Methodenartikel

Ein-Schritt-überlappende PCR zur schnellen Synthese von Single-Guide RNA-DNA-Vorlagen für das CRISPR-System

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DOI:

10.3791/70369

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24. April 2026

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1Institute of Cytology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, 2Translational Medicine Institute, the First People's Hospital of Chenzhou, Hengyang Medical School, University of South China, 3National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention & Ministry of Education Key Lab of Rare Pediatric Diseases, Institute of Cell Biology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine einstufige überlappende PCR-Methode mit vier Primern ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Erzeugung von DNA-Vorlagen für die in-vitro sgRNA-Transkription. Ein optimiertes Primer-Verhältnis (50:5:1:50) erzeugt hochwertige sgRNAs innerhalb von 5 Stunden, wobei die funktionelle Validierung durch In-vitro-Assays und Editieraktivitäten in HEK293T Zellen nachgewiesen wird.

Zusammenfassung

Das CRISPR–Cas-System hat die Genom-Editierung revolutioniert; konventionelle Methoden zur Erzeugung von Single-Guide-RNA (sgRNA) beinhalten jedoch oft zeitaufwändige Klonschritte oder teure kommerzielle Synthesekits. Eine optimierte, einstufige überlappende PCR-Strategie wird für die schnelle und kosteneffiziente Synthese von DNA-Vorlagen für die in vitro sgRNA-Transkription vorgestellt. Mit vier teilweise überlappenden Primern, die den T7-Promotor, die zielspezifische Führungssequenz und das sgRNA-Gerüst umfassen, werden vollwertige Vorlagen in einer einzigen PCR-Reaktion ohne Klonen zusammengesetzt. Systematische experimentelle Optimierung etablierte ein optimales Primer-Verhältnis (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50), minimierte unspezifische Nebenprodukte und maximierte die vollständige Produktausbeute, wie durch Agarosegel-Elektrophorese bestätigt. Dieser Ansatz wurde erfolgreich erweitert, um Vorlagen für Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) sgRNA zu erstellen, was eine systemübergreifende Anwendbarkeit über Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) hinaus demonstriert. Obwohl die direkte chemische Synthese von sgRNAs Vorteile wie hohe Reinheit, chemische Modifikationen zur Verbesserung der Stabilität und reduzierte Off-Target-Effekte bietet, bleibt sie für Hochdurchsatzanwendungen oder groß angelegte Screens, die zahlreiche sgRNAs benötigen, unerschwinglich teuer. In vitro Spaltungstests zeigten, dass mit dieser Methode erzeugte Guide-RNAs Editiereffizienzen erreichen, die mit denen durch konventionelles plasmidbasiertes Klonen vergleichbar sind. Darüber hinaus führten Ribonukleoproteinkomplexe, die mit diesen sgRNAs zusammengesetzt und per Elektroporation in HEK293T Zellen eingeliefert wurden, zu einer nachweisbaren Indelbildung am Ziellokus, was die Funktionalität in vivo bestätigt. Kostenanalysen zeigen, dass diese Methode die Template-Vorbereitungskosten im Vergleich zu kommerziellen Synthesekits erheblich senkt und die Bearbeitungszeit von Tagen auf Stunden reduziert und so einen zugänglichen und skalierbaren Ansatz für Labore bietet, die genetische Forschung betreiben.

Einleitung

Das CRISPR–Cas-System, abgeleitet von einem adaptiven Immunsystem in Bakterien und Archaeen, hat die Gentechnik revolutioniert, indem es präzise Genom-Editierung über verschiedene Organismen ermöglicht 1,2. Eine Schlüsselkomponente ist die Single-Guide-RNA (sgRNA), eine chimäre RNA, die Cas-Nukleasen zu spezifischen genomischen Loci leitet; ihr modulares Design ermöglicht eine Retargeting durch Modifikation einer etwa 20-nukleotidstarken Protospacer-Sequenz3. Neben SpCas9 wurden weitere Cas-Nukleasen mit unterschiedlichen Eigenschaften weit verbreitet übernommen. Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) ist kleiner, was die Lieferung von adenoassoziierten Virusen (AAV) erleichtert und dadurch die Abgabeoptionen erweitert4. Jedes System benötigt spezifische Leit-RNA-Architekturen, was eine vielseitige Synthesemethode sehr wünschenswert macht3.

