Methodenartikel

Kartierung der Morphologie hepatischer stellater Zellen in Mausmodellen der Leberfibrose

DOI:

10.3791/70396

⸱

13. Februar 2026

 , 
1Division of Liver Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll bietet eine umfassende Bildgebende Pipeline, um die Morphologie hepatischer Stellatenzellen im intakten Lebergewebe zu visualisieren und zu modellieren. Dieser Ansatz kombiniert fluoreszierende Markierung von Fibroblasten mittels Mausgenetik, in situ leberperfusionsbasierte Gewebevorbereitung und eine modifizierte iDISCO-Gewebereinigungsmethode, um optische Transparenz zu erreichen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geweberesidente Fibroblasten sind die zellulären Treiber der Fibrose in Geweben. Innerhalb der Leber aktivieren sich hepatische stellate Zellen (HSCs), die ansässigen Perizyten mit ihrer einzigartigen "sternartigen" Morphologie, während der Verletzung zu fibrogenen Myofibroblasten und bilden so die Lebernarbe. Obwohl jahrzehntelange Arbeit die wichtigsten Signalwege hinter der HSC-Aktivierung aufklärte, bleibt die funktionale Bedeutung ihrer eigenständigen dendritischen Morphologie aufgrund technischer Einschränkungen bei Bildgebung und Analyse schwer fassbar. Dieses Protokoll bietet eine umfassende Bildgebungspipeline zur Visualisierung und Modellierung der HSC-Morphologie im intakten Lebergewebe. Dieser Ansatz kombiniert fluoreszierende Markierung von HSCs mittels Mausgenetik, in situ leberperfusionsbasierte Gewebevorbereitung und eine modifizierte iDISCO-Gewebereinigungsmethode, um optische Transparenz bei Gewebeproben zu erreichen, die mehrere Zentimeter dick sein können. Freigegebene Proben werden mit optimierten konfokalen Mikroskopieplattformen abgebildet, und Bilddatensätze werden durch einen maßgeschneiderten Analyse-Workflow für die dreidimensionale Rekonstruktion einzelner HSCs mit Einzelzellauflösung verarbeitet. Zusammen ermöglicht diese Pipeline eine reproduzierbare Abbildung der HSC-Morphologie innerhalb der komplexen Lebermikroumgebung, einschließlich ihrer dendritischen Prozesse und räumlicher Beziehungen zu benachbarten Zellen. Abgesehen von der Leber ist der Arbeitsablauf anpassungsfähig an Fibroblasten in anderen Organen wie Lunge, Niere, Darm und Herz, wo ansässige mesenchymale Zellen ähnliche fibrogene Rollen bei Krankheiten aufweisen. Der vorgeschlagene Rahmen schafft somit eine methodische Grundlage für vergleichende organübergreifende Studien, um die Zusammenhänge zwischen Fibroblastenstruktur und Funktion sowie therapeutische Verwundbarkeiten bei fibrotischen Erkrankungen zu untersuchen.

Einleitung

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Fibrose, oder pathologische Narbenbildung von Gewebe, ist der letzte gemeinsame Weg für fast alle chronischen Organerkrankungen und trägt zu etwa 40 % der Todesfälle in Industrieländernbei. In der Leber entsteht Fibrose durch chronische Verletzungen wie virale Hepatitis, Alkoholkonsum oder zunehmend durch metabolische Dysfunktion assoziierte steatotische Lebererkrankung (MASLD), die derzeit 30–40 % der Erwachsenen in den USA betrifft. Chronische Verletzungen der Leber und die daraus resultierende fortschreitende Fibrose erhöhen das Risiko für Endstadium-Lebererkrankungen wie Zirrhose, Leberversagen und hepatozelluläres Karzinomdrastisch 2. 3,4,5.

