Der Mechanismus von Ermiao-Pulver bei der Behandlung der Prostatitis: Eine Studie basierend auf Netzwerkpharmakologie und experimenteller Verifikation

Zusammenfassung

Mit einem Netzwerkpharmakologie-Ansatz zeigte diese Studie, dass Ermiao-Pulver seine therapeutischen Wirkungen gegen Prostatitis ausübt, indem es entzündliche Faktoren und zugehörige Signalwege hemmt. Nachfolgende In-vitro-Experimente zeigten außerdem, dass sein wässriger Extrakt die Expression wichtiger entzündlicher Zytokine in einem LPS-induzierten Modell der Prostataepithelzellen signifikant unterdrückte.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet einen kombinierten Ansatz der Netzwerkpharmakologie und experimenteller Validierung, um den Wirkmechanismus von Ermiao-Pulver (EMP) bei der Behandlung von Prostatitis zu untersuchen. Der Arbeitsablauf folgt einem schrittweisen Design: (i) datenbankgestütztes Screening aktiver Verbindungen und Ziele, (ii) Aufbau und Analyse von Interaktionsnetzwerken und (iii) in-vitro-experimentelle Validierung. Zunächst wurden die aktiven Inhaltsstoffe von EMP und deren entsprechende Ziele aus der TCMSP-Datenbank abgerufen, während prostatitisbezogene Ziele aus der GeneCards-Datenbank bezogen wurden. Die Schnittstelle von EMP-Zielen und Krankheitszielen wurde genutzt, um wichtige therapeutische Ziele zu identifizieren. Zweitens wurde ein Netzwerk "Arzneimittel–Wirkstoff–Ziel-Krankheit" mit Cytoscape aufgebaut. Protein-Protein-Interaktionsanalyse (PPI) und die Kyoto-Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-Weganreicherung wurden an den wichtigsten Zielen durchgeführt, was zeigte, dass entzündliche Faktoren wie IL6 und TNF als Kernziele dienten und Wege wie PI3K/AKT und MAPK signifikant angereichert waren. Abschließend wurde die in-vitro-Validierung mit einem LPS-induzierten Entzündungsmodell von Prostataepithelzellen durchgeführt. Die Behandlung mit EMP reduzierte signifikant die Freisetzung der pro-inflammatorischen Faktoren IL-6 und TNF-α im Vergleich zur LPS-behandelten Gruppe (S. < 0,05) und bestätigte die entzündungshemmende Wirksamkeit von EMP. Dieser integrative Ansatz bietet einen reproduzierbaren Rahmen, der angepasst werden kann, um andere multikomponentige therapeutische Systeme zu untersuchen. Abschließend erläutert diese Studie vorläufig, dass EMP seine antiprostatitisbedingten Effekte durch einen Multikomponenten-, Multi-Ziel- und Multisignalweg-Mechanismus ausübt, der eng mit der Unterdrückung entzündlicher Reaktionen verbunden ist und somit eine wissenschaftliche Grundlage für seine klinische Anwendung bietet.

Einleitung

Prostatitis, insbesondere chronische nicht-bakterielle Prostatitis, stellt eine häufige urologische Störung dar, die durch komplexe Ätiologie und fehlende wirksame Therapien gekennzeichnet ist und eine erhebliche Belastung für die Lebensqualität der Patienten darstellt ^1,2,3. Die aktuelle klinische Behandlung der Prostatitis erfolgt mit einem integrierten Ansatz, der Antibiotika, α-Rezeptorblocker und nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente ^4,5,6 umfasst. Die Hauptprobleme sind das Fehlen ätiologiespezifischer Therapien und das komplexe Zusammenspiel zwischen psychologischen Faktoren und körperlichen Symptomen, die zusammen zu unbefriedigenden Behandlungsergebnissen und häufigen Rückfällen beitragen⁷. In den letzten Jahren wurden integrative medizinische Ansätze wie Akupunktur und Kräutermedizin weit verbreitet bei der Behandlung von Prostatitis eingesetzt und haben vielversprechende Wirksamkeit gezeigt. Die Sicherheit und Wirksamkeit dieser therapeutischen Ansätze wurden durch eine Reihe hochwertiger Forschungsbelege belegt: 8,9,10,11,12.

