Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Einzelzellenisolierung aus koronarem Endarteriektomiegewebe bei Patienten mit koronarem Bypass-Transplantat

686 Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/70382

⸱

3. April 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biotechnology, Gujarat Biotechnology University, 2U. N. Mehta Institute of Cardiology and Research Centre

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Koronare Endarteriektomie-Gewebeproben wurden mit einem optimierten Dissoziationsprotokoll untersucht, um einzelne Kerne zu isolieren. Die Integrität der isolierten Kerne wurde durch drei komplementäre Ansätze validiert: Trypan-blaue Ausschlussfärbung zur Bewertung der Membranintegrität, DAPI-basierte konfokale Mikroskopie zur Bestätigung der Kernmorphologie und Durchflusszytometrie zur Quantifizierung von Kernausbeute und Reinheit.

Zusammenfassung

Atherosklerose ist eine chronische, fortschreitende entzündliche Erkrankung, die durch die Ansammlung von Plaque in den Arterienwänden gekennzeichnet ist. Während des Fortschreitens der Plaquebildung werden bestimmte Läsionen instabil, die als Hochrisikoplaques bezeichnet werden, und haben das Potenzial, einen Myokardinfarkt (MI) zu verursachen. Eine atherosklerotische Plaque besteht aus glatten Muskelzellen, Endothelzellen, Immunzellen, Fettzellen und nekrotischen Zellen, von denen jede eine Plaque-Ruptur verursachen kann. Es ist entscheidend, die zelluläre Heterogenität in atherosklerotischen Plaques zu untersuchen, um die Mechanismen der Plaqueinstabilität besser zu verstehen. Wir präsentieren ein leicht reproduzierbares Protokoll zur Isolierung und Validierung von Kernen aus humanem koronaren Endarteriektomiegewebe, das von Patienten erhalten wird, die sich einer koronaren Bypass-Operation (CABG) unterziehen. Alle Gewebe werden auf Nasseis im Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium aufbewahrt, um die zelluläre Integrität vor der Ernte zu erhalten. Die Gewebeproben werden fein gehackt und dann vorsichtig mit einem Mikrostößel im Lysepuffer zerstört, um Zellen zu lysieren und Kerne freizusetzen. Die isolierten Kerne werden anschließend mit dem Trypan-Blue-Ausschlusstest in einem invertierten Verbindungsmikroskop auf Integrität und Ertragsausbeute geprüft. Die DAPI-Färbung ermöglicht die Visualisierung intakter Kerne mittels Konfokalmikroskopie, und die Durchflusszytometrie bietet fluoreszenzbasierte Quantifizierung, um die Kernisolationsausbeute zu bewerten und die Kernpopulation zu validieren. Im Gegensatz zu traditionellen Methoden der Isolierung durch Einzelzell-Dissoziation reduziert die nukleare Isolation den zellulären Stress und erhält die native transkriptomische Umgebung aufrecht, wodurch Veränderungen in der Genexpression verhindert werden. Die mit dieser Methode gewonnene hochwertige Kernpräparation ist mit nachgelagerten Anwendungen wie der Single-Nuclei-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) kompatibel.

Einleitung

Atherosklerotische Herz-Kreislauf-Erkrankung (ASCVD) ist die weltweit führende Todes- und Behinderungsursache und trotz großer therapeutischer Fortschritte bleibt ihre Belastung unvermindert1. Atherosklerose ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Arterienwand, die durch komplexe und dynamische Interaktionen zwischen verschiedenen Zellpopulationen ausgelöst wird, die gemeinsam den stillen Übergang von früher subklinischer Erkrankung zu lebensverändernden kardiovaskulären (CV-)Ereignissen orchestrieren2.

