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Methodenartikel

In vivo Kalziumbildgebung mit einem miniaturisierten Mikroskop im Hypothalamus zum Verständnis sozialer Verhaltensweisen bei Mäusen

951 Ansichten

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DOI:

10.3791/70401

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20. März 2026

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1School of Life Sciences, Westlake University, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt in vivo die Kalziumbildgebung von hypothalamischen Neuronen mit einem miniaturisierten Mikroskop (Miniscope) bei frei handelnden Mäusen während der Manipulation des sozialen Zustands (soziale Isolation und soziale Wiedervereinigung). Diese Methode ermöglicht die Bildgebung der hypothalamischen Aktivität, die sozialen Bedürfnisse und soziale Sättigung repräsentiert, mit einer einzelnen neuronalen Auflösung und ermöglicht mechanistische Studien der sozialen Homöostase.

Zusammenfassung

Soziales Verhalten bei Wirbeltieren wird streng durch hypothalamische Schaltkreise reguliert. Molekular definierte hypothalamische Neuronentypen wurden kürzlich identifiziert, um soziale Bedürfnisse auf homöostatische Weise zu kodieren. Hier beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung einer in vivo Kalziumbildgebung im hypothalamischen medialen präoptischen Kern (MPN) mit einem kopfmontierten miniaturisierten Mikroskop (Miniscope) bei frei handelnden Mäusen. Diese Methode ermöglicht longitudinale Aufzeichnungen neuronaler Populationsdynamik während sozialer Isolation und Wiedervereinigung und ermöglicht so mechanistische Studien des sozialen Bedarfs und der sozialen Sättigung bei der Auflösung eines einzelnen Neurons. Konkret erhalten erwachsene Mäuse stereotaktische Injektionen eines adenoassoziierten Virus (AAV), das einen genetisch codierten Kalziumindikator in das MPN exprimiert, gefolgt von der Einpflanzung einer Gradient-Index-(GRIN)-Linse und einer Miniskop-Basisplatte. Nach der Genesung gewöhnen sich die Mäuse an das Miniscope-Bildgebungssystem und werden einer geplanten sozialen Isolation und Wiedervereinigung unterzogen, während der neuronale Aktivitäten abgebildet werden. Kalziumsignale werden mit dem Verhalten der Tiere synchronisiert, um sie weiter zu analysieren. Dieses Protokoll bietet umfassende Hinweise für die in vivo Kalziumbildgebung mit Miniskop im Maus-Hypothalamus während sozialer Verhaltensweisen. Es lässt sich leicht für Bildgebung in anderen tiefen Hirnregionen und in verschiedenen Verhaltenskontexten anpassen. Dieser Ansatz verbindet neuronale Aktivität auf zellulärer Ebene und soziales Verhalten und erweitert unser Verständnis der neuronalen Grundlage komplexen Verhaltens bei frei bewegenden Tieren.

Einleitung

Die Fähigkeit, soziale Bindungen aufrechtzuerhalten, ist grundlegend für das Überleben von Tieren 1,2,3. Anhaltende soziale Isolation verursacht Angst, kognitive Defizite und metabolische Veränderungen, während Wiedervereinigung soziale Interaktion und soziale Bedürfnisse wiederherstellt 4,5,6. Der beobachtete Rückfall im sozialen Verhalten nach kurzfristiger sozialer Isolation deutet auf das Vorhandensein eines homöostatischen Mechanismus7 hin, analog zur Regulation vonHunger 8,9 oder Durst 10,11,12. Die neuronalen Substrate, die die soziale Homöostase vermitteln, sind jedoch weiterhin schlecht verstanden.

Jüngste Arbeiten haben gezeigt, dass unterschiedliche neuronale Populationen der hypothalamischen Neuronen das soziale Bedürfnis bzw. die soziale Sättigung codieren. In vivo Kalziumbildgebung hat gezeigt, dass eine Population genetisch definierter glutamaterger Neuronen im medialen präoptischen Kern (MPN) während der Isolation aktiv wird (MPN-Isolationsneuronen), während eine andere Population von GABAergen Neuronen bei der Wiedervereinigung aktiv wird (MPN-Reunion-Neuronen). Die optogenetische Aktivierung von MPN-Isolationsneuronen ahmt einen sozialenIsolationszustand nach, und die optogenetische Aktivierung von MPN-Wiedervereinigungsneuronen schwächt den sozialen Rebound ab, was auf ihre gegensätzlichen Rollen bei der Regulierung des sozialen Bedürfnisses hindeutet. Diese Populationen interagieren gegenseitig und verbinden sich mit hirnweiten neuronalen Schaltkreisen, wodurch eine Rückkopplungsschleife entsteht, die soziale Bedürfnisse dynamisch moduliert.