In diesem Zusammenhang bieten traditionelle Formulierungen der chinesischen Medizin (TCM) wie Ermiao-Pulver (EMP), bekannt für ihre entzündungshemmenden und entgiftenden Eigenschaften, einen vielversprechenden alternativen therapeutischen Ansatz 13,14,15. Die genauen pharmakologischen Mechanismen, die der Wirksamkeit von EMP gegen Prostatitis zugrunde liegen, sind jedoch weiterhin unvollständig aufgeklärt, hauptsächlich aufgrund seiner mehrkomponentenigen Natur. Das Aufkommen der Netzwerkpharmakologie bietet ein mächtiges Werkzeug zur Entschlüsselung des komplexen "Multi-Komponenten-, Multi-Ziel-, Multi-Pathways"-Wirkmechanismus der TCM-Formeln^16,17. Unsere Strategie bestand darin, die aktiven Komponenten des EMP und seine potenziellen Ziele zu identifizieren, gefolgt von Netzwerkanalysen, um Schlüsselziele und -wege zu identifizieren. Nachfolgende Experimente wurden durchgeführt, um die entzündungshemmenden Wirkungen und Kernmechanismen biologisch zu validieren, mit dem Ziel, eine wissenschaftliche Grundlage für die Anwendung von EMP zu schaffen. Diese Studie führt einen kombinierten Netzwerk-Pharmakologie-experimentellen Validierungsrahmen ein, der die mechanistische Interpretation von Mehrkomponententherapien verbessert

Protokoll

Für diese Studie war keine ethische Genehmigung erforderlich, da sie weder menschliche Teilnehmer noch klinische Proben umfasste. Alle Verfahren mit Zelllinien wurden gemäß institutionellen Biosicherheitsrichtlinien und -vorschriften durchgeführt. Die in dieser Studie verwendete Prostataepithelzelllinie stammt von einem zertifizierten kommerziellen Lieferanten.

HINWEIS: Alle in dieser Studie verwendeten Reagenzien, Instrumente und Software sind in der Materialtabelle aufgeführt. Das Flussdiagramm dieser Studie ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Screening der Wirkstoffe

1. Zugriff auf die TCMSP-Datenbank.
2. Wählen Sie im Suchfeld "Kräutername" aus, geben Sie "Huangbo" ein und klicken Sie auf "Suchen".
3. Klicken Sie auf den "OB"-Filter, setzen Sie "≥30" und wenden Sie es an.
4. Klicken Sie auf den "DL"-Filter, setzen Sie "≥0.18" und wenden Sie es an.
5. Kopieren Sie die gefilterten Ergebnisse in eine Excel-Tabelle.
6. Wenden Sie dieselbe Screening-Methode an, um die Wirkstoffe von "Cangzhu" zu erhalten.
7. Entfernen Sie die doppelten aktiven Inhaltsstoffe, indem Sie alle Datensätze in Microsoft Excel (Version 2019) importieren und die Zusammensetzungslisten im Excel-Format zusammenführen.
8. Entfernen Sie doppelte Wirkstoffe durch Standardisierung von Verbindungsnamen und identische Einträge. Wenn mehrere Unterlagen demselben Komplex entsprachen, blieb nur ein repräsentativer Eintrag erhalten.
9. Stellen Sie Verbindungen zwischen "Huangbo", "Cangzhu" und Wirkstoffen her.

2. Erziele die Ziele, die den Wirkstoffen entsprechen

1. Zugriff auf die TCMSP-Datenbank.
2. Wählen Sie im Suchfeld "Chemischer Name", geben Sie die Wirkstoffe ein und klicken Sie auf "Suchen".
3. Kopieren Sie den Target-Namen, der zu jedem Wirkstoff gehört.
4. Entfernen Sie doppelte Target-Namen und stellen Sie Assoziationen zwischen Wirkstoffen und Target-Namen her.
5. Greifen Sie auf die UniProt-Datenbank (https://www.uniprot.org/)¹⁸ zu, rufen Sie die offiziellen Gensymbole für jeden Zielnamen ab und ersetzen Sie sie systematisch.