In mittleren und großen Arterien ist die Ansammlung von Cholesterinablagerungen in den Makrophagen ein Kennzeichen der Arteriosklerose3. Der atherosklerotische Plaque besteht aus Fettsäuren, Cholesterin, Entzündungszellen, Kalzium, Fibrin, glatten Muskelzellen, Endothelzellen und Zellresten im Subendothel4. Atherosklerotische Plaques werden in zwei Typen eingeteilt: niedriges Risiko und Hochrisiko. Hochrisikoplaques werden durch ihre Tendenz erkannt, ein nachfolgendes kardiovaskuläres Ereignis auszulösen, typischerweise durch Mechanismen wie Plaqueerosion oder Ruptur5.

Zu den Eigenschaften von Hochrisikoplaques gehören große Lipidkerne, mehrere entzündliche Zellen, weniger glatte Muskelzellen, eine dünne faserige Kappe, Mikrokalkbildung, Intraplaque-Blutung, Neo-Gefäße und ein nekrotischerKern 6. Der Nachweis von Hochrisikoplaques erfolgt klinisch mit nicht-invasiven und invasiven Bildgebungsverfahren, nämlich der koronar-Computertomographie-Angiographie (CCTA) und der optischen Kohärenztomographie (OCT) 7,8. Trotz zahlreicher Fortschritte in der kardiovaskulären Bildgebung ist es weiterhin schwierig, den Riss der atherosklerotischen Plaque, die Myokardinfarkt (MI) verursacht, vorherzusagen, und sie ist in klinischen Situationen nicht immer nützlich9.

Trotz jahrzehntelanger Forschung fehlen uns weiterhin zuverlässige zirkulierende Biomarker, die speziell Hochrisikoplaque-Phänotypen identifizieren können, was eine kritische Lücke in unserer klinischen Behandlung der Arteriosklerose hinterlässt. Dies unterstreicht die Notwendigkeit molekularer Strategien, die diese Plaques auf einer grundlegenderen biologischen Ebenecharakterisieren können 7,10. In diesem Zusammenhang haben RNA-basierte Marker erhebliche Aufmerksamkeit erregt, da sie die komplexe transkriptionelle Aktivität innerhalb der Plaque-Mikroumgebung11 erfassen können. Jüngste Entwicklungen in der Single-Cell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) haben sich als besonders wirkungsvoll erwiesen und bieten eine beispiellose Auflösung, um einzelne Zellen in atherosklerotischen Plaques zu profilieren und unterschiedliche Zellpopulationen, Genexpressionsmuster und molekulare Wege aufzudecken, die der Plaque-Anfälligkeit zugrunde liegen12,13. Trotz dieser Entwicklungen gibt es wenig Wissen über die regulatorischen Prozesse, Interaktionen und die funktionelle Bedeutung der verschiedenen Zelltypen, die ander Entwicklung der Atherosklerose beteiligt sind.

Wenn die atherosklerotische Belastung schwer und diffus ist, wird die chirurgische Revaskularisation zur maßgeblichen Behandlungsstrategie. Die koronare Endarteriektomie (CE) ist eine chirurgische Ergänzung zur Koronararterie-Bypass-Operation (CABG), bei der der atherosklerotische Plaque mechanisch aus diffus kranken Koronararterien entfernt wird, um eine Bypass-Transplantation zu ermöglichen und eine vollständige myokardiale Revaskularisationzu erreichen. Atherosklerotische Plaques und Endarterektomie-Proben sind besonders schwierig zu bearbeiten, da sie reichlich nekrotisches Gewebe, Lipidablagerungen, Fibrin und Verkalkungen enthalten. Wenn diese Gewebe zur Analyse zerlegt werden, entstehen erhebliche Ablagerungen, die Filter und Mikrofluidiksysteme verstopfen, was die Isolierung lebensfähiger Einzelzellen äußerst erschwert17,18. Tatsächlich ergab eine Studie zur Karotisplaque, dass lebensfähige Zellen nach der Gewebeverarbeitung weniger als 1 % aller Partikel ausmachten; der Rest bestand einfach aus Plaque-Trümmern18.