Hepatische stellate Zellen (HSCs) sind zentral für die Leberhomöostase und Fibrogenese. In gesunden Lebern befinden sich HSCs in einem ruhigen, Vitamin-A-Speicherzustand und tragen zur Homöostase der Hepatozyten und insgesamt dergesamten Leber bei 6,7. Dies zeigt sich eindeutig in HSC-Depletionsstudien, bei denen die Entfernung nahezu aller HSCs in gesunder Leber die Lebermasse verringert und dieLeberregeneration stark einschränkt. 7,8. Nach einer Verletzung aktivieren sich HSCs zu myofibroblastähnlichen Zellen, die sich vermehren, in beschädigte Bereiche wandern und eine übermäßige extrazelluläre Matrix (ECM) erzeugen, wodurch fibrotische Narben entstehen. Aktivierte HSCs in fibrotischen Lebern sind auch die Quelle krebsassoziierter Fibroblasten und spielen tumorfördernde Rollen beim hepatozellulären Karzinom 9,10,11,12. Ruhe-HSCs besitzen eine einzigartige, neuronartige Morphologie mit kleinen Zellkörpern, von denen aus Langstreckenprojektionen austreten. HSCs verändern sich bei Aktivierung bei Fibrose13 zu einer flachen, blattartigen Myofibroblastenform. Obwohl jahrzehntelange Arbeit die Signalwege, die die ECM-Produktion durch HSCs steuern, aufgeklärt haben, bleibt die funktionelle Bedeutung ihrer besonderen neuronalen Morphologie, deren Regulierung, ob sie Interaktionen innerhalb der HSC-Nische fördern und zur HSC-Fibrogenität und -Erkrankung beitragen könnte, schwer fassbar14,15.

Aktuelle Methoden zur Visualisierung der Morphologie von HSCs beschränken sich auf zweidimensionale (2D) Bilder entweder von in vitro kultivierten Zellen oder in vivo Gewebeschnitten und erfassen selten die gesamte HSC-Morphologie, wobei Projektionen mehrere Zellkörperlängen in alle Richtungen umfassen. Außerdem kann der am häufigsten verwendete HSC-Marker, Desmin, die einzigartige neuronartige Morphologie der HSCs bei der Immunfluoreszenzfärbung nicht vollständig erfassen, da Desmin ein Zytoskelettprotein ist, das nur Zwischenfilamente innerhalb vonHSCs 16 markiert. Diese methodischen Herausforderungen erschwerten bisher die Fähigkeit, die HSC-Morphologie und ihre zellulären Interaktionen in dreidimensionaler (3D) Weise in ihrem natürlichen Kontext bei Einzelzellauflösung vollständig zu erfassen. Daher sind grundlegende Fragen darüber, wie die HSC-Morphologie mit ihrem funktionellen Zustand und den Wechselwirkungen mit benachbarten Zelltypen zusammenhängt, ungelöst geblieben.

Dieser Artikel präsentiert eine innovative und umfassende Bild- und Analysepipeline zur Visualisierung und Modellierung der HSC-Morphologie im intakten Lebergewebe. Diese Methode integriert mehrere wichtige Innovationen: (1) fluoreszierende Markierung von HSCs mittels genetischer Reporter-Mausmodelle, (2) optimierte In-situ-Leberperfusion und -fixierung zur Erhaltung der intakten Gewebearchitektur und zellulären Beziehungen, (3) ein modifiziertes iDISCO-basiertes Gewebereinigungsprotokoll zur Erreichung optischer Transparenz17, (4) hochauflösende konfokale Mikroskopie für die Aufnahme von Tiefengewebsbildern und (5) einen maßgeschneiderten computergestützten Workflow für 3D-Bildrekonstruktion und quantitative Analyse einzelner HSCs. Das Protokoll legt bestimmte Einschränkungen hinsichtlich der Gewebegröße und des Zeitaufwands fest, die berücksichtigt werden müssen. Zusammen bietet dieses Protokoll einen robusten und reproduzierbaren Rahmen zur Erfassung der komplexen 3D-Struktur von HSCs und zur Abbildung ihrer räumlichen Beziehungen zu benachbarten Gefäß-, Immun- und Parenchymalzellen. Die hier vorgestellten Strategien und Pipelines für die Leber sind ebenfalls leicht an andere Organe anpassbar.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle in dieser Studie verwendeten Mausexperimente wurden vom Icahn School of Medicine am Mount Sinai Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Entstehung von Mäusen mit tdTomato (TdT)-markierten HSCs