3. Erfassung von Krankheitszielen

1. Zugriff auf die GeneCards-Datenbank (https://www.genecards.org)¹⁹.
2. Geben Sie im Suchfeld "Prostatitis" ein und drücken Sie das Suchsymbol, um die entsprechende Genliste zu erhalten.
3. Sortiere die Gene in absteigender Reihenfolge nach Relevanzpunkt.
4. Exportiere die relevanten Gene im Excel-Format.
5. Ziele mit einem Score ≥1 wurden als prostatitisbezogene Ziele ausgewählt.

4. Vorbereitung auf den Aufbau eines Regulierungsnetzwerks für Wirkstoffwirkstoffe, Zielkrankheiten

1. Bestimmen Sie die Schnittmenge zwischen den Zielen der Wirkstoffe und den prostatitisbezogenen Zielen und definieren Sie dies als Ziele von EMP zur Behandlung der Prostatitis.
2. Stellen Sie den Zusammenhang zwischen den Wirkstoffen und therapeutischen Zielen von EMP für Prostatitis her.
3. Erstellen Sie eine Excel-Datei namens "Netzwerk" mit den ersten drei Spalten namens "Node1", "Node2" und "Net".
4. Füge die Assoziationen zwischen EMP und dem Medikament in die Spalten "Node1" und "Node2" ein, während du "drug" in die Spalte "Net" für alle Zeilen eingibst.
5. Füge die Assoziationen mit wirkstoffaktiven Inhaltsstoffen in die Spalten "Node1" und "TNode2" ein, während du "Ingredient" in der Spalte "Net" für alle Zeilen eingibst.
6. Befüllen Sie die Spalten "Knoten1" und "Knoten2" mit den Wirkstoff-Ziel-Assoziationen für Ziele von EMP zur Behandlung der Prostatitis, wobei "Ziel" in der Spalte "Netz" eingetragen wird.
7. Fügen Sie die therapeutischen Ziele von EMP für Prostatitis in die Spalte "Node1" ein, geben Sie "Prostatitis" in der Spalte "Node2" und "Krankheit" in der Spalte "Net" für alle Zeilen ein.
8. Speichere die Excel-Datei "Network" als Datei im txt-Format.
9. Erstellen Sie eine Excel-Datei namens "Typ" mit den ersten beiden Spalten namens "Node" und "Type".
10. Füllen Sie die Spalte "Knoten" mit "EMP" aus, wobei "Formel" in der Spalte "Typ" eingetragen wird.
11. Geben Sie "Huangbo" und "Cangzhu" in die Spalte "Node" ein; Geben Sie "Arzneimittel" in die Spalte "Typ" für alle Zeilen ein.
12. Geben Sie die aktiven Inhaltsstoffe in die Spalte "Knoten" ein, während Sie "Zutat" in die Spalte "Typ" für alle entsprechenden Zeilen eingeben.
13. Füllen Sie die Spalte "Knoten" mit den therapeutischen Zielen von EMP bei Prostatitis aus, wobei "Ziel" in der Spalte "Typ" eingetragen wird.
14. Geben Sie die prostatitisbezogenen Ziele in die Spalte "Knoten" ein, während Sie "Krankheit" in der Spalte "Typ" für alle entsprechenden Zeilen eingeben.
15. Speichere die Excel-Datei "Typ" als Datei im .txt-Format.