Diese Herausforderung wird zusätzlich erschwert, dass atherosklerotische Plaques sich in einem Zustand chronischen metabolischen und oxidativen Stresses befinden, wobei Zellen, die Apoptose, Alterung und andere degenerative Prozesse durchlaufen, Zellmembranen zunehmend fragil und anfällig für Störungen machen, was die Isolierung lebensfähiger Einzelzellen äußerst schwierig macht 18,19,20. Die mechanische und enzymatische Verdauung, die zur Vorbereitung von Proben für scRNA-seq erforderlich ist, schädigt oft diese bereits geschwächten Zellen, was die Lebensfähigkeit weiter verringert und zu schlechten Zellfangraten führt. Dieser Prozess führt außerdem dazu, selektiv fragile oder seltene Zellpopulationen zu verlieren, was sowohl in den transkriptomischen Daten als auch bei den im Endergebnis dargestellten Zelltypen zu erheblichen Verzerrungen führt. Dieses Problem wird noch ausgeprägter bei verkalkten oder stark kranken Plaques, wo die harten Verarbeitungsbedingungen zum Abbau des Gewebes zusätzlichen Schaden an der Zelllebensfähigkeit verursachen 18,21,22.

Im Gegensatz dazu bleibt der Kern auch unter diesen widrigen Bedingungen strukturell intakt23. Dies liegt hauptsächlich an der Kernhülle, einer doppelten Lipiddoppelschicht, verstärkt durch Kernlamine (Lamin A/C und Lamin B), die mechanische Steifigkeit und Widerstand gegen osmotische, enzymatische und physikalische Spannungen bietet, die die Plasmamembranleicht stören. Die Kernlamina bewahrt auch die Kernmorphologie, selbst wenn das umgebende Zytoplasma stark beeinträchtigt ist26. Dies macht die Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) zu einer praktischeren und zuverlässigeren Alternative zur Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) zur Profilierung von atherosklerotischem Gewebe27. Durch die Erfassung von transkriptionellen Informationen aus intakten Kernen statt ganzer Zellen umgeht snRNA-seq die Einschränkungen durch schlechte Zelllebensfähigkeit und hohen Abfallgehalt und ermöglicht so eine genauere und umfassendere transkriptomische Profilierung der Plaque-Mikroumgebung18.

Daher präsentieren wir in dieser Studie ein optimiertes Kernisolationsprotokoll, das speziell für das Gewebe der koronaren Endarteriektomie entwickelt wurde, das nicht-ionische detergentbasierte Lyse und empirisch angepasste Lysedauer basierend auf dem Grad der Gewebeverkalkung einbezieht, um konsistent hochwertige Kerne mit erhaltener struktureller und RNA-Integrität zu erhalten, die für nachgelagerte snRNA-seq-Analysen geeignet sind.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Die vorliegende Studie wurde mit Genehmigung und gemäß den Richtlinien des Human Ethical Committee des U. N. Mehta Institute of Cardiology and Research Centre (EC/Approval/26/Cardio/14/12/2024) und der Gujarat Biotechnology University (GBU_IHEC/2023/006) durchgeführt. Vor der Probenentnahme wurde von allen Teilnehmern eine informierte Zustimmung eingeholt. Die Patienten, die sich einer Bypass-Operation der Koronararterie mit koronarer Endarteriektomie unterziehen, wurden für die aktuelle Studie ausgewählt. Nach der chirurgischen Entfernung wurde das Endarterektomiegewebe sofort in ein serumfreies RPMI-Medium gebracht, bei 4 °C gehalten und innerhalb von etwa 12 Stunden in einem Kryovial ins Labor transportiert. Siehe die Materialtabelle für Details zu allen im folgenden Protokoll verwendeten Materialien.

1. Kernisolierung

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte auf Eis durch und verwenden Sie sterile Materialien. Alle Puffer frisch vorbereiten.

