Isolierung und Reinigung von Pankreasinseln bei Lewis-Ratten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradiententrennung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Methode zur chirurgischen Entnahme, enzymatischen Verdauung und Dichtegradientenreinigung von Lewis-Rattenpankreasinseln, die ertragreiche, hochreine Präparate für den direkten Einsatz bei Transplantationen oder in vitro-Studien ermöglicht.

Zusammenfassung

Bauchspeicheldrüseninseln sind sowohl für klinische Inseltransplantationen als auch für präklinische Studien unerlässlich, die darauf abzielen, die Mechanismen und das Fortschreiten von Diabetes zu verstehen. Der Fortschritt in diesen Bereichen wird jedoch oft durch die Verfügbarkeit hochwertiger Inselchen begrenzt, da aufkommende therapeutische Strategien größere, sauberere und standardisiertere Präparationen erfordern. Dieser Artikel präsentiert ein hochdurchsatzfähiges, standardisiertes Protokoll für die chirurgische Entnahme, enzymatische Verdauung und dichtegradientige Reinigung von Pankreasinseln von Lewis-Ratten. Die Methode kombiniert intraduktale Pankreas-Perfusion mit einer definierten Enzymmischung, eine gemeinsame Verdauung mehrerer Bauchspeicheldrüsse und dichtebasierte Trennung, um den Ertrag zu maximieren, wobei die Fragmentierung minimiert und routinemäßiges Handpflücken entfällt. Der Inselertrag wird mit zwei komplementären Ansätzen quantifiziert: einer traditionellen, auf Aliquot basierenden Zählungsmethode, die häufig in klinischen Umgebungen verwendet wird, und einer halbautomatisierten Whole-Preparation Imaging-basierten Methode. In einer repräsentativen Isolierung aus 12 Bauchspeicheldrüsen ergab die manuelle Zählung etwa 3.300 Inseläquivalente (IEQ) und 2.700 absolute Inselchen pro Bauchspeicheldrüse (~39.600 Gesamt-IEQ), mit einer Größenverteilung von 62 % (50–100 μm), 17 % (100–150 μm), 10 % (150–200 μm), 5 % (200–250 μm) und 6 % (>250 μm). Im Vergleich dazu ergab die automatisierte Gesamtanalyse von 16.350 IEQ (1.362 IEQ/Bauchspeicheldrüse) insgesamt 16.350, was die inhärente Variabilität der aliquotbasierten Quantifizierung hervorhebt. Präparate hatten eine Reinheit von 98 % durch Dithizonfärbung, und die Viabilität der Insel wurde an den Tagen 3 und 7 nach der Isolierung in vitro bei 98 % gehalten. Die funktionelle Beurteilung durch statische glukosestimulierte Insulinsekretion zeigte eine zehnfache Erhöhung der Insulinfreisetzung nach einer 1-Stunden-Stimulation mit 16,7 mM Glukose. Insgesamt bietet dieses Protokoll einen reproduzierbaren und effizienten Ansatz zur Erzeugung hochreiner, funktional intakter Inselvorbereitungen, die sofort ohne zusätzliche Reinigung verwendet werden können. Die Inselchen behalten eine robuste Funktion in Kultur für bis zu sieben Tage und ermöglichen Flexibilität für groß angelegte In-vitro-Assays sowie In-vivo-Transplantationsstudien .

Einleitung

Die Pankreasinsel-Transplantation stellt eine praktikable Strategie zur Wiederherstellung der endogenen Insulinproduktion bei Personen mit Typ-1-Diabetes (Typ-1D)¹ dar. Über T1D hinaus ist die Inselbiologie zunehmend relevant für Typ-2-Diabetes (T2D), eine Erkrankung, die durch fortschreitende β-Zell-Dysfunktion und -Verlust gekennzeichnet ist, sowie für Patienten, die sich einer teilweisen oder totalen Pankreatektomie wegen chronischer Pankreatitis, Bauchspeicheldrüsentumoren oder traumatischer Verletzungen unterziehen. In diesen Kontexten ist der Zugang zu hochwertigen Inselchen unerlässlich, um zelluläre Therapien voranzutreiben, β-Zellversagen zu modellieren, Insel-Immun- und Insel-Strom-Interaktionen zu untersuchen und neue regenerative^Ansätze zu entwickeln. Daher sind robuste und reproduzierbare Isolierungsverfahren der Inselchen entscheidend, um sowohl mechanistische Forschung als auch die translationale Entwicklung über eine Vielzahl von endokränenartigen Pankreaserkrankungen hinweg zu unterstützen.

