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Methodenartikel

Schnelle Produktion rekombinanter menschlicher SLFN14-Ribonuklease und stöchiometrische Analyse mittels Massenphotometrie

961 Aufrufe

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DOI:

10.3791/70393

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20. Februar 2026

 ,  , 
1Department of Structural Biology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, SUNY, 2Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Baylor College of Medicine, 3Therapeutic Innovation Center (THINC), Baylor College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung rekombinanter humaner SLFN14-Ribonuklease und deren stöchiometrische Analyse mittels Massenphotometrie.

Zusammenfassung

Ribonukleasen sind eine spezialisierte Klasse von RNA-bindenden Proteinen, die die RNA-Spaltung katalysieren und zu verschiedenen biologischen Prozessen, einschließlich der Genregulation, beitragen. Dennoch bleiben Struktur, Funktion und Regulation vieler menschlicher Ribonukleasen aufgrund der Herausforderungen der rekombinanten Proteinproduktion schlecht charakterisiert. Diese Methode beschreibt einen effizienten Ansatz für die transiente Expression, Reinigung und stöchiometrische Analyse des menschlichen Schlafen-14-(SLFN14)-Ribonukleases. Rekombinantes, mit Flag markiertes SLFN14 wurde in HEK293-Suspensionszellen exprimiert und mit einem schnellen zweistufigen Reinigungsworkflow isoliert, der aus Anti-Flag-Affinitätschromatographie gefolgt von Low-Resolution Size Exclusion Chromatography bestand. Die Massenphotometrie, eine empfindliche Einzelmolekül-Technik, zeigte, dass SLFN14 unter physiologischen Salzbedingungen ein stabiles Homodimer bildet, das an zellulära RNA gebunden ist, während hoher Salzgehalt die RNA-Dissoziation fördert und gleichzeitig die Homodimeranordnung erhalten bleibt. Das daraus resultierende rekombinante humane SLFN14-Protein eignet sich für nachgelagerte Strukturstudien und qualitative biochemische Tests. Dieser schnelle Ansatz zur Isolierung und Charakterisierung rekombinanter menschlicher Proteine ist breit anwendbar für die Produktion anderer Säugetier-Ribonukleasen und RNA-bindenden Proteine, die für biophysikalische und biochemische Charakterisierung vorgesehen sind.

Einleitung

Schlafen 14 (SLFN14) ist ein wenig erforschter Ribonuklease- und Säugetier-Wirtsrestriktionsfaktor 1,2,3. Das humane SLFN14-Protein gehört zu einer sechsköpfigen Familie von SLFN-Genregulatoren und spielt eine Rolle bei Immunität, antiviraler Aktivität, Chemosensitivität und Zelldifferenzierung 4,5,6,7,8. Mechanistische Einblicke in die Rolle der SLFN-Genregulatoren bleiben unvollständig; Viele Mitglieder besitzen jedoch eine Ribonuklease-Aktivität, die für die translationale Kontrolle unerlässlichist 7,9. SLFN-Ribonukleasen werden bei der Protein-Homodimerisierung aktiviert und bilden eine zusammengesetzte RNA-Bindungsspalte, die gut in der Substratspaltung10,11 geeignet ist. Um Zellen vor einer spuriosen RNA-Spaltung zu schützen, existieren die meisten SLFN-Ribonukleasen überwiegend als Monomer und warten auf die Aktivierung durch molekulare Signale, die spezifisch für jedes Familienmitgliedsind, 5,7,11,12.

Die rekombinante Produktion von menschlichem SLFN14 hat umfassende molekulare Studien zu diesem bisher wenig untersuchten Ribonucle ermöglicht und neue Erkenntnisse zu seiner Funktion und Regulationgeliefert 2,13,14. Das gereinigte rekombinante SLFN14-Protein hat die Charakterisierung seiner strukturabhängigen Transfer-RNA-Spaltaktivität mithilfe von in vitro RNA-Spaltungsassays 2,14 beschleunigt. Kryo-Elektronenmikroskopie-(KryoEM)-Studien des gereinigten SLFN14-Proteins zeigen ebenfalls eine SLFN14-Homodimer-Anordnung, bei der duplexierte RNA in eine zentrale Spalte 2,13,14 geladen wird. Die höherordnungige Assemblierung von SLFN14 wurde weiter durch Massenphotometrie charakterisiert, eine Einzelmolekültechnik zur Messung der Molekülmasse. Unerwarteterweise zeigt diese empfindliche Technik, dass SLFN14 überwiegend ein salzresistentes Homodimer bildet, aber auch ein salzempfindliches Homotetramer unbekannter Funktion 2,13,14 bilden kann. Insgesamt war die Fähigkeit, gereinigtes menschliches SLFN14-Protein zu gewinnen, ein entscheidender Meilenstein, der frühe molekulare Einblicke ermöglichte, die zweifellos eine spannende neue Forschungsphase zur SLFN14-vermittelten translationalen Kontrolle anstoßen werden.

