Erzeugung von Tumor-Organoidkulturen aus der Lungenadenokarzinomzelllinie

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine schnelle, reine und kostengünstige Methode zur Herstellung von Tumororganoiden aus der A549-Zelllinie, geeignet für Voruntersuchungen und Bildungszwecke.

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von Zelllinien-abgeleiteten Tumororganoiden (CDTOs) aus der A549-Zelllinie des menschlichen Lungenadenokarzinoms. Das Protokoll beinhaltet die Einbettung von 2D-erweiterten A549-Zellen in Matrigel und deren Aufbewahrung in einem 3D-Kulturmedium für die Langzeitkultur. Die empfohlene Saatdichte von 500 Zellen/μL wurde als Unterstützung für eine konstante Organoidbildung bestimmt. Die resultierenden CDTOs wurden durch Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbungen sowie Immunfluoreszenz (IF) charakterisiert. Die Organoide behielten eine hohe Expression der Lungenadenokarzinommarker Thyroid Transcription Factor 1 (TTF-1), Adhäsionsprotein E-Cadherin (ECAD) und Zytoskelettprotein Keratin 7 (KRT7) aufrecht. Darüber hinaus zeigte die Expression des tight junction-Proteins Zona Occludens 1 (ZO-1) eine dysregulierte Polarität der Tumororganoide. Dieses Protokoll bietet eine technisch unkomplizierte, kosteneffektive und rein tumoröse Organoid-Plattform für die Forschung am Lungenadenokarzinom. Seine Einfachheit und Reproduzierbarkeit machen es auch für den Laborunterricht im Grundstudium geeignet, wo es Studierenden helfen kann, grundlegende 3D-Tumororganoidkulturtechniken innerhalb eines begrenzten Laborplans zu erwerben.

Einleitung

Organoide sind in vitro. Selbstorganisierte dreidimensionale (3D) Strukturen, die aus Stammzellen stammen und in der Lage sind, biologische Komplexitäten realer Organe in erheblichem^Maße zu reproduzieren. Die Zellen, die Organoide bilden, können aus induzierten pluripotenten Stammzellen oder gewebeabgeleiteten Zellen stammen, wobei letztere normale Stamm-/Vorläuferzellen, differenzierte Zellen und Tumorzellen^{umfassen 2}. Im Vergleich zu traditionellen zweidimensionalen Kultursystemen und Tiermodellen können Organoide die physiologischen Eigenschaften des menschlichen Körpers näher nachahmen und gleichzeitig größere experimentelle Flexibilität bieten. Folglich wurde die Organoid-Technologie weit verbreitet in der Arzneimittelentwicklung³, der personalisierten Medizin⁴ und der Krankheitsmodellierung⁵ eingesetzt.

Zahlreiche Studien haben organoide Modelle für ein breites Spektrum von Krebsarten aufgestellt, darunter Kolorektal⁶, Prostata⁷, Bauchspeicheldrüse⁸, Magenkrebs⁹, Lebertumor¹⁰, Gallengang¹¹, Brust¹² und neuroendokrine Tumoren. Eine der größten Herausforderungen in der Tumororganoidforschung besteht jedoch darin, die Reinheit zu erhalten. So zeigte beispielsweise eine Studie an nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, dass nur 17 % der etablierten Organoide rein tumorös waren, da Tumorproben oft eine Mischung aus normalen und bösartigen Zellen enthalten, die vor Kultur¹³ schwer vollständig zu trennen sind. Dieses Verunreinigungsproblem kann zur Eliminierung von Tumorzellen durch das Auswachsen von Nicht-Tumorzellen führen, die Auswertungen von Medikamentenanfälligkeitstests beeinträchtigen und zu ungenauen molekularen Analysen wie RT-qPCR oder Western Blot führen, bei denen RNAs und Proteine von Tumorzellen um unkontrollierbare Anteile kontaminierender Zellen verdünnt werden.

Um dieses Problem anzugehen, haben Forscher das Design von selektiven Kulturmedien untersucht, die die verminderte Abhängigkeit von Tumorzellen von bestimmten Wachstumsfaktoren ausnutzen und so das normale Zellwachstum hemmen und gleichzeitig die Expansion der Tumorzellen fördern¹⁴. Darüber hinaus werden Strategien wie Zellsortierung oder monoklonale Identifikation entwickelt, um reine Tumororganoide zu konstruieren.