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll mit dem übergeordneten Ziel, Forschern zu ermöglichen, die Calciumdynamik im tiefen Gehirn mit Einzelneuron-Auflösung bei frei bewegenden Mäusen während ethologisch relevanter sozialer Verhaltensweisen wie sozialer Isolation und Wiedervereinigungaufzuzeichnen 13. Die Kombination dieser Bildgebenden Technik mit ethologisch relevanten sozialen Paradigmen bietet eine beispiellose Gelegenheit, die neuronale Darstellung unterschiedlicher sozialer Zustände zu untersuchen. Die Begründung für die Entwicklung dieser angepassten Methode liegt in der Notwendigkeit, zu visualisieren, wie soziale Bedürfnisse und Sättigung dynamisch in tiefen Gehirnstrukturen wie dem MPN dargestellt werden. Obwohl der Einsatz des Miniskop bereits 14,15,16 beschrieben wurde, erfordert sein Einsatz bei uneingeschränkten sozialen Interaktionen, insbesondere bei Übergängen zwischen Isolation und Wiedersehen, spezifische technische und verhaltensbezogene Anpassungen, um die optische Stabilität aufrechtzuerhalten, Bewegungsartefakte zu minimieren und einen naturalistischen Verhaltensausdruck zu gewährleisten.

Im Vergleich zur Faserphotometrie bietet der Miniscope-basierte Ansatz eine zelluläre Auflösung, die die Unterscheidung unterschiedlicher funktioneller Neuronentypen innerhalb derselben Region ermöglicht. Sie ermöglicht Langzeitaufzeichnungen frei interagierender Tiere, was für die Untersuchung sozial gesteuerter neuronaler Dynamiken unerlässlich ist. Frühere Studien mit Ein-Photonen-Mikroendoskopie konzentrierten sich hauptsächlich auf den Cortex oder den dorsalen Hippocampus während räumlicher oder sensorischer Aufgaben 14,15,16. Unser Protokoll erweitert diese Fortschritte auf tiefere subkortikale Regionen während komplexer sozialer Verhaltensweisen und bietet eine Vorlage für die Untersuchung affektiver Zustandsschaltkreise unter naturalistischen Bedingungen.

Das Protokoll ist für Hirnbereiche bis zu ~5 mm Tiefe optimiert, wobei GRIN-Linse-Implantation und genetisch kodierte Kalziumindikatoren verwendet werden. Wichtige Überlegungen sind chirurgische Präzision, Linsenplatzierung, Verhaltensparadigmendesign und zugehörige Datenanalyse. Diese Methode kann an andere tiefe Gehirnbereiche und Verhaltenskontexte angepasst werden. Dieses Protokoll führt die Nutzer durch alle kritischen Phasen: chirurgische Vorbereitung, Virenabgabe, Linsenimplantation, Verhaltensdesign, Miniskop-Anbringung, Bildgebung und Datenanalyse (Abbildung 1A-E). Wir erwarten, dass dieser zugängliche, detaillierte Arbeitsablauf die Untersuchung von Deep-Brain-Neuralpopulationen über eine Vielzahl natürlicher Verhaltensweisen hinweg ermöglichen wird.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Tierethikkomitee der Westlake University mit dem Tierprotokoll #25-076-LD-9 genehmigt. Alle Experimente wurden gemäß den Richtlinien der Laboratory Animal Resources an der Westlake University durchgeführt. Alle in diesem Protokoll verwendeten Geräte und Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Virusinjektionsoperation

