstadien, da das Geschlecht bei Zebrafischen erstmals etwa 20–25 Tage nach der Befruchtung (dpf)25 nachweisbar ist, nach allen Analysen.

1. Ethanolbehandlung

  1. Sammeln Sie Eier aus heterozygoten Kreuzungen und stufen morphologisch Embryonen wie beschrieben23.
  2. Sortieren Sie die Embryonen in Probengruppen von 100 und bringen Sie sie bei 28,5 °C auf gewünschte Entwicklungszeitpunkte. Inkubieren Sie alle Gruppen in Embryomedien (EM)10,18.
  3. 6 Stunden nach der Befruchtung (HPF) ändere EM zu frischem EM oder EM mit 1 % Ethanol (v/v). Bei 24 hpf wird EM-haltiges Ethanol mit drei frischen Änderungen von EM10,18 ausgewaschen.

2. Gesichtsfärbung und Bildgebung

  1. Zebrafischlarven bei 5 dpf fixieren und mit Alcian Blue färben, wobei Knorpel (Abbildung 1) wie zuvor beschrieben26 gekennzeichnet wird.
  2. Nehmen Sie ganze Montage, ventrale Ansicht und Hellfeldaufnahmen des Viscerocraniums, Montage der Larven wie zuvor beschrieben27.
  3. Kurz gesagt: Fische, die Bauchseite nach oben, in die 50%ige Glycerollösung vom Ende der Alcian-Blue-Färbung montieren.
    HINWEIS: Die Einstellungen bei Compoundmikroskopen können variieren; Verwenden Sie Einstellungen, die den gewünschten Bildstrukturen entsprechen. In dieser Studie wurde ein Olympus BX53-Compoundmikroskop verwendet, um alle analysierten Bilder zu erzeugen. Die Bilder wurden mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen.

3. Genotypisierung

  1. Entfernen Sie die Schwänze von 5 dpf-Larven nach der zuvor beschriebenen Färbung des Alcian-Blue-Knorpels18.
  2. Trennen Sie Köpfe und Schwänze der Larven. Bewahren Sie die Köpfe in 50% Glycerolspeicherung für spätere Bildgebung auf.
  3. Lyse-Tails mit 5 μL Proteinase K (10 mg/mL) extrahieren gDNA.
  4. Führen Sie PCR auf der gDNA für jede Probe mit Primern durch, die auf das gewünschte Gen abzielen, um Bereiche mit dem SNP zu amplifizieren.
  5. Verdauen Sie das PCR-Produkt mittels Restriktionsendonucle-basierter DNA-Verdauung, um mutierte von Wildtyp-Allelen anhand des SNP zu unterscheiden und das SNP zu identifizieren. Teile die Proben nach Genotyp in zusammengefasste Gruppen und Bild zur Analyse auf.
    HINWEIS: Für diese Arbeit wurde das SNP in bmp7a verstärkt und mit BslI (NEB) genotypisiert.

4. Software für Formanalysen

  1. Verwenden Sie tpsUtil und tpsDig221 sowie MorphoJ20 (https://sbmorphometrics.org) für morphometrische Analysen von alcian-gefärbten Larven sowie MorphoJ und Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis (PAST)22 https://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/ für alle statistischen Analysen.
    HINWEIS: Die tpsUtil-Software ist unter dem Link "Utility programs" zu finden, die tpsDig2-Software unter dem Link "Data Acquisition" und MorphoJ unter dem Link "Umfassende Programme" auf https://sbmorphometrics.org. Fehlerbehebung für jede Software ist sowohl frei online, über mehrere Plattformen als auch innerhalb der Software leicht zu finden. Die Principal Component Analysis (PCA), Canonical Variate Analysis (CVA), Procrustes ANOVA und Wireframe-Graphen der Gesichtsvariation wurden mit MorphoJ erstellt, und ein multivariater Test der Normalität sowie eine multivariate Varianzanalyse (MANOVA) wurden mit PAST durchgeführt.