5. Visualisierung des regulatorischen Netzwerks "Drug-Active Wirkstoff-Ziel-Krankheit" durch Cytoscape

1. Starte Cytoscape.
2. Gehe zu "Datei > Netzwerk aus >dem Dateisystem importieren" und öffne die Datei "network.txt".
3. Öffnen Sie das "Stil"-Panel. Wählen Sie "Form", wählen Sie "Typ" aus dem Dropdown-Menü "Spalte" und setzen Sie "Mapping-Typ" auf "Diskrete Zuordnung".
4. Weisen Sie den folgenden Kategorien unterschiedliche Knotenformen zu: Formel, Medikament, Inhaltsstoff, Ziel, Krankheit.
5. Wählen Sie "Füllfarbe", wählen Sie "Typ" aus dem Dropdown-Menü "Spalte" und setzen Sie "Mapping-Typ" auf "Diskrete Zuordnung".
6. Weisen Sie den folgenden Kategorien unterschiedliche Knotenfarben zu: Formel, Medikament, Inhaltsstoff, Ziel, Krankheit.
7. Wählen Sie "Höhe" und "Breite", wählen Sie "Typ" aus dem Dropdown-Menü "Spalte" und setzen Sie "Mapping-Typ" auf "Diskrete Kartierung".
8. Weisen Sie den folgenden Kategorien unterschiedliche Knotengrößen zu: Formel, Medikament, Zutat, Ziel, Krankheit.
9. Wählen Sie "Label-Schriftgröße", wählen Sie "Typ" aus dem Dropdown-Menü "Spalte" und setzen Sie "Mapping-Typ" auf "Diskrete Zuordnung".
10. Weisen Sie den folgenden Kategorien unterschiedliche Schriftgrößen zu: Formel, Medikament, Zutat, Ziel, Krankheit.
11. Positioniere die Knoten manuell, um das Netzwerklayout zu optimieren.
12. Gehe zu "Datei > Exportiere > Netzwerkabbild in Datei" und speichere das Netzwerk als Abbild.

6. Analyse und Visualisierung von PPI-Netzwerken

1. Greifen Sie https://cn.string-db.org/ auf und gehen Sie zum Modul "Multiple Proteins".
2. Geben Sie die Zielgenliste im Suchfeld ein, wählen Sie "Homo sapiens" als Organismus aus und klicken Sie auf "Suchen".
3. Nachdem die Ergebnisse geladen sind, klicken Sie auf "Fortsetzen".
4. Öffnen Sie das Panel "Einstellungen", setzen Sie den "minimal erforderlichen Interaktionsscore" auf "hohe Konfidenz (0,700)" und aktivieren Sie das Zeichen "Versteckende getrennte Knoten im Netzwerk".
5. Klicken Sie auf "Update" und exportieren Sie die PPI-Assoziationsdaten im TSV-Format über das Menü "Export".
6. Starte Cytoscape, öffne das Dateimenü und wähle "Netzwerk vom Dateisystem importieren", um deine TSV-Datei zu öffnen.
7. Navigiere zum Menü "Tools" und wähle dann "NetworkAnalyzer > Network Analysis > Network Interpretation > Behandle das Netzwerk als ungerichtet".
8. Navigiere zum Menü "Datei", wähle das System "Tabelle in die Datei exportieren" und exportiere die Netzwerkdaten.
9. Navigiere zum Panel "Stil" und konfiguriere die Attribute "Form", "Füllfarbe", "Höhe" und "Breite".
10. Passen Sie das PPI-Netzwerklayout an, indem Sie die Knoten neu positionieren.
11. Gehen Sie zum Menü "Datei", wählen Sie "Netzwerkabbild in Datei exportieren" und exportieren Sie das visualisierte Netzwerk als Abbild.
12. Öffnen Sie die exportierten PPI-Netzwerkdaten mit WPS und sortieren Sie sie absteigend nach der Spalte "Degree".
13. Wählen Sie die Top 20 sortierten Ziele aus, erstellen Sie ein Balkendiagramm und speichern Sie das Diagramm als Bild.

7. KEGG-Signalweganreicherungsanalyse

1. Öffnen Sie ein Terminal oder eine Eingabeaufforderung, tippen Sie R und drücken Sie Enter.
2. In der R-Konsole führen Sie die folgenden Befehle nacheinander aus:
   install.packages(c("RSQLite", "colorspace", "stringi", "BiocManager"))
   BiocManager::install(c("org. Hs.eg.db", "DOSE", "clusterProfiler", "pathview"))
3. Konvertiere die Gen-Symbole der Ziele von EMP zur Behandlung von Prostatitis in Entrez-IDs mit org. Hs.eg.db.
4. Lesen Sie die Entrez-IDs und führen Sie eine KEGG-Anreicherungsanalyse mit dem clusterProfiler-Paket durch, mit den Parametern: organism = "has", pvalueCutoff = 0,05, qvalueCutoff = 0,05.
5. Nachdem menschliche Krankheits- und stoffwechselbezogene Signalwege aus den erhaltenen KEGG-Anreicherungsergebnissen entfernt wurden, sortieren Sie die übrigen Signalwege nach der Anzahl der angereicherten Gene.
6. Stellen Sie die Verbindung zwischen den 15 besten Signalwegen und den Zielen her.
7. Bereite eine zweispaltige Datei mit den Assoziationen "Pathway" und "Target" vor und importiere sie dann über "File > Import > Network from File" in Cytoscape.
8. Stellen Sie Knotenformen und -farben ein, um Wege von Zielen mit dem "Stil"-Panel zu unterscheiden.
9. Passe das Layout manuell an und exportiere das Netzwerk als Image.

