Bewertung von Triptolideffekten auf hippocampales Gephyrin, Collybistin und Autophagie in einem Aβ1-42-Mausmodell

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines aggregierten Aβ1-42-induzierten, Alzheimer-ähnlichen Mausmodells und die Bewertung der Triptolideffekte auf hippocampale inhibitorische, synapseassoziierte Proteine, PI3K/Akt/GSK-3β-Signalübertragung und autophagiebezogene Marker.

Zusammenfassung

Die Alzheimer-Krankheit ist mit synaptischer Dysfunktion assoziiert, aber standardisierte Verfahren zur Bewertung, wie Aβ-induzierte Pathologie inhibitorische, synapsassoziierte Proteine und autophagiebezogene Signalgebung nach Kandidatenintervention beeinflusst, bleiben begrenzt. Dieses Protokoll beschreibt einen Arbeitsablauf zur Etablierung eines A�1-42-induzierten Alzheimer-ähnlichen Mausmodells und zur Bewertung der Auswirkungen von Triptolid auf hippocampale Gephyrin-, Collybistin-, PI3K/Akt/GSK-3β-Signalsignale und autophagiebezogene Marker. Erwachsene C57BL/6J-Mäuse erhalten eine bilaterale intrazerebroventrikuläre Injektion von Aβ1-42, die unter aggregationsinduzierenden Bedingungen hergestellt wird, gefolgt von der täglichen intraperitonealen Verabreichung von Triptolid mit oder ohne PI3K-Inhibitor LY294002. Räumliches Lernen und Gedächtnis werden mittels Morris-Wasserlabyrint-Tests bewertet. Hippocampusneuronale Verletzungen und Aβ-Ablagerungen werden mittels Hämatoxylin- und Eosinfärbung sowie Aβ-Immunhistochemie untersucht, und hippocampale Lysate werden mit Western Blotting analysiert, um Gephyrin, phosphorylierte Gephyrin, Collybistin, PI3K/Akt/GSK-3β-Signalproteine, LC3-II/I und p62 zu quantifizieren. Wichtige prozedurale Überlegungen umfassen die standardisierte Aβ1-42-Präparation, präzise stereotaktische Injektion, konsistente Verhaltenstestbedingungen, blinde Auswahl der Interessenregion sowie standardisierte Bild- und Densitometrieanalyse. Mit diesem Workflow führte die Verabreichung von Aβ1-42 zu räumlichen Lern- und Gedächtnisdefiziten, einer Verletzung der Hippocampusneuronen, einer Aβ-Ablagerung, reduzierter Gephyrin- und Collybistan-Expression, veränderter PI3K/Akt/GSK-3β-Signalübertragung sowie einer erhöhten Ansammlung von LC3-II/I und p62. Triptolid kehrte diese verhaltensbezogenen, histologischen und molekularen Veränderungen teilweise um, während LY294002 seine Auswirkungen abschwächte. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Aβ-induzierte hippocampale molekulare Veränderungen und Kandidateninterventionen zu evaluieren, wobei anerkannt wird, dass dieses Modell die chronische, multifaktorielle Entwicklung der menschlichen Alzheimer-Krankheit nicht reproduziert.

Einleitung

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, die durch kognitiven Abbau, Gedächtnisstörungen und Verhaltensstörungen gekennzeichnet ist und eine der Hauptursachen für Demenz bei älteren Erwachsenen darstellt. Obwohl Amyloid-β (Aβ)-Ablagerungen, Tau-Pathologie, synaptische Dysfunktion, Neuroinflammation und eine beeinträchtigte Proteinhomöostase weitgehend an der AD-Pathogenese beteiligt sind, sind die molekularen Mechanismen, die Aβ-assoziierte Toxizität mit inhibitorischer synaptischer Proteinstörung verknüpfen, weiterhin unvollständig verstanden 1,2,3,4 . Hemmende synaptische Dysfunktion kann das Gleichgewicht zwischen Anregung und Hemmung in neuronalen Schaltkreisen stören und so zu Netzwerkinstabilität und kognitiven Beeinträchtigungen beitragen. Die intrazellulären Signalereignisse, die inhibitorische, synapseassoziierte Gerüstproteine unter Aβ-induzierten AD-ähnlichen pathologischen Bedingungen regulieren, erfordern jedoch weitere Klärung⁵.

Gephyrin ist ein wichtiges postsynaptisches Gerüstprotein, das inhibitorische Neurotransmitterrezeptoren, einschließlich Glycinrezeptoren und γ-Aminobuttersäurerezeptoren Typ A, an postsynaptischen Stellen⁶ verankert und stabilisiert. Collybistin, codiert von ARHGEF9, ist ein Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor, der mit Gephyrin interagiert und die Clusterbildung sowie Membranlokalisierung inhibitorischer synaptischer Komponenten⁷ fördert. Die funktionelle Wechselwirkung zwischen Gephyrin und Collybistin ist daher wesentlich für die Organisation, Aufrechterhaltung und Plastizität inhibitorischer Synapsen. Eine Störung dieses Proteinkomplexes kann die inhibitorische Neurotransmission beeinträchtigen und zu kognitiven Defiziten beitragen. Bemerkenswert ist, dass Gephyrinstabilität und synaptische Clusterbildung durch phosphorylierungsabhängige Mechanismen reguliert werden können. Es wurde berichtet, dass die mit Aβ-Oligomer assoziierte Signalübertragung Chinasen wie Glykogensynthase-Kinase-3β (GSK-3β) beeinflusst, was die Gephyrinphosphorylierung bei Serin 270 fördern und somit die Gephyrin-Clusterbildung und -abbau beeinflussen kann. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die kinasevermittelte Regulation von Gephyrin eine wichtige molekulare Verbindung zwischen Aβ-assoziierter Pathologie und inhibitorischer synaptischer Dysfunktion^{darstellen könnte 8,9}.

Der PI3K/Akt-Weg ist ein zentraler intrazellulärer Signalweg, der an neuronalem Überleben, synaptischer Plastizität, Proteinhomöostase und Autophagieregulation beteiligt ist. Die Akt-Aktivität kann GSK-3β durch hemmende Phosphorylierung unterdrücken und so nachgelagerte Substrate modulieren, die an der neuronalen Funktion und synaptischen Stabilität beteiligt sind. Die Dysregulation der PI3K/Akt/GSK-3β-Signalübertragung wurde mit AD-bedingten neuronalen Schäden in Verbindung gebracht und könnte sowohl zu synaptischer Beeinträchtigung als auch zu abnormem Proteinabbau^{beitragen 10,11}. Parallel dazu ist Autophagie ein wesentlicher intrazellulärer Abbauweg, der beschädigte Organellen und fehlgefaltete Proteine entfernt. Autophagie-lysosomale Dysfunktion ist eng mit Aβ-Akkumulation, Tau-Pathologie und neuronaler Schädigung im Jahr¹² n. Chr. in Verbindung gebracht. Allerdings können LC3-II/I-Veränderungen allein keine erhöhte Autophagosomenbildung von beeinträchtigter autophagischer Degradation unterscheiden; Daher werden zusätzliche Marker wie P62 benötigt, um autophagiebedingte Flussänderungen besser zu bewerten. Zusammen unterstützen diese Beobachtungen die Notwendigkeit, die PI3K/Akt-Aktivität, die GSK-3β-vermittelte Regulation von Gephyrin und autophagiebezogene Marker innerhalb desselben experimentellen Rahmens zu untersuchen.

Triptolid, ein bioaktives Diterpen-Triepoxid, das aus Tripterygium wilfordii isoliert wurde, wurde als entzündungshemmend, immunmodulatorisch und neuroprotektiv berichtet¹³. Frühere Studien haben nahegelegt, dass Triptolid die kognitive Leistungsfähigkeit verbessern und inhibitorische, synapseassoziierte Proteine in AD-ähnlichen Modellen erhalten kann. Dennoch ist die mechanistische Beziehung zwischen Triptolidbehandlung, PI3K/Akt-Signalwegaktivierung, GSK-3β-vermittelter Gephyrinphosphorylierung, Collybistan-Expression und Veränderungen autophagiebedingter Proteine noch nicht vollständig definiert. Ob Triptolid die hippocampale Gephyrin- und Collybistan-Expression über einen PI3K/Akt/GSK-3β-assoziierten Mechanismus in einem Aβ1-42-induzierten AD-ähnlichen Mausmodell reguliert, bleibt unklar^14,15.