5. Die konsistente Bildgebung des Gesichtsskeletts für alle zu analysierenden Proben

  1. Stellen Sie sicher, dass Bilder des Gesichtsskeletts mit identischen Mikroskopeinstellungen aufgenommen und als .tif Dateien gespeichert werden.
    HINWEIS: Die Mikroskopeinstellungen variieren je nach Aufbau und Funktionalität des Mikroskops sowie den zu bildenden Proben/Geweben. Der Schlüssel ist eine konsequente Mikroskopvorbereitung und Probenvorbereitung.
  2. Speichere Dateien in einem einzigen Ordner, der das Experiment vollständig identifiziert.

6. Bildvorbereitung mit der TPS-Software

  1. Öffne Notepad und wähle 'Speichern unter'. Klicken Sie von hier aus auf alle Dateien am Ende. Speichere die Datei als "experiment-name.tps" und speichere sie in dem Ordner mit allen zu analysierenden Bildern.

7. Eingabe von Bildern in die TPS-Software

  1. Öffne die tpsUtil-Software. Als Nächstes ziehst du Operation herunter und wählst die Datei Build tps im Image-Tab aus .
  2. Klicken Sie in diesem Tab auf Eingabe und öffnen Sie die Datei mit den Bildern. Klicken Sie auf das erste Bild in der Datei und wählen Sie Öffnen.
  3. Wählen Sie den Ausgabe-Tab, gefolgt von der TPS-Notizblockdatei, und speichern Sie. Wenn du aufgefordert wirst, die Datei zu ersetzen, wähle ja.
  4. Als Nächstes klicken Sie auf den Reiter "Einrichten" und erstellen. Gehe in die Datei, um zu sehen, ob die Bilder hinzugefügt wurden.

8. Hinzufügen von Sehenswürdigkeiten zu Bildern

  1. Öffne tpsDigs2 und öffne die folgenden Tabs der Reihe nach: Quelle, Datei, dann die gespeicherte tps-Notepad-Datei.
  2. Klicken Sie als Nächstes auf die Optionen , um die Option Bildwerkzeuge zu visualisieren. Hier stellen Sie sicher, dass Sie die Referenzlänge auf 100 μm einstellen. Drücken Sie die Skala einstellen.
    HINWEIS: Skalieren Sie nicht relativ zum Maßstab des Bildes.
  3. Wenn du die Skala einstellst, drücke OK, um Parameter zu setzen, und verlasse dann die Bildwerkzeuge.
  4. Füge an dieser Stelle Orientierungspunkte zu jedem Bild hinzu, das für eine korrekte Morphologieanalyse analysiert werden soll, indem du auf das Zielsymbol klickst.
  5. Stellen Sie sicher, dass Orientierungspunkte für jedes Bild in derselben Reihenfolge platziert sind. An den folgenden Gelenken zwischen den Knorpelelementen wurden Landmarken angebracht (siehe Abbildung 1E, E'):
    1. Mittelliniengelenk zwischen den Meckel-Knorpeln (Landmark #1, Abbildung 1E, E').
    2. Die beidseitigen Gelenke zwischen Meckel- und Palatoquadrat-Knorpel (Landmarks #2, Abbildung 1E, E').
    3. Mittelliniengelenk zwischen den ceratohyalen Knorpeln (Landmark #3, Abbildung 1E, E').
    4. Die beidseitigen Gelenke zwischen dem Palatoquadrat und dem ceratohyalen Knorpel (Landmarks #4, Abbildung 1E, E').
    5. Das distale Ende der hyomandibulären Knorpel (Landmarks #5, Abbildung 1E, E').
  6. Nachdem Sie Orientierungspunkte auf ein Bild gesetzt haben, klicken Sie auf Dateien im Dropdown-Menü. Folgen Sie diesem Weg, um Daten zu speichern , und überschreiben Sie dann.
  7. Verlasse tpsDigs2.

