Integrative Multi-Omics-Analyse von Buti Huatan Tang bei chronisch obstruktiver Lungenerkrankung

Zusammenfassung

Multiomics-Profilierung von Buti Huatan Tang (BTHTT) bei chronisch obstruktiver Lungenerkrankung zeigt sein Potenzial, die Stoffwechselachse des IL-1R2/IL-1β-Schilddrüsenhormons zu modulieren. Diese Arbeit bietet einen Rahmen für eine weitere mechanistische Validierung der bioaktiven Komponenten von BTHTT und legt eine Grundlage für zukünftige kausale Interventionsstudien, die notwendig sind, um diese Achse zu bestätigen.

Zusammenfassung

Diese Studie nutzte einen Multi-Omics- und Computerbiologie-Rahmen, um das therapeutische Potenzial der Formel Buti Huatan Tang (BTHTT) der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) gegen chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) zu untersuchen. Signifikante physiologische Verbesserungen wurden in einem Rattenmodell nach der BTHTT-Intervention beobachtet. Histologische Analysen zeigten eine Umkehrung der Lungenschäden, während biochemische Tests und Transkriptomiken die Normalisierung der IL-1β - und IL-1R2-Spiegel bestätigten. Zusätzlich zeigte das metabolische Profiling, dass BTHTT Störungen der T3- und T4-Schilddrüsenhormonspiegel korrigierte. Eine negative Korrelation wurde zwischen der IL-1β/IL-1R2-Achse und diesen Schilddrüsenhormonen beobachtet, was darauf hindeutet, dass ihre Regulation mit der therapeutischen Wirkung der Formel verbunden ist. Über direkte Messungen hinaus identifizierten maschinelle Lernalgorithmen zehn COPD-Signaturgene aus klinischen Datenbanken. Die Analyse der Weganreicherung legt nahe, dass BTHTT durch Zytokin-Zytokin-Rezeptor-Interaktionen und Schilddrüsenhormonsynthesewege wirken kann. Darüber hinaus wurden 283 Komponenten in vivo identifiziert, Verbindungen wie Tanshinon IIA und Cryptotanshinon gelten derzeit als Kandidaten-Wirkstoffe. Ihre Rolle als Haupttreiber wird durch ein Modell unterstützt, in dem sie stabil an IL-1R2 gebunden sind; diese Schlussfolgerung basiert auf molekularem Andocken und Molekulardynamik (MD)-Simulationen und nicht auf direkter experimenteller Isolation. Insgesamt unterstützen die Daten ein Modell, in dem BTHTT einen Multi-Ziel-Effekt auf COPD ausübt, indem es Entzündung und metabolische Homöostase moduliert. Dieser integrierte Ansatz bietet eine verfeinerte wissenschaftliche Grundlage für die klinische Anwendung von BTHTT und hebt spezifische Wege für zukünftige experimentelle Validierung hervor.

Einleitung

Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), eine der häufigsten Atemwegserkrankungen in der klinischen Praxis, ist aufgrund ihrer extrem hohen Behinderungsrate und wiederkehrender akuter Exazerbationen^weltweit zur dritthäufigsten Todesursache geworden. COPD war ein wesentlicher Faktor, der zum Verlust der Arbeitskapazität in der Bevölkerung und zu einem starken Anstieg der Kosten für Familienpflege führte, wobei soziale und wirtschaftliche Verluste die meisten chronischen Krankheiten bei weitem überstiegen². In der "Healthy China Initiative 2030" wurde COPD als Schlüsselkrankheit für Prävention und Behandlung aufgeführt. Aufgrund eines unvollständigen Verständnisses der zugrunde liegenden Mechanismen der COPD blieb die kombinierte Anwendung von Bronchodilatatoren und Kortikosteroiden die Hauptbehandlung. Obwohl dieser Ansatz eine relativ offensichtliche Linderung der Symptome ermöglichte, kann er den fortschreitenden Rückgang der Lungenfunktion nicht verhindern. Darüber hinaus erhöht die langfristige Anwendung von Kortikosteroiden zwangsläufig die Häufigkeit von Nebenwirkungen, was die langfristige Wirksamkeit der Medikamente und die Toleranz der Patienten weiter beeinträchtigt³. Studien haben gezeigt, dass selbst bei dreifacher Therapie 28–31 % der Patienten noch akute Verschlechterungen oder Verschlechterungen der Symptome erleben. Daher bleibt die Entwicklung wirksamer Medikamente gegen COPD ein zentrales und zentrales Thema in der aktuellen COPD-Forschung⁴.