  1. Richtete Tg(lox-stop-lox-TdTomato) x Tg(Lrat:Cre) Züchter ein (Jackson Laboratories Stamm #00791420 und Mutant Mouse Resource & Research Centers (MMRRC) Stamm #06959521-JAX).
    HINWEIS: Erwarten Sie nach 3 Wochen Streu. Verwenden Sie LratCre-Weibchen zur Fortpflanzung, da in der männlichen Keimbahn einige Cre-Expression nachgewiesen wurde.
  2. Sammeln von Schwänzen und Genotyp-F1-Wurf zur Identifizierung von Tg (Lrat:Cre); Tg(LSL-TdT)-Mäuse, die das TdTomato-Fluorophor selektiv in hepatischen stellaten Zellen exprimieren.

2. In-situ-Leberperfusion und -fixierung

  1. Vorbereitung vor der Operation
    1. Bereiten Sie eine Ketamin/Xylazin-Mischung für die Mäusenästhesie vor, indem Sie 2 ml Ketamin, 1 ml Xylazin und 7 ml Wasser mischen.
      HINWEIS: Ketamin ist eine kontrollierte Substanz und erfordert eine ordnungsgemäße Zulassung und Regulierung für den Laborgebrauch.
    2. Bereiten Sie die Perfusionslösung mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor.
    3. Richte die peristaltische Pumpe ein, indem du 1x PBS durch das Rohr fließen lässt und die Durchflussrate auf 2 mL/min stellst.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblase im Rohr befindet.
  2. Wiegen Sie die Maus, um die Menge der Ketamin/Xylazin-Mischung zu bestimmen, die injiziert werden soll.
  3. Injizieren Sie die Ketamin/Xylazin-Mischung intraperitoneal in die Maus.
    HINWEIS: Injizieren Sie 200 μL der Mischung für jeweils 20 g Mausgewicht.
  4. Setzen Sie die Maus in einen Behälter mit Deckel und warten Sie etwa 20 Minuten, bis die Maus vollständig betäubt ist.
    HINWEIS: Kneif den Mauszeh, um das Fehlen eines Reflexes zu überprüfen. Stellen Sie sicher, dass die Maus noch lebt, wenn die Perfusion beginnt.
  5. Übertragen Sie die Maus vom Glasbehälter auf die Operationsplattform in der Rückenlage.
    VORSICHT: PFA ist giftig und volatil; Führen Sie daher das Perfusionsverfahren in einer chemischen Haube durch. Sammeln und entsorgen Sie den PFA-Durchfluss ordnungsgemäß gemäß den institutionellen Biosicherheitsrichtlinien.
  6. Kneifen Sie die Handflächen des Mausfußes mit einer Zange, um sicherzustellen, dass die Maus keine Reflex- oder Spasmenbewegungen zeigt.
  7. Stiche vier Handflächen mit Nadeln, um den Bauch der Maus zu spreizen.
  8. Besprühe den Bauch mit 70 % Ethanol, um das Fell zu benetzen.
  9. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut in der Mitte des Bauches aufzuheben, richten Sie sich mit den Hinterbeinen aus und beginnen Sie, die Haut (beide Schichten) zu schneiden, um den Bauch freizulegen.
  10. Verwenden Sie PBS-Nasswattebäbchen, um Därme und andere Organe zur Seite zu bewegen und den linken Lappen anzuheben.
  11. Schneiden Sie vorsichtig die Membran zwischen linkem Lappen und Caudatus durch.
  12. Verwenden Sie eine Naht, um an der oberen Basis des linken Lappen zu binden.
  13. Schneiden Sie den linken Lappen unterhalb des Nahtknotens ab und legen Sie den linken Lappen für die Entnahme und Verarbeitung von Gewebeproben beiseite, abhängig von experimentellen Bedürfnissen (z. B. direktes Einfrieren in flüssigem Stickstoff, Einbettung in eine Optical Cutting Temperature (OCT)-Verbindung oder Formalinfixierung).
  14. Verwenden Sie PBS-Nasswattenstöbchen, um die Leber zu bewegen und die Pfortvene freizulegen.
  15. Führen Sie die Katheternadel vorsichtig etwa auf halber Höhe der Länge der Pfortvene in die Paldrene ein.
    HINWEIS: Um das Einführen des Katheters zu erleichtern, heben Sie den Körper der Maus, indem Sie eine Pinzette unter den Körper legen, um eine flachere Oberfläche zu gewährleisten. Richten Sie die Katheternadel vor dem Einsetzen sorgfältig so parallel wie möglich zur Pfortvene aus.
  16. Entfernen Sie die Katheternadel.
    HINWEIS: Stellen Sie einen Rückfluss des Blutes durch den Katheter sicher, um eine erfolgreiche Einführung anzuzeigen.
  17. Starten Sie die Perfusionspumpe mit einer Durchflussrate von 2 mL/min, verbinden Sie den Schlauch mit dem Katheter und perfundieren Sie die Leber mit 20 mL 1x PBS.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Katheter vollständig mit Blut gefüllt ist und der Schlauch vollständig mit dem Perfusionspuffer gefüllt ist, bevor Sie sie anschließen, damit absolut keine Luftblasen ins System gelangen.
  18. Klemmen Sie die Lungenarterie oberhalb der Leber mit einem Hämostat ab, um zu verhindern, dass das 1-fache PBS durch das Herz gelangt.
  19. Schneide die untere Vena cava durch, um den Druckaufbau abzubauen.
  20. Stellen Sie die Pumpengeschwindigkeit auf 5 mL/min ein.
    HINWEIS: Planen Sie etwa 15 Minuten ein, um die Perfusion zu beenden.
  21. Stoppe die Pumpe, um den Behälter auf 4 % PFA zu stellen.
    HINWEIS: Achte darauf, keine Luftblasen in das Rohr zu bringen, indem du die Pumpe stoppst, während noch Flüssigkeit im Behälter ist.
  22. Durchsickern Sie die Leber mit 25 ml 4 % PFA.
  23. Sobald die Perfusion abgeschlossen ist, entfernen Sie die Leber aus den umliegenden Organen, indem Sie die verbindenden Gewebe durchtrennen.
  24. Setzen Sie die Leber in ein 50 ml konisches Rohr, gefüllt mit 25 ml 4 % PFA.
  25. Stellen Sie das Rohr horizontal auf eine Schaukelplattform für 1 Stunde bei Raumtemperatur bei 1,5 U/min, um die Lösungsbewegung zu gewährleisten.
  26. Waschen Sie die Leber dreimal in 1x PBS auf einer Schaukelplattform für jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur bei 1,5 U/min.
  27. Lagere die Leber in 20 ml 1x PBS mit 0,02 % NaN3 bei 4 °C.
    HINWEIS: Lagern Sie die Leber in diesem Stadium langfristig, bis mindestens ein Jahr.