  1. Setze die Maus in eine Anästheseinduktionskammer mit 2–3 % Isofluran.
    HINWEIS: Eine erfolgreiche Einleitung der Anästhesie wird durch das Fehlen eines Zehenkneifreflexs und das Vorhandensein von gleichmäßiger, tiefer Atmung bestätigt.
  2. Nach 2–3 Minuten, oder sobald der Aufrichtreflex verloren ist, wird das Tier schnell auf das stereotaktische Instrument übertragen. Sichern Sie die Nase im Anäsenkegel und halten Sie die Anästhesie mit 1–1,5 % Isofluran während der gesamten Operationsdauer aufrecht (Abbildung 1B). Die Sauerstoffdurchflussrate ist typischerweise zwischen 0,8 und 1,2 L/min eingestellt.
    HINWEIS: Überwachen Sie die Atemfrequenz und andere physiologische Symptome des Tieres. Wenn die Atemfrequenz des Tieres steigt und es Schnurrhaare sowie andere Anzeichen des Aufwachens zeigt, erhöhen Sie die Isoflurankonzentration auf 2–3 %.
  3. Sichern Sie die Schneidezähne der Maus durch die Schneidezahnstange des stereotaxischen Instruments. Ziehe die Nasenklemme fest, um den Kopf zu befestigen.
  4. Führen Sie vorsichtig zwei Ohrenstangen in die äußeren Hörgänge ein, bis sie sicher ruhen, um eine stabile und starre Kopffixierung sicherzustellen (Abbildung 1B).
    HINWEIS: (1) Eine falsche Platzierung, die das Halsgewebe zusammendrückt, kann Atemnot oder instabile Fixation verursachen. (2) Wenn das Tier Anzeichen von Atmungsanstrengung oder Kampfhandlung während der Fixierung zeigt, lassen Sie die Ohrenstangen sofort los und positionieren Sie sie neu, da dies auf eine mögliche Kompression der Atemwege hinweist. (3) Stellen Sie sicher, dass beide Ohrstangen auf gleicher Höhe sind. Dies ist entscheidend für die spätere präzise Nivellierung des Schädels.
  5. Tragen Sie auf beide Augen der Maus eine Augensalbe auf, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern.
  6. Entfernen Sie das Kopffell mit Haarentfernungscreme. Wischen Sie die Stelle gründlich mit 75%-Ethanol-Tüchern ab, um Reste von Creme und Haaren zu entfernen.
  7. Desinfizieren Sie die freiliegende Haut mit 75%igen Ethanoltüchern und Betadin. Mit feiner chirurgischer Schere wird ein sagittaler Schnitt in der Mittellinie durch die Kopfhaut gemacht. Ziehe die Haut zurück, um den Schädel vollständig über dem Zielbereich des Gehirns freizulegen. Reinigen Sie vorsichtig die Schädeloberfläche mit einem Wattestäbchen, um das Periost zu entfernen.
    HINWEIS: Das Freilegen eines ausreichend großen Bereichs des Schädels ist notwendig, um einen stabilen Anker für den Zahnklement zu schaffen und so die langfristige Stabilität des Implantats zu gewährleisten.
  8. Befestigen Sie eine Glaspipette auf den stereotaxischen Halter zur Schädeloberflächenmessung. Unter einem Stereomikroskop lokalisieren Sie die Pipettenspitze an der Bregma (dem Schnittpunkt der sagittalen und koronalen Nähte) und setzen Sie sie als Ursprung (X = 0, Y = 0, Z = 0, Abbildung 1C).
  9. Bewegen Sie die Pipettenspitze ±2 mm seitlich zum Bregma und stellen Sie die Schädelniveau an, bis der Höhenunterschied zwischen diesen beiden Punkten auf ±0,03 mm liegt.
  10. Dann wird die Pipette zur Lambda (der Schnittstelle der sagittalen und lambdoiden Nähte) bewegt und die anteroposteriore Neigung angepasst, bis der Höhenunterschied zwischen Bregma und Lambda innerhalb von ±0,03 mm beträgt (Abbildung 1C).
    HINWEIS: (1) Eine vorherige visuelle Untersuchung und Anpassung des Schädels könnte den Feinnivellierungsprozess erheblich vereinfachen. (2) Das Trocknen der Schädeloberfläche mit Druckluft vor dem Nivellieren verbessert die Sichtbarkeit der Schädelnähte.