Um diesen Bedürfnissen gerecht zu werden, wurden klassische TCM-Formeln wie Buti Huatan Tang (BTHTT), Shengmai Yin und Bu Fei Tang entwickelt. Unter ihnen war BTHTT besonders bemerkenswert für seine bedeutenden Effekte bei der Tonisierung der Lunge, der Energiesteigerung und der Auflösung von Schleim zur Linderung von Husten 5,6,7,8. BTHTT wurde in der klinischen Behandlung von COPD weit verbreitet eingesetzt, nicht nur wegen seiner bemerkenswerten Wirksamkeit und minimalen Nebenwirkungen, sondern auch wegen seines Potenzials, den fortschreitenden Rückgang der Lungenfunktion umzukehren. Es hatte großes Potenzial in klinischen und sozialen Kontexten und hatte das Potenzial für eine "Sekundärentwicklung" als Hauptarzneimittel mit erheblichem wissenschaftlichem und wirtschaftlichem Wert⁽9,10,11,12^). Aufgrund des Mangels an systematischer, langfristiger wissenschaftlicher Forschung leiden Studien zu BTHTT jedoch im Allgemeinen unter einem unklaren Verständnis der Komponentenbasis und unbekannter Kernziele. Grundsätzlich lag dies an erheblichen Defiziten in der Forschung zum Hauptmechanismus und der potenziellen therapeutischen Substanzgrundlage von BTHTT.

Als Reaktion auf diese Eigenschaft kann die Integration mehrerer Omics-Technologien wie Metabolomik und Transkriptomik sowie Multialgorithmus-Mining-Methoden, wobei der Fokus auf die Hauptkorrelationen zwischen charakteristischen Schlüsselgenen und wichtigen metabolischen Wegen im Mikroumfeld des Körpers 13,14,15 nicht nur das Wesen der Behandlung erforscht, sondern auch die synergetische Wirksamkeit der aktiven Komponenten bewertet. Ein besonderer Fokus liegt auf der Schilddrüsenhormon-Achse, da neue Forschungen darauf hinweisen, dass eine Schilddrüsendysfunktion eine häufige Begleiterkrankung bei COPD ist, die oft mit einer erhöhten systemischen Entzündung und einer beeinträchtigten Atemmuskulatur korreliert. Die Modulation dieser Achse könnte einen neuartigen Weg zur Wiederherstellung der metabolischen Homöostase bei Lungenerkrankungen^{darstellen 16,17}.

Zusammenfassend verfolgte diese Studie einen dreigleisigen Ansatz, der Multi-Omics-Integration mit computergestützter Biologie kombiniert, basierend auf der Prämisse von Syndrom- und Formelkorrespondenz. Einerseits nutzte es TCM-Serumpharmakochemietechniken, um die im Blut übertragenen Komponenten von BTHTT unter effektiven Bedingungen zu identifizieren. Andererseits konzentrierte es sich auf die wichtigsten charakteristischen Gene der COPD und nutzte umfassende Gewebemetabolomik, um Krankheitsbiomarker aus endogenen kleinen Molekülen zu entdecken und eine präzise Bewertung der Gesamtwirkungen der Formel zu erstellen. Gleichzeitig identifizierte es in Kombination mit Multialgorithmus-Mining und transkriptomischer Identifikationsanalyse die wichtigsten charakteristischen Gene, die unter effektiven Bedingungen von BTHTT reguliert wurden, und führte eine Korrelationsanalyse zwischen den wichtigsten charakteristischen Genen und wichtigen metabolischen Signalwegen durch. Die potenzielle therapeutische Substanzbasis wurde mittels molekularer Andockung und molekularer Dynamik untersucht.

Basierend auf unserem Multi-Omics-Rahmen und dem pharmakologischen Profil von BTHTT schlägt diese Studie folgende testbare Vorhersagen vor. Antiinflammatorische Modulation: Die BTHTT-Intervention reduziert systemische und pulmonale Entzündungsmarker signifikant, insbesondere durch die Normalisierung der IL-1β/IL-1R2-Expressionsachse zur Minderung von Gewebeschädigungen. Metabolische Wiederherstellung: BTHTT verändert die Signale im Schilddrüsenhormonsynthesewege, was zu einer messbaren Korrektur der T3/T4-Spiegel und einer anschließenden Verbesserung des Stoffwechselzustands der Lungenmikroumgebung führt. Metabolische Wiederherstellung: BTHTT verändert die Signale im Schilddrüsenhormonsynthesewege, was zu einer messbaren Korrektur der T3/T4-Spiegel und einer anschließenden Verbesserung des Stoffwechselzustands der Lungenmikroumgebung führt.

Protokoll

HINWEIS: Die Reagenzien und die in dieser Studie verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Klinische Datenerfassung und Vorverarbeitung