Obwohl Inselchen weniger als 2 % der Bauchspeicheldrüsenmasse ausmachen, spielen sie eine unverhältnismäßig bedeutende Rolle bei der Glukose-Homöostase. Ihre intrinsische Anfälligkeit für Hypoxie, enzymatische Überverdauung, oxidativen Stress und mechanische Scherung macht sie besonders empfindlich gegenüber isolationsbedingten Verletzungen ^3,4,5. Selbst subtile Abweichungen bei Temperatur, Sauerstoffversorgung oder Gewebehandhabung können die Kopplung von Reizen und Sekretionen zwischen β-Zellen beeinträchtigen oder Apoptose auslösen, bedingt durch begrenzte antioxidative Abwehrkräfte und einen hohen Stoffwechselbedarf ^6,7. Daher betonen die meisten konventionellen Protokolle eine schnelle nachgelagerte Nutzung, typischerweise innerhalb von 24–48 Stunden nach der Entnahme sowohl in klinischen als auch experimentellen Umgebungen 8,9,10,11,12. Während dieses "Immediate-Use"-System die Verschlechterung minimiert, schränkt es die experimentelle Flexibilität ein, erschwert Längsstudien und erschwert die Ansammlung ausreichender Inselanzahl für große in-vitro-Assays oder In-vivo-Transplantationsexperimente.

Unter den Nagetiermodellen werden Lewis-Ratten aufgrund ihres inzuchtigen genetischen Hintergrunds, ihres stabilen Immunprofils und reproduzierbaren physiologischen Merkmale häufig für die Inselforschung eingesetzt¹⁴. Stammabhängige Unterschiede in Inselaustrag, Reaktionsfähigkeit und Resilienz sind gut dokumentiert. De Groot et al. zeigten, dass Lewis-Ratteninseln eine überlegene glukosestimulierte Insulinsekretion im Vergleich zu anderen Stämmen aufweisen, was ihre Eignung für funktionelle, metabolische und^{Transplantationsstudien} unterstreicht. Weitere Arbeiten haben ihre Zuverlässigkeit für immunologische und Allo-/Xenotransplantationsforschung bestätigt 14,15,16. Zwischen verschiedenen Laboren bleibt jedoch die Variabilität im Inselertrag, der Reinheit und der Funktion eine bedeutende Hürde. Ein Großteil dieser Variabilität resultiert aus Inkonsistenzen in Enzymmischungen, intraduktalen Perfusionstechniken, Pankreashandhabung, Verdauungszeitpunkt und Reinigungsstrategie¹⁷.

Um diese Einschränkungen zu beheben, entwickelten wir ein reproduzierbares, schrittweises Protokoll für die chirurgische Entnahme, enzymatische Verdauung und Dichtegradientenreinigung von Bauchspeicheldrüseninseln von Lewis-Ratten. Dieser Workflow ist optimiert, um den Ertrag zu maximieren, Fragmentierung zu minimieren und die funktionale Lebensfähigkeit zu erhalten. Wichtig ist, dass sie klare Benchmarks festlegt, darunter Inseläquivalente (IEQ), Zeitvermögen, Reinheit und glukosestimulierte Insulinsekretion, die es den Forschern ermöglichen, erfolgreiche von suboptimalen Isolationen^{zuverlässig zu unterscheiden.} Durch die Verbesserung sowohl des Ertrags als auch der Langlebigkeit erhöht das Protokoll die experimentelle Flexibilität und kann die Anzahl der benötigten Spendertiere verringern, was ein ethischeres und skalierbareres Versuchsdesign unterstützt.