8. Pharmazeutische Zubereitung

HINWEIS: Die Formulierung des EMP besteht aus 15 g Phellodendri Chinensis Cortex (Huangbo) und 15 g Atractylodis Rhizoma (Cangzhu). Die Wasserextraktions- und Alkoholfällungsmethode wurde verwendet, um den Extrakt für nachfolgende zellbasierte Experimente^{zu gewinnen 20}.

1. Tauchen Sie das Medikament 1 Stunde lang in eine zehnfache Wassermasse ein.
2. Dekokt 1 Stunde lang und dann durch Mull filtern, um den Abkok zu erhalten.
3. Fügen Sie dem Medikament erneut eine zehnfache Masse Wasser hinzu, dekokten Sie 30 Minuten lang und filtern Sie durch Gaze, um den Abzug zu erhalten.
4. Gib dem Medikament erneut eine zehnfache Masse Wasser hinzu, dekokte 30 Minuten lang und filtere durch Gaze, um den Abzug zu erhalten.
5. Kombinieren Sie die drei gefilterten Decoctions und filtern Sie die Mischung dann durch Filterpapier.
6. Konzentrieren Sie den Skok unter reduziertem Druck auf 10 % seines ursprünglichen Volumens.
7. Das Konzentrat abkühlen, langsam Ethanol auf 75 % unter Rühren hinzufügen, anschließend versiegeln und 12 Stunden bei 4 °C lagern.
8. Zentrifugiere die Mischung und sammle das Supernatantum.
9. Fahren Sie mit der Destillation unter reduziertem Druck fort.
10. Zum Schluss wird das Produkt mit einem Vakuum-Gefriertrockner getönt.
    HINWEIS: Das lyophilisierte Pulver kann bei –20ºC bis zu 3 Monate gelagert werden, was als sicherer Pausenpunkt dient. Um fortzufahren, rekonstituieren Sie das Pulver bei Bedarf in einem geeigneten Lösungsmittel.

9. Zellauftauen und -kultur

HINWEIS: Die gekauften Zellen wurden auf Trockeneis ins Labor geliefert. Vor Beginn des Experiments wurde Keratinozytenserumfreies Medium (K-SFM) im Voraus hergestellt, indem es mit humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (rEGF) auf eine Endkonzentration von 5 ng/mL, Rinder-Hypophysenextrakt auf eine Endkonzentration von 50 μg/mL und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt wurde.

1. Aktiviere das Wasserbad und stelle die Temperatur auf 37 °C ein.
2. Entferne die Zellen aus dem Trockeneis und rühre sie sofort im Wasserbad, bis sie vollständig aufgetaut sind.
3. Fügen Sie den Zellen 5 ml K-SFM hinzu. Sanft rühren und dann die Mischung zentrifugieren (4 °C, 500 × g, 5 min).
4. Entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet wieder in vollständigem K-SFM.
5. Übertragen Sie die Zellen in eine T-25-Flasche und setzen Sie sie in einen Zellkultur-Inkubator.
   HINWEIS: Die Umweltparameter des Zellkulturinkubators wurden bei 37 °C, 5 % CO₂ und ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit gehalten.

10. Zellsubkultivierung

HINWEIS: Die Subkultivierung erfolgte, wenn die Zellen 80–90 % Konfluenz erreichten, mit einem Subkultur-Verhältnis von 1:2 zu 1:3.