Um die molekularen Signaturen von COPD zu untersuchen, wurden transkriptomische Datensätze aus der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank abgerufen. Insgesamt wurden fünf Datensätze ausgewählt: GSE11784, GSE12472, GSE16972, GSE38974 und GSE222965. Die Rohdaten und Plattformannotationsdateien wurden für die Probe-zu-Gen-Kartierung heruntergeladen. Wenn mehrere Sonden ein einzelnes Gen anvisierten, wurde der maximale Expressionswert beibehalten. Die resultierenden Genexpressionsmatrizen (Zeilen als Gene, Spalten als Proben) wurden zu einem einzigen Entdeckungsdatensatz zusammengeführt. Um technische Unterschiede zwischen verschiedenen Microarray-Plattformen und Studienkohorten zu berücksichtigen, wurde die Batch-Effect-Korrektur mit dem ComBat-Algorithmus aus dem sva R-Paket durchgeführt. Die Wirksamkeit der Korrektur wurde mittels Principal Component Analysis (PCA)-Diagrammen validiert. Nach der Batch-Korrektur wurde der zusammengefasste Discovery-Datensatz für die Differentialanalyse verwendet. Differenziell exprimierte Gene (DEGs) zwischen COPD-Patienten und gesunden Kontrollpersonen wurden mit dem Limma-Paket identifiziert. Die Signifikanzschwellen wurden bei |logFC| festgelegt. ≥ 1 und p ≤ 0,05.

Um die robustesten charakteristischen Gene zu identifizieren, wurden drei unabhängige maschinelle Lernalgorithmen integriert. Um die Zuverlässigkeit der Modelle zu gewährleisten und Datenlecks zu verhindern, wurde der Feature-Auswahlprozess in die Kreuzvalidierungsschleifen verschachtelt, wo es zutrifft, und der Discovery-Datensatz wurde strikt von den unabhängigen Validierungssätzen getrennt. Das LASSO-Modell wurde auf die DEGs mit dem glmnet-Paket angewendet. Wir verwendeten eine zehnfache Kreuzvalidierung, um den optimalen Strafparameter zu bestimmen. Der optimale Strafparameterwert, der dem minimalen Kreuzvalidierungsfehler entspricht, wurde als Schwelle zur Identifizierung der Kernmerkmale-Gene ausgewählt. SVM wurde verwendet, um Gene nach ihrer Diskriminierungskraft zu bewerten. Eine zehnfache Kreuzvalidierungsstrategie wurde implementiert, um den Punkt des minimalen Generalisierungsfehlers zu identifizieren und so die optimale Anzahl charakteristischer Gene zu bestimmen. Das randomForest-Paket wurde verwendet, um DEGs basierend auf ihrer Mean Decrease Accuracy und ihrem Gini-Index zu bewerten. Gene mit den höchsten Wichtigkeitswerten wurden als krankheitsbezogene Merkmale ausgewählt.

Die Schnittmenge der von LASSO, SVM und randomForest identifizierten Merkmale wurde genutzt, um die endgültigen Kerncharakteristikagene zu definieren. Die diagnostische Leistung dieser Gene wurde mittels einer Analyse der Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve bewertet. Die Fläche unter der Kurve (AUC) und die zugehörigen 95%-Konfidenzintervalle (KI) wurden mit dem pROC-Paket berechnet. Ein Gen wurde als hochdiagnostisch wertvoll angesehen, wenn der AUC 0,70 >. Schließlich wurden die Expressionsniveaus und die diagnostische Genauigkeit dieser Gene in einem unabhängigen Validierungsset weiter validiert, um die Generalisierbarkeit der Ergebnisse sicherzustellen.

Mit PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) und drugbank (https://go.drugbank.com/) wurden insgesamt 12 spezifische Arzneimittelprofile erstellt, wie LABAs, LAMAs, SABAs, SAMAs, SAMAs, Fluticasonpropionat, Budesonid, Beclomethason, Fluticason, Salmeterol, Umeclidinium, Vilanterol, Theophyllin. Die kompilierten Ziele wurden mit der Uniprot-Datenbank (https://www.uniprot.org/) kalibriert, wobei nicht-menschliche Gene entfernt und ungültige doppelte Ziele gelöscht wurden, um standardisierte Gennamen zu erhalten. Durch Eingabe des Schlüsselworts "chronisch obstruktive Lungenerkrankung", "COPD" in den Datenbanken GeneCards (https://www.genecards.org/), OMIM (https://www.omim.org/) und DisGENET (https://www.disgenet.org/) wurden krankheitsbezogene Ziele abgerufen. Alle Ziele aus den drei Datenbanken wurden in einer Excel-Datei zusammengefasst, doppelte Gene entfernt, und die Daten wurden mit der Uniprot-Datenbank kalibriert, um die endgültigen Krankheitszielgeninformationen zu erhalten.

Entwicklung von Modellen für maschinelles Lernen

Ein multialgorithmisches maschinelles Lern-Framework wurde durch sequentielle Nutzung der R-Pakete glmnet, e1071 und randomForest erstellt. Konkret wurde die LASSO-Regression zur strafbasierten Dimensionsreduktion durchgeführt, die Support Vector Machine (SVM)-Analyse wurde verwendet, um Validierungsfehler anhand der Stichprobengruppierung zu bewerten, und Random Forest wurde verwendet, um Merkmale nach Wichtigkeitswerten zu filtern. Dieser Prozess lieferte entsprechende diagnostische Visualisierungen, einschließlich Kreuzvalidierungskurven und Genprämiet-Blasendiagrammen. Nach der Modellkonstruktion wurde eine Venn-Diagramm-Analyse an den von diesen mehreren Algorithmen identifizierten Gensets durchgeführt, um die sich überlappenden "Schnitt"-Merkmale-Gene zu extrahieren und so die Zuverlässigkeit der potenziellen Biomarker zu erhöhen. Die Expressionsmatrix dieser Schnittgene wurde dann extrahiert, um die Expressionsunterschiede zwischen den Gruppen mittels Violinplots sichtbar zu machen. Schließlich wurden ROC-Kurven durch iterative Schleifen für jedes Gen generiert, um die Fläche unter der Kurve (AUC) zu berechnen und ihren diagnostischen Wert als Kandidaten-Biomarker zu validieren.