  1. Waschen Sie das Gewebe ein- oder zweimal mit serumfreiem RPMI-Medium, um Blutflecken und -fragmente zu entfernen. Mit steriler Pinzette überträgt man das Gewebe auf eine sterile Petrischale und zeichnet das Gewicht auf.
  2. Mit einer chirurgischen Klinge (Nr. 10) wird das Gewebe in kleine Stücke von ∼1 mm3 Größe gehackt.
  3. Bereiten Sie einen 1 mL Lysepuffer vor, indem Sie 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 (mit Standardlösungen von 1 M pro Komponente), 0,1 % (v/v) Nonidet P-40 in nukleasefreiem Wasser kombinieren. Fügen Sie die Komponenten nacheinander in folgender Reihenfolge hinzu: zuerst nukleasefreies Wasser, dann Tris-HCl, NaCl, MgCl₂ und zuletzt NP-40, um Schäumbildung zu vermeiden.
    HINWEIS: Der Lysis-Puffer sollte am Tag der Anwendung frisch vorbereitet und jederzeit auf Eis gekühlt gehalten werden. Nicht einfrieren.
  4. Fügen Sie dem Gewebe in einem 5-mL Mikrozentrifugenröhrchen einen gekühlten 1-mL-Lysepuffer hinzu.
  5. Lyse das Gewebe auf Eis mit einem Mikrostößel, indem du eine sanfte, gleichmäßige Kraft anwendest und den Mikrostößel abwechselnd im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn wirbelst. Setzen Sie die Lyse etwa 30 Minuten fort und sorgen Sie dafür, dass die Probe während der gesamten Zeit kalt bleibt.
    HINWEIS: Lyse das Gewebe, bis es trüb wird. Verwende eine 1000 μL Spitze, um sanft durch Pipette zu mischen.
  6. Filtern Sie die Lösung mit einem 100 μm porengroßen Sieb in ein 15-mL Zentrifugenrohr, um Ablagerungen und Gewebestücke zu entfernen.
    HINWEIS: Das Filtrat sollte weniger trüb erscheinen und sichtbare Ablagerungen am Sieb erhalten.
  7. Zentrifugiere die Kerne bei 500 x g für 5 Minuten bei 4 °C mit einem schwenkbaren Eimerrotor.
    HINWEIS: Am Boden des Rohrs sollte sich eine sichtbare Kugel bilden.
  8. Entfernen Sie das Überdachungsmittel mit einer Pipettenspitze mit normaler Bohrung, ohne das Pellet zu stören.
  9. Bereiten Sie den Kernspül- und Resuspensionspuffer vor, indem Sie 1 % Rinderserumalbumin (BSA) (mit 10 % Lagerlösung), 0,2 U/μL RNase-Inhibitor (unter Verwendung von 20 U/μL Lagerlösung) in 1X Dulbeccos Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (DPBS) kombinieren. Fügen Sie die Komponenten nacheinander in folgender Reihenfolge hinzu: zuerst DPBS, dann BSA und schließlich RNase-Inhibitor.
    HINWEIS: Der Puffer sollte am Tag der Anwendung frisch vorbereitet und jederzeit auf Eis gekühlt gehalten werden. Nicht einfrieren.
  10. Das Pellet in einer Nuclei-Wasch- und Resuspensionspuffer wieder aufhängen. Kühlen Sie den Puffer vor der Verwendung auf Eis.
  11. Bewerten Sie die Lyseeffizienz und Zelllebensfähigkeit durch Färbung mit 5 μL Trypanblau und Zählung in einem Hämozytometer.
    HINWEIS: Wenn noch lebensfähige Zellen vorhanden sind, zentrifugiere mit 500 x g für 5 Minuten bei 4 °C und wiederhole dann die Abschnitte 3–10.
  12. Filtern Sie die Lösung mit einem 30 μm porengroßen Sieb in ein 15-mL Zentrifugenrohr, um Schmutz und Klumpen zu entfernen.
  13. Zentrifugiere die Kerne bei 500 x g für 5 Minuten bei 4 °C mit einem schwenkbaren Eimerrotor.
  14. Entfernen Sie das Überdachungsmittel mit einer Pipettenspitze mit normalem Bohrrohr und suspendieren Sie das Pellet anschließend in 1 ml Nuclei-Wash und Resuspensionspuffer.