  11. Verwenden Sie einen Handbohrer mit einem 0,8-mm-Bohrkopf, um eine Kraniotomie über dem Ziel-Gehirnbereich durchzuführen (z. B. bei C57BL6/J-Mäusen). Die Koordinaten liegen bei vorder-posterior (AP) 0 mm, medial-lateraler (ML) 0,3 mm und dorsal-ventral (DV) -4,8 mm, um die MPN-Region zu zielen; bei FVB/NJ-Mäusen erfolgt die Kraniotomie bei AP +0,4 mm-+0,5 mm, ML 0,3 mm und DV -4,8 mm) (Abbildung 1C).
    HINWEIS: Im Falle von Blutungen erhöhen Sie die Isoflurankonzentration vorübergehend auf 2–2,5 %. Verwenden Sie eine sterile Baumwollspitze oder einen hämostatischen Schwamm, um das Blut aufzunehmen, und tragen Sie sofort sterile Kochsalzlösung auf. Bringen Sie das Isofluran nach der Hämostase wieder auf das Erhaltungsniveau (1–1,5 %) zurück und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit.
  12. Nach der Kraniotomie wird eine stereotaktische Injektion des Virus durchgeführt, wobei der Kalziumindikator im Zielbereich des Gehirns exprimiert wird.
  13. Verdünnen Sie das AAV-hSyn-jGCaMP7f, ein adenoassoziiertes Virus, das verwendet wird, um einen genetisch kodierten Kalziumindikator in Neuronen zu exprimieren und die Bildgebung neuronaler Aktivität mittels Kalziumsignalen zu ermöglichen, auf einen finalen Titer von etwa 5 × 10¹² viralen Genomen pro Milliliter vor der Injektion.
  14. Füllen Sie zuerst eine Glaspipette mit Mineralöl und dann mit der viralen Lösung, wobei Sie darauf achten, dass keine Luftblasen entstehen. Positioniere die Pipette auf den Zielkoordinaten auf der Schädeloberfläche und senke sie langsam auf die Zieltiefe.
  15. Injizieren Sie das Virus einseitig mit einer langsamen, konstanten Geschwindigkeit (z. B. 30 nL/min) mit einem Gesamtvolumen von 400 nL7, um sicherzustellen, dass genügend Neuronen im MPN-Bereich infiziert werden. Diese Menge kann je nach spezifischer Größe der Hirnregionen angepasst werden und ob weitere Einschränkungen, wie das Cre-loxP-System, bestehen.
  16. Nach Abschluss lassen Sie die Pipette 10–15 Minuten an Ort und Stelle, um eine ausreichende virale Diffusion zu ermöglichen und den Reflux entlang der Injektionsstrecke zu minimieren, bevor sie langsam zurückgezogen wird.
    HINWEIS: (1) Virale Aliquoten mit geeigneten und konsistenten Titern sind entscheidend für die erfolgreiche und konsistente Expression bei Tieren. Übermäßig hoher Titer kann zu Neurotoxizität führen, während unzureichender Titer zu einer schwachen Expression und einem schlechten Signal-Rausch-Verhältnis für die Bildgebung führt. (2) Eine langsame Injektionsgeschwindigkeit und ausreichende Wartezeit vor dem Entfernen der Pipette sind entscheidend, um Gewebeschäden zu minimieren und viralen Reflux zu verhindern, wodurch eine präzise und robuste Virusexpression im Zielbereich gewährleistet wird.
  17. Nach der Virusinjektion wird die Haut oberhalb des Schädels mit resorbierbaren Nähten vernäht.
  18. Injizieren Sie unmittelbar nach der Operation Carprofen (5 mg/kg) subkutan, mit fortgesetzter Überwachung und zusätzlicher Verabreichung bei Bedarf über die folgenden 3 Tage.
  19. Halten Sie die Maus nach der Virusinjektionsoperation mindestens 2-3 Wochen einzeln unter, um eine ausreichende Tiergenesung und Virusexpression zu ermöglichen.
    HINWEIS: Die Implantation der GRIN-Linse (Abschnitt 2) kann am selben Tag wie die virale Injektion oder 2–3 Wochen nach der Virusinjektion durchgeführt werden. In diesem Protokoll beschreiben wir die Zwei-Schritte-Methode, die es dem Experimentator ermöglicht, die virale Expression während der GRIN-Linsenimplantation zu bewerten.