Im Vergleich zu chronisch transgenen AD-Modellen wie APP/PS1- oder 5xFAD-Mäusen sowie tauopathischen Modellen bietet die intrazerebroventrikuläre Injektion aggregierter Aβ1-42 einen relativ schnellen und technisch zugänglichen Ansatz zur Auslösung von Aβ-assoziierten hippocampusalen Verletzungen und kognitiven Beeinträchtigungen. Dieses Protokoll ist geeignet, wenn das experimentelle Ziel darin besteht, kurzfristige Aβ-induzierte Neurotoxizität, hippocampusale molekulare Veränderungen und interventionsbezogene Effekte auf definierte Signalwege zu bewerten. Dieses Modell reproduziert jedoch nicht die chronische Amyloidproduktion, Tau-Pathologie, vaskuläre Veränderungen, neuroimmune Komplexität oder altersabhängige Entwicklung des menschlichen AD. Daher sollten die mit diesem Protokoll gewonnenen Ergebnisse als Aβ-induzierte, AD-ähnliche Pathologie interpretiert und idealerweise in chronischen transgenen Modellen, tau-bezogenen Modellen oder menschlich abgeleiteten neuronalen Systemen validiert werden. Trotz früherer Evidenz, die Aβ-Pathologie, PI3K/Akt/GSK-3β-Signalisierung, inhibitorische synapseassoziierte Proteine und autophagiebedingte Anomalien mit AD-ähnlicher Pathologie in Verbindung bringen, integrieren nur wenige Protokolle Verhaltenstests, hippocampale histologische Bewertung, Aβ-Immunhistochemie, Analyse inhibitorischer synapseassoziierter Proteine, Kinase-Signalbewertung und Nachweis autophagiebezogener Marker in einem einzigen Aβ1-42-induzierten Interventionsmodell. Diese methodologische Lücke begrenzt die reproduzierbare Bewertung, ob Kandidatenverbindungen Veränderungen in inhibitorischen, synapseassoziierten Proteinen durch definierte intrazelluläre Signalwege modulieren.

Ziel dieses Protokolls ist es, einen reproduzierbaren Workflow zur Bewertung der hippocampalen Gephyrin- und Collybistan-Expression sowie deren zugehöriger regulatorischer Mechanismen in einem Aβ1-42-induzierten AD-ähnlichen Mausmodell bereitzustellen, das mit Triptolid behandelt wird, mit oder ohne den PI3K-Inhibitor LY294002. Der ursprüngliche Beitrag dieser Arbeit ist die Integration der stereotaxischen Aβ1-42-Verabreichung, pharmakologischer Modulation der Signalwege, Morris-Wasserlabyrint-Tests, histologischer und immunhistochemischer Bewertung sowie Western-Blot-Analyse von inhibitorisch-synapseassoziierten Proteinen, PI3K/Akt/GSK-3β-Signalisierung und autophagiebezogenen Markern. Die Arbeitshypothese war, dass die durch Aβ1-42 induzierte AD-ähnliche Pathologie mit einer beeinträchtigten PI3K/Akt-Signalübertragung, veränderter GSK-3β-assoziierter Gephyrinphosphorylierung, reduzierter hippocampaler Gephyrin- und Collybistin-Expression sowie einer abnormen Ansammlung autophagiebedingter Proteine assoziiert wäre, während die Triptolidbehandlung diese verhaltens- und molekularen Anomalien teilweise umkehren würde.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom Medizinischen Ethikausschuss der Universität Hubei genehmigt und gemäß institutionellen Richtlinien für Tierpflege und -anwendung durchgeführt (Nr. SYXK2019-0031.). Alle Verfahren, die Tiere betreffen, darunter Aβ1-42, Triptolid, LY294002, Paraformaldehyd, Xylol, Ethanol und chemilumineszente Reagenzien, sollten mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden, einschließlich Laborkittel, Handschuhen und Schutzbrillen. Tierkadaver, Hirngewebe, Aβ-kontaminierte Verbrauchsgüter, Paraformaldehydabfälle, Xylenabfälle und ECL-kontaminierte Materialien sollten separat gesammelt und gemäß den institutionellen Vorschriften zur Biosicherheit und Entsorgung chemischer Abfälle entsorgt werden. Die Bildanalyse wurde mit ImageJ durchgeführt. Für die immunhistochemische Analyse wurden Bilder in 8-Bit-Graustufen umgewandelt oder einer Farbdekonvolution unterzogen, um DAB-positive Färbungen zu isolieren. Der gleiche Schwellenwert wurde auf alle Bilder innerhalb desselben Experiments angewendet. Die positive Färbungsfläche, die gesamte Interessensregion und die integrierte Dichte wurden gemessen. Beim Western Blotting wurden die Bandintensitäten mit dem Gelanalyse-Tool nach Hintergrundsubtraktion gemessen. Die Zielproteinwerte wurden auf β-Aktin normalisiert, während phosphorylierte Proteine auf ihre entsprechenden Gesamtproteinwerte normalisiert wurden.

Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt, einschließlich Produktnamen, Hersteller, Katalog- oder Modellnummern sowie generischen Beschreibungen.

Tiere und experimentelle Gruppierung
Achtundvierzig adulte C57BL/6J-Mäuse, darunter 24 Männchen und 24 Weibchen, im Alter von 10 bis 12 Wochen und mit einem Gewicht von 22 bis 28 g, wurden vom Tierversuchszentrum der Medizinischen Universität Hubei gekauft. Die Mäuse wurden unter spezifischen, pathogenfreien Bedingungen bei 22 ± 2 °C untergebracht, mit freiem Zugang zu autoklaviertem Wasser und normalem Nagetierfutter. Nach einer Woche der Akklimatisierung wurden die Mäuse zufällig in vier Gruppen eingeteilt: die Kontrollgruppe, die Aβ1-42-induzierte AD-ähnliche Modellgruppe, die mit Triptolid behandelte Gruppe und die LY294002 plus Triptolid-Kobehandlungsgruppe mit jeweils 12 Mäusen. Männliche und weibliche Mäuse waren so gleichmäßig wie möglich über die Gruppen verteilt.

Das Aβ1-42-Peptid wurde in steriler normaler Kochsalzlösung auf eine Endkonzentration von 10 μg/μL gelöst. Um Aβ1-42 unter aggregationsinduzierenden Bedingungen herzustellen, wurde die Lösung 7 Tage lang bei 37 °C in einem zirkulierenden Wasserbad inkubiert, vor der Anwendung vorsichtig vermischt und während der Injektion auf Eis gelegt. Diese Vorbereitungsbedingung wurde von zuvor veröffentlichten Aβ42-Aggregationsverfahren übernommen. In der vorliegenden Studie wurde der Aggregationszustand der exakt injizierten Aβ1-42-Charge nicht unabhängig durch Thioflavin-T-Fluoreszenz, SDS-PAGE/Western-Blotting oder Transmissionselektronenmikroskopie charakterisiert. Daher bezieht sich der Begriff "aggregiertes Aβ1-42" in diesem Protokoll auf Aβ1-42, das unter aggregationsinduzierenden Inkubationsbedingungen hergestellt wurde.