Tiermodell-Induktion

Das experimentelle Protokoll wurde vom Tierethikkomitee der Guizhou Medical University (2303411) genehmigt und folgte den ARRIVE-Richtlinien und Tierschutzvorschriften. Insgesamt 72 männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten mit SPF-Qualität (230 ± 20 g). Nach einer Woche adaptiver Unterbringung unter Standardbedingungen (25 ± 1 °C, 50 ± 5 % Luftfeuchtigkeit, 12 Stunden Hell-Dunkel-Zyklus) wurden die Ratten zufällig in die Kontrollgruppe (C-Gruppe) (n = 24) und die Modellgruppe (M-Gruppe) (n = 48) eingeteilt.

Die M-Gruppe wurde einer Dual-Faktor-Modellierung unterzogen: Intermittierende Zigarettenrauchexposition (9 Wochen, 6 Tage pro Woche, 3 Forschungszigaretten pro Tag, aufgeteilt in 2 Sitzungen, 30 Minuten pro Sitzung) und intratracheale Instillation von LPS (200 μg pro Instillation, einmal alle zwei Wochen)^18,19. Die C-Gruppe erhielt ein äquivalentes Volumen normaler Kochsalzlösung. Nach erfolgreicher Modellierung wurden die Gruppen zufällig in die M-Gruppe (n = 12), die hochdosierte BTHTT-Gruppe (H-Gruppe) (hoch, 1× klinische Dosis, n = 12) und die niedrig-dosierte BTHTT-Gruppe (L-Gruppe) (niedrig, 1/2× klinische Dosis, n = 12) unterteilt, mit kontinuierlicher Gavage-Intervention über 2 Wochen. Die C- und M-Gruppen erhielten synchron destilliertes Wasser.

Körpergewicht und spontane Aktivität wurden wöchentlich erfasst. Am Ende der Modellierung und Behandlung wurden Lungengewebe, Serum sowie Serum- und bronchoalveoläre Spülflüssigkeit (BALF) gesammelt. Die Konzentrationen von Entzündungsmarkern (d. h. TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, OPN und MCP-1) wurden mit ELISA gemäß der Kit-Anleitung gemessen. Es wurden ebenfalls Gewebepathologie- und Multi-Omics-Analysen durchgeführt.

Behandlungsgabe

Buti Huatan Tang (BTHTT) besteht aus neun traditionellen chinesischen Heilkräutern: Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. (Astragali Radix, 15 g), Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax (Pseudostellariae radix, 15 g), Cinnamomum cassia (L.) J. Presl (Cinnamomi Cortex, 15 g), Angelica sinensis (Oliv.) Diels (Angelicae sinensis radix, 10 g), Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma, 15 g), Perilla frutescens (L.) Britt. (Perillae Folium, 10 g), Raphanus sativus L. (Raphani Semen, 10 g), Lepidium apetalum Willd. (Descurainiae Semen, 10 g) und Mahonia fortunei (Lindl.) Fedde (Mahoniae Folium, 10 g). Die Kräutermaterialien wurden 30 Minuten lang mit dem Zehnfachen ihres Gesamtgewichts in Wasser eingeweicht und anschließend 1 Stunde lang dekoktiert. Der Suk wurde gefiltert, das Filtrat gesammelt und in drei gleichmäßige Portionen für die orale Verabreichung aufgeteilt.

Basierend auf der klinischen Sicherheit und Wirksamkeit betrug die Standarddosis von BTHTT für Erwachsene gemäß den klinischen Medikationsrichtlinien 1,57 g∙^kg-1∙^Tag-1 . Unter Berücksichtigung des Dosisumrechnungsfaktors bei Ratten, der anzeigte, dass die Standarddosis für Ratten 6,3 × der menschlichen Standarddosis betrug, wurde die entsprechende H-Gruppe für Ratten auf 9,9 g∙kg-1∙Tag-1 gesetzt, und die L-Gruppe auf die Hälfte dieser Dosis (4,95 g∙^kg-1∙^Tag-1). Angesichts des endgültigen konzentrierten BTHTT-Volumens von 50 mL betrug das verabreichte Volumen für die H-Gruppe bei Ratten etwa 1,6 mL und für die L-Gruppe etwa 0,8 mL. Das Medikament wurde einmal täglich oral verabreicht.