1. Aspirieren Sie den Kulturmedium-Supernatant, gefolgt von zwei Zellwäschen mit PBS ohne Calcium und Magnesium.
2. Geben Sie 2 ml Trypsin-EDTA ein und lassen Sie die Zellen 3 Minuten für die enzymatische Dissoziation einwirken.
   VORSICHT: Dieses Protokoll beinhaltet den Einsatz gefährlicher Reagenzien, darunter Lipopolysaccharid (LPS), Chloroform, Ethanol und Trizol-Reagenzien. Alle Verfahren, die gefährliche Chemikalien betreffen, sollten mit einer zertifizierten chemischen Abzugshaube durchgeführt werden, während geeignete persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz) getragen wird. Biologische Materialien sollten gemäß institutionellen Biosicherheitsrichtlinien behandelt werden.
3. Fügen Sie K-SFM-Medium hinzu, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum, um die Verdauung zu beenden.
4. Übertragen Sie das Zellgemisch in ein 15-mL-Zentrifugenrohr, zentrifugieren (4 °C, 500 × g, 5 min) und entfernen Sie das Supernatant.
5. Das Zellpellet wurde in vollständigem K-SFM resuspendiert und anschließend in neue Kulturkolben überführt.

11. Bestimmung der maximalen Konzentration der Arzneimittelbehandlung mittels MTS-Test

HINWEIS: Jede Arzneimittelkonzentration wurde mit 5 technischen Replikaten getestet.

1. Ververdauung von RWPE-1-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase.
2. Die Zellen in einem vollständigen K-SFM-Medium wieder suspendieren und dann die Zellkonzentration durch Zählen bestimmen.
3. Stellen Sie die Zellsuspension mit einem vollständigen K-SFM-Medium auf eine Dichte von 1 × 10⁵ Zellen/mL ein.
4. Geben Sie die Zellsuspension in eine 96-Well-Platte mit 100 μL pro Bohrloch ein.
5. Die 96-Well-Platte wurde in einen Zellkultur-Inkubator zur Kultivierung gebracht.
6. Nach 24 Stunden, sobald die Zellen vollständig hafteten, wurde das Kulturmedium aspiriert und entsorgt.
7. Ersetzen Sie das Medium durch ein vollständiges K-SFM-Medium mit unterschiedlichen EMP-Konzentrationen.
8. Setze die Platte für weitere 24 Stunden Inkubation zurück in den Zellkultur-Inkubator.
9. Aspirieren Sie das Medium und spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
10. Fügen Sie jedem Brunnen 100 μL vollständiges K-SFM-Medium hinzu und inkubieren Sie die Platte dann weitere 4 Stunden im Zellkulturinkubator.
11. Geben Sie 10 μL MTS-Lösung in jedes Bohrloch und bestimmen Sie den OD bei 490 nm nach einer 1-stündigen Inkubation.
12. Anhand der Blank-Kontrollgruppe (Zellen, die in vollständigem Medium ohne LPS-Stimulation oder medikamentöse Behandlung kultiviert wurden) als Ausgangspunkt wurde die Zellproliferation unter jeder Behandlungskonzentration berechnet.
    HINWEIS: Die höchste Konzentration, die keinen signifikanten Einfluss auf die Zellproliferation zeigt, wurde als Hochdosisbehandlung definiert, gefolgt von der halben Konzentration als mitteldosierter Behandlung und einem Viertel als niedrigdosierter Behandlung.

12. Zelluläre Intervention

1. Ververdauung von RWPE-1-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase.
2. Die Zellen wurden in einem vollständigen K-SFM-Medium neu suspendiert, und die Zellkonzentration wurde durch Zellzählung bestimmt.
3. Die Zellsuspension wurde auf eine Dichte von 5 × 10⁵ Zellen/mL unter Verwendung eines vollständigen K-SFM-Mediums eingestellt.
4. Die Zellsuspension wurde in eine 6-Well-Platte mit jeweils 2 mL pro Bohrloch eingesät.
5. Die Platte wurde in einen Kulturinkubator gelegt und 12 Stunden inkubiert, um eine Zelladhäsion zu ermöglichen.
6. Die Zellen wurden mit niedrigen (150 μg/mL), mittleren (300 μg/mL) bzw. hohen EMP-Konzentrationen (600 μg/mL) behandelt.
7. Nach 1 Stunde wurde 10 μg/mL LPS-Lösung in das Kulturmedium gegeben.
8. Nach 24 Stunden Behandlung wurde das Supernatant für ELISA entnommen und die Zellen für die RT-PCR-Analyse entnommen.
   HINWEIS: LPS wurde ausgewählt, um eine entzündliche Reaktion auszulösen, da es gut etabliert ist, pro-inflammatoriske Signalwege in Prostataepithelzellen zu aktivieren; die Konzentration (10 μg/mL) wurde auf Basis früherer Studien gewählt, die eine robuste Zytokin-Induktion zeigten.