Die rekombinante SLFN14-Ribonuklease war historisch schwer mit Standard-Proteinproduktionsstrategien zu erhalten. Der ursprüngliche Bericht, der die enzymatische Aktivität von SLFN14 beschreibt, wies auf seine geringe Ausbeute, verminderte Stabilität und geringe Löslichkeithin. Das humane SLFN14-Protein zeichnet sich durch eine lange Polypeptidkette, ausgeprägte Hydrophobie und ribonucle-abhängige Zytotoxizität aus, die zusammen die Nutzung konventioneller bakterieller Expressionssystemeweitgehend behindern 1,13,14. Allerdings bieten ausgefeilte eukaryotische Translations- und Begleitmaschinen eine leistungsstarke Alternative, die effizient das vollständige menschliche SLFN14-Protein15 produzieren. Sowohl Baculovirus-Insekten- als auch Säugetierexpressionssysteme wurden eingesetzt, um das vollständige humane SLFN14-Protein für KryoEM-Studien und biochemische Assays 2,13,14 zu gewinnen. In einigen Fällen benötigte das insektenabgeleitete SLFN14-Protein jedoch stabilisierende Mutationen, um die Probenaggregationzu verhindern. Die durch Baculovirus vermittelte Genlieferung ist zudem mit einem erheblichen Aufwand und einer langen Vorlaufzeit verbunden, die den Forschungsfortschrittverzögert 15,16. Andererseits bietet rekombinantes SLFN14-Protein, das aus einem säugetierischen Expressionswirt isoliert ist, den Vorteil der Geschwindigkeit und vermeidet die Notwendigkeit von Proteintechnik bei der Probenoptimierung.

Diese Methode ist darauf ausgelegt, einen relativ schnellen und aufwandarmen Ansatz zur Herstellung eines rekombinanten Wildtyp-SLFN14-Proteins zu ermöglichen, das für nachgelagerte molekulare Studien geeignet ist. Die Verwendung von Säugetierzellen bietet eine nahezu natürliche Umgebung, um eine ordnungsgemäße Proteinfaltung zu erhalten, ohne dass SLFN14 Protein Engineering13 erforderlich ist. Eine chemisch basierte Genabgabemethode im Gegensatz zu einer viralen Vektorstrategie beschleunigt zudem die Produktionszeit von Monaten auf15 Tage. Um die relativ hohen Kosten der Säugetierzellkultur auszugleichen, nutzt diese Methode das kostengünstige Polyethylenimin (PEI) Transfektionsreagenz und transfektionseffiziente humane embryonale Nierenzellen 293 (HEK293), die in Suspension17,18 gezüchtet werden. Um den Proteinverlust während der Probenverarbeitung zu minimieren, nutzt dieses Verfahren auch Strategien mit geringem Probenverbrauch für die SLFN14-Proteinreinigung und stöchiometrische Analyse zur Qualitätskontrolle der Proben. Dieses viertägige Protokoll liefert spezifische Details darüber, wie 1) eine vorübergehende Genexpression in HEK293-Zellen durchgeführt werden kann, 2) ein zweistufiger Chromatographie-Workflow mit Spin-Säulen durchgeführt wird und 3) die Protein-Stöchiometrie mittels Massenphotometrie bestimmt werden kann. Das Endprodukt dieses Verfahrens ist ein Wildtyp-menschliches SLFN14-Protein mit einem doppelten C-terminalen Myc-Flag-Tag (SLFN14Myc-Flag), das für nachgelagerte CryoEM-Studien und qualitative biochemische Charakterisierung13 verwendet werden kann. Dieser vielseitige Ansatz kann angewendet werden, um andere wenig erforschte menschliche RNA-bindende Proteine zu isolieren und zu charakterisieren, insbesondere große und zytotoxische Ribonuklease-Gene, die in heterologen Expressionssystemen oft schwer überexprimiert werden können. Daher senkt dieses Protokoll die Hürde für eine umfassende molekulare Charakterisierung des menschlichen Proteoms.

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Protokoll

Experimente mit HEK293-Zellkultur sollten unter Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) gemäß genehmigten institutionellen Biosicherheitsprotokollen durchgeführt werden.