9. Verwendung von MorphoJ zur Formanalyse durch Procrustes ANOVA

  1. Öffne die MorphoJ-Software.
  2. Unter Vorläufen erstellen und benennen Sie den Datensatz. Wählen Sie einen neuen Datensatz erstellen und benennen Sie den Datensatz. Klicken Sie dann auf tps und wählen Sie das Notizblock mit den neuen Datenpunkten aus, die aus Schritt 8.4 hinzugefügt wurden. Erstellen Sie den Datensatz.
  3. Die Bilder können statistisch mit Procrustes Fit betrachtet werden. Wählen Sie den Tab Projektbaum und klicken Sie auf den Datensatz. Wählen Sie in diesem Weg die folgenden Tasten: Vorläufe, neue Procrustes passen, Nach Hauptachsen ausrichten und Procrustes anpassen.
  4. Select erzeugt Kovarianzmatrix unter Vorläufen; die Software zeigt Procrustes Koordinaten an. Führe die Funktion aus, wenn du aufgefordert wirst.
  5. Wählen Sie unter Preliminaries Wireframe erstellen oder bearbeiten und die Punkte auf den Bildern verknüpfen. Dann wähle Linkpunkte aus und akzeptiere oder erstelle das Bild. Bearbeiten: Klassifikatoren.
  6. Öffne eine Tabelle, während du MorphoJ offen lässt. Fügen Sie alle notwendigen Informationen hinzu, zum Beispiel: Genotyp, Behandlung, Genotyp und Behandlung, Experiment usw. Speichere die Tabelle als CSV-Datei.
  7. In MorphoJ klicken Sie auf Datei und importieren Sie die Klassifikationsvariablen , um die CSV-Datei auszuwählen. Nachdem du die Datei geöffnet hast, gehe zurück zum Projektbaum und klicke auf den Datensatz.
  8. Sobald der Datensatz geöffnet ist, klicken Sie auf Vorläufer und bearbeiten Sie die Klassifikatoren. So werden alle Bilder hinzugefügt.
  9. Als Nächstes klicken Sie auf Projektbaum, Covmatrix und dann auf Variation oben.
  10. Wählen Sie Principal Component Analysis , um PC-Ergebnisse zu sehen. Klicken Sie auf PC-Scores, um das generierte Diagramm zu sehen.
  11. Um Farben zum Graphen hinzuzufügen, klicken Sie mit der rechten Maustaste und drücken Sie die Vertrauens-Ellipse , um den gewünschten Klassifikator hinzuzufügen. Drücken Sie Farbdatenpunkte , um die Farben hinzuzufügen, und OK, um diese Änderungen zu akzeptieren.
    HINWEIS: Sobald der PC-Score-Tab geschlossen und gemäß den Anweisungen in Schritt 9.10 wieder geöffnet wird, sollten die Farben aktualisiert werden.
  12. Um die Farben des Drahtgitters zu ändern, gehe zu Preliminaries. Klicken Sie auf Optionen für das Formdiagramm setzen , das sich unten auf dem Bildschirm befindet. Wählen Sie Drahtgitterdiagramme , um die Farben der Zielform, der Startform und der Zahlen zu ändern.
  13. Wähle Variation aus, dann Procrustes ANOVA.
  14. Exportiere die Procrustes-ANOVA-Ergebnisse aus Schritt 9.7 in die Tabellenkalkulationsdatei.