Traditionelle Methoden zur Erzeugung funktioneller Guide-RNAs umfassen plasmidbasiertes Klonieren, kommerzielle sgRNA-Synthesekits oder direkte kommerzielle Synthese von sgRNAs 5,6. Plasmidbasierte Klonierung erfordert mehrere arbeitsintensive Schritte – Restriktionsverdauung, Ligation, Transformation und Koloniescreening – und dauert typischerweise über 48 Stunden 2,4,6. Kommerzielle sgRNA-Kits bieten zwar einen optimierten Arbeitsablauf (<5 Stunden), bleiben für Hochdurchsatzanwendungen jedoch unerschwinglich teuer und kosten typischerweise 35–45 $ pro Reaktion. Die direkte chemische Synthese von sgRNAs bietet Vorteile wie hohe Reinheit, chemische Modifikationen zur Verbesserung der Stabilität und reduzierte Off-Target-Effekte7; allerdings ist es für Hochdurchsatzanwendungen oder großflächige Screens, die Hunderte von SG-RNAs erfordern, unerschwinglich teuer (typischerweise 200–280 US-Dollar pro SG-RNA).

Im Gegensatz dazu schließt die hier beschriebene einstufige überlappende PCR-Methode die Template-Synthese in weniger als 5 Stunden mit Standardprimern zu Kosten von etwa 5–8 $ pro sgRNA ab, was eine erhebliche Reduzierung sowohl der Zeit als auch der Materialkosten darstellt. Darüber hinaus erreichen die durch diese Methode erzeugten sgRNAs Editiereffizienzen, die mit denen durch plasmidbasiertes Klonen vergleichbar sind, wie durch in vitro Spaltungstests bestätigt wird. Ein Vergleich dieser Ansätze ist in Abbildung 1 dargestellt.

Overlap Extension PCR (OE-PCR) bietet eine schnelle, ligaseunabhängige Strategie zur Assemblierung von DNA-Fragmenten8. Dieser Ansatz wurde für die Synthese von sgRNA-Templates unter Verwendung überlappender Primer angepasst. In einer Ein-Schritt-Reaktion mit vier teilweise überlappenden Primern findet eine kompetitive Bindung statt: Die äußeren Primer (AF1 und Tracr-R) definieren die Amplifikationsgrenzen, während die inneren Primer (AF2 und AF3) verdünnt werden müssen, um eine geordnete Ausdehnung von beiden Enden zum Zentrum zu gewährleisten. Trotz dieses theoretischen Rahmens wurde ein entscheidender Parameter, der die Montageeffizienz beeinflusst – das optimale Primer-Verhältnis – nicht systematisch untersucht. Darüber hinaus bleibt die breitere Anwendbarkeit solcher OE-PCR-Methoden auf verschiedene CRISPR-Systeme unerforscht.

Um diese Einschränkungen zu beheben, wurde eine Studie entwickelt, um eine einstufige überlappende PCR-Methode für die Synthese von sgRNA-Templates zu optimieren und zu validieren. Das optimale Primer-Verhältnis wurde durch ein strukturiertes experimentelles Design festgelegt, bei dem Agarose-Gel-Elektrophorese verwendet wurde, um Bedingungen zu identifizieren, die ein einziges, korrekt dimensioniertes Produkt ergaben. Nach der Optimierung wurde die Vielseitigkeit der Methode auf zwei weit verbreiteten CRISPR-Systemen (SpCas9 und saCas9) bewertet, wobei beide Vorlagen erfolgreich amplifiert wurden. Funktionelle Validierung mit in vitro Spaltungstests zeigte, dass mit dieser Methode erzeugte sgRNAs Effizienzen erzielen, die mit denen durch plasmidbasiertes Klonen vergleichbar sind.

Um die Funktionalität im zellulären Kontext weiter zu bewerten, wurde SpCas9-sgRNA mit dem Cas9-Protein komplexisiert, um Ribonukleoprotein-(RNP)-Komplexe zu bilden und per Elektroporation in HEK293T Zellen abgegeben. Die Genom-Editierung an einem endogenen Locus wurde mit einem T7-Endonuklease-I (T7EI)-Test untersucht, wobei Spaltmuster auf Agarose-Gelen auf nachweisbare Indel-Bildung in vivo hinweisen. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass diese Methode zuverlässig hochwertige, funktionale sgRNA-Vorlagen erzeugt. Das folgende Protokoll beschreibt das detaillierte Verfahren unter Verwendung von SpCas9 als repräsentatives Beispiel, wobei Primer-Vorlagen zur Anpassung an andere Cas-Nukleasen bereitgestellt werden.