1. Transiente Expression von SLFN14Myc-Flag in Säugetierzellen

  1. Säe Säugetier-HEK293-Suspensionszellen bei 0,5 x 106 Zellen/mL in vorerwärmtes, serumfreies Wachstumsmedium für ein letztes Volumen von 320 ml in einem belüfteten, mit Baffling versehenen 1-Liter-Kolben.
  2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 125 U/min, 8 % CO2und 75-80 % Luftfeuchtigkeit für 24 bis 32 Stunden.
  3. Überprüfen Sie die Zellanzahl von 1,2–1,8 x 106 Zellen /mL und die Lebensfähigkeit von über 90 % mit Trypan-Blau-Färbung und einem Zellzähler19.
  4. Dekantieren Sie 40 ml Kultur in acht konische Röhren.
  5. Zellen werden durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 Minuten bei 20-25 °C entnommen.
  6. Entsorge das Wachstumsmedium.
  7. Jede Zellkugel wird vorsichtig in 38 mL vorgewärmtes, serumfreiem Transfektionsmedium für ein Endvolumen von 304 ml wieder suspendiert.
    HINWEIS: Die verbleibenden 16 mL des ursprünglichen Kulturvolumens, wie in Schritt 1.1 beschrieben, werden durch das in Schritt 1.12 beschriebene Transfektionsgemisch zugeführt.
  8. Übertragen Sie die Zellen in eine neue, belüftete 1-Liter-Flasche.
  9. In einem konischen Rohr werden 320 μg gereinigte Plasmid-DNA, die das rekombinante SLFN14Myc-Flag-Gen codiert, zu 8 mL serumfreiem Transfektionsmedium hinzugefügt und 5 Minuten bei 20–25 °C inkubiert.
    HINWEIS: Die Plasmidkonzentration beträgt typischerweise 500 ng/μL bei einem Endvolumen von 640 μL.
  10. Gleichzeitig mit Schritt 1,9 fügen Sie 960 μg 0,22 μm filtersterilisiertes PEI zu 8 mL serumfreiem Transfektionsmedium hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten bei 20-25 °C.
    HINWEIS: Arbeitsmaterial beträgt typischerweise 1 mg/mL bei einem Endvolumen von 960 μL.
  11. Langsam die PEI-Mischung (siehe Schritt 1.10) tropfenweise zur rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung geben (siehe Schritt 1.9) und 15 Minuten bei 20–25 °C inkubieren.
  12. Fügen Sie langsam 16 ml der DNA/PEI-Mischung tropfenweise zu den in Schritt 1.8 hergestellten Zellen hinzu.
  13. Inkubiere die Zellen bei 37 °C, 125 U/min, 8 % CO2und 75–80 % Luftfeuchtigkeit für 48 Stunden.
  14. Dekantieren Sie 40 ml transfizierte Zellen in acht konische Röhren.
  15. Transfizierte Zellen werden durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 Minuten bei 20-25 °C entnommen.
  16. Kippen Sie das Supernatant ab und lagern Sie die acht Zellpellets bei -80 °C.