Im Gegensatz zu vielen traditionellen Ansätzen zeigt die vorliegende Methode, dass Lewis-Ratteninselchen bis zu 7 Tage in Kultur erhalten werden können, wobei Lebensfähigkeit und Funktion erhalten bleiben, was ihren Nutzen für längere In-vitro-Studien erweitert. Das Protokoll beinhaltet zudem eine stromlinienförmige, gepoolte Verarbeitungsstrategie, die bis zu 30 Bauchspeicheldrüsen in einer einzigen Charge verarbeiten kann, was eine gleichmäßige Verdauung ermöglicht und die Variabilität zwischen den Proben reduziert. Mit einer endokrinen Reinheit von bis zu 98 % beseitigt das Verfahren die arbeitsintensive Handpicking und verringert die Möglichkeiten für mikrobielle Kontaminationen. Im Vergleich zu Einzelschritt- oder Massenverdauungsmethoden, die häufig unreine oder mechanisch beeinträchtigte Präparate^erzeugen, liefert dieser Hochdurchsatz-Workflow zuverlässig eine große Anzahl sauberer, transplantationsfähiger Inseln, die sich für In-vitro-Analysen , metabolische Profilierung und In-vivo-Transplantationsstudien eignen.

Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Houston Methodist Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, Protokoll #IS00007362) genehmigt und gemäß dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals sowie dem Animal Welfare Act durchgeführt.
HINWEIS: Die im gesamten Protokoll verwendeten Materialien und Instrumente sind in der Materialtabelle zu finden.

1. Vorbereitung vor Ernte- und Isolationstag

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen unter aseptischen Bedingungen in einem Biosicherheitsschrank vor (siehe Tabelle 1) und lagern Sie alle Lösungen bis zur Nutzung bei 4 °C.
   Penicillin-Streptomycin-Spüllösung (Pen-Strep).
   Waschmittel.
   Abschreckpuffer.
   Inselkultur-Medien.
   Krebs-Puffer.
2. Sterilisieren Sie Werkzeuge und Geräte mittels Autoklavierung.
   1. Chirurgisches Paket zur Entnahme der Bauchspeicheldrüse für Autoklaven: chirurgische Vorhänge, Mullbinde, Rattenzahn-Gewebepinzette, flache Pinzette, fein gebogene Pinzette, eine Hautschere, Mikro-Dissektionsschere, zwei kleine Hämostaten und ein gebogener Hämostat.
      HINWEIS: Autoklaven, zwei Bauchspeicheldrüsen, entnehmen chirurgische Packungen, falls zwei chirurgische Operatoren vorhanden sind.
   2. Autoklaven-Bauchspeicheldrüsenreinigungs-Operationspaket: fein gebogene Pinzette und Mikro-Dissektionsschere.
   3. Ein Autoklav, 30 cm x 30 cm großes Alufolieblatt.
   4. Autoklaven 1–6 600 mL und 1 L Becher, je nach Anzahl der zu verarbeitenden Bauchspeicheldrüsen (siehe Tabelle 2).
   5. Autoklav ein 500 μm Sieb.
   6. Autoklaven zwei 14-G-Spinalnadeln, falls eine mit unverdauten Bauchspeicheldrüsengewebe verstopft.
   7. Ein Autoklav, ein Spritzenröhrchen für jede benötigte 50-ml-Spritze (siehe Tabelle 3).
3. Bereite das Wasserbad für die Verdauung vor.
   1. Füllen Sie das Wasserbad, das mit einem Orbitalshaker ausgerüstet ist, mit autoklaviertem ultrareinem Wasser, bis es 3/4 Zoll über dem Plattformniveau liegt.
   2. Gib 3 ml antimikrobielle Lösung hinzu und halte den Deckel geschlossen, um eine Kontamination zu minimieren.