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Protokoll

Die Verwendung der kommerziell erhältlichen HEK293T-Zelllinie (ATCC CRL-3216) erfolgte gemäß den Richtlinien des Ethischen Komitees des First People's Hospital of Chenzhou City, University of South China, für die Verwendung menschlicher Zelllinien. Die verwendeten Reagenzien, Software und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Design von sgRNA-Zielsequenzen

  1. Identifizieren Sie die Zielgenomregion mit etablierten Online-Tools (z. B. CRISPRscan, CHOPCHOP oder Broad Institute CRISPick)3.
  2. Greifen Sie auf den CHOPCHOP-Webserver unter https://chopchop.cbu.uib.no/ 3,9 zu.
  3. Geben Sie die Zielgeninformationen ein und wählen Sie das passende CRISPR/Cas-System aus (z. B. EGFR für CRISPR/Cas9) (Abbildung 2A).
  4. Überprüfen Sie die Ausgabetabelle, einschließlich Rang, Zielsequenz, genomischer Lage, Strang, GC-Gehalt (%), Selbstkomplementarität, vorhergesagten Off-Target-Standorten (MM0, MM1, MM2, MM3) und Effizienzscore (Abbildung 2B).
  5. Wählen Sie eine Guide-RNA-Sequenz mit hoher On-Target-Effizienz und geringer vorhergesagter Off-Target-Aktivität.
  6. Zeichnen Sie die endgültige sgRNA-Zielsequenz für das Primerdesign auf (z. B. EGFR-Zielsequenz: "CTTAATTCCTTGATAGCGACGG") (Abbildung 2B).

2. Synthese und Vorbereitung von vier sich überlappenden Primern

  1. Entwerfen Sie vier Oligonukleotidprimer (AF1, AF2, AF3, Tracr-R) mit sich überlappenden Regionen wie folgt (Abbildung 3A):
    AF1: 5′–TTCTAATACGACTCACTATAG
    [Ziel-Seq] GTTTTAGAGCTAGAAATAG–3′
    AF2: 5′–GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT
    TAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC–3′
    AF3: 5′–GGCTAGTCCGTTATCAACTTG
    AAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT–3′
    Tracr-R: 5′–AAAAAAAGCACCGACTCGTGCCAC–3′
    HINWEIS: Ersetzen Sie [Zielseq] im AF1-Primer durch die Sequenz, die in Schritt 1.6 erhalten wurde.
  2. Primer auf einer 25-nmol-Skala mit Standard-Entsalzreinigung synthetisieren.
  3. Trocknete Primer in nukleasefreiem Wasser auf eine Lagerkonzentration von 100 μm resuspendieren. Zentrifugiere bei 5000 × g für 1 Minute bei Raumtemperatur.

3. Optimierung der Primerkonzentration und einstufiges überlappendes PCR für die Synthese von sgRNA-Templates

  1. Bereite Primer-Mischungen mit unterschiedlichen AF2- und AF3-Konzentrationen gemäß Tabelle 1 vor. Halte AF1 und Tracr-R bei 10 μM.
  2. Bereite PCR-Reaktionen in 0,2 mL nukleasefreien Röhren gemäß Tabelle 2 vor. Verwenden Sie eine hochpräzise DNA-Polymerase.
  3. Rühren Sie vorsichtig fünfmal durch Pipetten. Nicht vortexieren. Zentrifugieren Sie bei 5000 × g für 1 Minute.
  4. Führen Sie eine PCR unter Verwendung der in Tabelle 3 beschriebenen Zyklusbedingungen durch.

4. Elektrophorese und Rückgewinnung von DNA-Vorlagen

  1. Bereiten Sie ein 2%-Agarose-Gel vor, indem Sie 2 g Agarose in 100 ml 1× TAE-Puffer auflösen. Kühlen Sie auf 50–60 °C ab, fügen Sie 5 μL Nukleinsäurefärbung hinzu und gießen Sie das Gel.
  2. Lass das Gel bei Zimmertemperatur 30 Minuten fest werden.
  3. Lade ein 10 μL PCR-Produkt gemischt mit 2 μL 6× Ladepuffer. Fügen Sie eine 100 bp DNA-Leiter hinzu.
  4. Elektrophorese bei 100 V für 30–40 Minuten laufen lassen.
  5. Visualisieren Sie unter UV-Beleuchtung. Bestätigen Sie, dass Zustand 9 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50) ein einzelnes ~120 bp-Band erzeugt (Abbildung 4A).
  6. Verwenden Sie optimierte Primer-Konzentrationen: AF1 10 μM, AF2 1 μM, AF3 0,2 μM, Tracr-R 10 μM.
  7. Entfernen Sie das Zielband mit einem sterilen Skalpell. Begrenzen Sie die UV-Exposition auf ≤30 Sekunden.
    HINWEIS: Gelscheiben bis zu einer Woche bei −20 °C aufbewahren oder sofort fortfahren.