3. iDISCO+-basierte Gewebebeseitigung

HINWEIS: Die ursprüngliche Beschreibung des iDISCO+-Protokolls ist unter 17 zugänglich

Tag 1: Probenenttrocknung

  1. Schneiden Sie die Leberproben in Stücke mit einer Größe von etwa 0,5–1 cm3.
    HINWEIS: Schneiden Sie verschiedene Proben in unterschiedliche Formen, um die Erkennung während der Bildaufnahme zu erleichtern.
  2. Bereiten Sie 20 % (Vol/vol), 40 %, 60 % und 80 % Methanolverdünnungen in Wasser in separaten Glasflaschen vor.
  3. Leberproben in Glasphiolen mit Schraubverschluss (z. B. 4–7 ml) geben.
    HINWEIS: Geben Sie bis zu 6 Leberproben in ein 7-mL-Glasfläschchen.
  4. Die Probe wird mit der Methanolverdünnung in derH2-O-Reihedehydriert, 20 % (Vol/Vol), 40 %, 60 % und 80 % für jeweils 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Radrotator bei 8 U/min, ohne Zentrifugation.
  5. Waschen Sie die Probe mit einem weiteren 100%-Methanol auf einem Radrotator bei 8 U/min, ohne Zentrifugation für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
  6. Kühlen Sie die Probe bei 4 °C für 30 Minuten bis 1 Stunde.
  7. Bereite 66 % (Vol/vol) DCM-Verdünnungen in Methanol in einer Glasflasche vor.
    HINWEIS: Bereiten Sie jedes Mal neue Verdünnungen vor. Verwenden Sie Glaszylinder zur Herstellung der Lösung, da DCM Kunststoff wie Polystyrol lösen kann.
  8. Inkubieren Sie Proben in 66 % DCM/Methanol-Lösung über Nacht auf einem Radrotator bei 8 U/min bei Raumtemperatur, ohne Zentrifugation.
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, dass Proben nach dem Hinzufügen der Lösung nach oben schwimmen.