Zur Modellbildung wurden die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 10 % Pentobarbitalnatrium in einer Dosis von 0,04 mL/10 g Körpergewicht betäubt. Eine ausreichende Anästhesie wurde durch das Fehlen des Pedalrückzugs und der Hornhautreflexe bestätigt. Jede Maus wurde dann an einem stereotaxischen Gerät fixiert, und die Kopfhaut wurde rasiert und mit Iodophor oder 75 % Ethanol desinfiziert. Ein Mittellinienschnitt wurde gemacht, um den Schädel freizulegen, und das Bregma wurde unter einem Stereomikroskop identifiziert. Der Schädel wurde so eingestellt, dass Bregma und Lambda auf derselben horizontalen Ebene standen.

Beidseitige laterale Ventrikelinjektionen wurden unter Verwendung folgender Koordinaten relativ zum Bregma durchgeführt: anteroposterior, −0,50 mm; mittelmäßig, ±1,00 mm; und dorsoventral, −3,00 mm von der Schädeloberfläche entfernt. Ein Gesamtvolumen von 2 μL aggregierter Aβ1-42-Lösung wurde langsam (2 μL/min) mit einer Mikrospritze in jeden Seitenventrikel injiziert. Die Injektion erfolgte mit konstanter niedriger Geschwindigkeit, um Gewebeschäden und Reflux zu reduzieren. Nach der Injektion wurde die Nadel etwa 5 Minuten an Ort und Stelle gelassen und dann langsam zurückgezogen. Kontrollmäuse erhielten an denselben Koordinaten und mit demselben chirurgischen Eingriff ein gleiches Volumen steriler normaler Kochsalzlösung. Nach der Injektion wurde der Kopfhautschnitt mit Nähten oder Wundklammern geschlossen, und die Mäuse wurden in einen erwärmten Erholungskäfig gelegt, bis sie wieder zu Bewusstsein kamen. Die postoperative Erholung, das Körpergewicht, die Wundheilung, das Pflegeverhalten, die Bewegungsbewegung sowie Anzeichen von Schmerzen oder Belastung wurden täglich überwacht.

Die medikamentöse Intervention wurde zwei Wochen nach der stereotaxischen Injektion eingeleitet, nachdem das Modell als stabil eingestuft wurde. Triptolid wurde in normaler Kochsalzlösung gelöst, die 4 % Propylenglykol enthielt, und intraperitoneal einmal täglich für 30 aufeinanderfolgende Tage verabreicht. Die mit Triptolid behandelte Gruppe erhielt täglich 0,2 mg/kg Triptolid, während die LY294002 plus Triptolid-Kooperationsgruppe Triptolid zusammen mit dem PI3K-Inhibitor LY294002 einmal täglich für 30 aufeinanderfolgende Tage erhielt. Die Kontrollgruppe und die Aβ1-42-induzierte AD-ähnliche Modellgruppe erhielten mit demselben Einspritzschema¹⁶ gleiche Mengen Trägerlösung.

Morris-Wasserlabyrinth-Test
Räumliches Lernen und Gedächtnis wurden 24 Stunden nach der letzten Verabreichung mit dem Morris-Wasserlabyrinth bewertet. Das Wasserlabyrinth bestand aus einem runden Becken, das mit Wasser gefüllt war und bei 22 °C ± 1 °C gehalten wurde. Visuelle Hinweise wurden rund um das Becken platziert und während des gesamten Experiments unverändert geblieben. Während der Ortsnavigationsphase wurde die versteckte Plattform im Zielquadranten festgesetzt. Vor den täglichen Tests durften sich die Mäuse etwa 30 Minuten lang an den Testraum gewöhnen.

Der Ortsnavigationstest wurde sechs aufeinanderfolgende Tage durchgeführt. In jedem Versuch wurde die Maus vorsichtig ins Wasser gelegt, von einem der Startquadranten zur Poolwand gewandt, und durfte bis zu 60 Sekunden nach der versteckten Plattform suchen. Fand die Maus die Plattform innerhalb von 60 Sekunden, durfte sie 15 Sekunden auf der Plattform bleiben. Wenn die Maus die Plattform innerhalb von 60 Sekunden nicht finden konnte, wurde sie zur Plattform geführt und durfte dort 20 Sekunden verbleiben, um die räumliche Speicherkonsolidierung zu erleichtern. Jede Maus unterzog sich vier Versuchen pro Tag, und Fluchtlatenz, Schwimmdistanz und Schwimmgeschwindigkeit wurden mit einem automatisierten Video-Tracking-System aufgezeichnet.

Am siebten Tag wurde die Plattform für den Untersuchungsprozess entfernt. Die Maus wurde vom gegenüberliegenden Quadranten zur ursprünglichen Plattform ins Wasser gesetzt und konnte 60 Sekunden frei schwimmen. Die Anzahl der Bahnsteigübergänge und der Prozentsatz der im Zielquadranten verbrachten Zeit wurden erfasst. Nach jedem Versuch wurde die Maus getrocknet und in einen erwärmten Käfig zurückgebracht, um Unterkühlung^zu verhindern^.

Gewebesammlung
Nach Verhaltenstests wurden die Mäuse tief betäubt durch intraperitoneale Injektion von 10 % Pentobarbitalnatrium in einer Dosis von 0,04 mL/10 g Körpergewicht. Acht Mäuse aus jeder Gruppe wurden zufällig für die hippocampale Proteinextraktion ausgewählt. Ihre Gehirne wurden schnell auf Eis entfernt, und beidseits hippocampale Gewebe wurde auf einer eiskalten Oberfläche seziert. Die hippocampalen Proben wurden in vormarkierte Kryoviale gelegt, in flüssigem Stickstoff gefroren und bei −80 °C bis zur Proteinextraktion gelagert.

Die übrigen vier Mäuse jeder Gruppe wurden für histologische und immunhistochemische Analysen verwendet. Unter Tiefenanästhesie wurden die Mäuse transkardial mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung perfundiert, bis die Leber blass wurde, gefolgt von 4 % Paraformaldehyd. Die Gehirne wurden sorgfältig entfernt und mit 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C für 24 Stunden nachfixiert. Nach der Fixierung wurden das Hirngewebe der pathologischen Versuchsplattform vorgelegt, wo Paraffin-Einbettung und anschließende Sektionierung durchgeführt wurden. Paraformaldehyd wurde in einem chemischen Abzugshaube behandelt, und paraformaldehydhaltige Abfälle wurden gemäß den institutionellen Anforderungen zur Entsorgung von chemischen Abfällen separat gesammelt.

Hämatoxylin- und Eosin-Färbung
Paraffin-eingebettete Hirngewebe wurde in 4 μm große koronale Schnitte mit dem Hippocampus aufgeteilt. Die Abschnitte wurden bei 60 °C für 1 Stunde gebacken, jeweils zweimal 10 Minuten in Xylol deparaffinisiert und anschließend durch graduierte Ethanollösungen (100 %, 95 %, 85 % und 75 %) rehydriert, gefolgt von destilliertem Wasser (jeweils 5 Minuten pro Schritt). Nach der Rehydrierung wurden die Abschnitte 10 Minuten lang mit Hämatoxylin gefärbt, in fließendem Leitungswasser ausgespült, bei Bedarf kurz in saurem Alkohol (2 S) unterschieden und in fließendem Leitungswasser gebläutet. Die Abschnitte wurden dann 5 Minuten lang mit Eosin gekontert, durch gradiertes Ethanol dehydriert, jeweils jeweils 5 Minuten lang mit Xylol behandelt und mit neutralem Harz montiert.

Die hippocampusale Morphologie wurde unter einem Lichtmikroskop beobachtet. Bilder wurden aus derselben hippocampalen Subregion in allen Gruppen aufgenommen, wobei die 20× Vergrößerungs- und Bildgebensparameter verwendet wurden. Neuronale Schäden wurden anhand der neuronalen Dichte, nukleärer Pyknose und ungeordneter Anordnung mit Bildanalyse-Software von einem auf Gruppe¹⁹ blinden Forscher untersucht.