5. Reinigung von DNA-Vorlagen

  1. Reinigen Sie DNA mit einem Gel-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers10.
  2. Elute DNA in 20–30 μL vorgewärmtem (60 °C) nukleasefreiem Wasser.
  3. Messung der DNA-Konzentration. Typische Ausbeute: 15–50 ng/μL; A260/A280: 1,8–2,0.
    HINWEIS: Lagern Sie gereinigte DNA bis zu 1 Jahr bei −20 °C.

6. In-vitro-Transkription und Reinigung von sgRNA

  1. Assembleren Sie die Transkriptionsreaktion mit einem T7-RNA-Synthesekit (Tabelle 4). Bereiten Sie auf Eis11 vor.
    HINWEIS: Verwenden Sie RNase-freie Materialien und dekontaminieren Sie alle Oberflächen.
  2. Inkubiere bei 37 °C für 16 Stunden.
  3. Fügen Sie 1 μL DNase I hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 °C.
  4. Reinigen Sie sgRNA mit einem RNA-Reinigungskit12.
  5. Elutieren in 30–50 μL nukleasefreiem Wasser.
  6. Quantifizieren Sie sgRNA. Erwarteter Ertrag: 700–900 ng/μL; A260/A280: 1,9–2,1.
    HINWEIS: Lagere sgRNA bei −80 °C bis zu einem Jahr lang.

7. In-vitro-Spaltungstest zur Überprüfung der sgRNA-Aktivität

  1. Bereite die Ziel-DNA vor und reinige sie. Stelle die Konzentration auf 60 ng/μL13 an.
  2. Die Spaltungsreaktion (Tabelle 5) zusammensetzen – ohne DNA bei 25 °C für 30 Minuten vorinkubieren. Eine Negativkontrolle einfügen.
  3. Fügen Sie 1 μL Ziel-DNA hinzu.
  4. Inkubieren Sie bei 37 °C für 2 Stunden.
  5. Fügen Sie 4 μL 6× Ladepuffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
  6. Verwenden Sie die Produkte mit einem 2%igen Agarosegel bei 100 V für 30–40 Minuten.
  7. Visualisieren Sie unter UV-Licht. Bestätigen Sie die Spaltung (z. B. 617 bp → 414 bp + 203 bp) (Abbildung 4C).

8. Zelluläre Validierung der sgRNA-gesteuerten Cas9-Editierung

  1. Bereite den Ribonukleoprotein-(RNP)-Komplex vor, indem du Cas9-Protein und sgRNA im molaren Verhältnis von 1:2 mischst. Mixe 10 μL Cas9 (4 mg/mL), 280 μL sgRNA (60 ng/μL) und 200 μL DMEM. Inkubiere 15 Minuten.
  2. Kultur HEK293T Zellen auf ~80 % Konfluenz. Entnehmen und auf 3 × 10 bis6 Zellen pro Probe anpassen.
  3. Kombinieren Sie den RNP-Komplex mit den Zellen und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur.
  4. Auf eine 2-mm-Elektroporationscuvette übertragen. Elektroporat bei 115 V, 4 ms, einem Impuls (575 V/cm). Sofort 10 mL vollständiges Medium hinzufügen und auf eine 6-Well-Platte übertragen.
  5. Inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO2für 48 Stunden.
  6. Genomische DNA aus behandelten und Kontrollzellen extrahieren. Konzentration messen.
    HINWEIS: Lagern Sie DNA bis zu 6 Monate bei −20 °C.
  7. Verstärkung des Ziellokus durch PCR (Tabelle 6 und Tabelle 7).
    HINWEIS: Erwartete Produktgröße: 617 Basispunkte für EGFR.
  8. Verifiziere PCR-Produkte mit einem 2%igen Agarosegel. Reinigen Sie das richtige Band und quantifizieren Sie DNA.
  9. Führen Sie eine Heteroduplexbildung durch (Tabelle 8 und Tabelle 9).
  10. 1 μL T7 Endonuklease I hinzufügen und 15 Minuten bei 37 °C inkubieren. 10 Minuten bei 85 °C inaktivieren.
  11. Gib einen Loading Buffer hinzu und lasse es mit einem 2%igen Agarose-Gel laufen.
  12. Visualisieren Sie unter UV-Licht. Indel-Bildung bestätigen (617 bp → 414 bp + 203 bp) (Abbildung 4D).

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Ergebnisse

Die erfolgreiche Anwendung des einstufigen überlappenden PCR-Protokolls erzeugt bei Analyse durch Agarosegel-Elektrophorese ein einzelnes, scharfes DNA-Band der erwarteten Größe.