2. Implantation der GRIN-Linse

  1. Wiederhole Schritte 1.1-1.10, um die Kraniotomie wieder zu öffnen. Kratze die Schädeloberfläche mit einem Skalpell, um den Zahnklement in Schritt 2.8 besser zu greifen. Für die neue Kraniotomie sollte der Durchmesser etwas größer als die der GRIN-Linse sein (typischerweise ~1 mm), um eine glatte Einnistung zu ermöglichen. Entfernen Sie nach dem Bohren sorgfältig alle Knochenreste.
  2. Um die Gewebekompression während der GRIN-Linsenimplantation zu verringern, führen Sie eine Glaspipette in die Zielhirnregion ein und bewegen Sie die Pipette langsam mittelseitig, um einen Schnitt zu erzeugen. Dieser Mikroschnitt ist ~1 mm lang, um Platz für die Implantation der GRIN-Linse zu schaffen (Abbildung 2A).
    HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für den Erfolg des gesamten Protokolls.
  3. Desinfiziere sie vor der Implantation der GRIN-Linse mit 75 % Ethanol, wasche sie dann mit steriler Kochsalzlösung und wische sie vorsichtig mit Linsengewebe ab.
  4. Halten Sie das GRIN-Objektiv mit einem Objektivhalter fest und befestigen Sie das Miniskop oben am Objektiv.
  5. Positioniere die gesamte Baugruppe am Bregma und setze alle Koordinaten auf null (d. h. X = 0, Y = 0, Z = 0). Dann positioniere ihn auf die Zielkoordinaten X-Y oberhalb der Kraniotomie.
  6. Befeuchte die Schädeloberfläche mit steriler Kochsalzlösung. Senken Sie die GRIN-Linse sehr langsam mit einer Geschwindigkeit von etwa 100 μm/min ins Gehirngewebe, bis sie das Ziel erreicht (Abbildung 2B).
    HINWEIS: (1) Wenn die Implantation der GRIN-Linse 2–3 Wochen nach der Virusinjektion durchgeführt wird, während des Linseneinsetzens das Miniskop einschalten, um Echtzeit-Fluoreszenzänderungen zu beobachten. Wenn sich die Linse dem Zielbereich nähert, wird das gesamte fluoreszierende Signal im Sichtfeld heller, und diese Änderung kann direkt aus dem Signalhistogramm in Echtzeit mit der Bildgebungssoftware abgelesen werden (Abbildung 2C, D). (2) Achten Sie darauf, Blutungen während der Einnistung zu vermeiden, da Blutgerinnsel die Signalqualität erheblich verschlechtern. (3) Wenn die Blutung unvermeidlich und stark ist, ziehen Sie die GRIN-Linse heraus, reinigen Sie die Linse und setzen Sie sie nach Ende der Blutung wieder ein.
  7. Nach der Linsenimplantation trocknen Sie die Schädeloberfläche gründlich, indem Sie die Restflüssigkeit aufnehmen und mit Druckluft blasen.
  8. Tragen Sie vorsichtig Zahnkleber auf, um die GRIN-Linsenbasis am Schädel zu verankern, und bauen Sie eine vollständige Kopfkappe, die den freiliegenden Schädel bedeckt (Abbildung 2B). Achte darauf, dass der Zement nicht mit den umliegenden Muskeln in Kontakt kommt. Dann lockere vorsichtig den Objektivhalter und entferne den Halter zusammen mit dem Miniscope.
    HINWEIS: (1) Zahnkleber in einer abgekühlten Schicht auf Eis mischen, um den Erstarrungsprozess zu verlangsamen und mehr Arbeitszeit zu ermöglichen. (2) Es wird empfohlen, eine Kopfstange hinter dem Objektiv anzubringen, um die Maus während des Miniscope-Anschlusses zu halten. (3) Seien Sie sehr vorsichtig, den Zement nicht auf den Objektivhalter oder das Miniskop aufzutragen.
  9. Bereiten Sie den zweiteiligen Silikonkleber vor, indem Sie die beiden Flüssigkeiten miteinander mischen. Tragen Sie es auf die Oberseite der GRIN-Linse auf, um während der Erholungsphase eine schützende Abdichtung gegen Staub und Kratzer zu bilden.
  10. Nach der Einpflanzung der GRIN-Linse sollte die Maus einzeln untergebracht werden, um mögliche Schäden an der Linse durch ihre Kammergenossen während der Genesung zu vermeiden.

3. Grundplatteninstallation

  1. Zwei bis drei Wochen nach der Implantation der GRIN-Linse erfolgt die Basisplatte. Betäuben und fixieren Sie die Maus im stereotaxischen Instrument, wie oben beschrieben.
  2. Entfernen Sie die Silikondichtung von der Oberseite der GRIN-Linse und reinigen Sie die Linsenoberfläche vorsichtig mit einem Stück Linsengewebe.
  3. Befestige die Grundplatte am Miniscope. Montiere die gesamte Mikroskop-Grundplatten-Baugruppe über einen Halter am Arm des stereotaxischen Manipulators.
  4. Schließen Sie das Miniscope mit der Datenerfassungsbox an und schalten Sie die Live-Bildgebung ein.
  5. Richten Sie das Miniscope-Objektiv und die implantierte GRIN-Linse durch feine Einstellung des Manipulators aus, um eine präzise optische koaxiale Ausrichtung zwischen Miniscope und GRIN-Linse zu erreichen.
  6. Positioniere das Miniscope-Objektiv so dass es parallel zur Oberfläche des GRIN-Objektivs verläuft und achte darauf, dass der Rand des gesamten GRIN-Objektivs im Bildfenster perfekt kreisförmig ist und das Zentrum der Linse im Zentrum des Bildfensters liegt.
  7. Senken Sie das Miniskop auf einen optimalen Arbeitsabstand, um klare Bilder von Neuronen in der Ziel-Fokalebene zu erhalten.
  8. Verwenden Sie Zahnbeton, um die Grundplatte mit der vorhandenen Zementkappe zu überbrücken und zu kapseln (Abbildung 2B).
    HINWEIS: (1) Ein entscheidender Schritt ist es, das Miniskop vor der endgültigen Fixierung um eine kleine, empirisch bestimmte Entfernung (etwa 50–100 μm) anzuheben, um eine mögliche Verschiebung der Brennebene durch Zementschrumpfung während der Erstarrung auszugleichen. (2) Seien Sie äußerst vorsichtig, um zu verhindern, dass der Zahnklement mit Teilen des Miniscopes in Kontakt kommt, die nach der Basisplatte abgetrennt werden sollen.
  9. Nachdem der Zahnklement vollständig verfestigt ist, lockern Sie den Halter, lösen Sie das Mikroskop vorsichtig von der Grundplatte und schrauben Sie sofort eine Kappe auf die Grundplatte, um die optische Schnittstelle zu schützen.
  10. Man hält die Maus nach der Basisplatte 3–5 Tage einzeln und vereint sie dann mindestens eine Woche lang mit ihren Käfiggenossen, bevor der soziale Zustand manipuliert wird (z. B. soziale Isolation).