Gewebe- und BALF-Sammlung

An den experimentellen Endpunkten (Woche 9 und Woche 11) wurden die Ratten mittels intraperitonealer Injektion von 5 % Natriumpentobarbital (1 ml/100 g) betäubt. Das Blut wurde aus der Pfortvene entnommen, bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen gelassen und dann bei 13.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Das Supernatant wurde bei -80 °C gelagert. Das Lungengewebe wurde schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert. BALF wurde durch drei aufeinanderfolgende Lavages mit kaltem PBS gesammelt.

Transkriptomik-Analyse

Die Gesamt-RNA wurde aus dem Lungengewebe extrahiert und qualitätskontrolliert mit (A₂₆₀/A₂₈₀ > 1,8) (RIN ≥ 7,0). RNA-Sequenzierungsbibliotheken wurden konstruiert: mRNA wurde mit Oligo(dT) angereichert, fragmentiert und zur Synthese von doppelsträngiger cDNA verwendet, die dann zu Adapter-Oligonukleotiden ligiert und durch PCR amplifiziert wurde. Bibliotheken wurden vor der Sequenzierung quantifiziert und qualitätsgeprüft. Einschließlich der Inspektion der Inhaltsverteilung, der Analyse der FPKM-Dichteverteilung jeder Probe sowie der Gesamtqualitätsbewertung von RNA-seq²⁰.

Roh-Transkriptomik-Daten, die von der Sequenzierungsplattform erzeugt wurden, wurden mit Perl-Skripten verarbeitet, um Adaptersequenzen und minderwertige Lesearten zu entfernen (Lesungen mit Q ≤ 25 Basen, die > 60 % oder N-Rate > 5 % ausmachen). Nach diesem Filterprozess wurden saubere Lesungen erzielt. Die sauberen Reads wurden mit HISAT2 auf das Referenzgenom ausgerichtet, und die Genexpressionswerte wurden quantifiziert, um FPKM-Werte zu berechnen. Es wurde eine differentielle Expressionsanalyse durchgeführt (mit Screeningkriterien von |log2FC| > 1 und p-adj < 0,05). Die Annotation der Transkriptionsfaktoren basierte auf Tier-TFDB- oder Pfam/DBD-Datenbanken, die Gen-IDs und Protein-Domäneninformationen²¹ übereinstimmten.

Eine orthologe Genkartierungsstrategie wurde angewandt, um methodologische Strenge für die artübergreifende Validierung sicherzustellen. Diese Strategie bestand darin, Orthologen bei Ratten für menschliche Kerngene (z. B. SRPX2, IL-1R2, TFF3) mithilfe der NCBI HomoloGene und Ensembl BioMart-Datenbanken zu gewinnen. Die Auswahl beschränkte sich auf Genpaare mit einer klaren "Eins-zu-eins"-Kartierungsbeziehung und hoher Proteinsequenzidentität. In Fällen, in denen mehrere Kandidaten anwesend waren, wurde orthologe Paare, die vom HGNC zertifiziert waren, bevorzugt. Um eine hohe Nachweisgenauigkeit zu gewährleisten, wurden spezifische RT-qPCR-Primer auf Basis der mRNA-Sequenzen der identifizierten Rattenorthologe entwickelt. Validierungskriterien wurden durch Konsistenz in der Ausdrucksrichtung und funktionale Verifikation definiert. Konsistenz in der Expressionsrichtung: In einem rauchinduzierten Ratten-COPD-Modell zeigte RT-qPCR, dass die Expressionstrends der Zielgene im Lungengewebe von Ratten vollständig mit denen in humanen GEO-klinischen Datensätzen übereinstimmten. Gene, die die gleiche Polarität des Wandels zwischen Arten aufweisen, wurden als konserviert als Krankheitsbiomarker betrachtet. Pathologische Verifikation: Nach Expressionskonsistenz wurde eine Korrelationsanalyse durchgeführt, um die Beteiligung dieser Gene an der pathologischen Evolution der COPD zu überprüfen.

Metabolomik-Workflow

Das Lungengewebe (20–50 mg) wurde in vorgekühltem Methanol-Acetonitril-Wasser (2:2:1, v/v) homogenisiert und in einem Eisbad soniziert. Das Homogenat wurde mit 13.000 × g für 20 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Der Supernatant wurde vakuumkonzentriert, in Acetonitrilwasser (1:1, v/v) wieder gelöst und durch eine 0,22-μm-Membran für LC-MS-Analyse²² gefiltert.