2. Vorbereitungen für den Ernte- und Isolationstag

1. Bereite Gradientenspritzen vor.
   1. Entferne Inselgradientenlösungen von 1,108 g/cm³, 1,096 g/cm³ und 1,069 g/cm³, die in den nächsten Schritten und dem "Inselreinigungsschritt 5,2" hergestellt und verwendet werden, aus 4 °C-Speicher und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (etwa 1 H) ausgleichen.
      HINWEIS: Das erforderliche Gradientvolumen variiert je nach Anzahl der zu verarbeitenden Bauchspeicheldrüsen; siehe Tabelle 3 , um ausreichend aufgetaute Volumina ausgewählter Gradienten sicherzustellen.
   2. Vorladen und beschriften Sie die 50-mL-Spritzen mit 1,096 g/cm³ und 1,069 g/cm³ Steigungen.
      1. Die Dichtegradientenlösungen von 1,069 und 1,096 g/cm³ energisch mischen.
      2. Füllen Sie je nach Tabelle 3 die entsprechenden Mengen in 50-ml-Spritzen, die mit chirurgischem Schlauch und einer 16-G-Nadel ausgestattet sind.
      3. Nach dem Auffüllen werden die Nadeln verdeckt, um die Sterilität zu erhalten, und die Spritzen für den späteren Gebrauch im Schritt 5.5 der "Inselreinigung" beiseitegelegt.
   3. Halte einen Gradient von 1,108 g/cm³ bei Raumtemperatur bis zur späteren Nutzung.
2. Stellen Sie Working Dissociation Media (WDM) Enzymlösung her, geben Sie sie in Spritzen zur Perfusion und in autoklavierte Becher.
   1. Arbeiten Sie unter sterilen Bedingungen in einem Biosicherheitsschrank und bewahren Sie alle Lösungen auf Eis.
   2. Taue Aliquoten von Kollagenase, Thermolysin und DNase I auf Eis.
   3. Verdünne Enzymreagenzien in einem sterilen 1-Liter-Becher mit WDM, um folgende Endkonzentrationen zu erreichen: Kollagenase 0,15 mg/mL, Thermolysin 5 μg/mL und DNase I 0,1 mg/mL (Tabelle 2).
   4. Rühre WDM vorsichtig mit einer Wirbelbewegung 10 Mal. Nicht mit einer Pipette mischen; Erhält die Enzymaktivität durch sanftes Wirbeln.
   5. Nach und nach werden 10 ml der WDM-Enzymlösung mit einer 16-G-Nadel für schnelle Befüllung in jede 10-mL-Spritze gegeben und dann durch eine verschlossene 25 G x 1/2" Zoll Nadel für spätere Pankreasperfusion ersetzt.
   6. Wickle die geladenen Spritzen mit autoklavierter Alufolie ein und lege sie bis zum Gebrauch auf Eis.
   7. Geben Sie den überschüssigen WDM gleichmäßig in sterile 600-mL-Becher ab, um die geernteten Bauchspeicheldrüsen gemäß Tabelle 2 aufzunehmen. Decken Sie jeden Becher mit steriler Alufolie ab und legen Sie ihn auf Eis (Tabelle 2).
3. Bereiten Sie den Arbeitsbereich für Zellkulturen vor.
   1. Schalten Sie den orbitalen Wasserbadshaker ein, stellen Sie auf 130 U/min und 37 °C ein. Lassen Sie es während der Bauchspeicheldrüsenernte so.
   2. Stellen Sie die folgenden Gegenstände für 1 Stunde unter UV-Licht in den Biosicherheitsschrank zur weiteren Sterilisation.
      Sterile 500 μm Sieb.
      Steriler 1-Liter-Becher.
      Spritzenpumpe.
   3. Stellen Sie sicher, dass der Zellkulturinkubator auf 25 °C und 5 %_CO2 eingestellt ist.
   4. Stellen Sie die Zentrifuge auf 4 °C ein, mit Beschleunigung und Verzögerung bei 9.
4. Sammeln Sie Materialien für die Entnahme und begeben Sie sich in den Operationssaal.
   1. Designierter Bauchspeicheldrüsenreiniger:
      1. Sammeln Sie einen großen Eisbehälter, der die erforderliche Anzahl von 600 mL WDM-Bechern und die Bauchspeicheldrüsenspüllösung aufnehmen kann (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2).
      2. Sammeln Sie eine sterile Petrischale für jeweils 6 zu verarbeitende Bauchspeicheldrüsen.
      3. Sammeln Sie eine sterile Mikro-Sezierschere und zwei kleine, gebogene, empfindliche Pinzetten.
   2. Designierter Bauchspeicheldrüsenernter:
      1. Sammeln Sie ein steriles Operationspaket zur Entnahme.
      2. Sammeln Sie sterile chirurgische Handschuhe.
      3. Sammeln Sie eine Eisschale mit vorgeladenen 10-mL WDM-Spritzen, die in autoklavierter Alufolie versiegelt sind.
5. Im Operationssaal bereiten Sie die Bauchspeicheldrüsenentnahmestation vor.
   1. Schalten Sie den Glasperlensterilisator ein, um chirurgische Werkzeuge zu sterilisieren, indem Sie sie zwischen jedem Tier für eine Minute in den Sterilisator tauchen. Instrumente können schnell durch Eintauchen in sterile 1x-PBS gekühlt werden.
   2. Legen Sie ein absorbierendes Pad unter das Sichtfeld des Mikroskops, um Blut oder undichte WDM-Enzymlösung zu erkennen.
   3. Stellen Sie das Mikroskop auf eine Gesamtvergrößerung von 6,3-fach zwischen Okular- und Objektivlinse ein.
   4. Öffnen Sie das OP-Paket und ziehen Sie sterile chirurgische Handschuhe mit aseptischer Technik an.
   5. Fahren Sie mit der chirurgischen Entnahme fort.
6. Im Operationssaal bereiten Sie die Bauchspeicheldrüsenreinigungsstation vor.
   1. Gießen Sie genug Pen-Strep-Lösung, um die Hälfte einer 100 mm Petrischale (etwa 6 ml) zu füllen, um die isolierten Bauchspeicheldrüsen zu untertauchen, und legen Sie sie auf Eis.
   2. Öffnen Sie das OP-Paket und ziehen Sie sterile chirurgische Handschuhe mit aseptischer Technik an.
7. Im Operationssaal bereiten Sie die Euthanasiekammer vor.
   1. Stellen Sie die Behälter in einen leeren, sauberen und wieder verschließbaren Rattenkäfig.
   2. Fülle die Tabletts halb voll mit Isofluran.
   3. Stellen Sie das perforierte Behälter auf die Reservoirs, um ein Verschütten zu verhindern, während die Ratten hineingesetzt werden.
   4. Versiegeln Sie den Kammerdeckel mit dem Käfigdeckel.
8. Fahren Sie mit der Bauchspeicheldrüsenentnahme fort.