2. Charakterisierung isolierter Kerne

  1. Trypan-Blaufärbung zur Beurteilung der Integrität von Kernen.
    1. Nehmen Sie 15 μL der isolierten Kernsuspension in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenrohr.
    2. Füge 5 μL Trypan-Blau-Farbstoff (0,4 % W/V) hinzu und vermische vorsichtig durch Pipetten.
    3. Inkubiere bei Zimmertemperatur für 5 Minuten, um eine richtige Färbung zu ermöglichen.
    4. Laden Sie 10 μL der gefärbten Mischung auf ein Hämozytometer.
    5. Beobachten Sie unter einem invertierten Verbindungsmikroskop, um die Morphologie zu untersuchen und die Anzahl der Kerne zu zählen.
  2. Durchflusszytometrie-Analyse der Suspension von einzelnen Kernen
    1. Nehmen Sie 1 ml isolierte Kernsuspension und zentrifugieren Sie die Kernsuspension bei 500 x g für 5 Minuten bei 4 °C mit einem Schwenkschaufel-Rotor.
    2. Entfernen Sie das Überstandsmittel mit einer Pipettenspitze mit normalem Bohrrohr und setzen Sie das Pellet in einem 200 μL FACS-Puffer (1x PBS und 1 % BSA) wieder auf.
    3. Teilen Sie 200 μL resuspendierter Kerne in zwei Aliquoten: 100 μL als ungefärbte Kontrolle und 100 μL als gefärbte Probe verwenden.
    4. Fügen Sie der gefärbten Probe 1 μL 4', 6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) (1 mg/mL Stock) hinzu, um eine Endkonzentration von 10 μg/mL zu erreichen. Sanft mischen und 5 Minuten bei Zimmertemperatur im Dunkeln inkubieren, bevor die Flowzytometrie durchgeführt wird.
    5. Im für diese Studie verwendeten Durchflusszytometer wird der violette Laser bei 405 nm verwendet und mit 448/45 nm detektiert. Führen Sie zuerst die unverfärbte Kontrollprobe durch und erfassen Sie mindestens 10.000 Ereignisse der Gesamtpopulation.
    6. Stellen Sie die Spannung auf 183 V für Vorwärtsstreuung (FSC), 300 V für Seitenstreuung (SSC) und 400 V für V450 (DAPI-Laser) ein. Setzen Sie die Schwelle für FSC auf 10.000.
      HINWEIS: Alle Instrumentenspannungs- und Verstärkungseinstellungen sind über alle Samples konstant, um Konsistenz zu gewährleisten.
    7. Plotten Sie die Vorwärtsstreufläche (FSC-A) gegen die Vorwärtsstreuungshöhe (FSC-H), um Singulette von Doppelstreuen und Aggregaten zu unterscheiden. Zeichnen Sie ein Gatter um Ereignisse, die eine lineare Beziehung zeigen, um nur Singlet-Kerne zu erhalten.
    8. Erstellen Sie ein bivariates Diagramm von FSC-A versus Seitenstreufläche (SSC-A). Wenden Sie ein breites Tor an, das die gesamte Streupopulation umfasst, da isolierte Kerne typischerweise ein heterogenes Streuprofil ohne unterschiedliche Subpopulationen aufweisen.
    9. Erstellen Sie ein 2D-Dichtediagramm (Pseudofarbe-)Diagramm von SSC-A versus Violet, 450 nm-Fläche (V450-A). Verwenden Sie die unverfärbte Kontrolle, um die Hintergrundfluoreszenz zu definieren und die präzise Gate-Platzierung zu steuern. Identifizieren und gaten Sie die unterschiedliche DAPI⁺-Population, die den intakten Kernen entspricht.
      HINWEIS: Da ein einzelnes Fluorochrom (DAPI) verwendet wird, ist keine Fluoreszenzkompensation erforderlich.
  3. Bildgebung der isolierten Kerne mittels Konfokalmikroskopie
    1. Nehmen Sie 50 μL Kernsuspension und fügen Sie 1 μL DAPI (1 mg/mL) zur gefärbten Probe hinzu, um eine Endkonzentration von 10 μg/mL zu erreichen, mischen Sie vorsichtig und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 5 Minuten im Dunkeln vor der konfokalen Bildgebung.
    2. Montiere 5 μL gefleckte Kernsuspension auf einen sauberen Glasschlitten und decke ihn mit einem Deckmantel ab.
      HINWEIS: Vermeiden Sie Fixierung, um die Kernmorphologie zu erhalten.
    3. Visualisieren Sie die Kerne mit einem invertierten konfokalen Mikroskop. Öffne die Konfokalmikroskop-Software und beobachte zuerst im 10-fachen Hellfeld, dann wechsel zu 40-fachem Hellfeld.
    4. Aufnehmen Sie konfokale Bilder mit einem laserabtastenden konfokalen Mikroskop, das mit einem spektralen Detektor und Objektiven ausgestattet ist, PLAN APO λD 40X (NA 0.95, RI 1.0). Erzeugen Sie DAPI mit einem 405-nm-Laser und sammeln Sie Emissionen zwischen 429 und 474 nm.
    5. Die Bildgebungsparameter waren wie folgt:
      1. Detektormodus: Mehrkanal (GaAsP)
      2. Scanner: Galvano unidirektional
      3. Scan-Modus: Band
      4. Liniendurchschnitt: 2X
      5. Auflösung: 1024 × 1024 Pixel
      6. Dwellzeit: 2,0 μs
      7. Lochgröße: 47,7 μm
      8. Laserleistung: 0,1–9,3 % (abhängig von der Feldintensität)
      9. Detektorverstärkung: 37,8–45,9 %
      10. Zoom: 1,0X
      11. Kalibrierung: 0,43–0,58 μm/Pixel
    6. Nehmen Sie alle Bilder mit der AX-Kamera mit minimalem Crosstalk-Modus unter identischen optischen Konfigurationen auf, und das perfekte Fokussystem (PFS) sollte während der Bildgebung aktiv sein, um die Z-Plane-Stabilität zu gewährleisten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Das humane koronare Endarteriektomiegewebe wurde von Patienten entnommen, die sich einer CABG-Operation unterzogen. Das Gewebe wurde gewogen und zur Kernisolierung verarbeitet, weitere isolierte Kerne wurden durch Durchflusszytometrie und Konfokalmikroskopie bestätigt (Abbildung 1).