Die chromatographische Trennung wurde mit einer amidbasierten UPLC-Säule (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm) erreicht. Die Säulentemperatur wurde bei 25 °C gehalten. Die mobile Phase bestand aus (A) Wasser mit 25 mM Ammoniumacetat und 25 mM Ammoniak sowie (B) Acetonitril. Die Durchflussrate wurde auf 0,5 mL/min festgelegt, und das Einspritzvolumen betrug 2 μL. Das Gradienten-Elutionsprogramm war wie folgt: 0–0,5 Min, 95 % B; 0,5–7 Minuten, linearer Rückgang von B von 95 % auf 65 %; 7–8 Minuten, linearer Rückgang von B von 65 % auf 40 %; 8–9 Min, B blieb bei 40 %; 9–9,1 Min, linearer Anstieg von B von 40 % auf 95 %; 9,1–12 Min, B blieb bei 95 %. Während der gesamten Analyse wurden die Proben im Autosampler bei 4 °C aufbewahrt. Um die Systemstabilität und die Zuverlässigkeit der experimentellen Daten sicherzustellen, wurden die Proben in einer Zufallssequenz analysiert, wobei Qualitätskontrollproben (QC) in der Warteschlange eingestreut wurden. Die Massenspektrometrieanalyse wurde mit einem Ultra-High-Performance-Liquid Chromatography (UHPLC)-System durchgeführt, das mit einem Massenspektrometer gekoppelt war. Die Proben wurden mittels Elektrospray-Ionisation (ESI) sowohl im positiven als auch im negativen Ionenmodus ionisiert. ESI-Quell- und MS-Einstellungen waren wie folgt: Verneblergas (Gas 1) wurde auf 50 gesetzt, Hilfsgas (Gas 2) auf 2, Ionenquellentemperatur auf 350 °C, Sprühspannung (ISVF) auf 3.500 V im positiven Ionenmodus und 2.800 V im negativen Ionenmodus. Der Massenbereich für MS1 wurde von 70 bis 1.200 Da festgelegt, mit einer Auflösung von 60.000 und einer Scan-Akkumulationszeit von 100 ms. Für MS2 wurde eine datenabhängige Erfassung (DDA) mit gestufter Kollisionsenergie verwendet. Der Massenbereich für MS2 wurde ebenfalls von 70 bis 1.200 Da festgelegt, mit einer Auflösung von 60.000 und einer Scan-Akkumulationszeit von 100 ms. Die dynamische Ausschlusszeit wurde auf 4 Sekunden festgelegt.

Rohmetabolomik-Daten wurden in das mzXML-Format umgewandelt und anschließend für die Spitzenausrichtung, Korrektur der Speicherzeit und die Spitzenflächenextraktion verarbeitet. Der Datenvorverarbeitungs-Workflow umfasste folgende Schritte: Zunächst wurden Ionenspitzen mit einer fehlenden Rate > 50 % entfernt. Zweitens wurden die übrigen fehlenden Werte mit dem KNN-Algorithmus imputiert. Drittens wurden metabolische Merkmale mit relativer Standardabweichung (RSD) >50 % verworfen. Die Qualität der experimentellen Daten wurde mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) und Clustering von QC-Proben bewertet. Weitere Analysen umfassten Univariate Statistiken (z. B. t-Tests), multivariate Statistiken (PLS-DA), differentielle Metaboliten-Screening (VIP > 1 und p < 0,05) sowie KEGG-Signalweganreicherungsanalyse (hypergeometrischer Test)^23,24.

Etablierung analytischer Methoden für in vivo- und in vitro-Komponenten

Vorbereitung von BTHTT-Proben für In-vitro-Tests : BTHTT wurde durch Skok in Wasser extrahiert (2 x 30 min), auf 1,1–1,2 g/mL konzentriert und anschließend gefriertrocknet. Vor der Analyse wurden 600 μL der gefriergetrockneten Pulverlösung mit 400 μL Methanol gemischt, in 40 % Methanol neu gelöst und zentrifugiert, um das Supernatant zu sammeln.

Herstellung von BTHTT-Proben für die In-vivo-Tests : Das Serum wurde durch Mischen mit Methanol (1:1) deproteinisiert und bei −20 °C für 30 Minuten ausgefällt, gefolgt von Zentrifugation bei 20 Minuten. Der Supernatant wurde vakuumgetrocknet und in 40 % Methanol erneut gelöst, um die endgültige Probe zu erhalten. Für die Herstellung von Blankserum + BTHTT-Proben wurde eine angemessene Menge Blankserum mit dem in vitro BTHTT-Supernatant versetzt, und die restlichen Schritte wurden wie beschrieben durchgeführt.

Die Proben wurden mit einem UHPLC-System getrennt, das mit einer Rückphasen-UPLC-Säule (2,1 mm × 100 mm, 1,8 μm) ausgestattet war. Die Säulentemperatur wurde bei 35 °C gehalten, und die Durchflussrate wurde auf 0,3 mL/min eingestellt. Die mobile Phase bestand aus (A) 0,1 % Ameisensäure im Wasser und (B) 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril. Die Gradientenelution wurde wie in Tabelle 1 gezeigt durchgeführt.