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Zelllinien-abgeleiteten Tumororganoiden (CDTOs) unter Verwendung der A549-Zelllinie des menschlichen Lungenadenokarzinoms, die teilweise krebsartige Stammzelleigenschaften sowie eine erhöhte Klonogenität, das proliferative Potenzial und die Tumorigenität in vitro aufweist.¹⁵. Die resultierenden CDTOs behielten die Expression linienspezifischer Biomarker Thyroid Transcription Factor 1 (TTF-1)¹⁶, Adhäsionsprotein E-Cadherin (ECAD)¹⁷ und Zytoskelettprotein Keratin 7 (KRT7)¹⁶ auf und zeigten physiologische Merkmale, die für Tumororganoide charakteristisch sind. Dieses Modell ist leicht zu etablieren und enthält definierte Krebszellkomponenten, was es für Forscher geeignet macht, die neu im Bereich der Tumororganoiden sind, oder für diejenigen, die durch den Verlust der Tumoridentität in primären Organoidkulturen herausgefordert werden. Mögliche Anwendungen umfassen vorläufige Arzneimittelanfälligkeitstests¹⁸, Tumor-Mikroumgebungsstudien¹⁹ und Schulungen in 3D-Kulturtechniken.

Protokoll

Die Raumtemperatur im Labor beträgt 22–24 °C und wird als RT bezeichnet. Die Verwendung einer Schwenk-Eimer-Zentrifuge wird empfohlen. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Etablierung primärer A549-Organoide

1. Zubereitung und A549-Zellentnahme
   1. Bereiten Sie eine 6 cm große Schale mit A549-Zellen bei 70 % Konfluenz vor. Vorwarme TrypLE und PBS auf 37 °C. Berechnen Sie die Zellmenge und das Matrigelvolumen gemäß dem Versuchsdesign und Tabelle 1.
      1. Die Auftauung erforderte Matrigel-Aliquots mit Redundanz für mindestens zwei Brunnen, die mindestens 60 Minuten auf Eis standen. Bereiten Sie Polystyrol- und TC-behandelte Platten vor, damit die Kuppeln halbkugelförmig bleiben.
      2. Frisch vorbereitetes 2D-Medium (Dulbeccos modifiziertes Adlermedium mit 10 % fetalem Rinderserum) und 3D-Medium (Human Lung Adenocarcinoma Organoid Medium). 3D-Medium kann aus kommerziellen Bausätzen oder laut den Arbeiten von Sachs, N. u. a. aus Hans Clevers Labor²⁰ erzeugt werden.
         HINWEIS: Eine 6-cm-Schale kann nach der Verdauung in der Regel etwa 5.000.000 Zellen erzeugen. Reduziere die Anzahl der Eingabezellen für das experimentelle Design. Platten, die für konfokale Bildgebung mit Glasboden konzipiert sind, sind für Matrigel nicht geeignet, um eine richtige 3D-Form zu bilden.
   2. Aspiriere das verbrauchte 2D-Medium und wasche die Zellen einmal mit 1 ml PBS, um Restserum zu entfernen. PBS aspirieren, 1 ml vorgewärmtes TrypLE hinzufügen und die Platte 4 Minuten bei 37 °C inkubieren.
   3. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Wenn das Zytoplasma sich zurückzieht und die Zellen die interzellulären Verbindungen verlieren, wird ein gleiches Volumen (1 ml) frisches 2D-Medium hinzugefügt, um die enzymatische Reaktion zu beenden.