Tag 2: Bleichprobe

  1. Waschen Sie die Probe zweimal mit 100 % Methanol auf einem Radrotator bei 8 U/min, ohne dass bei Raumtemperatur jeweils 1 Stunde Zentrifugation stattfindet.
  2. Kühlen Sie die Probe bei 4 °C für 30 Minuten bis 1 Stunde.
  3. Bleichen Sie die Probe in gekühltem 5 % H2O2 in Methanol (1 Volumen von 30 % H2O2 bis 5 Bänden Methanol) auf einem Radrotator bei 8 U/min, ohne Zentrifugation, bei 4 °C über Nacht.
    HINWEIS: Bereiten Sie jedes Mal eine neue Lösung vor.

Tag 3-5: Probenpermeabilisierung

  1. Rehydrieren mit Methanol/H2O-Serie: 80 %, 60 %, 40 %, 20 %, 1x PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Radrotator bei 8 U/min, ohne Zentrifugation.
  2. Waschen Sie die Probe zweimal in PTx.2 (Tabelle 1) jeweils 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Radrotator bei 8 U/min, ohne dass Zentrifugation stattfindet.
  3. Inkubieren Sie die Proben in einer Permeabilisierungslösung (Tabelle 1) bei 37 °C für 2 Tage.

Tag 5-17: Immunkennzeichnung

  1. Blockieren Sie die Proben in der Blocklösung (Tabelle 1) für 2 Tage bei 37 °C.
    HINWEIS: Bereiten Sie jedes Mal eine frische Blockierungslösung vor, da das Eselserum instabil ist. Lagern Sie die übrig gebliebene Blocklösung bis zu einem Monat bei 4°C auf.
  2. Inkubieren Sie die Proben in primären Antikörpern, die in PTwH (Tabelle 1) verdünnt sind, mit 5 % DMSO und 3 % Donkey Serum bei 37 °C auf einem Radrotator bei 5 U/min, ohne Zentrifugation für 4 Tage.
    HINWEIS: Beginnen Sie mit einer primären Antikörperverdünnung von 1:500.
  3. Waschen Sie die Proben in PTwH 4-5 Mal für jeweils 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Radrotator bei 8 U/min, ohne dass Zentrifugation stattfindet.
    HINWEIS: Optional lassen Sie die Proben über Nacht zum Waschen stehen.
  4. Inkubieren Sie die Proben in sekundären Antikörpern und Propidiumiodid, die in PTwH mit 3% Donkey Serum bei 37 °C auf einem Radrotator bei 5 U/min verdünnt werden, ohne Zentrifugation für 4 Tage.
    HINWEIS: Beginnen Sie mit einer sekundären Antikörperverdünnung von 1:500. Verwenden Sie eine 1:250 Propidiodid-Verdünnung aus einer 5 mg/ml-Propidiodid-Lösung.
  5. Waschen Sie die Proben in PTwH 4-5 Mal für jeweils 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Radrotator bei 8 U/min, ohne dass Zentrifugation stattfindet.
  6. Lassen Sie die Probe über Nacht in PTwH, bei Raumtemperatur auf einem Radrotator mit 8 U/min, ohne Zentrifugation stattfinden.