Ein Massenspektrometer wurde für die Erfassung von MS1- und MS2-Spektren verwendet. Das Massenspektrometer war mit dem UHPLC-System gekoppelt und arbeitete sowohl im positiven als auch im negativen ESI-Modus. ESI-Parameter waren wie folgt: Sprühspannung 3.800 V (ESI+) / 3500 V (ESI-), Mantelgasdruck 45 Arb, Hilfsgasdruck 20 Arb, Ionentransferrohrtemperatur 320 °C und Verdampfertemperatur 350 °C. Der Detektionsmodus war auf voll scan-/datenabhängiges MS2 (Full-MS/dd-MS2) mit Auflösungen von 60.000 für MS1 und 15.000 für MS2 eingestellt. Die Top 10 MS1-Ionen wurden für die MS/MS-Fragmentierung mit gestuften normalisierten Kollisionsenergien von 20, 40 und 60 ausgewählt. Der Massenbereich für MS1 wurde von 90 bis 1.300 Da festgelegt.

Für die In-vivo-Analyse , einschließlich Leergruppenproben, dosierten Gruppenproben und Leergruppen + BTHTT-Proben, wurden 6 μL jeder Probe präzise injiziert. Für die In-vitro-Analyse von BTHTT wurden 2 μL der Probe injiziert. Jede Charge von Leer- und dosierten Gruppenproben wurde einmal injiziert, während die Leergruppe + BTHTT-Proben im Dreifach und die BTHTT-Proben im Fünffach injiziert wurden.

Daten im mzXML-Format wurden verarbeitet und Verbindungen anhand einer lokalen hochauflösenden kommerziellen TCM-Massenspektrometriedatenbank identifiziert. Die Identifikationskriterien wurden wie folgt festgelegt: ein Massenfehler von <25 ppm für MS1 und ein Match-Wert > 0,7 für MS2 (wobei der Wert die Ähnlichkeit der Fragmentionen widerspiegelte, wobei ≥0,7 eine zuverlässige Schwelle war)^25,26. Die statistische Analyse umfasste das Zählen und die Klassifikation von Verbindungen (z. B. Flavonoide, Alkaloide), die in Verbindung mit Annotationen aus der Massenspektrometriedatenbank²⁷ durchgeführt wurde.

Molekulare Andocken und MD-Simulation

Um potenzielle Bindungsmodi zwischen den identifizierten charakteristischen Proteinen und ihren entsprechenden Liganden zu untersuchen, wurde ein in silico molekulares Andocken durchgeführt. Die dreidimensionalen Strukturen der kleinen Moleküle wurden aus der PubChem-Datenbank abgerufen und ihre geometrischen Konfigurationen optimiert. Die Kristallstrukturen der Zielproteine wurden aus der RCSB Protein Data Bank (PDB) gewonnen. Mit PyMOL wurden Wassermoleküle und Heteroatome entfernt und kokristallisierte Liganden extrahiert, um die Koordinaten der aktiven Stellen zu definieren. Wasserstoffatome wurden hinzugefügt, und Gasteiger-Ladungen wurden per Software zugewiesen. Andocksimulationen wurden ausgeführt, die pro Durchlauf 15 unabhängige Konformationen erzeugten. Die Konformation mit der niedrigsten Bindungsenergie wurde für eine weitere Analyse ausgewählt. Um die nicht-kovalenten Interaktionen rigoros zu charakterisieren, wurden die Rezeptor-Liganden-Komplexe mit dem Protein-Ligand-Interaktionsprofiler (PLIP) analysiert. HINWEIS: Es ist wichtig zu betonen, dass diese Andockergebnisse strukturelle Unterstützung für potenzielle molekulare Wechselwirkungen bieten und als Grundlage für weitere dynamische Verfeinerungen dienen; sie stellen jedoch keinen eigenständigen Beweis für biologische Wirksamkeit dar.

Um die Stabilität und konformationelle Entwicklung der vorhergesagten Protein-Liganden-Komplexe unter physiologisch relevanten Bedingungen zu bewerten, wurden molekulardynamische Simulationen mit dem Softwarepaket GROMACS durchgeführt. Topologiedateien für sowohl die Proteine als auch die Liganden wurden basierend auf dem GROMOS96 43a1-Kraftfeld generiert. Jeder Komplex wurde im Zentrum einer dodekaedrischen Box positioniert, wobei ein Mindestabstand von 1,0 nm zu den Kastenkanten gehalten und mit dem SPC-Wassermodell solviert wurde. Um die elektrische Neutralität zu gewährleisten, wurden dem System bei Bedarf Natrium- oder Chloridionen zugesetzt. Die Energieminimierung erfolgte mit dem steilsten Abstiegsalgorithmus, bis die maximale Kraft unter 1.000,0 kJ∙^mol-1∙^nm-1 lag. Das System wurde dann in zwei Stufen ausgegliglibriert: Zunächst wurde ein NVT-Ensemble eingesetzt, um das System mit einem V-Reskalierungsthermostat auf 300 K über 100 PS zu erhitzen; zweitens wurde ein NPT-Ensemble verwendet, um den Druck bei 1 bar über 100 ps mit einem Parrinello-Rahman-Barostat zu stabilisieren. Produktionssimulationen wurden für eine Gesamtdauer von 10 ns mit einem Zeitsprung von 2 fs durchgeführt. Langstrecken-elektrostatische Wechselwirkungen wurden mit der Particle Mesh Ewald (PME)-Methode berechnet, während Kurzstrecken-Van-der-Waals- und elektrostatische Wechselwirkungen mit einem Cutoff-Radius von 1,2 nm gesteuert wurden. Um die Zuverlässigkeit der Simulationen zu gewährleisten, wurden dort möglich, wo möglich, drei unabhängige Durchläufe durchgeführt. Die Stabilität der Komplexe wurde quantitativ bewertet, indem die Root Mean Square Deviation (RMSD) und die Root Mean Square Fluctuation (RMSF) der Protein-Backbone-Atome relativ zur Anfangsstruktur berechnet wurden. Das Erreichen eines Plateaus im RMSD-Profil wurde als primäres Kriterium für Systemausgleich und strukturelle Stabilität verwendet.