13. Isolierung der Gesamt-RNA

HINWEIS: Um RNA-Abbau zu verhindern, wurden während des gesamten experimentellen Verfahrens Handschuhe und Masken getragen, und RNase-freie Pipettenspitzen sowie Zentrifugenröhren wurden verwendet.

1. Nach dem Eingriff spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
2. Gib den Zellen 1 ml Trizol-Reagenz zu und mischen Sie es wiederholt mit einer Pipette zur Homogenisierung.
   VORSICHT: Führen Sie alle Verfahren mit einer chemischen Abzugshaube unter Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durch.
3. Transferiere das Lysat in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr und lasse es 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Anschließend werden 0,2 ml Chloroform hinzugefügt und die Probe kräftig vorversetzt.
5. Nachdem Sie sie 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C.
6. Nach der Zentrifugation wird die obere farblose wässrige Phase vorsichtig in ein frisches Mikrozentrifugenrohr übertragen.
7. Geben Sie ein gleiches Volumen vorgekühltes Isopropanol dazu, mischen Sie gründlich und inkubieren Sie dann 10 Minuten bei Raumtemperatur.
8. Zentrifugieren Sie die Probe erneut (4 °C, 10.000 × g, 10 min), entsorgen Sie anschließend die Flüssigkeitsphase und behalten Sie den Niederschlag.
9. Spülen Sie das Pellet mit 1 ml vorgekühltem 75%igen Ethanol ab und lassen Sie es vorsichtig durch Pipettieren wieder suspendieren.
10. Führen Sie eine abschließende Zentrifugation bei 4 °C und 7.500 × g für 10 Minuten durch, entfernen Sie dann den Überstand und lassen Sie das RNA-Pellet in einem Biosicherheitsschrank an der Luft trocknen.
11. Lösen Sie die gereinigte RNA in 50 μL DEPC-behandeltem Wasser.
12. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration, das A260/A280-Verhältnis und das A260/A230-Verhältnis mit einem NanoDrop-Spektrophotometer, um die RNA-Reinheit zu bewerten und eine minimale Kontamination von Proteinen und Lösungsmitteln vor nachgelagerten Analysen sicherzustellen.

14. RT-PCR

1. Verwenden Sie 1 μg Gesamt-RNA, um ein 20 μL Reverse-Transkriptionsreaktionssystem herzustellen.
2. Das Reaktionssystem 15 Minuten bei 42 °C inkubieren, gefolgt von 5 Minuten 95 °C und dann auf 4 °C abkühlen.
3. Verdünne die resultierende cDNA zehnfach mit destilliertem Wasser.
4. Bereiten Sie ein 20 μL PCR-Reaktionssystem mit der verdünnten cDNA vor.
5. Programmieren Sie den Thermozyklus und stellen Sie einen Anfangshalt auf 95 °C für 60 Sekunden, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 15 Sekunden und 60 °C für 60 Sekunden.
6. Führen Sie eine Analyse der Schmelzkurve durch und notieren Sie nach Abschluss die CT-Werte für alle Zielgene und Referenzgene.
7. Verwenden Sie die 2^(-ΔΔCT)- Methode, um die normalisierten Expressionsniveaus der Zielgene zu bestimmen.

15. ELISA-Test

HINWEIS: Holen Sie das ELISA-Set aus dem Lager und lassen Sie es vor der Nutzung 30 Minuten bei Raumtemperatur ausgleichen.