3. Bauchspeicheldrüsenernte

1. Setzen Sie die Ratten einzeln in die Euthanasiekammer auf das Tablett für eine schnelle Isofluran-Überdosis.
   HINWEIS: Die Euthanasiezeit für die Ratte variiert, besonders wenn das Isofluran verdampft.
2. Bestätigen Sie das Fehlen von Puls und Atmung bei jeder Ratte.
3. Bestätigen Sie die Euthanasie mit einer sekundären Methode, die die Bauchhöhle nicht stört (z. B. Herzpunktion).
   HINWEIS: Andere primäre Euthanasiemethoden sind akzeptabel; Eine Überdosis Isoflurane wird jedoch bevorzugt, da eine schnelle Euthanasie die Inselhypoxie minimiert.
4. Besprühen Sie das Bauchfell jeder Ratte mit 70 % Ethanol, um lose Haare im chirurgischen Bereich zu verfilzen und zu verhindern.
5. Legen Sie die eingeschläferte Ratte im Rücken unter das Mikroskop, mit dem Kopf distal vom Bediener. Stellen Sie sicher, dass die obere Bauchhöhle unter dem Sichtfeld des Mikroskops steht.

Abbildung 1: Chirurgische Exposition und intraduktale Perfusion der Rattenpankreas. Illustration der wichtigsten Schritte bei der Pankreas-Exposition und -Durchfluss durch den Oddi-Sphinkter. (A) Euthanasierte Lewis-Ratte mit geöffneter Bauchhöhle. (Aa) Klemmenlegung des Gallengangs und der Lebervene. (B) Vergrößerte Ansicht des Duodenums, die Hämostate zeigen, die die Region des Oddi-Sfinkters markieren. (Bb) Perfusionsnadel im Hauptgang der Bauchspeicheldrüse positioniert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