Allgemeine statistische Analyse

In diesem Experiment wurden Gruppenberechnungen mittels t-Tests oder einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt.

Ergebnisse

Vorhersage wichtiger charakteristischer Gene bei COPD

Nach der Batch-Effektkorrektur klinischer Daten von mehreren Mikroarray-Plattformen (Supplemental File 1–Supplemental Figure S1) wurde eine differentielle Expressionsanalyse durchgeführt. 34 Kandidatengene (32 hochreguliert und 2 herunterreguliert) wurden identifiziert, darunter SRPX2, CLDN10 und TFF3 (Abbildung 1A

Diskussion

Die Synthese und Aufrechterhaltung der Schilddrüsenhormonspiegel sind für COPD-Patienten bedeutend und gehen weit über die rein endokrine Funktion hinaus, da sie den Krankheitsverlauf, den Ernährungsstatus, die Lungenfunktion und die Gesamtprognose^{maßgeblich beeinflussen}. Insbesondere bei akuten Exazerbaten zeigten COPD-Patienten oft einen hypothyreoseähnlichen Zustand, der als "Low T3-Syndrom" ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Acetonitril (chromatographische Qualität)	Merck, Deutschland	1499230-935
Agilent 4150 Bioanalyzer	Agilent Technologies, USA
Ammoniumacetat	SIGMA, Deutschland	SRE0035-20230321
Angelica sinensis (Oliv.) Diels (Angelicae Sinensis Radix),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240807
Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. (Astragali Radix),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240601
ChemOffice		Software zur chemischen Strukturzeichnung und molekularen Modellierung
Cinnamomum cassia (L.) J. Presl (Cinnamomi Cortex),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240901
Eppendorfer Zentrifuge 5430 R	Eppendorf, Deutschland
Experimentelle Zigaretten	Harbin Taihua, China	20230208
GraphPad Prism 8		Software für statistische Analysen und Grafiken
Huangshan-Zigaretten		Forschungstaugliche Zigaretten für Rauchexpositionsexperimente
IL-1β ELISA-Kit	Shanghai Enzymgebundene Biotechnologie, China	E-EL-R0012c-20230522
Illumina Novaseq 6000 Sequenzierungsplattform	Illumina, USA
Lepidium apetalum Willd. (Descurainiae Samen)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240201
Lepidium sativum L. (Raphani Semen)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240301
Lipopolysaccharid (LPS)	Shandong Huino Pharmaceutical, China	20230315
Mahonia fortunei (Lindl.) Fedde (Folium Mahoniae)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240301
Methanol (chromatographische Qualität)	Fisher, USA	DK745764
Nanodrop-Spektrophotometer ND-2000	Thermowissenschaftlich, USA
Perilla frutescens (L.) Britt. (Perillae Folium)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240510
Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax (Pseudostellariae Radix),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20250201
Qubit 4.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific, USA
Bausatz für RNA-Bibliotheken	ABclonal, USA	RK20301-20230415
SMINA		Molekulare Andocksoftware
Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240902
Spontanaktivitätsrekorder für kleine Tiere (KW-ZF)	Nanjing Karlvin Biotechnologie, China
Natriumpentobarbital	Shanghai Experimental Reagent Procurement Company, China	20230412
TNF-α ELISA-Kit	Shanghai Enzymgebundene Biotechnologie, China	E-EL-R2856c-20230522
MS-Datenbank für traditionelle chinesische Medizin (Shanghai Applied Protein Technology Co., Ltd.)		kommerzielle Massenspektrometrie-Datenbank der traditionellen chinesischen Medizin
Trizolreagenz	Magen, China	20230508
UPLC BEH-Amid-Säule		Amidbasierte UHPLC-Analysesäule
UPLC HSS T3-Spalte		Umkehrphasen-UHPLC-Analysesäule (T3-Typ)
Vanquish Neo UHPLC-Orbitrap Exploris 480 MS System	Thermowissenschaftlich, USA
Vertreiben UHPLC-Q-Exaktives HFX-MS-System	Thermowissenschaftlich, USA