4. Habituation und bildgebende Parametereinstellung

  1. Gewöhnen Sie die implantierten Mäuse 2-3 Mal vor formellen Bildgebungssitzungen an eine temporäre Kopfstütze für die Miniscope-Befestigung und an das Bildgebungs-Setup.
  2. Um das Miniskop an der Grundplatte zu befestigen, den Kopf der implantierten Mäuse zu fixieren, die Kappe der Grundplatte zu entfernen und das Miniskop über eine Magnetschnittstelle an die Grundplatte anzudocken. Dann ziehe die Seitenschraube fest, um das Miniskop zu sichern. Führen Sie 10 Minuten lang eine Kalziumbildgebung durch, während der das Tier sich frei in der Aufnahmearena oder im Käfig bewegt.
  3. Führen Sie während dieser Pilotbildgebungssitzung Reize ein, wie eine sanfte Berührung und eine neue Maus. Analysieren Sie die Daten (siehe Details in Abschnitt 6), um zu prüfen, ob einzelne neuronale Signale extrahiert werden können. Während der Gewöhnung bestimmen Sie die optimalen Bildeinstellungen, indem Sie die Brennebene des Miniscopes über dessen Arbeitsabstand anpassen, um die Anzahl der beobachteten Neuronen und die Bildschärfe zu maximieren.
  4. Stellen Sie die Beleuchtungsleistung auf ~10 % des Maximalwerts und die Sensorverstärkung auf ~10–20 % des Maximalwerts ein, um klare Signale ohne Sättigung zu erhalten. Bild mit einer räumlichen Auflösung von 1280 x 800 und einer Abtastrate von 20 Hz. Speichern Sie diese Einstellungen für jedes Tier und verwenden Sie die Einstellungen während der folgenden Bildaufnahmesitzungen erneut.

5. Soziale Verhaltenstests für die Calciumbildgebung im Miniscope

  1. Sozialer Wiedervereinigungstest (Abbildung 3A)
    1. Isolieren Sie die mit dem Miniskop implantierte Maus für 1, 3 oder 5 Tage vor der Bildgebung. Führen Sie während des Ausgangspunkts, der Wiedervereinigung und der Wiederisolierung Kalziumbildgebung durch.
    2. Basis: Die Maus mit dem Miniskop verbinden und 10 Minuten lang aufzeichnen, während der die Maus isoliert bleibt.
    3. Wiedervereinigung: Füge einen ehemaligen Käfiggefährten in die Aufnahmekammer hinzu und nimm 10 Minuten auf.
    4. Re-Isolation: Entfernen Sie den Käfiggefährten nach dem 10-minütigen Wiedersehen und bilden Sie sich während der erneuten Isolation weitere 10 Minuten lang.
  2. Sozialer Isolationstest (Abbildung 3B)
    1. Isoliere die mit dem Miniskop-implantierte Maus für 6 Stunden und nimm zu Beginn jeder Stunde für 15 Minuten Kalziumsignale auf.
    2. Fügen Sie der Aufzeichnungskammer einen ehemaligen Käfiggefährten hinzu und nehmen Sie am Ende der gesamten Bildgebungssitzung für 10 Minuten auf, um Neuronen zu identifizieren, die durch soziale Wiedervereinigung stark moduliert werden (siehe Details in den Abschnitten 6 und 7).
      HINWEIS: (1) Dieser spezielle Bildablauf wird verwendet, um Signal-Photobleaching zu minimieren und die Überwachung der neuronalen Aktivität während der ersten 6 Stunden der sozialen Isolation zu ermöglichen. (2) Das Miniskop ist während des gesamten Verfahrens verbunden. (3) Dieser Ansatz ermöglicht die Verfolgung desselben neuronalen Ensembles während der gesamten Bildgebungssitzung. (4) Nahrung und Hydrogel werden während der Bildgebung bereitgestellt.