Aβ-Immunhistochemie
Bei der Aβ-Immunhistochemie wurden Paraffinschnitte deparaffinisiert und wie beschrieben für die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung rehydriert. Die Antigenrückgewinnung erfolgte im EDTA-Antigenrückholpuffer bei pH 8,0, indem die Abschnitte zweimal in einer Mikrowelle mit hoher Leistung für 3 Minuten erhitzt wurden. Die Abschnitte wurden auf Zimmertemperatur abgekühlt und anschließend dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten gewaschen. Die endogene Peroxidase-Aktivität wurde mit 3 % Wasserstoffperoxid bei Raumtemperatur 15 Minuten lang blockiert, gefolgt von dreimaliger PBS-Waschung für jeweils 5 Minuten. Die unspezifische Bindung wurde mit 5 % normalem Ziegenserum bei Zimmertemperatur 30 Minuten lang blockiert. Die Schnitte wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert, wobei ein primärer Antikörper gegen Aβ im PBS mit 1:200 verdünnt wurde. Nach der Inkubation wurden die Abschnitte dreimal mit PBS jeweils 5 Minuten lang gewaschen und anschließend mit einem HRP-konjugierten Sekundärantikörper für 60 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurde das DAB-Substrat aufgetragen und die Farbentwicklung unter dem Mikroskop überwacht. Die Reaktion wurde mit destilliertem Wasser gestoppt, sobald braun-positive Färbungen sichtbar wurden. Die Abschnitte wurden mit Hämatoxylin gekontert, durch graduales Ethanol dehydriert, mit Xylol gereinigt und mit neutralem Harz montiert. Bilder wurden aus derselben hippocampusalen Subregion in allen Gruppen mit identischen Mikroskopeinstellungen bei 20× Vergrößerung aufgenommen. Die Aβ-Immunfärbung wurde mittels Bildanalyse-Software quantifiziert. Die positive Färbungsschwelle wurde über alle Bilder hinweg konstant gehalten, und die Aβ-Ablagerung wurde als positive Färbungsfläche geteilt durch die Gesamtzahl der Zellen in jedem mikroskopischen Feld berechnet.

Hippocampale Proteinextraktion und Western-Blot-Analyse
Gefrorenes hippocampales Gewebe wurde auf Eis gehalten und in eiskalten RIPA-Lysepuffern mit Protease- und Phosphataseinhibitoren homogenisiert. Die Homogenate wurden 30 Minuten auf Eis inkubiert und zwischendurch vormitierend, um eine ausreichende Lyse zu gewährleisten. Anschließend wurden die Lysate bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, und die Supernatanten wurden für die Proteinanalyse gesammelt. Die Proteinkonzentrationen wurden mit einem BCA-Protein-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Kurz gesagt wurden BSA-Standards und Proteinproben doppelt hergestellt, mit BCA-Arbeitsreagenz gemischt, bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert und bei 562 nm mit einem Mikroplattenleser gemessen. Die Proteinkonzentrationen wurden nach der Standardkurve berechnet, und alle Proben wurden auf die gleiche Endkonzentration vor der Elektrophorese²⁰ angepasst.

20 μg Gesamtprotein aus jeder hippocampalen Probe wurden durch 12 % SDS-PAGE getrennt und auf PVDF-Membranen übertragen. Die Elektrophorese wurde bei 80 V für das Stapeln und 120 V für die Trennung durchgeführt. Die Proteine wurden auf PVDF-Membranen übertragen, die in Methanol aktiviert wurden, mittels Nasstransfer bei 100 V für 90 Minuten bei 4 °C. Nach dem Transfer wurden die Membranen mit 5 % BSA für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Die Membranen wurden anschließend über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen Gephyrin (1:1000 Verdünnung), phosphoryliert-Gephyrin (1:500 Verdünnung), Collybistin (1:1000 Verdünnung), PI3K (1:1000 Verdünnung), Akt (1:1000 Verdünnung), phosphoryliertes Akt (1:1000 Verdünnung), GSK-3β (1:1000 Verdünnung), phosphoryliertes GSK-3β (1:1000 Verdünnung), LC3 (1:1000 Verdünnung), p62 (1:1000 Verdünnung) und β-Aktin (1:5000 Verdünnung) inkubiert. Nach der Reinigung mit TBST wurden die Membranen 1 Stunde lang mit HRP-konjugierten sekundären Antikörpern bei Raumtemperatur (1:5000 Verdünnung) inkubiert. Die Proteinbänder wurden mit ECL-chemilumineszentem Substrat visualisiert und mit einem chemilumineszenten Bildgebungssystem erfasst. Bandintensitäten wurden mit Bildanalysesoftware quantifiziert. Die Gesamtproteinexpression wurde auf β-Actin normalisiert. Hochauflösende, unbeschnittene Western-Blot-Bilder wurden in den ergänzenden Materialien enthalten.

Statistische Daten
Die statistische Analyse wurde mit Software zur statistischen Analyse und Graphengenerierung durchgeführt. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD angegeben, wie in den Abbildungslegenden angegeben. Verhaltenstests und Bildquantifizierung wurden von Forschern durchgeführt, die der Gruppenzuweisung blind waren. Die Fluchtlatenz während der Trainingsphase des Morris-Wasserlabyrinths wurde mit zweiseitigen wiederholten Messungen (ANOVA) analysiert, wobei Gruppe und Trainingstag Faktoren waren. Probe-Studiendaten, histologische Quantifizierung, immunhistochemische Quantifizierung und Western-Blot-Densitometrie wurden mit einem Einweg-ANOVA-Test analysiert. Die statistische Signifikanz wurde als p < 0,05 definiert. Die Standardsignifikanznotation wurde wie folgt verwendet: *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001. Genaue Stichprobengrößen wurden in den entsprechenden Abbildungslegenden angegeben. Männliche und weibliche Mäuse waren gleichmäßig auf die Versuchsgruppen verteilt. Allerdings wurde keine geschlechtsstratifizierte statistische Analyse durchgeführt, da die Studie nicht entworfen oder ausgestattet war, um geschlechtsspezifische Effekte zu erkennen. Diese Einschränkung wird im Abschnitt Diskussion anerkannt.

Ergebnisse

Beeinträchtigtes Lernen und Gedächtnis bei Aβ1-42-induzierten AD-ähnlichen Mäusen und teilweise Verbesserung nach Triptolidbehandlung

Um ein Aβ1-42-induziertes, AD-ähnliches Mausmodell zu etablieren, wurde aggregierte Aβ1-42 stereotaktisch in die bilateralen Seitenventrikel von C57BL/6J-Mäusen injiziert. Nach der Modellentwicklung wurden die Mäuse mit Vehikel, Triptolid oder Triptolid in Kombination mit dem PI3K-Inhibitor LY294002 behandelt. Räumliches Lernen und Gedächtnis wurden anschließend mit dem Morris-Wasserlabyrinth bewertet.

Während der 6-tägigen Ortsnavigationsphase nahm die Fluchtlatenz in allen Gruppen allmählich ab, was darauf hindeutet, dass die Mäuse die räumliche Lernaufgabe durch wiederholtes Training erlernten (Abbildung 1A). Allerdings zeigten Aβ1-42-induzierte AD-ähnliche Mäuse durchgehend längere Fluchtlatenzen als Kontrollmäuse, insbesondere an späteren Trainingstagen, was auf beeinträchtigtes räumliches Lernen hindeutet. Die Triptolid-Behandlung verkürzte die Fluchtlatenz im Vergleich zur Aβ1-42-induzierten AD-ähnlichen Modellgruppe, während die Kotherapie mit LY294002 diese Verbesserung schwächte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Triptolid die durch Aβ1-42 induzierte räumliche Lernbeeinträchtigung teilweise verbesserte und dieser Effekt durch die PI3K-Hemmung abgeschwächt wurde.