2. Zweistufige rekombinante SLFN14Myc-Flag-Reinigung

  1. Anti-Flag-Affinitätschromatographie.
    Führen Sie das Anti-Flag-Affinitätschromatographieprotokoll doppelt durch, wobei pro Präparat vier Zellpellets aus Schritt 1.16 verwendet werden.
    1. Harzvorbereitung.
      1. Anti-Flag-Agaroseharz auf 20-25 °C für 15 Minuten ausgleichen.
      2. Lassen Sie das Harz vorsichtig wieder suspendieren, indem Sie die Flasche umkehren, unmittelbar bevor 40 μL 50%ige Harzschlamm in ein 2-mL-Mikrozentrifugenrohr überführt wird.
        HINWEIS: Schneiden Sie das Ende der Pipettenspitze ab, um die zähflüssige Schlamm leicht aufzufangen.
      3. Suspendieren Sie das Harz in 1 ml High Salt Wash Buffer (50 mM Tris pH 7,4, 600 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,1 % Tween-20).
      4. Inkubiere 45 Minuten bei 4 °C.
      5. Zentrifugieren Sie die Harzsuspension bei 8.000 x g für 2 Minuten bei 4 °C.
      6. Aspirieren und entsorgen Sie den High Salt Wash Buffer, wobei Sie darauf achten, das Harz nicht zu stören.
    2. Zelllysat-Klärung.
      1. Jede transfectierte Zellpellet wird mit 225 μL gekühltem Resuspensionspuffer (50 mM Tris pH 7,4, 600 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,5 % Triton-X-100, 1 mM PMSF, 5 μg/mL Leupeptin, 1 mM Benzamidin, 0,7 μg/mL Pepstatin A, 0,25 U/mL Genius-Nuklease) für ein Gesamtvolumen von 900 μL über vier Zellpellets resuspendiert.
      2. Zellen werden in ein 2-mL Mikrozentrifugenrohr übertragen, das auf Eis vorgekühlt wurde.
      3. Inkubieren Sie das Mikrozentrifugenrohr horizontal auf einem Nutator für 30 Minuten bei 4 °C.
        HINWEIS: Lagern Sie einen 20 μL Aliquot Gesamtlysat bei -20 °C zur Fehlersuche bei schlechter Proteinexpression.
      4. Zelllysat durch Zentrifugation bei 21.300 x g für 20 Minuten bei 4 °C klären.
    3. Proteinaffinitätsaufnahme und -washes.
      1. Kombinieren Sie das klarisierte Lysat (siehe Schritt 2.1.2.4) mit dem ausgeglichen Anti-Flag-Harz (siehe Schritt 2.1.1.6).
      2. Inkubieren Sie das Lysat-Harz-Gemisch in einem horizontal auf einem Nutator positionierten Mikrozentrifugenröhrchen für 60 Minuten bei 4 °C.
      3. Zentrifugieren Sie das Lysat-Harz-Gemisch bei 8.000 x g für 2 Minuten bei 4 °C, um ein Harzpellet zu bilden.
      4. Verwerfen Sie etwa 700 μL Supernatant und achten Sie darauf, das Harzpellet nicht zu stören.
        HINWEIS: Lagern Sie einen 20 μL Aliquot Supernatant bei -20 °C nach Harzbindung zur Fehlersuche bei schlechter Fangeffizienz.
      5. Das verbleibende Harz-Supernatant-Gemisch wieder suspendieren und die Lösung in eine leere 800-μL-Spin-Säule übertragen, die in ein leeres 2-mL-Mikrozentrifugenrohr eingefügt wurde.
      6. Zentrifugieren Sie die Spin-Säule bei 1.000 x g für 2 Minuten bei 4 °C und entsorgen Sie den Durchfluss.
      7. Spülen Sie das leere Mikrozentrifugenrohr aus Schritt 2.1.3.5 mit 500 μL High Salt Wash Buffer und übertragen Sie die Lösung in die Spin-Säule.
        HINWEIS: Dieser Schritt hilft, eventuelle Restharze im Mikrozentrifugenröhrchen zurückzugewinnen.
      8. Zentrifugieren Sie die Spin-Säule bei 1.000 x g für 2 Minuten bei 4 °C und entsorgen Sie den Durchfluss.
      9. Gib 500 μL High Salt Wash Buffer zur Spin-Säule. Zentrifugieren Sie die Spin-Säule bei 1.000 x g für 2 Minuten bei 4 °C und entsorgen Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt vier hohe Salzwäschen.
      10. Fügen Sie 500 μL Low Salt Wash Buffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,1 % Tween-20) zur Spin-Säule hinzu. Zentrifugieren Sie die Spin-Säule bei 1.000 x g für 2 Minuten bei 4 °C und entsorgen Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt zwei Salzarme Waschungen.
      11. Fügen Sie 500 μL ATP Wash Buffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,1 % Tween-20, 10 mM ATP) zur Spin-Säule hinzu. Verstopfe den Boden der Spin-Säule und inkubiere 5 Minuten bei 4 °C. Die Spin-Säule abziehen und bei 1.000 x g für 2 Minuten bei 4 °C zentrifugieren und den Durchfluss entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt vier ATP-Waschungen.
      12. Führen Sie eine Endwäsche durch, indem Sie 500 μL Low Salt Wash Buffer zur Spin-Säule hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Spin-Säule bei 1.000 x g für 2 Minuten bei 4 °C und entsorgen Sie den Durchfluss.
    4. Protein-Elution durch 3xFlag-Peptid.
      1. Tupfen Sie den unteren Teil der Säule mit einem Fusselfeuchter ab, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und verschließen Sie den unteren Teil der Säule.
      2. Fügen Sie 55 μL 3xFlag Elution Buffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,1 % Tween-20, 300 μg/mL 3xFlag Peptid) direkt über das Harz hinzu.