6. Datenvorverarbeitung

  1. Importiere rohe Bildaufnahmen in die Datenverarbeitungssoftware.
  2. räumlich und zeitlich wird das Originalvideo bei Bedarf heruntergesampelt, um die Rechenbelastung für die Datenanalyse zu verringern.
    HINWEIS: Für diese Analyse werden rohe Bilddaten mit einer räumlichen Auflösung von 1280 x 800 bei 20 Hz aufgenommen; räumlich das Video um den Faktor 4 heruntersampeln und zeitlich um den Faktor 2 heruntersamplen.
  3. Wenden Sie einen räumlichen Bandpassfilter mit der globalen mittleren Subtraktion an, um das hochfrequente Rauschen und den niedrigfrequenten Hintergrunddrift zu reduzieren.
  4. Korrigiere Bewegungsartefakte mithilfe des Bewegungskorrekturalgorithmus in der Datenverarbeitungssoftware. Untersuchen Sie den bewegungskorrigierten Film visuell, um stabile neuronale Somaten und minimale Restbewegungsartefakte sicherzustellen.
  5. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Zellen identifizieren" und wählen Sie in der Liste "CNMFe", um mit dem CNMF-E17 (Constrained Non-negative Matrix Factorization for microEndoscopic Data) Calciumaktivitätsspuren einzelner Neuronen zu extrahieren.
  6. Klicken Sie auf den Linealknopf in der Datenverarbeitungssoftware und messen Sie die Soma-Durchmesser (in Pixeln) von repräsentativen Neuronen. Gib die durchschnittliche Größe im Feld "Durchschnittlicher Zelldurchmesser (Pixel)" ein. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Anwenden , um CNMF-E auszuführen.
  7. Passen Sie die CNMF-E-Initialisierungseinstellungen an, wenn die Zellerkennung unzureichend ist, übermäßige Nicht-Zellkomponenten auftreten oder Übersegmentierung auftritt.
  8. Inspiziere alle extrahierten Komponenten und akzeptieren/lehne sie basierend auf Zellmorphologie und biologisch plausiblen Kalziumdynamiken ab. Schließe Bauteile mit unregelmäßigen und stacheligen Formen aus. Lösen Sie Spuren, die von Rauschen oder Bewegungsartefakten dominiert werden.
    HINWEIS: (1) Abbildung 2E und 2F zeigen zwei akzeptierte Neuronen mit klarer Morphologie der Neuronen sowie den typischen Kalziumtransienten. (2) Abbildung 2G und 2H zeigen zwei abgestoßene Neuronen mit ausgeprägten Ausgangsschwankungen und fehlenden typischen Kalziumtransienten.
  9. Exportieren Sie Fluoreszenzspuren akzeptierter Neuronen aus der Datenverarbeitungssoftware zur nachgeschalteten Identifikation sozialzustandsmodulierter Neuronen (Abschnitt 7).

7. Identifizieren von sozial zustandsmodulierten Neuronen

  1. Nutze MATLAB oder Python, um die vorverarbeiteten Daten weiter zu analysieren.
  2. Richten Sie die Calciumaktivitätsspuren der akzeptierten Neuronen auf Verhaltenszeitstempel aus.
  3. Finde den Zeitpunkt für das soziale Wiedersehen im Verhaltensvideo. Für jedes Neuron segmentieren Sie die Aktivität in eine 300-seündige Phase der sozialen Isolation vor der Wiedervereinigung und eine soziale Wiedervereinigungsphase von 300 Sekunden.
  4. Für jedes Neuron quantifizieren Sie die Calciumaktivitätsverteilungen während der Isolations- und Wiedervereinigungsphasen.
  5. Führen Sie die Receiver Operating Characteristic (ROC)-Analyse18 durch, um die Fähigkeit neuronaler Aktivität zu bewerten, zwischen Isolations- und Reunion-Zuständen zu unterscheiden, und erhalten Sie einen AUC-Wert, der die Fläche unter der ROC-Kurve berechnet.
  6. Bewerten Sie die statistische Signifikans mit einem Permutationstest. Für jedes Neuron werden Kalziumaktivitätswerte zirkulär über Verhaltenszustände in 1-s-Zeit-Bins für 1.000 Mal gemischt, um eine Nullverteilung der AUC-Werte zu erzeugen. Neuronen mit beobachteten AUC-Werten, die das 95. Perzentil ihrer gemischten Nullverteilung überschreiten, gelten als signifikant moduliert durch den sozialen Zustand.
  7. Klassifizieren Sie die signifikant modulierten Neuronen basierend auf der Modulationsrichtung. Klassifizieren Sie die durch Reunion gehemmten Neuronen als Isolationsneuronen und durch Reunion aktiviert als Reunion-Neuronen (Abbildung 4).

8. Nachverifikation nach dem Experiment

  1. Perfundieren Sie die Mäuse und führen Sie eine Standardhistologie durch, um die GRIN-Linsenspur und die virale Expression zu überprüfen (siehe ein Beispiel für eine histologische Bildgebung in Abbildung 2I).
  2. Benutze das 4%-PFA, um den gesamten Mauskopf mit dem Implantat zu verbinden, und entferne dann die GRIN-Linse, um eine klare Linsenspur zu visualisieren.
    HINWEIS: Beziehen Sie nur die Daten der Tiere mit korrekter Zielerfassung ein.