6. Ernte die Bauchspeicheldrüse (Bauchspeicheldrüsen-Erntefunktion):
   1. Machen Sie einen "V-förmigen" Schnitt mit einer Hautschere, beginnend von der Symphyse der Schamhaut bis zu jedem lateralen Brustkorb, um an die Bauchhöhle zu gelangen (siehe Abbildung 1A).
   2. Ziehe den Dünn- und Dickdarm mit flacher Zange auf die linke Seite des Tieres zurück, um den Bauchraum zu säubern.
   3. Entfalten Sie den Zwölffingerdarm mit der flachen Zange und den gebogenen Hämostaten. Stellen Sie sicher, dass der gemeinsame Gallengang und die hepatische Pfortader im Sichtfeld des Mikroskops sind.
   4. Ziehen Sie das Leberkopf zurück und schließen Sie den gemeinsamen Gallengang sowie die Lebervene mit den gebogenen Hämostaten ab. Klemmen Sie 1–2 mm von der Leber entfernt ab (siehe Abbildung 1Aa).
      HINWEIS: Die Schritte 3.6.1-3.6.4 und 3.6.8 können durch direkte Visualisierung durchgeführt werden. Verwenden Sie das Mikroskop für alle anderen Schritte, um eine empfindliche Gewebemanipulation zu gewährleisten.
   5. Unter Beobachtung des Mikroskops wird mit flacher Pinzette und flacher Hämostat der Inhalt des Zwölffingerdarms sanft mobilisiert, um den Schlofmuskel von Oddi zu reinigen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Inhalt des Duodenums von der vorgesehenen Nadelstichstelle entfernt wird.
   6. Isolieren Sie die Region um den Oddi-Shinkter, indem Sie den Duodenum mit den flachen Hämostaten etwa 5 mm von jeder Seite des Schließmuskels vorsichtig abklemmen. Achten Sie auf minimale Kompression, um die Gewebeintegrität zu erhalten (siehe Abbildung 1B).
   7. Mit einer sterilen WDM-Spritze wird die Nadel vorsichtig durch die Wand des Duodenalfingers eingeführt, durch den Oddi-Sphinkter geführt und in den Hauptgang der Bauchspeicheldrüse zur Durchfluss eingeführt (siehe Abbildung 1Bb).
      1. Sobald die Nadel durch den Oddi-Sphinkter geht, wird unter konstantem Druck 7–10 ml WDM mit einer Geschwindigkeit von etwa 500 μL/s in die Bauchspeicheldrüse geperfundiert, bis die Bauchspeicheldrüse vollständig aufgebläht ist.
         HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Fasen nach oben ist und die Nadel parallel zum Bauchspeicheldrüsengang ist, um das Trauma zu minimieren. Beginnen Sie sofort mit der Injektion nach dem Einsetzen. Dies hilft, den Schließmuskel und den Gang zu erweitern und so das Vorrücken der Nadel zu erleichtern. Die Bauchspeicheldrüse gilt als vollständig aufgebläht, wenn der Schwanz der Bauchspeicheldrüse, der sich in der Nähe der Milz befindet, sichtbar durchströmt wird.
   8. Entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse, indem Sie sie vorsichtig von den umliegenden Strukturen in folgender Reihenfolge befreien: Milz, Magen, Dickdarm, Zwölffingerdarm und Mesenterium.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um Gewebeschäden zu minimieren. Fahren Sie sequentiell vor, um die anatomische Ausrichtung zu erhalten und die Spannung an den Gefäß- und Ductalverbindungen zu verringern.
      1. Entfernen Sie beide flachen Hämostaten aus dem Duodenum.
      2. Benutze die flache Pinzette, um das Splenopankreasband (verbindet Bauchspeicheldrüse und Milz) zu klemmen und greife sanft an.
      3. Mit der feingebogenen, sezierenden Zange mobilisieren und trennen Sie vorsichtig die Bauchspeicheldrüse von den benachbarten Milzbefestigungen.
      4. Lösen Sie die Bauchspeicheldrüse vom Magen, indem Sie das Bauchspeicheldrüsengewebe mit fein gebogenen Pinzetten anheben und mit flacher Zange sanften Gegenzug anwenden.
      5. Anschließend übt man mit der flachen Zange festen Trakt aus, um den Dickdarm aus der Bauchspeicheldrüse zu entfernen.
      6. Heben Sie den Dünndarm mit der flachen Pinzette an und sezieren Sie das Mesenterium von der Bauchspeicheldrüse mit der fein gebogenen Pinzette.
      7. Heben Sie vorsichtig die perfundierte Bauchspeicheldrüse mit der flachen Zange an und verwenden Sie die feine Sezierschere, um alle verbliebenen Ansätze am Bindegewebe abzutrennen.
   9. Die entfernte Bauchspeicheldrüse wird sofort in eine Petrischale mit eiskalter Spüllösung gegeben und die nächste Bauchspeicheldrüse entnommen, während der Bauchspeicheldrüsenreiniger mit der Bauchspeicheldrüsenreinigung beginnt.
7. Die Bauchspeicheldrüse reinigen (Bauchspeicheldrüsenreiniger):