   4. Führen Sie vorsichtig eine Pipette, um die anhaftenden Zellen von der Kulturoberfläche abzulösen und wieder aufzuhängen. Die Zellsuspension wird in 1,5 mL Zentrifugenröhren übertragen und bei 300 × g 3 Minuten bei RT zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren.
   5. Entsorge das Supernatant und suspendiere das Zellpellet in 1 mL 2D-Medium. Verdünnen Sie die 10-μL-Zellsuspension auf 100 μL und zählen Sie die Zellzahlen mit einem Hämozytometer. Berechnen Sie das erforderliche Volumen gemäß Schritt 1.1.1 und aspirieren Sie in ein 1,5 mL Zentrifugenrohr mit vorgespülten Spitzen.
2. Aussäen von geernteten Zellen in Matrigel
   1. Bereiten Sie Eis und Vorkühlen der Pipettenspitzen im Kühlschrank von -20 °C für 1 Minute vor und verwenden Sie, wenn möglich, Spitzen mit wenig Halt. Achten Sie darauf, dass keine Kristalle in den Matrigel-Aliquots verbleiben und keine Blasen entstehen, wenn die Spitze in die Lösung eintritt.
   2. Zentrifugiere das Rohr mit den entnommenen Zellen bei 300 × g bei RT und entsorge das Überlagerungsmittel. Stell das Rohr auf Eis. Verwenden Sie vorgekühlte Pipettenspitzen, um langsam das benötigte Volumen an Matrigel anzusaugen, und geben Sie es dem Pellet auf Eis zu. Langsam auf Eis mit nur dem ersten Stopp der Pipette wieder suspendieren. Bitte lassen Sie das Eis nicht länger als 10 Sekunden liegen, wenn Beobachtung erforderlich ist.
   3. Verwende vorgekühlte Pipettenspitzen und lasse die Mischung auf Eis. Gib einen Aliquot der Mischung in die Mitte jedes Brunnens. Ziehen Sie die Pipette beim Ausgeben langsam zurück und verwenden Sie nur die erste Haltestelle, um Blasenbildung zu vermeiden.
      HINWEIS: Die Mischung sollte in der Mitte eine kuppelförmige 3D-Struktur bilden. Suspendiere die Mischung erneut, bevor du zum nächsten Brunnen übergehst. Wenn möglich, vermeiden Sie die Nutzung der Randbrunnen und geben Sie PBS zu diesen Brunnen.
   4. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem 5%-CO₂-Inkubator für 40 Minuten, um die Gelpolymerisation zu ermöglichen. Nachdem das Matrigel ausgehärtet ist, fügen Sie vorsichtig 3D-Medium entlang der Brunnenwand hinzu und kultivieren Sie weiter bei 37 °C.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, während der Abgabe Blasen zu erzeugen. Wenn Blasen entstehen, vermeiden Sie es, diesen Teil der Mischung zu verwenden.
   5. Während der Kultur sollte das 3D-Medium alle 3 Tage oder wenn eine Farbveränderung (von Rosa zu Gelb) beobachtet wird, ersetzt werden. Untersuchen Sie das Wachstum von Organoiden unter einem umgekehrten Mikroskop bei jedem Mediumwechsel und dokumentieren Sie die Morphologie fotografisch, um die strukturelle Entwicklung zu überwachen.
      HINWEIS: Organoide sollten dicht und gewölbt sein, mit Durchmessern von mehr als 30 μm, anstatt wie durch 5000 Zellen/μL (Abbildung 1D) zerfallen oder fragmentiert zu sein.