9. Fehlerbehebung & praktische Tipps

  1. Sichern Sie eine Kopfstange mit Zahnbeton hinter dem Miniscope, um das Anbringen und Entfernen des Miniscopes zu erleichtern.
    HINWEIS: Die Kopfstange sollte nicht zu lang sein und kann in einem leicht geneigten Winkel platziert werden, um Störungen des sozialen Verhaltens zu verhindern.
  2. Die implantierten Mäuse werden während der Erholungsphase nach der Operation mindestens eine Woche lang einzeln untergebracht. Dies gibt den Mäusen genügend Zeit zur Erholung und verhindert die Schädigung des Implantats durch andere Mäuse.
  3. Vereine die implantierten Mäuse wieder mit ihren vorherigen Cagemates, sobald sie vollständig genesen sind. Überprüfen und ziehen Sie regelmäßig die Deckel fest. Bereiten Sie zusätzliche Abdeckungen vor und ersetzen Sie sie, wenn sie während der Tierpflege verloren gehen.
  4. Überprüfen Sie die Kalziumsignale 3-4 Wochen nach der Injektion des GCaMP-Virus. Wenn die Signale zu schwach oder unklar sind, verbessert eine längere Erholungszeit manchmal die Qualität der Signale.
  5. Sei vorsichtig mit den Objektivoberflächen auf der GRIN-Linsenseite oder auf der Miniscope-Seite. Halte die Linsen sauber und kratzfrei. Decke das Objektiv ab, wenn du es nicht benutzt.
  6. Vor der Bildnahme sollte die Länge des Signalkabels so angepasst werden, dass das Tier die Ecken der Bildarena erreichen kann, und kurz genug, um reibungslose soziale Interaktionen zu ermöglichen.
  7. Schützen Sie das Kabel bei Bedarf mit einer Schicht harten Materials, um das Beißen durch andere Mäuse während sozialer Interaktionen zu verhindern. Überprüfen Sie regelmäßig das Signalkabel, um zu prüfen, ob es durch intensive soziale Interaktion verdreht ist.
  8. Um dasselbe neuronale Ensemble aus aufeinanderfolgenden Bildgebungssitzungen zu identifizieren (zum Beispiel in Abbildung 3B), könnten die rohen Bildgebungsvideos angeordnet werden, um Kalziumspuren zu extrahieren.
  9. Um mehrere Signale zu synchronisieren, zum Beispiel die Verhaltensvideos und die Kalziumsignale, werden üblicherweise gemeinsame TTL-Eingänge und synchronisierte Taschenlampen verwendet, um verschiedene Aufnahmedateien auszurichten.

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Ergebnisse

Identifikation neuronaler Populationen
Wir exprimierten das GCaMP-Virus und implantierten eine GRIN-Linse in die MPN einer C57BL/6J-Maus. Nach der Operation erholte sich die Maus einzeln und wurde mindestens eine Woche lang mit ihren Kammergenossen wiedervereint. Die Maus wurde dann drei Tage lang einzeln vor der Kalziumbildgebung untergebracht. Während der Bildgebung wurde zunächst ein 10-minütiger Isolations-Baseline aufgezeichnet, gefolgt von einem 10-minütigen soz...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt einen integrierten Ansatz, der in vivo eine Miniscope-Kalziumbildgebung mit sozialen Verhaltensparadigmen kombiniert, um das Aktivitätsprofil von hypothalamischen Neuronen zu bewerten. Es ermöglicht eine langfristige, zelluläre Auflösung von Kalziumbildgebung aus tiefen Gehirnstrukturen während natürlicher sozialer Interaktionen. Die folgenden Abschnitte behandeln die entscheidenden Schritte, die methodische Bedeutung, die Grenzen und das zukünftige P...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären kein konkurrierendes finanzielles Interesse oder Interessenkonflikt. ChatGPT wurde im Manuskriptbearbeitungsprozess verwendet, wobei alle Autoren sorgfältig und detailliert Korrektur lesen.

Danksagungen

Wir möchten Professor Catherine Dulac für ihre Unterstützung bei der anfänglichen Ausbildung der Miniskop-Experimente und Yang Sun für seine Hilfe bei der Durchführung der Operation danken. Diese Arbeit wurde durch die Startfinanzierung der Westlake University sowie die Finanzierung der NOMIS Foundation, des Tan-Yang Center for Autism Research an der Harvard University, des Jane Coffin Childs Medical Research Award für D.L. und des Charles A. King Trust Postdoctoral Fellowship für D.L. unterstützt. Wir danken allen Mitgliedern des Liu-Labors für ihre Kommentare zum Manuskript.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
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