Repräsentative Schwimmstrecken unterstützten diese Verhaltensänderungen weiter (Abbildung 1B). Kontrollmäuse zeigten ein direkteres, zielorientiertes Suchmuster rund um den Plattformstandort, während Aβ1-42-induzierte AD-ähnliche Mäuse eine verstreute, ineffiziente Schwimmbahn zeigten. Mit Triptolid behandelte Mäuse zeigten ein verbessertes Suchverhalten, wobei die Flugbahnen stärker um das Zielgebiet konzentriert waren. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse, die mit LY294002 und Triptolid behandelt wurden, eine weniger effiziente Suche als solche, die nur mit Triptolid behandelt wurden. In der Probe-Studie nach der Plattformentfernung durchquerten Aβ1-42-induzierte AD-ähnliche Mäuse den ursprünglichen Plattformstandort seltener als Kontrollmäuse, was auf eine beeinträchtigte räumliche Gedächtnisretention hinweist (Abbildung 1C). Die Triptolidbehandlung erhöhte die Anzahl der Bahnsteigübergänge, während LY294002 Kobehandlung diesen Effekt reduzierte. Ebenso wurde der Prozentsatz der Zeit im Zielquadranten bei Aβ1-42-induzierten AD-ähnlichen Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen reduziert, nach der Triptolidbehandlung erhöht und nach LY294002 Kotherapie wieder verringert (Abbildung 1D).

Zusammen zeigen diese Verhaltensergebnisse, dass die bilaterale intrazerebroventrikuläre Injektion aggregierter Aβ1-42 räumliche Lern- und Gedächtnisdefizite bei Mäusen verursachte. Triptolid kehrte diese Verhaltensbeeinträchtigungen teilweise um, während LY294002 die schützende Wirkung von Triptolid abschwächte, was darauf hindeutet, dass die PI3K/Akt-Signalgebung zu den in diesem Modell beobachteten Verhaltenseffekten beitragen könnte.

Die Aβ1-42-Injektion induzierte eine Hippocampus-Neuronenverletzung und Aβ-Ablagerung, die durch Triptolid abgeschwächt wurden

Um die Entstehung von Aβ1-42-induzierten AD-ähnlichen pathologischen Veränderungen weiter zu überprüfen und die Wirkung von Triptolid auf Hippocampus-Verletzungen zu bewerten, wurden Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen sowie Aβ-Immunhistochemie an Gehirnschnitten jeder Gruppe durchgeführt.

Die HE-Färbung zeigte, dass die Neuronen in der Kontrollgruppe dicht und regelmäßig angeordnet waren, mit relativ klarer Zellmorphologie und Kernstruktur (Abbildung 2A). Im Gegensatz dazu zeigten Aβ1-42-induzierte AD-ähnliche Mäuse offensichtliche neuronale Schäden am Hippocampus, gekennzeichnet durch ungeordnete zelluläre Anordnung, geringere neuronale Dichte und erhöhte Kernkondensation. Die Triptolidbehandlung verbesserte teilweise die neuronale Morphologie des Hippocampus, mit einer besser erhaltenen zellulären Anordnung und weniger offensichtlicher nuklearer Pyknosis im Vergleich zur Aβ1-42-induzierten Modellgruppe. Die Begleitbehandlung mit LY294002 jedoch die schützende Wirkung von Triptolid abgeschwächt, was sich in einer ausgeprägteren neuronalen Desorganisation und Verletzung im Vergleich zur mit Triptolid behandelten Gruppe widerspiegelt.

Anschließend wurde eine Aβ-Immunhistochemie durchgeführt, um die Aβ-Ablagerung im Hippocampus zu beurteilen (Abbildung 2B). In der Kontrollgruppe wurde eine minimale Aβ-positive Färbung beobachtet, während die Aβ1-42-induzierte AD-ähnliche Modellgruppe deutlich erhöhte braune Aβ-positive Signale zeigte. Die Triptolidbehandlung reduzierte die Aβ-positive Färbung im Vergleich zur Modellgruppe, was darauf hindeutet, dass Triptolid die Aβ-Ablagerung in diesem Modell abgeschwächt hat. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse, die mit LY294002 plus Triptolid behandelt wurden, eine erhöhte Aβ-positive Färbung im Vergleich zu Mäusen, die nur mit Triptolid behandelt wurden. Quantitative Analysen bestätigten diese histologischen Beobachtungen weiter. Die Aβ-positive Signalfläche, die auf die Gesamtzahl der Zellen in jedem mikroskopischen Feld normalisiert wurde, wurde in der Aβ1-42-induzierten AD-ähnlichen Modellgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht, nach der Triptolidbehandlung reduziert und nach LY294002 Kotherapie teilweise wieder erhöht (Abbildung 2B).

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aβ1-42-Injektion eine Schädigung der Hippocampusneuronen und Aβ-Ansammlung induzierte, während Triptolid diese pathologischen Veränderungen teilweise linderte. Die nach LY294002 Co-Behandlung beobachtete Umkehr deutet darauf hin, dass die PI3K/Akt-Signalübertragung zur schützenden Wirkung von Triptolid beitragen könnte.

Triptolid stellte die hippocampale Gephyrin- und Collybistan-Expression wieder her und modulierte die PI3K/Akt/GSK-3β-Signalübertragung

Um festzustellen, ob die verhaltensbezogenen und histologischen Veränderungen von Veränderungen der inhibitorischen, synapseassoziierten Proteine und ihrer vorgelagerten regulatorischen Signalübertragung begleitet wurden, wurden hippocampale Lysate jeder Gruppe mittels Western-Blotting analysiert. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigten Aβ1-42-induzierte AD-ähnliche Mäuse eine deutliche Reduktion der hippocampalen Gephyrin-Expression, während die phosphorylierten Gephyrinspiegel erhöht waren (Abbildung 3A). Die Triptolidbehandlung stellte teilweise die gesamte Gephyrinexpression wieder her und reduzierte die phosphorylierten Gephyrinspiegel. Im Gegensatz dazu schwächte LY294002 Kotherapie die Wirkung von Triptolid, was sich an einer reduzierten Gephyrinexpression und einer erhöhten phosphorylierten Gephyrin-Gruppe im Vergleich zur triptolidbehandelten Gruppe zeigte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die durch Aβ1-42 induzierte Pathologie nicht nur mit einer verringerten Gephyrinhäufigkeit im Hippocampus, sondern auch mit einer verstärkten Gephyrinphosphorylierung verbunden war, während Triptolid diese Veränderungen teilweise umkehrte.

Collybistin zeigte ein ähnliches Expressionsmuster wie das Gesamtgephyrin. Aβ1-42-induzierte AD-ähnliche Mäuse zeigten eine verringerte hippocampale Collybistin-Expression im Vergleich zu Kontrollmäusen, während die Triptolidbehandlung die Collybistan-Expression wiederherstellte. LY294002 Kotherapie hat diesen Effekt teilweise umgekehrt (Abbildung 3B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Triptolid die Expression inhibitorischer, synapseassoziierter Gerüstproteine im Hippocampus bewahrte und dieser Effekt durch die PI3K-Hemmung abgeschwächt wurde. Der PI3K/Akt/GSK-3β-Signalweg wurde anschließend untersucht, um die molekularen Veränderungen hinter der Gephyrinphosphorylierung weiter aufzuklären. In der Aβ1-42-induzierten AD-ähnlichen Modellgruppe waren die PI3K-Expression und das p-Akt/Akt-Verhältnis im Vergleich zur Kontrollgruppe reduziert, was auf eine beeinträchtigte PI3K/Akt-Signalaktivität hinweist (Abbildung 3B). Das p-GSK-3β/GSK-3β-Verhältnis wurde in der Modellgruppe ebenfalls reduziert. Da die Phosphorylierung von GSK-3β an der inhibitorischen Stelle die Unterdrückung der GSK-3β-Aktivität widerspiegelt, deutet diese Reduktion auf eine relativ erhöhte GSK-3β-Aktivität im Aβ1-42-induzierten AD-ähnlichen Hippocampus hin. Die Triptolidbehandlung erhöhte die PI3K-Expression, stellte das p-Akt/Akt-Verhältnis wieder her und erhöhte das p-GSK-3β/GSK-3β-Verhältnis. Diese Effekte wurden durch LY294002 Kotherapie abgeschwächt.