Trypan-blaue Bewertung der Qualität der Kernisolation
Das im RPMI-Medium gehaltene Gewebe wurde gewogen und maß 247,8 mg. Das Gewebe wurde gehackt und anschließend ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Ein optimierter Arbeitsablauf zur Isolierung von Kernen aus dem humanen koronaren Endarteriektomiegewebe ist im aktuellen Protokoll beschrieben. Das hier beschriebene Nuklearisolationsprotokoll wurde speziell entwickelt, um die kritischen Einschränkungen bei der Gewinnung lebensfähiger, intakter Zellen aus fortgeschrittenen koronaren atherosklerotischen Plaques zu überwinden. Im Gegensatz zu herkömmlichen scRNA-seq-Ansätzen, die auf einer harten enzymatischen Verdauung und mechanischer D...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Indian Council of Medical Research (ICMR) (EM/Dev/SG/34/01106/2024) und in Zusammenarbeit mit dem U. N. Mehta Institute of Cardiology and Research Centre in Ahmedabad unterstützt. Khushi Jani würdigt die University Grant Commission (UGC) und den Council of Scientific and Industrial Research (CSIR) der indischen Regierung für die Vergabe der gemeinsamen CSIR-UGC NET-Qualifikation (NTA Reference No.: 241620143543).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 & mu; M-SiebMiltenyi Biotech 130-098-463
30 μ M-SiebMiltenyi Biotech 130-098-458
Rinderserum-AlbuminHiMediaTC546-25G
ZentrifugeMPWNAhttps://mpw.pl/en/offer/mpw-352r
CompoundmikroskopNikonNA Nikon Eclipse Ts2 Invertiertes Mikroskop (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2)
Konfokalmikroskop NikonNANikon Ti2-E invertiertes Konfokalmikroskop (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series)
DeckzettelHiMediaBG011C
CRYOCHIL WeitmündungsprobenfläschchenTarsons883191
DAPISigmaD9542-5MG
DPBSGibco (Thermofischer)10010-023
Zentrifugenröhre (15 mL)Tarsons546021
Durchflusszytometer BD Biosciences663029BD FACSLyric (3L12C Instrument CEIVD)
HämozytometerAxibioCCB 100
Mikrozentrifugenröhre (1,5 ml)Tarsons500010C
Mikrozentrifugenröhre (5 mL)Tarsons500050
MgCl2SigmaM1028-100ML
MikrostößelTarsons160020
NaClSigmaS9888-500G
NP-40HiMediaMB143-100ML
Nukleasefreies WasserGibco (Thermofischer)W4502-1L
RNase-InhibitorSigma333540201
RPMI 1640Gibco (Thermofischer)11875093
Slide Riviera72910135
Tris-HClSigmaT2194-100ML
Trypan blau Sigma302643-25G