10. Kanonische Variatenanalyse des Datensatzes

  1. In MorphoJ wählen Sie den ursprünglichen Datensatz oder das Projekt aus. Um mit der Kanonischen Variatenanalyse (CVA) zu beginnen, wählen Sie Vergleich, gefolgt von Kanonischer Variatenanalyse. Wählen Sie die Klassifikatorvariable(n) aus – wählen Sie Genotyp & Behandlung und führen Sie die Funktion aus.
  2. Um CVA zu exportieren, klicken Sie auf den Reiter Ergebnisse und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die jetzt geöffnete Ergebnisseite. Wählen Sie Exportieren in Datei und speichern Sie die Informationen.
  3. Klicken Sie auf Projektbaum und wählen Sie CVA aus, dann Scores. Oben links auf der Seite wählen Sie Datei. Sobald der Datei-Tab geöffnet ist, wählen Sie Datensatz exportieren und wählen Sie den Datentyp sowie Genotyp & Behandlung. Speichere CVA-Scores als .txt Datei.
  4. Um die Datei für die PAST-Software vorzubereiten, öffnen Sie die gespeicherten CVA-Ergebnisse in Notepad oder einer vergleichbaren Software. Ändere die ID oben links auf Label , um die PAST-Software nicht zu verwirren. Speichern Sie die bearbeiteten CVA-Scores oder ein Gleichwert.

11. MANOVA in PAST-Software

  1. Um die CVA-Scores in PAST zu importieren, wählen Sie File und dann Open, um auf die gespeicherten CVA-Scores aus Notepad oder einem Äquivalent zuzugreifen. Wenn das Fenster "Textdatei importieren" geöffnet wird, wählen Sie Name, Data für Zeile und Spalte und Tab für einen Trenner aus. Wählen Sie Import.
  2. Wählen Sie unter dem Reiter Anzeigen Spaltenattribute aus. Öffne neben der Typ-Schaltfläche das Dropdown-Menü und wähle Gruppen für die erste Spalte, die die Klassifikatorvariable(n) enthalten sollte.
  3. Markiere die PC- oder CV-Daten. Wählen Sie Multivariate, Tests und Multivariate Normality , um den Normalitätstest durchzuführen. Führe diesen Test separat auf PC und CV durch.
  4. Klicken Sie auf die graue leere Zelle oben links, über der Eingabe, um den gesamten Datensatz auszuwählen. Wählen Sie Multivariate, Tests und MANOVA aus, um die MANOVA zu verarbeiten. Exportiere die MANOVA-Ergebnisse aus Schritt 9.7 in die Tabellentabellendatei.
    HINWEIS: Sowohl Zusammenfassungs - als auch Pairwise-Ergebnisse werden von der Software bereitgestellt. Exportiere oder speichere beides.

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Ergebnisse

Um ethanolbedingte Gesichtsformänderungen bei Zebrafischen zu identifizieren, kombinierten wir frei verfügbare Softwareanwendungen, um morphologische Daten des Gesichtsskeletts zu generieren und zu quantifizieren. Embryonen von bmp7a, heterozygoten adulten Trägerfischen wurden erzeugt und mit Ethanol von 6 bis 24 HPF behandelt. Larven dieser Kreuzungen wurden auf 5 DPF fixiert, und Gesichtsknorpel wurde mit Alcian Blue gefärbt. Bilder des Viscerocraniums wurden für jede Larve in...

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Diskussion

FASD ist durch eine Vielzahl von Entwicklungsstörungen gekennzeichnet, darunter kraniofaciale Defekte wie Kieferhypoplasie. Zebrafische sind ein starkes Modell für FASD aufgrund ihrer genetischen Konservierung beim Menschen, ihrer hohen Fruchtbarkeit, durchscheinenden Larven und ihrer äußeren Befruchtung. Zebrafische werden seit Jahrzehnten verwendet, um sowohl die Bildung des kraniofacialen Skeletts als auch den Einfluss von Ethanol auf die Entwicklung zu untersu...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die in diesem Artikel vorgestellte Forschung wurde durch einen Zuschuss des National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R01AA031043 an C.B.L. unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
tpsUtil, tpsDig2, MorphoJhttps://sbmorphometrics.orgFreeware-Software – kann administrative Berechtigungen zum Download erfordern
VERGANGENHEIThttps://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/Freeware-Software – kann administrative Berechtigungen zum Download erfordern
Compound-Brightfield-MikroskopOlympusBX53

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