2. Fixierung, Einbettung und Sektionierung von Organoiden

1. Organoidkulturen werden am Tag 6–9 vorbereitet. Entferne das Kulturmedium von der Zellkulturplatte. Lösen Sie die Organoide vorsichtig ab, indem Sie mit 1 ml kaltem PBS pipettieren und sie in ein 1,5 ml-Rohr geben, das mit 5 % BSA vorgespült ist, um eine Haftung zu verhindern. Lassen Sie die Organoide sich durch die Schwerkraft auf Eis natürlich absetzen und entfernen Sie vorsichtig den Supernatanten.
2. Füge 1 ml kaltes PBS hinzu, um das Pellet wieder aufzuhängen. Lassen Sie die Organoide mindestens 5 Minuten durch die Schwerkraft auf natürliche Weise absinken und entfernen Sie vorsichtig das Überlagerungsmittel. Wenn einige Organoide nicht absinken, zentrifugieren Sie kurz bei 200 × g für 1 Minute bei 4 °C, um sie zu sammeln. Dieser Schritt wird mehrfach ausgeführt und als 'Small Wash' bezeichnet.
3. Führe die kleine Wäsche zweimal durch, um Rückstände des Matrigels zu entfernen. Wenn der Rest von Matrigel vorhanden ist, geben Sie während des Waschens eine Endkonzentration von 10 mM EDTA zu kaltem PBS.
   VORSICHT: Übertragen Sie die Proben in die Abzugshaube. Füge 4 % Paraformaldehyd (PFA) hinzu, das ausreichend ist, um die Organoide zu bedecken, und fixiere es für 1 Stunde auf Eis in einer Abzugshaube. Entsorgen Sie das Fixativ und führen Sie die kleine Wäsche zweimal durch. Fahren Sie mit Schritt 4.1 für die IF-Verfärbung fort.
4. Nachdem die Organoide am Boden des Rohrs abgesackt sind, entsorgen Sie das Überlagerungsmittel und erhitzen Sie die Proben in einem 70–75 °C Metallbad für 5 Minuten, um eine schnelle Agarose-Erstarrung während Schritt 2.7 zu vermeiden.
5. Bereite 3 % (W/V) Agarose in 1× PBS vor und erhitze die Mischung in einem Mikrowellenbad, bis sie vollständig gelöst und transparent ist. Vermeiden Sie das Kochen, um Volumenverlust oder Veränderungen der Agarosekonzentration zu vermeiden.
6. Die fixierten Organoide werden schnell in 30–50 μL 3 % Agarose aufgehängt, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten, und 20–30 Minuten auf Eis abgekühlt, bis sie erstarrt sind, um Blasen zu vermeiden.
7. Sobald die Agarose-Organoid-Mischung erstarrt ist, entferne den Agaroseblock vorsichtig mit einer Nadel aus dem Röhrchen und übertrage ihn in eine beschriftete Gewebeeinbettungskassette.
8. Tauchen Sie die Kassette mit dem Agaroseblock nacheinander in gradierte Ethanollösungen (30 %, 50 %, 70 % [kann über Nacht bei 4 °C gelagert werden], 80 %, 90 %, 95 %, 100 % und 100 %) zur Austrocknung. Inkubiere jeden Schritt auf einer schüttelnden Plattform bei 20 U/min für 30 Minuten.
9. Paraffinwachsblöcke vor der Verwendung bei 65 °C im Ofen vorschmelzen. Übertragen die dehydrierten, mit Agarose eingebetteten Organoide in Xylol zur Entfernung. Zweimal eintauchen, jeweils 15–20 Minuten, um den restlichen Ethanol zu entfernen.
10. Transferiere die Gewebekassetten nacheinander in Paraffinbad 1 für 45 Minuten und dann für weitere 45 Minuten in Paraffinbad 2.
11. Setzen Sie die Gewebekassetten und Metallformen in die geschmolzene Paraffinkammer der Einbettungsstation. Entnehmen Sie das Organoid oder die Gewebeprobe aus der Kassette und positionieren Sie sie in der Mitte der Metallform. Legen Sie die Form auf eine kalte Platte, um die Ausrichtung der Probe zu korrigieren.
12. Legen Sie die Gewebekassette auf die Metallform, füllen Sie sie mit zusätzlichem geschmolzenem Paraffin und lassen Sie sie mindestens 60 Minuten auf der kalten Platte abkühlen. Sobald der Paraffinblock vollständig erstarrt ist, entferne die Metallform und lagere den mit Paraffin eingebetteten Organoidblock bei 4 °C bis zur Sektionierung.
13. Schneiden Sie die mit Paraffin eingebetteten Organoidblöcke mit einem Mikrotom. Stellen Sie sicher, dass die Dicke jedes Abschnitts gleichmäßig ist, um die nachfolgende Färbung und Bildgebung zu erleichtern.
14. Lassen Sie die geschnittenen Abschnitte in einem Wasserbad schwimmen, das bei 40 °C gehalten wird, um eine vollständige Ausdehnung der Paraffinbänder zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass sich jeder Abschnitt als eine einzige, faltenfreie Schicht ausbreitet; Entsorge alle gefalteten oder überlappenden Abschnitte.
15. Montieren Sie die erweiterten Abschnitte auf selbstklebende Mikroskopobjektträger, indem Sie den Objektträger leicht schräg unter dem Schnitt eintauchen und ihn vertikal anheben, um das Gewebe einzufangen. Beschriften Sie die Dias mit einem Bleistift, um die Probenidentifikation während der späteren Verarbeitung zu sichern.

3. Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbung

1. Backen Sie die Objektträger mit Gewebe oder organoiden Schnitten 1–2 Stunden in einem 60 °C Ofen, um eine ordnungsgemäße Haftung sicherzustellen und Restparaffin zu entfernen.
2. Entwachsen Sie die Abschnitte nacheinander, indem Sie sie 15 Minuten in Xylol I eintauchen, 15 Minuten in Xylol II, und anschließend durch eine graduierte Ethanolserie von jeweils 100 %, 100 %, 95 %, 90 %, 80 % und 70 % rehydrieren. Dann spülen Sie die Scheiben zweimal in doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O), jeweils 5 Minuten lang.
3. Färben Sie die Schnitte 5 Minuten mit Hämatoxylin, spülen Sie sie 1–2 Minuten in fließendem Leitungswasser ab und differenzieren Sie dann 2 Sekunden in 1 % Säurealkohol. Waschen Sie erneut 1–2 Minuten mit Leitungswasser, bleichen Sie die Kerne dann 5 Sekunden lang in 1% Ammoniakwasser und spülen Sie sie 1–2 Minuten abschließend mit Leitungswasser.
4. Die Abschnitte durch eine graduierte Ethanolserie von jeweils 70 %, 80 %, 90 % und 95 % für jeweils 3 Minuten dehydrieren und anschließend 10 Minuten mit Eosin in einer alkoholbasierten Eosinlösung kontrastieren.
5. Spülen Sie die Stücke zweimal in absolutem Ethanol, jeweils 5 Minuten lang.
   HINWEIS: Bei alkoholhaltigem Eosin sollten Sie vor der Färbung auf bis zu 95 % Ethanol dehydrieren. Bei wasserlöslichem Eosin sollten Sie vor der Dehydrierung eine Färbung durchführen.
6. Räume die Abschnitte, indem du sie zweimal in Xylen tauchst, jeweils für 5 Minuten, und behalte sie bis zum Aufsteigen in Xylen.
7. Montage der Verschlüsse unmittelbar nach der Entfernung aus Xylol mit neutralem Harz-Montagemedium und vermeiden Sie dabei sorgfältig Luftblasen.
8. Die montierten Objektträger 30–60 Minuten am RT an der Luft trocknen lassen und anschließend unter einem Lichtmikroskop betrachten.
   HINWEIS: Die sofortige Montage nach dem Xyleng-Clearing verhindert Oxidation und gewährleistet optische Klarheit.

4. Ganzmontierte Immunfluoreszenzfärbung

1. Fahren Sie ab Schritt 2.4 fort. Fügen Sie 1 ml Blockierungs- und Permeabilisierungslösung (5 % BSA + 0,3 % Triton X-100) zum Pellet hinzu und inkubieren Sie bei RT für 60 Minuten oder bei 4 °C als Stopppunkt für 1–2 Tage.
2. Verdünnen Sie primäre und sekundäre Antikörper gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Verhältnis in der Blockierungs- und Permeabilisierungslösung. Einmal eine kleine Wäsche und 200 μL verdünnte primäre Antikörper zum Pellet hinzufügen. Inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C.
3. Führe das kleine Wash dreimal durch und gib dem Pellet 200 μL verdünnte Sekundärantikörper zu. Inkubiere 60 Minuten im RT.
4. Als Nächstes führen Sie das kleine Waschen dreimal durch. Fügen Sie 15 μL Montagemedium hinzu, um das Pellet wieder aufzuhängen, und lassen Sie das Medium mit Organoiden auf einen Glasträger fallen. Trage langsam einen Deckdeckel auf das Medium auf und versiegele den Deckdeckel mit Nagellack. Drücken Sie den Deckungsschlupf nicht manuell zusammen und lassen Sie das Montagemedium nicht durch Oberflächenspannung ausbreiten.