Zusammen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass durch Aβ1-42 induzierte AD-ähnliche Pathologie mit einer verminderten hippocampalen Gephyrin- und Collybistan-Expression, erhöhter Gephyrinphosphorylierung und einer beeinträchtigten PI3K/Akt-vermittelten inhibitorischen Phosphorylierung von GSK-3β assoziiert war. Triptolid kehrte diese molekularen Veränderungen teilweise um, während LY294002 die Effekte von Triptolid abschwächte, was die Beteiligung der PI3K/Akt/GSK-3β-Signalübertragung an der Regulation von hippocampalem Gephyrin und Collybistin in diesem Modell unterstützte.

Triptolid abschwächte, autophagiebedingte Proteinanomalien im Hippocampus von Aβ1-42-induzierten AD-ähnlichen Mäusen

Um festzustellen, ob Aβ1-42-induzierte AD-ähnliche Pathologie und Triptolidbehandlung mit Veränderungen autophagiebezogener Proteine assoziiert sind, wurden LC3- und p62-Expression in hippocampalen Lysaten mittels Western Blotting untersucht. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigten Aβ1-42-induzierte AD-ähnliche Mäuse ein erhöhtes LC3-II/I-Verhältnis, was auf eine erhöhte Ansammlung von LC3-II in Verbindung mit Autophagosomen hinweist. Parallel dazu war auch die p62-Expression in der Modellgruppe erhöht, was auf eine Ansammlung autophagiebedingter Substrate im Hippocampus hindeutet. Die Triptolidbehandlung reduzierte sowohl das LC3-II/I-Verhältnis als auch die p62-Expression im Vergleich zur Aβ1-42-induzierten AD-ähnlichen Modellgruppe. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Triptolid die abnormale Ansammlung autophagiebedingter Proteine, die durch Aβ1-42 induziert wurden, abschwächte. Im Gegensatz dazu erhöhte LY294002 Kobehandlung das LC3-II/I-Verhältnis und die p62-Expression im Vergleich zur reinen Behandlung mit Triptolid, was darauf hindeutet, dass die PI3K-Hemmung die Wirkung von Triptolid auf autophagiebedingte Proteinveränderungen abschwächte (Abbildung 4).

Insgesamt lieferte die Kontrollgruppe das Basis-Verhaltens-, histologisches und molekulares Profil, während die Aβ1-42-induzierte AD-ähnliche Modellgruppe bestätigte, dass intracerebroventrikuläre Aβ1-42-Verabreichung kognitive Beeinträchtigungen, hippocampusale Neuronenverletzungen, Aβ-Ablagerung, reduzierte inhibitorische synapseassoziierte Proteine, Veränderungen der PI3K/Akt/GSK-3β-Signalübertragung und die Ansammlung autophagiebedingter Proteine verursachte. Der Vergleich zwischen der Aβ1-42-induzierten Modellgruppe und der mit Triptolid behandelten Gruppe zeigte, dass Triptolid diese Anomalien teilweise umkehrte. Der Vergleich zwischen der mit Triptolid behandelten Gruppe und der LY294002 plus Triptolid-Kotherapiegruppe zeigte zudem, dass die PI3K-Hemmung die Effekte von Triptolid abschwächte. Diese Ergebnisse stützen die Arbeitshypothese, dass Triptolid Veränderungen in hippocampalen Gephyrin-, Collybistin- und autophagiebezogenen Proteinen in einem Aβ1-42-induzierten AD-ähnlichen Modell durch einen PI3K/Akt/GSK-3β-assoziierten Mechanismus moduliert.

DATENVERFÜGBARKEIT:

Alle Rohdaten, die zur Reproduktion der Ergebnisse dieser Studie erforderlich sind, werden als Supplementary File 1 und Supplementary File 2 bereitgestellt. Dazu gehören die ursprünglichen Western Blot- und Gel-Bilder, unbeschnittene Blot-Daten, die für statistische Analysen verwendeten Rohwerte und die erzeugten Graphen. (Ergänzungsakte 1 und Nachsatzakte 2) Diese Dateien liefern die Rohdaten, die die in Abbildung 1–4 gemeldeten quantitativen Ergebnisse unterstützen.

Abbildung 1: Triptolid verbesserte teilweise räumliches Lernen und Gedächtnisdefizite bei Aβ1-42-induzierten AD-ähnlichen Mäusen. (A) Fluchtlatenz während der 6-tägigen Ortsnavigationsphase des Morris-Wasserlabyrinths. (B) Repräsentative Schwimmbahnen während des Probe-Tests. (C) Anzahl der Übergänge über den ursprünglichen Bahnsteigstandort nach der Entfernung des Bahnsteigs. (D) Prozentsatz der Zeit, die während der Sondenversuche im Zielquadranten verbracht wurde. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Fluchtlatenz wurde mit zweiseitigen wiederholten Messungen (ANOVA) analysiert, und die Daten der Sondenversuche wurden mit einem einseitigen ANOVA-Test analysiert. Ctr, Kontrollgruppe; AD, Aβ1-42-induzierte AD-ähnliche Modellgruppe; TP, mit Triptolid behandelte Gruppe; LY, LY294002 plus Triptolid-Kooperationsgruppe. n = 6 pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Triptolid-abgeschwächte Hippocampus-Neuronenschädigung und Aβ-Ablagerung bei Aβ1-42-induzierten AD-ähnlichen Mäusen. (A) Repräsentative Hämatoxylin- und Eosin-Färbungsbilder von hippocampusalen Schnitten jeder Gruppe. Scale Bar = 50μm. (B) Repräsentative Aβ-immunhistochemische Färbungsbilder und quantitative Analyse einer Aβ-positiven Ablagerung im Hippocampus. Skala = 50μm. Die Daten werden als Mittelwert ± SD präsentiert. Die statistische Analyse erfolgte mit einem einseitigen ANOVA-Test. Ctr, Kontrollgruppe; AD, Aβ1-42-induzierte AD-ähnliche Modellgruppe; TP, mit Triptolid behandelte Gruppe; LY, LY294002 plus Triptolid-Kooperationsgruppe. n = 3 pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Triptolid stellte die hippocampale Gephyrin- und Collybistan-Expression wieder her und modulierte die PI3K/Akt/GSK-3β-assoziierte Signalübertragung in Aβ1-42-induzierten AD-ähnlichen Mäusen. (A) Repräsentative Western-Blot-Bilder und quantitative Analyse der Gesamtexpression von Gephyrin und phosphoryliertem Gephyrin in hippocampalen Lysaten jeder Gruppe. (B) Repräsentative Western-Blot-Bilder und quantitative Analyse von Collybistin, PI3K, Akt, phosphoryliertem Akt, GSK-3β und phosphoryliertem GSK-3β in hippocampalen Lysaten. Collybistin und PI3K wurden auf β-Aktin normalisiert. Phosphoryliertes Akt und phosphoryliertes GSK-3β wurden als p-Akt/Akt- bzw. p-GSK-3β/GSK-3β-Verhältnis quantifiziert. Die Daten werden als Mittelwert ± SD präsentiert. Die statistische Analyse erfolgte mit einem einseitigen ANOVA-Test. Ctr, Kontrollgruppe; AD, Aβ1-42-induzierte AD-ähnliche Modellgruppe; TP, mit Triptolid behandelte Gruppe; LY, LY294002 plus Triptolid-Kooperationsgruppe. n = 3 pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Triptolid abgeschwächte, autophagiebedingte Proteinanomalien im Hippocampus von Aβ1-42-induzierten AD-ähnlichen Mäusen. Repräsentative West-Blot-Bilder und quantitative Analyse der LC3-I/II- und p62-Expression in hippocampalen Lysaten jeder Gruppe. Das LC3-II/I-Verhältnis wurde berechnet, indem die Intensität des LC3-II-Bandes durch die Intensität des LC3-I-Bandes geteilt wurde, und die p62-Expression wurde auf β-Aktin normalisiert. Die Daten werden als Mittelwert ± SD präsentiert. Die statistische Analyse erfolgte mit einem einseitigen ANOVA-Test. Ctr, Kontrollgruppe; AD, Aβ1-42-induzierte AD-ähnliche Modellgruppe; TP, mit Triptolid behandelte Gruppe; LY, LY294002 plus Triptolid-Kooperationsgruppe. n = 3 pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Datei 1: Unbeschnittene Western Blot-Bilder. Die für die Quantifizierung verwendeten Bänder sind angegeben, und Molekulargewichtmarker sind, wo verfügbar, angegeben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Rohe numerische Werte, die für statistische Analysen verwendet werden, in diesem Artikel. Diese Datei enthält die unbearbeiteten numerischen Datensätze, die zur Erstellung der quantitativen Graphen in Abbildung 1–4 verwendet wurden, darunter Verhaltensmessungen des Morris-Wasserlabyrinths, die Quantifizierung der Aβ-Immunhistochemie und Western-Blot-Dichtemessungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Der zentrale mechanistische Vorschlag dieser Studie ist, dass durch Aβ1-42 induzierte Pathologie die PI3K/Akt-Signalübertragung unterdrückt, die hemmende Phosphorylierung von GSK-3β reduziert, die Gephyrinphosphorylierung fördert, die hippocampale Gephyrin- und Collybistin-Expression verringert und zur Ansammlung autophagiebezogener Proteine beiträgt, während Triptolid diese Veränderungen teilweise durch einen PI3K/Akt/GSK-3β-assoziierten Weg entgegenwirkt. Diese Studie zeigt, dass durch Aβ1-42 induzierte AD-ähnliche Pathologie von beeinträchtigtem räumlichem Lernen und Gedächtnis, einer Verletzung von Hippocampusneuronen, erhöhter Aβ-Ablagerung, reduzierter Gephyrin- und Collybistan-Expression, verstärkter Gephyrinphosphorylierung, veränderter PI3K/Akt/GSK-3β-Signalübertragung und der Ansammlung autophagiebedingter Proteine einhergeht. Triptolid kehrte diese verhaltensbezogenen, histologischen und molekularen Anomalien teilweise um, während LY294002 seine Auswirkungen abschwächte. Diese Ergebnisse unterstützen ein Modell, bei dem Triptolid hippocampale inhibitorische, synapseassoziierte Proteine zumindest teilweise durch PI3K/Akt/GSK-3β-vermittelte Regulation der Gephyrinphosphorylierung und Veränderungen autophagiebezogener Proteine schützt. Es sollte beachtet werden, dass das Aβ1-42-Intracerebroventrikular-Injektionsmodell in erster Linie Aβ-induzierte Neurotoxizität und AD-ähnliche Pathologie widerspiegelt und nicht die vollständige chronische, multifaktorielle Entwicklung des menschlichen AD²¹.