      3. Versiegeln Sie die Öffnung der Spin-Säule mit Parafilm und setzen Sie die Säule in ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenrohr.
      4. Inkubieren Sie die Spin-Säule vertikal auf einem Nutator für 60 Minuten bei 4 °C.
        HINWEIS: Um die Spin-Säule senkrecht zu halten, montieren Sie ein Mikrozentrifugenröhrengestell mit Gummibändern am Nutator.
      5. Entfernen Sie den Parafilm und den Spin-Säulen-Stopfen. Sammeln Sie das eluierte rekombinante SLFN14Myc-Flag-Protein in einem sauberen 1,7-mL-Mikrozentrifugenrohr durch Zentrifugation bei 1.000 x g für 2 Minuten bei 4 °C.
      6. Behalte 50 μL Anti-Flag-Harz-Eluat für die nachfolgende Größenausschlusschromatographie und 5 μL für die SDS-PAGE-Analyse.
  2. Größenausschlusschromatographie.
    Führen Sie das Größenausschlusschromatographieprotokoll mit Low Salt Desalting Buffer (150 mM NaCl) für Standard-SLFN14Myc-Flag-Proteinanalysen oder High Salt Desalting Buffer (500 mM NaCl) für apo SLFN14Myc-Flag-Charakterisierung durch.
    1. Kombinieren Sie zwei 50 μL Anti-Flag-Harz-Eluate aus Schritt 2.1.4.6 zu einer Gesamtprobe von 100 μL.
    2. Bereiten Sie eine 0,5 mL Spin-Entsalzungssäule mit einem 40 kDa Molekulargewichts-Cutoff vor, indem Sie die Kappe lockern, den unteren Verschluss entfernen und die Säule in ein 2-mL Mikrozentrifugenrohr einsetzen.
    3. Zentrifugieren Sie die Spin-Entsalzsäule bei 700 x g für 1 Minute bei 4 °C, um die Säulenspeicherlösung zu entfernen. Verwerfen Sie den Durchfluss.
    4. Füge 300 μL Niedrig- oder Hohe Salzentsalzungspuffer (20 mM Tris pH 7,4, 150/500 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM TCEP) zur Spin-Entsalzungssäule hinzu. Zentrifugieren Sie die Spin-Säule bei 700 x g für 1–2 Minuten bei 4 °C und entsorgen Sie den Durchfluss. Führen Sie diesen Schritt dreimal aus, um die Säule vollständig auszugleichen.
    5. Tupfen Sie den unteren Teil der Spin-Entsalzsäule mit einem Flusenarmen Feuchttuch ab.
    6. Übertragen Sie die Spin-Entsalzungssäule in ein sauberes 1,7-ml-Mikrozentrifugenrohr.
    7. Fügen Sie 100 μL kombiniertes Anti-Flag-Harz-Eluat (siehe Schritt 2.2.1) in die Mitte des Säulenbetts hinzu, ohne das Harz zu stören.
    8. Elutieren Sie das rekombinante SLFN14Myc-Flag-Protein , indem Sie die Spin-Entsalzsäule bei 700 x g für 2 Minuten bei 4 °C zentrifugieren.
    9. 95 μL rekombinantes Protein für die molekulare Charakterisierung und 5 μL für die SDS-PAGE-Analyse zurückhalten.
  3. Charakterisierung der gereinigten rekombinanten SLFN14Myc-Flag-Proteinprobe .
    1. Führen Sie eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) durch.
      1. Kombinieren Sie 5 μL 2x Laemmli-Probenpuffer mit 5 μL Aliquoten der Probe, die in verschiedenen Phasen des Reinigungsprotokolls gesammelt wurden.
      2. Proben bei 95 °C 5 Minuten erhitzen.
      3. Lösen Sie eine breit angelegte Proteinleiter zusammen mit 10 μL Proben-Laemmli-Puffermischung mit 4-15 % SDS-PAGE bei 200V für 30 Minuten auf.
      4. Visualisieren Sie die Proteinbänder, indem Sie das Gel 30 Minuten lang mit Coomassie G-250 Farblösung auf einem Orbitalshaker färben und das Gel mit deionisiertem Wasser auf einem Orbitalshaker entfärben, bis der Hintergrund klar ist.
      5. Untersuchen Sie die resultierenden Proteinbänder, um sicherzustellen, dass die aus Schritt 2.2.9 gewonnene Probe ein einziges Proteinband ist, das dem theoretischen Molekulargewicht von 107,5 Kilodalton (kDa) entspricht, das dem SLFN14Myc-Flag entspricht.
    2. Quantifizieren Sie Protein und Nukleinsäure mittels UV/vis-Spektrophotometrie.
      1. Blenden Sie ein Mikrovolumenspektrophotometer mit 2 μL entweder Low- oder High-Salt Desalting Buffer, das zum Proteinspeicherpuffer passt.
      2. Misse die Absorption bei 260 nm und 280 nm aus 2 μL des zurückgewonnenen rekombinanten SLFN14Myc-Flag-Proteins (siehe Schritt 2.2.9) mit einem Mikrovolumenspektrophotometer.
      3. Berechnen Sie die rekombinante SLFN14Myc-Flag-Proteinkonzentration unter Verwendung der aufgezeichneten Absorption bei 280 nm und ihres Extinktionskoeffizienten (93330 M-1 cm-1) mit dem Beer-Lambert-Gesetz20.
      4. Berechnen Sie das Probenabsorptionsverhältnis A260/280, indem der bei 260 nm angegebene Absorptionswert durch den bei 280 nm gemessenen Absorptionswert geteilt wird, um festzustellen, ob Nukleinsäure mit dem rekombinanten SLFN14Myc-Flag-Protein co-purifiziert.
        HINWEIS: Ein A260/280-Verhältnis über 0,7 deutet wahrscheinlich auf das Vorhandensein von Nukleinsäure21 hin.
    3. Quantifizieren Sie zelluläre RNA mittels Fluorometrie.
      1. Quantifizieren Sie den RNA-Gehalt mit 1-3 μL des zurückgewonnenen rekombinanten Proteins aus Schritt 2.2.9 unter Verwendung eines hochsensitiven RNA-spezifischen fluoreszierenden Farbstoffs22.