Suboptimale Primer-Verhältnisse, insbesondere solche mit übermäßigen Konzentrationen innerer Primer (AF2 und AF3), führen zu zusätzlichen Bändern, die größer sind als das erwartete Produkt, was auf eine unspezifische Amplifikation oder Primer-Dimer-Bildung hinweist, zusammen mit schwa...

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Diskussion

Ein stromlinienförmiges, wirtschaftliches Protokoll zur Synthese von sgRNA-DNA-Vorlagen mittels einer einstufigen überlappenden PCR-Strategie wird beschrieben. Diese Methode eliminiert die Notwendigkeit von Plasmidkonstruktion und Klonierung und reduziert die Vorbereitungszeit der Vorlagen von mehreren Tagen auf etwa 5 Stunden. Ein zentraler Aspekt dieses Ansatzes ist die systematische Optimierung des Primer-Verhältnisses, das auf 50:5:1:50 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R) bestimmt wird, e...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Gesundheitsforschungsprojekt der Provinzgesundheitskommission der Provinz Hunan (Fördernummer W20243264), die Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Hunan (Fördernummer 2023JJ50368), das Schlüsselforschungsprojekt des Bildungsministeriums der Provinz Hunan (Fördernummer 24A0607) sowie das Innovative Team Project des First People's Hospital of Chenzhou (Fördernummer CX202103) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 bp DNA LadderTIANGENMD109DNA-Größenmarker für Elektrophorese
2Taq Plus MasterMixCWBIOCW2849MPCR-Amplifikationsreagenz
50 bp DNA LadderTIANGENMD108DNA-Größenmarker für kleine Fragmente
6DNA loading bufferTIANGEN1109565Proben-Ladepuffer für Elektrophorese
Agarose Gel DNA Recovery KitTIANGENDP219DNA-Reinigung von Agarose-Gel
Agarose I Thermo Scientific 17850Agarose-Gel-Vorbereitung
Broad Institute CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/publicsgRNA-Design-Tool
CentrifugeHENGNUO2-16RProbenzentrifugation
Certified Copper Fetal Bovine SerumUmedium, Beijing BioTopped Technology Co., Ltd3023AZellkultur-Zusatz
CH3CO2HShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA758682TAE-Pufferlösungs-Präparationsreagenzien
CHOPCHOPhttps://chopchop.cbu.uib.no/sgRNA-Design-Tool
CO2 incubatorThermo Scientific51032874Inkubation von Säugerzellen
CRISPRscanhttps://www.crisprscan.org/sgRNA-Design-Tool
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)KeyGEN BioTECHKGL1211-500Zellkulturmedium
dsDNaseThermo Scientific EN0771Entfernung der DNA-Vorlage nach der Transkription
ECM 830 Square Wave Electroporation SystemBTXECM830Elektroporation von Zellen
EDTA Na2BioSharpBS108TAE-Pufferlösungs-Präparationsreagenzien
Electric thermostatic water bathSHANGHAI SUMSUNG LABORATORY INSTRUMENT CO.,LTDDKD8Temperaturgesteuerte Inkubation
Electrophoresis Apparatus TrophoresisLIUYIDYCP-31BNAgarose-Gel-Elektrophorese
Gel Imaging analysis systemShanghHai JiaPengZF-258Gel-Visualisierung und -Imaging
GenCRISPR SpCas9GenScriptZ03624-GMP-2.5Cas9-Nuklease für Genome Editing
Genomic DNA extraction kitTIANGENYDP304Genomische DNA-Isolierung
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNEBE2040SIn-vitro-Transkription von sgRNA
MiniAmp ThermocyclerThermo Scientific A37834PCR-Amplifikation
NanoDrop 2000c SpectrophotometerThermo Scientific 2000cNukleinensäure-Quantifizierung
Nucleic acid stain (e.g., GeneRed)TIANGENRT211DNA-Visualisierung in Agarose-Gel
PCR Using Q5 Quick-Load High-Fidelity 2X Master MixNEBM0578Hochtreue PCR-Amplifikation
Primers (AF1, AF2, AF3, Tracr-R)GenScriptOligonucleotide für sgRNA-Vorlagen-Zusammenbau
Tris-baseBioSharpBS083TAE-Pufferlösungs-Präparationsreagenzien
VAHTS RNA Clean BeadsVAHTSN412-01RNA-Reinigung

Referenzen

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Schlagwörter

DNA TemplatsyntheseIn vitro TranskriptionPrimer OptimierungAgarose GelelektrophoreseRibonukleoprotein KomplexElektroporationGenomeditierung

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