Referenzen

  1. Roth, G. A., et al. Global burden of cardiovascular diseases and risk factors- 1990-2019. J. Am. Coll. Cardiol. 76 (25), 2982-3021 (2020).
  2. de Winther, M. P. J., et al. Translational opportunities of single-cell biology in atherosclerosis. Eur. Heart J. 44 (14), 1216-1230 (2023).
  3. Mohebbati, R., Momeni-Moghaddam, M. A. The role of red blood cells in cholesterol accumulation and atherosclerotic plaque instability: a perspective on atherosclerosis. Curr. Cardiol. Rev. 21 (5), (2025).
  4. Ajoolabady, A., et al. Inflammation in atherosclerosis: pathophysiology and mechanisms. Cell Death Dis. 15 (11), 817(2024).
  5. Dawson, L. P., Layland, J. High-risk coronary plaque features: a narrative review. Cardiol. Ther. 11 (3), 319-335 (2022).
  6. Tong, W., et al. Highly sensitive magnetic particle imaging of vulnerable atherosclerotic plaque with active myeloperoxidase-targeted nanoparticles. Theranostics. 12 (17), 7641-7641 (2022).
  7. Lu, G., et al. Coronary computed tomography angiography assessment of high-risk plaques in predicting acute coronary syndrome. Front. Cardiovasc. Med. 8, (2021).
  8. Kinoshita, D., et al. High-risk plaques on coronary computed tomography angiography. JACC Cardiovasc. Imaging. 17 (4), 382-391 (2024).
  9. Canu, M., et al. Non-invasive multimodality imaging of coronary vulnerable patient. Front. Cardiovasc. Med. 9, (2022).
  10. Liu, X., et al. Assessment of coronary computed tomography angiography-derived plaque features in the diagnosis of optical coherence tomography-defined vulnerable plaques. Quant. Imaging Med. Surg. 15 (3), 2029-2041 (2025).
  11. Chiorescu, R. M., et al. Vulnerable atherosclerotic plaque: is there a molecular signature. Int. J. Mol. Sci. 23 (21), 13638(2022).
  12. The applications of single-cell RNA sequencing in atherosclerotic disease. Front. Cardiovasc. Med. Slenders, L., Tessels, D. E., van der Laan, S. W., Pasterkamp, G., Mokry, M. 9, (2022).
  13. Adam, C. A., et al. Novel biomarkers of atherosclerotic vascular disease-latest insights in the research field. Int. J. Mol. Sci. 23 (9), 4998(2022).
  14. Ye, W., Chen, Z., Xia, Z., Li, D. Single-cell RNA sequencing in human atherosclerotic plaques reveals a novel smooth muscle cell subtype that possesses multi differentiation potential and shapes the microenvironment. Clin. Exp. Med. 25 (1), 251(2025).
  15. Kelly, J. J., et al. Coronary endarterectomy: analysis of the society of thoracic surgeons adult cardiac surgery database. Ann. Thorac. Surg. 114 (3), 667-674 (2022).
  16. Ghatanatti, R. Coronary endarterectomy: recent trends. J. Clin. DIAGNOSTIC Res. , (2017).
  17. Li, Y., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic cell populations and differential gene expression patterns in control and aneurysmal human aortic tissue. Circulation. 142 (14), 1374-1388 (2020).
  18. Alsaigh, T., Evans, D., Frankel, D., Torkamani, A. Decoding the transcriptome of calcified atherosclerotic plaque at single-cell resolution. Commun. Biol. 5 (1), 1084(2022).
  19. Iqbal, F., Lupieri, A., Aikawa, M., Aikawa, E. Harnessing single-cell RNA sequencing to better understand how diseased cells behave the way they do in cardiovascular disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 41 (2), 585-600 (2021).