3. Analyse der Molekularmasse von SLFN14Myc-Flag mittels Massenphotometrie

  1. Aufbau von Massenphotometerinstrumenten.
    1. Schalten Sie den Laser mit dem Schalter auf der Rückseite der Elektronikbox des Massenphotometers ein.
    2. Schalte das Isolationsdeck ein und klicke auf den "Isolation"-Button, um Instrumentenvibrationen zu minimieren.
    3. Öffnen Sie die AcquireMP-Software.
    4. Warte eine Stunde, bis das Instrument das thermische Gleichgewicht erreicht hat.
  2. Cover-Folien-Vorbereitung.
    1. Halten Sie eine Glasabdeckung mit einer weichen Pinzette in vertikaler Position.
    2. Spülen Sie beide Seiten des Glasdeckel-Objektträgers mit ultrareinem Typ-I-Wasser, gefolgt von Isopropylalkohol. Wiederholen Sie diesen Schritt insgesamt dreimal.
    3. Spülen Sie beide Seiten des Glasdeckel-Objektträgers ein letztes Mal mit Typ-I-Ultrareinwasser für 45 Sekunden ab.
    4. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Wassertropfen von der Glasabdeckung durch Aspiration mit einer sauberen Pipettenspitze, die an eine Vakuumleitung angeschlossen ist.
    5. Bewahre den sauberen Glasdeckel-Objektträger in einer mit Linsenpapier ausgekleideten Plastikbox auf, um sie zum Massenphotometer zu transportieren.
  3. Montiere den Deckelverschluss am Instrument.
    1. Setzen Sie eine 6-Well-Siliziumdichtung mit einer weichen Pinzette auf das Metallausrichtungswerkzeug.
    2. Setzen Sie den sauberen Glasdeckelverschluss von Schritt 3.2.5 auf die Siliziumdichtung und drücken Sie mit der weichen Pinzette leicht um die Siliziumdichtung herum.
      HINWEIS: Üben Sie keinen Druck auf die Probenbohrungen aus.
    3. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Oculus des Massenphotometers.
    4. Drehen Sie den Glasdeckelverschluss so, dass die Silikondichtung nach oben zeigt, und setzen Sie den Glasdeckelverschluss vorsichtig mit einer weichen Pinzette auf den Oculus.
    5. Sichern Sie die obere linke und untere rechte Ecke des Glasdeckelverschlusses mit Magneten.
    6. Wählen Sie unter lateraler Steuerung das obere linke Bohrloch in der AcquireMP-Software aus, um den Laser mit der Mitte des Wells auszurichten.
  4. Analysen von Proteinstandards mit großem Spektrum.
    1. Bereiten Sie eine Lösung mit 50-fachem Breitkaliber (90 kDa bis 1 MDa) vor, indem Sie 1 μL eines 500-fachen Kaliberbestands in 9 μL 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung verdünnen.
    2. Bereiten Sie ein 5-fach-Kaliber-Arbeitsmaterial vor, indem Sie 2 μL der 50-fach-breitkalibrigen Lösung aus Schritt 3.4.1 in 18 μL 1-fach phosphatgepufferte Kochsalzlösung kombinieren.
    3. Fügen Sie 10 μL 0,22 μm gefilterten Low- oder High Salt Desalting Buffer in das leere Bohrloch ein.
      HINWEIS: Es ist wichtig, den gefilterten Puffer in diesem Schritt mit dem Puffer abzugleichen, der zur Vorbereitung der SLFN14Myc-Flag-Probe in Schritt 2.2.9 verwendet wurde.
    4. Schließ den Deckel.
    5. Unter Fokus finden Sie in der AcquireMP-Software auf "Tröpfchenverdünnung" klicken, um den korrekten Fokus des Probenschachts zu bestimmen.
    6. Gib 10 μL des 5-fachen Kaliber-Arbeitsmaterials zum Puffertropfen (siehe Schritt 3.4.3) und pipette vorsichtig auf und ab, um die Lösung zu mischen.
    7. Schließ den Deckel.
    8. Überprüfen Sie die Instrumenteneinstellungen, um sicherzustellen, dass die Werte für Bewegung, Signal, Sättigung und Schärfe stabil und optimal sind.
      HINWEIS: Optimale Werte erscheinen blau, und Ausreißer sind orange gefärbt.
    9. Klicken Sie in der AcquireMP-Software auf "aufnehmen", um ein 60-sekündiges Video aufzunehmen.
    10. Speichere die Ergebnisdatei (.mpr) mit einem beschreibenden Titel und Zeitstempel.
  5. Erstellen Sie eine Kalibrierungskurve.
    1. Öffnen Sie die DiscoverMP-Software.