Gephyrin und Collybistin sind zentrale Bestandteile der inhibitorischen synaptischen Organisation. Gephyrin verankert inhibitorische Neurotransmitterrezeptoren an postsynaptischen Stellen, während Collybistin die Gephyrin-Clusterbildung und Membranlokalisierung fördert. Eine reduzierte Expression dieser Proteine kann daher die hemmende synaptische Stabilität stören und zur beeinträchtigten Funktion des hippocampusalen Netzwerks^beitragen. In dieser Studie reduzierte Aβ1-42 die hippocampale Gephyrin- und Collybistan-Expression, während Triptolid beide Proteine wiederherstellte. Der Anstieg des phosphorylierten Gephyrins bietet einen plausiblen Mechanismus für den Gephyrinverlust, da die Phosphorylierung bei Ser270 mit Gephyrin-Dispersion, reduzierter Clusterbildung und Proteindestabilisierung in Verbindung gebracht wurde. Die parallele Reduktion der PI3K-Expression, der Akt-Phosphorylierung und der inhibitorischen Phosphorylierung von GSK-3β deutet darauf hin, dass Aβ1-42 die PI3K/Akt-Signalübertragung schwächt und möglicherweise die GSK-3β-Aktivität erhöht, was mit einer verstärkten Gephyrinphosphorylierung übereinstimmt. Umgekehrt stellte Triptolid die Akt-Phosphorylierung wieder her, erhöhte die hemmende Phosphorylierung von GSK-3β und reduzierte die Gephyrinphosphorylierung, während LY294002 diese Effekte schwächte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Triptolid die Expression von Gephyrin und Collybistin durch die PI3K/Akt/GSK-3β-assoziierte Regulierung der Gephyrinphosphorylierung erhalten kann. Da jedoch ganze hippocampale Lysate verwendet wurden, spiegeln diese Ergebnisse Veränderungen in der hippocampalen Proteinhäufigkeit und Phosphorylierung wider und nicht auf direkte Hinweise auf synaptische Lokalisation^22,23.

Autophagiebedingte Anomalien können ebenfalls zu den molekularen Veränderungen beitragen, die in diesem Modell beobachtet werden. Autophagie ist wichtig für die neuronale Proteostase, aber eine beeinträchtigte autophagische Degradierung bei AD kann zur Ansammlung von Autophagosomen und pathologischen Proteinsubstraten führen^24,25. In der vorliegenden Studie erhöhte Aβ1-42 sowohl das LC3-II/I-Verhältnis als auch die p62-Expression, was auf die Ansammlung von autophagosomassoziierten LC3-II und autophagiebezogenen Substraten hindeutet. Triptolid reduzierte beide Marker, während LY294002 diesen Effekt teilweise umkehrte, was darauf hindeutet, dass Triptolid die autophagiebedingte Proteinakkumulation über einen PI3K/Akt-abhängigen Mechanismus lindern kann. Zusammen mit den Veränderungen in Gephyrin-, Collybistin- und PI3K/Akt/GSK-3β-Signalübertragungen erweitern diese Ergebnisse das Verständnis der neuroprotektiven Effekte von Triptolid über entzündungshemmende oder allgemeine neuroprotektive Wirkungen hinaus und deuten darauf hin, dass Triptolid auch inhibitorische, synapseassoziierte Gerüstproteine, Kinase-Signalübertragung und proteostase-bezogene Signalwege in Aβ-assoziierter AD-ähnlicher Pathologie²⁶ beeinflussen kann.

Mehrere entscheidende Schritte bestimmen den Erfolg und die Reproduzierbarkeit dieses Protokolls. Erstens sollte der Aggregationszustand von Aβ1-42 vor der Injektion sorgfältig kontrolliert und überprüft werden, da die Peptidpräparation pathologische Ergebnisse stark beeinflussen kann. Zweitens ist eine präzise stereotaktische Injektion in die Seitenventrikel unerlässlich; Reflux, falsche Nadelplatzierung oder übermäßige Injektionsgeschwindigkeit können zu variabler Aβ-Exposition und inkonsistenten Verhaltens- oder histologischen Ergebnissen führen. Drittens erfordert der Wasserlabyrinthtest in Morris stabile visuelle Hinweise, eine konstante Wassertemperatur und Überwachung der Schwimmgeschwindigkeit, um motorische Beeinträchtigungen als Störfaktor auszuschließen. Viertens sollte die histologische und immunhistochemische Quantifizierung mit vordefinierten hippocampusalen Interessensregionen und einer verblindeten Analyse durchgeführt werden. Schließlich hängen die Ergebnisse des Western-Blot von gleichmäßiger Proteinbelastung, angemessener Gelkonzentration, effizientem Transfer und der Verwendung unbeschnittener Blot-Bilder zur Bestätigung der Bandspezifität ab.