Tag 18: Räumung

  1. Die Probe wird mit der Methanolverdünnung in derH-2-O-Seriedehydriert, 20 % (Vol/Vol), 40 %, 60 %, 80 % für jeweils 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Radrotator bei 8 U/min, ohne Zentrifugation.
  2. Waschen Sie die Probe zweimal mit 100 % Methanol in Rotation für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Radrotator bei 8 U/min, ohne dass Zentrifugation stattfindet.
  3. Inkubieren Sie die Probe in 66 % (Vol/vol) DCM-Verdünnungen in Methanol für 3 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Radrotator bei 8 U/min, ohne Zentrifugation.
  4. Waschen Sie die Probe zweimal mit 100 % DCM für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Radrotator bei 8 U/min, ohne dass Zentrifugation stattfindet.
  5. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei Raumtemperatur in DBE vor der Bildgebung.
  6. Lagern Sie die Proben langfristig in DBE bis zu 1 Jahr ohne Auswirkungen auf das Färbungssignal.

4. Konfokalmikroskopische Bildgebung

  1. Lege die geklärten Probe in eine 35-mm-Glasbodenschale mit einem Glasboden #1,5.
  2. Füllen Sie die Schale mit Ethyl-Cinnamat und tauchen Sie die Probe vollständig ein.
  3. Stellen Sie die Schüssel auf die Konfokalkamera und stellen Sie den Fokus ein, um die beste Ebene mit dem hellsten Signal zu finden.
  4. Nehmen Sie ein Kachelbild auf der hellsten Ebene auf, um einen großen Bereich der Probe mit dem Format 1024 x 1024 und 600 Geschwindigkeit zu erfassen.
    HINWEIS: Verwenden Sie ein niedrigeres Objektiv (10x oder 20x) für das Kachelbild, um die Bildzeit und Dateigröße zu verkürzen.
  5. Wählen Sie basierend auf dem Kachelbild interessante Bereiche aus, um einen Z-Scan mit höherer Auflösung zu erstellen.
  6. Nehmen Sie einen Z-Scan durch das freigegebene Gewebe auf, der die gesamte Gewebetiefe mit der besten Auflösung des Mikroskops abdeckt, mit dem Format 1024 x 1024 und Geschwindigkeit 600.
    HINWEIS: Verwende ein 40x-Objektiv bei Ölimmersion, um die beste Auflösung für HSC zu erzielen.
  7. Speichere Bilddateien im LIF-Format und schaue Dateien mit Fiji oder ImarisViewer 11.0.0 an.

5. Bildanalyse für 3D-Rekonstruktion und quantitative Analyse einzelner HSCs

  1. Konvertiere Bilddateien in das IMS-Format mit dem ImarisFileConverter 10.2.0.
  2. Verwenden Sie das Surface-Modell auf Imaris 10.2.0, um das Objekt in den Bildern zu erkennen.
  3. Verwenden Sie den Erstellungsassistenten, um eine Analyse eines ausgewählten 3D-Interessenbereichs durchzuführen, und wenden Sie ihn dann auf das gesamte Bild an.
    HINWEIS: Nutzen Sie dies, um den Analyseprozess zu beschleunigen.
  4. Wählen Sie den Quellkanal, absolute Intensität und deaktivieren Sie die Glatt-Taste, um die Intensitätsschwelle für das gesamte Bild zu definieren.
  5. Ändern Sie die Schwelle, um alle Objekte im Bild zu erfassen.
  6. Nutze die Anzahl der Voxels, um Trümmerobjekte herauszufiltern.
  7. Mach den Assistenten fertig, drücke den Statistik-Button, um alle statistischen Werte zu erhalten.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die erfolgreiche Durchblutung und Fixierung der Mausleber wird durch eine einheitliche, blass-beige-gelbe Farbe der Leber dargestellt, was eine effiziente Blutentfernung und das Eindringen des Fixativs widerspiegelt (Abbildung 1A,B). Eine falsche Perfusion führt zu dunkelroten oder braunen Regionen von Blutgerinnseln, die die optische Klarheit verringern und zu einem starken Hintergrundsignal in diesen Probenregionen führen (