    2. Klicken Sie unter Messungen auf die Schaltfläche "+ öffnen" und navigieren Sie zur Kalibrant-Ergebnisdatei aus Schritt 3.4.10.
    3. Doppelklicken Sie auf die angegebene Proteinstandardsdatei, um die Ergebnisse einzusehen.
    4. Unter der Plot-Konfiguration passen Sie die Kontrastgrenzen auf 0,00000 bzw. -0,03000 an.
    5. Definieren Sie manuell eine Gaußsche Kurve für die ersten vier Protein-Standardspitzen, indem Sie den Cursor über jeden einzelnen Peak ziehen.
    6. Klicken Sie auf "Erstellen" und wählen Sie "Massenkalibrierung".
    7. Unter der Kaliberkopfzeile wird jedem angepassten Kaliberpeak vom Schritt 3.5.5 seine bekannte Molekularmasse von 86, 172, 258 bzw. 344 kDa zugeordnet.
    8. Überprüfen Sie, dass die Kalibrierungskurve einenR2 nahe 1,0 und einen maximalen Massenfehler (MME) von weniger als 2 % aufweist.
    9. Klicken Sie auf "Kalibrierung bestätigen" und speichern Sie die Kalibrierungskurvendatei (.mc).
      HINWEIS: Das Massenphotometer sollte jede Stunde neu kalibriert werden.
  6. Analyse des rekombinanten SLFN14Myc-Flag-Proteins unter Bedingungen mit niedrigem und hohem Salzgehalt.
    1. Bereite eine 50-μL-Lösung aus 50 nM rekombinantem SLFN14Myc-Flag-Protein vor (siehe Schritt 2.2.9) mit dem Low Salt Desalting Buffer für die Standardprobenanalyse unter physiologischen Salzbedingungen oder dem High Salt Desalting Buffer für die Charakterisierung der apo-Proteinproben.
    2. Zentrifugiere die 50 nM rekombinante SLFN14Myc-Flag-Proteinmischung bei 21.300 x g für 10 Minuten bei 20–25 °C, um potenzielle Proteinaggregate und Staub zu entfernen.
    3. Unter lateraler Steuerung klickst du in der AcquireMP-Software auf "Nächster Brunnen".
    4. Laden Sie 10 μL 0,22 μm gefilterten Low oder High Salt Desalting Buffer in den Brunnen und schließen Sie den Deckel.
      HINWEIS: Es ist wichtig, den gefilterten Puffer in diesem Schritt mit dem Puffer abzugleichen, der zur Vorbereitung der SLFN14Myc-Flag-Probenverdünnung in Schritt 3.6.1 verwendet wird.
    5. Klicken Sie unter "Fokus finden" auf "Tröpfchenverdünnung", um den richtigen Fokus des neuen Probenbohrlochs zu bestimmen.
    6. Laden Sie 10 μL der 50 nM rekombinanten SLFN14Myc-Flag-Proteinlösung aus Schritt 3.6.2 in den Puffertropfen und pipieren Sie vorsichtig, um die Probe zu mischen.
    7. Schließen Sie den Deckel und stellen Sie die optimalen Instrumenteneinstellungen sicher, wie in Schritt 3.4.8 beschrieben.
    8. Klicken Sie in der AcquireMP-Software auf "aufnehmen", um ein 60-sekündiges Video aufzunehmen.
      HINWEIS: Die optimale Massenauflösung wird durch ein 60-sekündiges Video mit etwa 1.000–4.000 Gesamtzählungen erreicht.
    9. Speichere die Ergebnisdatei (.mpr) mit einem beschreibenden Titel und Zeitstempel.
  7. Berechnung der Molekularmasse und Stöchiometrie des rekombinanten SLFN14Myc-Flag-Proteins .
    1. Unter Messungen in der DiscoverMP-Software klicken Sie auf die Schaltfläche "+ öffnen", um die Ergebnisdatei aus Schritt 3.6.9 auszuwählen.
    2. Unter Kalibrierungen doppelt klicken Sie auf die Kalibrierungskurvendatei, die in Schritt 3.5.9 erstellt wurde, um die Kalibrierung anzuwenden.
    3. Definieren Sie manuell eine Gaußsche Kurve für jede beobachtete SLFN14Myc-Flag-Spezies , indem Sie den Cursor über jeden Peak ziehen, um einen berechneten Molekularmassewert zu erhalten.
    4. Berechnen Sie die durchschnittliche Molekülmasse jeder oligomeren Spezies aus drei unabhängigen Messungen sowie deren entsprechender Standardabweichung.
    5. Bestimmung der Stöchiometrie des rekombinanten SLFN14Myc-Flag-Proteins durch Berechnung der durchschnittlich berechneten Molekülmasse mit ganzen Zahlen des theoretischen Massenwerts des SLFN14Myc-Flag-Protomers .
      HINWEIS: Die theoretische Masse eines SLFN14Myc-Flag-Monomers beträgt 107,5 kDa, ein Dimer 215 kDa, ein Trimer 322,5 kDa und ein Tetramer 430 kDa.