1. Bereite die Standardlösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und führe geeignete Verdünnungen für Standards, biotinylierte Antikörper, Enzymkonjugate und Waschpuffer durch.
2. Zentrifugieren Sie das gesammelte Zellkultur-Supernatant (4 °C, 10.000 × g, 10 min) und sammeln Sie das Supernatant.
3. Übertragen Sie 100 μL der Standardverdünnungen und Testproben in die vorbeschichteten Bohrungen.
4. Versiegeln Sie die Brunnen mit einem Klebestreifen und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C 90 Minuten lang.
5. Entsorge die Flüssigkeit aus den Brunnen und wasche die Platte mit einer automatischen Plattenwäsche.
   HINWEIS: Stellen Sie die automatischen Waschmaschinenparameter ein: 350 μL Waschpuffer pro Brunnen, 15 Sekunden Einweichzeit zwischen Dosierung und Aspiration, 5 komplette Zyklen.
6. Geben Sie 100 μL biotinylierte Antikörper-Arbeitslösung in jeden Brunnen. Lassen Sie 60 Minuten bei 37 °C inkubieren.
7. Verwerfen Sie die Lösung und waschen Sie die Platte wie in 15.5 beschrieben.
8. Pipette pro Bohrmulde 100 μL enzymkonjugierte Arbeitslösung und inkubiere dann bei 37 °C für 60 Minuten.
9. Verwerfen Sie die Lösung und waschen Sie die Platte wie in 15.5 beschrieben.
10. Zu jedem Brunnen werden 100 μL chromogenes Substrat hinzugefügt. Halten Sie die Temperatur 15 Minuten bei 37 °C und schützen Sie sich vor Licht.
11. Pipette 100 μL Stop-Lösung pro Mulde und dann vorsichtig mischen.
12. Messen Sie sofort die optische Dichte (OD) bei 450 nm.
13. Stellen Sie eine Standardkurve fest, indem Sie die mittleren OD-Werte mit den Standardkonzentrationen mit der Software Curve Expert darstellen.
14. Die Konzentration jeder Probe wird durch Interpolation aus der Standardkurve unter Verwendung ihres OD-Werts bestimmt.

16. Statistische Analyse

1. Betrieb der SPSS-Software (Version 20.0).
2. Importiere den Datensatz in SPSS Statistics und definiere die Variablen entsprechend. Nutzen Sie Analyze > Descriptive Statistics> Explore, um den Mittelwert und die Standardabweichung (SD) zu berechnen.
3. Verwenden Sie Analyze > Compare Means > One-Way ANOVA für Vergleiche mehrerer Gruppen.
4. Beziehen Sie p-Werte direkt aus den Testausgabetabellen und melden Sie sie entsprechend.
5. Alle Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD präsentiert und statistisch signifikante Unterschiede berücksichtigt, wenn p < 0,05 liegt.

Ergebnisse

Identifikation aktiver Verbindungen und Zielvorhersage

Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit unserer integrierten Netzwerkpharmakologie und unseres in-vitro-Ansatzes zur Identifizierung und Validierung der therapeutischen Ziele von EMP bei Prostatitis. Eine Suche in der TCMSP-Datenbank identifizierte 46 bioaktive Komponenten aus den Bestandteilen der EMP-Kräuter, was 178 potenziellen Zielen entspricht. Aus der Genecards-Datenbank wu...

Diskussion

Dieses Protokoll integriert Netzwerkpharmakologie mit experimenteller Validierung, um einen systematischen Rahmen für die Untersuchung von multikomponenten therapeutischen Mechanismen zu schaffen. Kritische Schritte umfassen eine genaue Überprüfung aktiver Verbindungen unter Verwendung definierter Schwellenwerte (OB ≥ 30 %, DL ≥ 0,18), zuverlässige Netzwerkkonstruktion und geeignete Auswahl experimenteller Validierungsmodelle. Eine sorgfältige Parameterauswahl in bioinformatischen Analys...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Menschliches IL-6 ELISA KIT	4Abio	CHE0009
Menschliches TNF-Α ELISA KIT	4Abio	CHE0019
K-SFM-Ergänzungen	Procell	CM-0200
Lipopolysaccharide	Solarbio	L8880
MTS	Promega	G1111
Reverse-Transkriptionssystem	Promega	A3500
RWPE-1	Procell	CL-0200	RRID:CVCL_EQ24
RWPE-1 Zell-Komplettmedium	Procell	CM-0200
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	Toyobo	QPK-201
Trizolreagenz	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	15596026
Trypsin-EDTA	Gibco (Thermofischer)	25200072