Es sollten mehrere Einschränkungen berücksichtigt werden. Erstens reproduziert das Aβ1-42-Injektionsmodell nicht das chronische Fortschreiten, die Tau-Pathologie, die Gefäßveränderungen oder die neuroimmune Komplexität des menschlichen AD. Zweitens, obwohl männliche und weibliche Mäuse gleichmäßig auf die Gruppen verteilt waren, war die Studie nicht für die geschlechtsstratifizierte Analyse²⁷ befähigt. Drittens können ganze hippocampale Lysate nicht bestimmen, ob Veränderungen bei Gephyrin und Collybistin speziell an inhibitorischen Synapsen auftreten. Viertens bleibt der vorgeschlagene PI3K/Akt/GSK-3β–Gephyrin-Mechanismus assoziativ, da die GSK-3β-Aktivität und die Gephyrin-Ser270-Phosphorylierung nicht direkt manipuliert wurden. Schließlich sind LC3-II/I und p62 statische Western-Blot-Ablesungen und können den dynamischen autophagischen Fluss nicht vollständig definieren. Künftige Studien sollten synaptosomale Fraktionierung, immunfluoreszente Kolokalisierung mit inhibitorischen postsynaptischen Markern, GSK-3β-Gewinn- oder -verlust-Ansätze, Gephyrin-Ser270-Mutantenkonstrukte sowie lysosomale inhibitorbasierte Flux-Assays verwenden. Eine Validierung in chronisch transgenen AD-Modellen, tau-bezogenen Modellen und menschlich abgeleiteten neuronalen Systemen wird ebenfalls erforderlich sein, um festzustellen, ob dieser Signalweg breit für AD-Pathologie¹⁴ relevant ist. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass der Aggregationszustand der exakten Aβ1-42-Präparat für die stereotaxische Injektion nicht unabhängig durch Thioflavin-T-Fluoreszenz, SDS-PAGE/Western-Blotting oder Transmissionselektronenmikroskopie validiert wurde. Obwohl das Peptid mit einem verlängerten 37 °C Inkubationsverfahren hergestellt wurde, das häufig zur Förderung der Aβ1-42-Aggregation verwendet wird, kann eine Batch-zu-Charge-Variation im Aggregationszustand die pathologischen Ergebnisse beeinflussen. Zukünftige Studien sollten diesen Workflow in chronisch transgenen AD-Modellen, tau-bezogenen Modellen und menschenbasierten neuronalen Systemen validieren. Weitere Experimente sollten die direkte Validierung des Aβ1-42-Aggregationsstatus, die Genauigkeitsbewertung stereotaxischer Injektionen mittels Farbstoff- oder anatomischer Verifikation, synaptosomale Fraktionierung, immunfluoreszente Kolokalisierung mit inhibitorischen postsynaptischen Markern, GSK-3β-Gewinn- oder Funktionsverlust-Ansätze, Gephyrin-Ser270-Mutantenexperimente sowie lysosomalinhibitorbasierte autophagische Flusstests umfassen. Dosis-Wirkungs- und Sicherheitsstudien zu Triptolid sind ebenfalls erforderlich, bevor translationale Anwendungen in Betracht gezogen werden können

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-Gephyrin Antikörper	12681	Peoteintech	Primärantikörper für die Western Blot-Nachweisverfahren des gesamten Gephyrins.
Anti-phosphoryliertes-Gephyrin  Antikörper	147011	Synaptic Systems	Primärantikörper für die Western Blot-Nachweisverfahren des phosphorylierten Gephyrins.
Anti-Collybistin Antikörper	ab316963	abcam	Primärantikörper für die Western Blot-Nachweisverfahren des Collybistins.
Anti-PI3K Antikörper	27921	Peoteintech	Primärantikörper für die Western Blot-Nachweisverfahren von PI3K.
Anti-Akt Antikörper	9272	Cell Signaling Technology	Primärantikörper für die Western Blot-Nachweisverfahren des gesamten Akt.
Anti-phosphorylierter Akt Antikörper	4060	Cell Signaling Technology	Primärantikörper für die Western Blot-Nachweisverfahren des phosphorylierten Akt.
Anti-GSK-3β Antikörper	12456	Cell Signaling Technology	Primärantikörper für die Western Blot-Nachweisverfahren des gesamten GSK-3β.
Anti-phosphoryliertes GSK-3β Antikörper	5558	Cell Signaling Technology	Primärantikörper für die Western Blot-Nachweisverfahren des phosphorylierten GSK-3β.
Anti-β-Aktin Antikörper	66009	Peoteintech	Ladekontrollantikörper für die Western Blot-Normalisierung.
Anti-LC3 Antikörper	11972	Cell Signaling Technology	Primärantikörper für die Western Blot-Nachweisverfahren von LC3-I und LC3-II.
Anti-p62 Antikörper	5114	Cell Signaling Technology	Primärantikörper für die Western Blot-Nachweisverfahren von p62/SQSTM1.
Anti-Aβ1-42 Antikörper	ab150155	abcam	Primärantikörper für den Nachweis von Aβ1-42.
HRP-konjugiertes Sekundärantikörper (anti-Maus-IgG)	7076S	Cell Signaling Technology	Sekundärantikörper für Maus-Primärantikörper beim Western Blotting.
HRP-konjugiertes Sekundärantikörper (anti-Rinder-IgG)	7074S	Cell Signaling Technology	Sekundärantikörper für Kaninchen-Primärantikörper beim Western Blotting.
Anti-Aβ Antikörper	GT622,	Invitrogen,	Primärantikörper für Aβ-Immunhistochemie.
Aβ1-42	9001	Shanghai Duma Technology Co., Ltd.	Amyloid-β-Peptid zur Herstellung der aggregierungsinduzierenden Injektionslösung.
Triptolid	BD9097	Shanghai Bide Pharmaceutical.	Testverbindung, intraperitoneal verabreicht.
LY294002	ab120243	abcam	PI3K-Inhibitor, der für die Ko-Behandlungsgruppe verwendet wird.
Paraformaldehyd	P0099	Beyotime	Fixativ für transkardiale Perfusion und Gewebenachfixierung.
Xylol	108298	Merck	Entparaffinierungs- und Gewebeklarmittel.
Ethanol	100983	Merck	Rehydrations- und Dehydratationsmittel für Paraffinschnitte.
Propylenglykol	294004	Merck	Fahrzeugkomponente für die Herstellung der Arzneimittellösung.
Proteasen- und Phosphatasehemmer	P1045	Beyotime	Lysepufferadditiv zur Konservierung von Proteinen und Phosphorylierungszuständen.
RIPA Lysepuffer	P0013	Beyotime	Lysepuffer für die Gesamtproteinextraktion aus Hippocampusgewebe.
EDTA Antigenrettungspuffer	ab93680	abcam	Hitzeinduzierter Antigenrettungspuffer für die Immunhistochemie.
Pentobarbital-Natrium	P3761	Sigma	Anästhetikum, das für Operationen und Gewebeentnahme verwendet wird.
Ziegenserum	ZLI-9056	ZSGB-BIO	Blockierreagenz für die Immunhistochemie.
PVDF-Membranen	ISEQ00010	Merck Millipore	Membran, die für die Western Blot-Übertragung verwendet wird.
Morris-Wasserlabyrinth	VX80	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	Verhaltensapparat und Video-Tracking-System zur Beurteilung des räumlichen Lernens und Gedächtnisses.
Chemilumineszenz-Imaging-System	Doc™ XR+ 1708195	Bio-rad	Imaging-System zur chemilumineszenten Western-Blot-Signalerfassung.
Stereotaktisches Gerät	/	Stoelting Technology Co., Ltd	Gerät zur stereotaktischen intracerebroventrikulären Injektion.
BCA-Protein-Assay-Kit	P0006	Beyotime	Kolorimetrisches Assay-Kit zur Messung der Gesamtproteinkonzentration.
Mikroplatten-Reader	Synergy2	Biotek	Absorbanzmessgerät zur Messung des BCA-Assays.
ImageJ	version 9.0.1	National Institutes of Health	Bildanalysesoftware für Histologie, Immunhistochemie und Western Blot-Densitometrie.
GraphPad Prism	version 8.5	GraphPad Software	Software zur statistischen Analyse und Erstellung von Grafiken.