Ergebnisse

Der allgemeine Prozess dieses Protokolls umfasst die Erweiterung von 2D-A549-Zellen in die Exponentialstufe (ergänzende Abbildung 1A) und den Übergang in 3D-Matrigel zur Bildung von Organoiden (Abbildung 1A). Nach der Verkapselung in der Matrigel vermehrten sich die Zellen und organisierten sich selbst, wobei überwiegend monoklonale Organoide gebildet wurden (Abbildung 1B). Seine dichte und verworrene Morphologie war über die Gänge hinweg einhei...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von A549-Lungenadenokarzinom-Zelllinien-abgeleiteten Tumororganoiden, optimiert für technische Einfachheit, Reproduzierbarkeit und pädagogische Anwendungen. Drei Parameter bestimmen den Erfolg entscheidend: Anfangszustand der Zelle, Mediumformulierung und Matrixzusammensetzung. Außerdem wird empfohlen, die Kulturdauer nicht über 14 Tage zu überschreiten. Nachfolgend sind die wichtigsten Parameter und die Fehlersuche aufgeführt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1.5 mL Micro Zentrifugenröhrchen	Biofil	CFT003015
A549 [A-549]menschliche nicht-kleinzellige Lungenkrebszellen	ZQXZbio	ZQ0003	STR: Amelogenin: X,Y; CSF1PO: 10,12; D13S317: 11; D16S539: 11,12; D5S818: 11; D7S820: 8,11; TH01: 8,9.3; TPOX: 8,11; vWA: 14. Mycoplasma war negativ, als es gekauft wurde, wurde alle 2 Wochen getestet. Passagennummer innerhalb von 10 Passagen aus den P1-Aliquots des gekauften Batchs wurde verwendet.
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Anti-E Cadherin Antikörper	Abcam	ab231303
Anti-Fade Einbettungsmittel	YEASEN	36307ES08
Anti-HIF-1 alpha Antikörper	Abcam	ab51608
Biologische Sicherheitskabinett	Nuaire LABGARD	NU-540
Biologische Gewebe Einbettungsmaschine	KEDEE	KD-BM
BSA	Sigma	A1933
Cell-Grade BSA	Sigma	A1933-100G
Zentrifuge	Eppendorf	Zentrifuge 5702 R	Schleudereimer; Milde bis niedrige Geschwindigkeit.
Zentrifugenröhrchen	Biofil	CFT920150
Citrat Antigen-Retrieval-Lösung (pH 6,0)	ZSGB-BIO	ZLI-9065
Cryostage	KEDEE	KD-BL
Cytation 5 Zell-Imaging-Multimodus   Reader	Biotek	Cytation 5
Cytokeratin 7 (KRT7) Kaninchen mAb	Abclonal	A4357
DMEM	Gibco	11965092
DMSO	Solarbio	D8371
Esel Serum	Solarbio	SL050
Dulbecco's Modifiziertes Eagle-Medium	Gibco	11965118
Eclipse Ts2 Invertiertes Mikroskop	Nikon	Eclipse Ts2
Eosin-Färbelösung (alkohollöslich)	Servicebio	G1001
FBS	Nobimpex	B118-500
Forma Steri-Cycle i160 CO2 Inkubator	Thermo Scientific	i60
Hämatoxylin-Blaulösung	Servicebio	G1040
Hämatoxylin-Differenzierungslösung	Servicebio	G1040
Hämatoxylin-Färbelösung	Servicebio	G1004
Hämozytometer	Solarbio	YA0810
Humanes Lungenadenom Organoid Medium (3D-Medium)	PMO Bio	HC1001
Immunhistochemie (IHC) Stift	ZSGB-BIO	ZLI-9305	Bei 4°C lagern
Laser-Konfokalmikroskop  FV3000	Olympus	FV3000	Üblicher Parameterbereich: PMT-Spannung: 500 & plusmn; 200 V; Laser-Übertragungsfähigkeit: 5 & plusmn; 3 %; Offset: 3 %
Manuelles Rotationsmikrotom	Leica	RM2235
Metallbad	ALLSHENG	MK-3000
Mikrowelle	Galanz
Nagellack	Lete
Neutraler Balsam (Einbettungsmittel für Mikroskopie)	Beyotime	C0173
Organoid-spezifische extrazelluläre Matrix Gel	PMO Bio	BM1001
PBS	WISENT	311-010-CL
Peroxidase-Blockierungslösung	Beyotime	P0100A
Pipetten	Eppendorf	312300063/312300020/312400083
Pipettenspitzen	Axygen	14-222-692/14-222-723/14-222-869	Erwägen Sie, wenn möglich, Tipps mit geringer Rückhaltung zu verwenden.
Dreidimensionaler Schüttler	SCILOGEX	SK-D3309-Pro	Niedrige Geschwindigkeit.
Gewebe-Flotations-Wasserbad	KEDEE	KD-P
Triton X-100	VWR	92046-34-9
Trypanblau	Gibco	15250061
TryPLE	Gibco	12605028
TTF1 Rekombinantes monoklonaler Antikörper	HUABIO	HA720067