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Ergebnisse

Ein Säugetiervektor, der für die vorübergehende Genexpression eines vollständigen rekombinanten menschlichen SLFN14Myc-Flag-Proteins entwickelt wurde, ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein zweistufiger Reinigungsablauf zeigt die Isolierung des SLFN14Myc-Flag-Proteins aus HEK293-Zellen (Abbildung 2A). Ein erfolgreiches repräsentatives Denaturierungsgel des gereinigten SLFN14Myc-Flag-Proteins ist in ...

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Diskussion

Mehrere entscheidende Schritte unterstreichen die Leistungsfähigkeit und Vielseitigkeit dieses Proteinproduktionsprotokolls. Um den Ertrag rekombinanter Proteine zu maximieren, nutzen wir HEK293-Zellen, die eine hohe Aufnahme fremder Plasmid-DNA aufweisen und in Suspension kultiviert werden können, um die Zelldichte im gesamten Mediumvolumen23 zu maximieren. Das PEI-Transfektionsreagenz wird in diesem groß angelegten Transgen-Lieferprotokoll verwendet, da es eine ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken den Mitgliedern des Pillon-Labors für ihre kritische Lektüre dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom Extramural Research Program des US National Institute of Health und dem National Institute of General Medical Sciences (NIGMS; R35GM147123 zu M.C.P.) an das Baylor College of Medicine ausgegeben, und an die State University of New York in Buffalo übertragen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-Mercapptoethanol (b-Me)SigmaM3148-500ML14,3 M Lösungs-Tock
AcquireMP 2024 R2Refeyn/Datenerfassungssoftware
Adenosin-5'-Triphosphatdinatriumnatrium-Trihydrat (ATP)Chem-Impex International00015-100GLösung auf pH-Wert 7,0 anpassen
Anti-Flag M2 AffinitätsgelMilliporeA2220Anti-Flaggen-Affinitätsharz
BenzamidinhydrochloridhydratSigmaB6506-25GProteaseinhibitor
Breitband-Proteinstandards (10–250 kDa)Bio-RadP7719SStandards für vorgefärbtes Protein
Gräfin 3InvitrogenA49862Automatisierter Zellzähler
DiscoverMP v2024 R2Refeyn/Datenanalyse-Software
Dulbeccos phosphatgepufferte KochsalzlösungCorning21-031-CV1x-Lösungsschaft
DYKDDDDK-PeptidThermo Fisher ScientificA368053xFlag-Peptid
FreeStyle 293-F-ZellenThermo Fisher ScientificR79007Säugetier-Suspensionszellen
Geniust M Nuklease DMF eingereichtSanta Cruzsc-391121BUniversalnuklease
HyClone CDM4HEK293 MedienCytivaSH3085802Serumfreies Wachstumsmedium
HyClone SFM4Transfx-293 MedienCytivaSH3086002Transienten Transfektionsmedium
Immersol 518FZeiss4Y00-R0DY-1007-3BF3Immersionsöl
IsopropylalkoholMacron Feinchemikalien3032-02
Laemmli-SamplepufferBio-Rad16107372x-Lösungsstock
LeupeptinVWRJ580-25MGProteaseinhibitor
Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2)Fisher ScientificM33-500
MassFerence P1 RefeynMP-CON-41033500x Kaliberschaft
MassGlass UC MustervorbereitungssetRefeynMP-CON-21022Schlitten und Dichtung
Mikro-Biospin-SäuleBio-Rad7326204Leere Polypropylen-Spin-Säule
Milli-Q IQ 7000 SystemMilliporeZIQ7000T0CTyp-I-Ultrareins Wasser
Mini-Protean TGX fleckfreie GelsBio-Rad45680864–15 % SDS-PAGE
Minitron mit Feuchtigkeit, Kühlung und CO2Infors72175Inkubator-Shaker
MP-AusrichtungssetRefeynMP-CON-21019Ausrichtungswerkzeug, weiche Pinzette, Magnet
NanophotometerImplenNP80UV-Vis-Spektrophotometer
NutatorMarke Clay Adams421105
Pepstatin ASanta Cruzsc-45036BProteaseinhibitor
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)Research Products InternationalP20270-25.0Proteaseinhibitor
Polycarbonat-Shake-Kolben Duran Wheaton KimbleWPFBC1000Sbelüftete, gelüftete Bodenflasche
Polyethylenimin (PEI) MW 40.000Polywissenschaften24765Transfektionsreagenz
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33226
Qubit-RNA-Hochsensitivitäts-Assay-KitThermo Fisher ScientificQ32852Quantifizierung mit RNA-spezifischem Farbstoff
SimplyBlue SafeStainThermo Fisher ScientificLC6065Coomassie G-250
SLFN14-Expressionsplasmid-DNAOrigeneRC226257menschenmarkierter ORF-Klon
Natriumchlorid (NaCl)Millipore1.37017
Tris, pH 7,4Thermo Fisher ScientificJ60202. K21 M gepufferte Lösung
Tris (2-Carboxyethyl) Phosphinhydrochlorid (TCEP)GoldbiotechnologieTCEP10TCEP
Triton X-100VWRM143-1LWaschmittel
Trypan-Blau-BeizeThermo Fisher ScientificT102820,4 % Lösungsaktie
Tween 20VWR0777-1LWaschmittel
TwoMPRefeynMP-PRO-00001Massenphotometer
Zeba 40K Desaltin-SäuleThermo Fisher ScientificA57759Größenausschlusschromatographie

Referenzen

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