  20. Ahmad, H., et al. Single cell RNA sequencing of haematopoietic cells in fresh and frozen human atheroma tissue. Cardiovasc. Res. 121 (3), 396-404 (2025).
  21. Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circ. Res. 127 (11), 1437-1455 (2020).
  22. Williams, J. W., et al. Single cell RNA sequencing in atherosclerosis research. Circ. Res. 126 (9), 1112-1126 (2020).
  23. Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -A., Lee, H. -O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J. Pathol. Transl. Med. 57 (1), 52-59 (2023).
  24. Gruenbaum, Y., Foisner, R. Lamins: Nuclear intermediate filament proteins with fundamental functions in nuclear mechanics and genome regulation. Annu. Rev. Biochem. 84 (1), 131-164 (2015).
  25. Zwerger, M., Ho, C. Y., Lammerding, J. Nuclear mechanics in disease. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13 (1), 397-428 (2011).
  26. Dechat, T., et al. Nuclear lamins: major factors in the structural organization and function of the nucleus and chromatin. Genes Dev. 22 (7), 832-853 (2008).
  27. Oh, J. -M., et al. Comparison of cell type distribution between single-cell and single-nucleus RNA sequencing: enrichment of adherent cell types in single-nucleus RNA sequencing. Exp. Mol. Med. 54 (12), 2128-2134 (2022).
  28. Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat. Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
  29. Gulko, A., et al. Protocol for flow cytometry-assisted single-nucleus RNA sequencing of human and mouse adipose tissue with sample multiplexing. STAR Protoc. 5 (1), 102893(2024).
  30. Fernandez, D. M., et al. Single-cell immune landscape of human atherosclerotic plaques. Nat. Med. 25 (10), 1576-1588 (2019).
  31. Galvis, A. E., Fisher, H., Camerini, D. NP-40 fractionation and nucleic acid extraction in mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (20), (2017).
  32. Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nat. Med. 25 (8), 1280-1289 (2019).
  33. Pan, H., et al. Single-cell genomics reveals a novel cell state during smooth muscle cell phenotypic switching and potential therapeutic targets for atherosclerosis in mouse and human. Circulation. 142 (21), 2060-2075 (2020).
  34. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).
  35. Litviňuková, M., et al. Cells of the adult human heart. Nature. 588 (7838), 466-472 (2020).
  36. Hu, P., et al. Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes Dev. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).
  37. Rani, U., et al. Evaluation of use of RPMI Medium to preserve cell morphology for pleural/peritoneal fluid cytology. J. Cytol. 39 (1), 26-29 (2022).
  38. Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends Cell Biol. 31 (11), 888-897 (2021).
  39. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat. Med. 26 (5), 792-802 (2020).
  40. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nat. Protoc. 11 (3), 499-524 (2016).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Atherosklerotische PlaquesProtokoll zur KernisolationDurchflusszytometrieKonfokalmikroskopieTrypanblau F rbungDAPI F rbungEinzelkern RNA Sequenzierungzellul re Heterogenit t
Einzelzellenisolierung aus koronarem Endarteriektomiegewebe bei Patienten mit koronarem Bypass-Transplantat
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.