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und anpassungsfähige Probenvorbereitungspipeline, die zur dreidimensionalen Visualisierung und quantitativen Analyse der HSC-Morphologie in intaktem Lebergewebe führt. Die Integration der genetischen Kennzeichnung von fluoreszenten Zellen, in-situ-Leberperfusion und einer modifizierten iDISCO+-Clearing-Methode ermöglicht die Abbildung großer Gewebevolumina mit Einzelzellauflösung, wobei die räumliche Architektur der Lebermikroumg...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wird durch 1R01 DK136016-01 und 5P30CA196521 (NCI-Zentrumszuschuss) unterstützt. Mikroskopie und/oder Bildanalyse wurden bei der Mikroskopie und Advanced Bioimaging CoRE an der Icahn School of Medicine am Mount Sinai durchgeführt. Diese Forschung wurde teilweise vom Tisch Cancer Institute at Mount Sinai, P30 CA196521 – Cancer Center Support Grant, unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-RFP-Antikörper, Kaninchen, voradsorbiertRockland600-401-379
4-Kammer 35 mm Glasbodenschüssel mit 20 mm Mikroschacht, #1,5 AbdeckglasCellvisD35C4201,5N
AnaSed-Injektion (Xylazin-Injektion)Akorn, Inc.NDC 593990110-2020 mg/mL
Konische Zentrifugenröhren: 50 ml&nblöffel;Falcon352098
WattestäbchenMedlineMDS202000
Gebogene Verriegelung  HämostatenFisher Scientific16-100-117
Cy3-konjugiertes AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch712-165-153
Empfindliche Operationsscheren 4,75" gebogen, scharf/stumpfRoboz Chirurgisches Instrument
728501
Dibenzyläther (DBE), 98 %Sigma Aldrich108014
Dichloromethan (DCM),  ≥ 99.8%Sigma Aldrich270997
Dimethylsulfoxid (DMSO), ≥ 99.9%Sigma AldrichD8418
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) hoch kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA31573
EselserumEMD MilliporeS30
Ethylcinnamat, 99 %Sigma Aldrich112372
Besonders feine Mikro-Sezierende Schere; 24-mm-KlingeFisher ScientificNC9232515
F4/80 Monoklonale AntikörperratteThermoFisher Scientific14-4801-82
FidschiNIH
PinzetteFisher ScientificNC9214139
GlycinBio-Rad1610718
Heparin-NatriumsalzChem-Impex29984
Hybaid HybridisierungsofenTriad ScientificMaxi 14
Wasserstoffperoxid, 30 %Sigma Aldrich31642
Imaris 10.2.0 SoftwareOxford Instruments
ImarisFileConverter 10.2.0 SoftwareOxford Instruments
ImarisViewer 11.0.0Oxford Instruments
IV-KatheterExel International Inc.EXE 26751
Ketamin, Hydrochlorid-InjektionDechraB8U4100 mg/mL
LAS X 4.4.0.24861 SoftwareLeica
Leica Stellaris 8 KonfokalmikroskopLeica
Methanol, HPLC-QualitätFisherA452-2
Vielseitiger RotatorScientific Industries, Inc.Modell 151
Nadeln (27G x 1/2'')BD305109
Paraformadehyld, Pulver, 95 %Sigma Aldrich158127
Peristaltische PumpeGilsonModell Minipuls 3
Peristaltische Pumpenschlauch, MasterFlexThermowissenschaftlich96400-163,1 mm Einbaugrad x 7,6 m L/s peroxidgehärtetes Silikon-Präzisionspumpenrohr, Größe L/S 16, 1/8 Zoll Schlauchbarb
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)CytivaSH30256.01Steril, pH-Wert 7,0 - 7,2, ohne Kalzium, Magnesium
Propidiumiodid, ≥ 94,0 % (HPLC)Sigma AldrichP4170
RasierklingenAmerikanische Linie66-0362
SchaukelplattformVWRModell 200
Natriumazid, ≥ 99.5%Sigma AldrichS2002
NahtEthiconJ109T
Spritze (1 ml)BD309628
TritonX-100SigmaT9284
Tween-20ThermowissenschaftlichJ20605-AP
Fläschchen, Schraubdeckel mit massivem Deckel und Aluminiumfolie, vormontiertSigma Aldrich27470-UBand 7 mL, bernsteinfarbenes Glasfläschchen, O.D. & Times; H 17 mm & mal; 60 mm, Gewinde für 15-425 mm

Referenzen

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