Abbildung 2: Reinigung der perfundierten Rattenpankreas. Sequentielle Visualisierung der Bauchspeicheldrüse vor und nach der Entfernung von nicht essenziellem Gewebe. (A) Perfundierte Bauchspeicheldrüse unmittelbar nach der Dissektion, wobei angrenzendes Fettgewebe, Lymphknoten und Bindestrukturen sichtbar sind. (B) Perfundierte Bauchspeicheldrüse mit markierten anatomischen Orientierungspunkten. (C) Bauchspeicheldrüse nach Entfernung des überschüssigen Gewebes gereinigt, wobei das endgültige Erscheinungsbild vor der Verdauung gezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

1. Verwenden Sie die fein gebogene Zange und die feine Sektionsschere, um vorsichtig Lymphknoten, Fettgewebe, Mesenterium und große Gefäße von der perfundierten Bauchspeicheldrüse zu entfernen, falls vorhanden (siehe Abbildung 2).
2. Übertragen Sie die gereinigte Bauchspeicheldrüse in einen sterilen 600-mL-Becher mit 25 mL kaltem WDM. Decken Sie den Becher mit steriler Aluminiumfolie ab, um die Sauberkeit zwischen dem Transport vom chirurgischen Arbeitsbereich und dem Zellkulturbereich zu gewährleisten.
   1. Ersetzen Sie die Spüllösung alle 6 Bauchspeicheldrüsen in der Petrischale, um eine Kontamination zu vermeiden.
   2. Notieren Sie die Zeit, zu der die erste Bauchspeicheldrüse auf Eis gelegt wird. Dies wird genutzt, um die Zeit der Kälteischämie zu dokumentieren.

8. Sobald alle Bauchspeicheldrüsen beschafft und gereinigt sind, gehen Sie schnell in die Verdauungsphase im Zellkulturbereich über.

4. Verdauung der Bauchspeicheldrüse

1. Pausieren Sie die Umlaufbewegungen des Orbitalshakers und sichern Sie die abgedeckten Becher(s), die die Bauchspeicheldrüse enthalten, in die vorgesehenen Halter des Wasserbades.
2. Schnell starten Sie den Orbitalshaker auf 130 U/min neu und starten Sie einen 10-minütigen Timer für die Verdauungszeit (siehe Abbildung 3A).
   HINWEIS: Notieren Sie diesen Punkt als Ende der Phase der Kälteischämie. Protokollieren Sie jede Inselernte mit der entsprechenden Gesamtzeit der Kälteischämie in einem Laborprotokoll.
3. Nach 5 Minuten wirbeln Sie den Becher manuell im Uhrzeigersinn und dann gegen den Uhrzeigersinn, um die Gewebedissoziation zu unterstützen.
4. Nach der 8-Minuten-Marke wird die Abschrecklösung aus dem Kaltlager geholt und in den Biosicherheitsschrank für spätere sofortige Verwendung überführt (siehe Tabelle 1).
5. Bei der 10-Minuten-Marke werden Becher schnell übertragen und in Eis getaucht, um die Enzymaktivität zu verlangsamen (siehe Abbildung 3B).
   HINWEIS: Ab diesem Punkt werden alle Gewebe, Zellen und Lösungen auf Eis behandelt, um sie bis Schritt 4.20 zu erhalten, wenn Raumtemperaturdichtegradienten verwendet werden.
6. Bringen Sie die Außenseite des Bechers und das Tablett in einen Biosicherheitsschrank.
7. Fügen Sie den Abschreckpuffer im Verhältnis 1:1 mit der Lösung im Becher hinzu, um die Verdauung zu stoppen (ca. 75-100 ml pro Becher).
8. Aspirieren und stoßen Sie die Gewebesuspension vorsichtig und wiederholt mit einer 50-ml-Spritze mit einer 14-G-Spinalnadel ab, um große Gewebefragmente zu dissoziieren (siehe Abbildung 3C).
9. Übertragen Sie die Federung auf 200 mL konische Rohre.
10. Spülen Sie den Becher mit 5 ml Waschmedium ab und füllen Sie ihn in das 200 mL konische Rohr mit dem Inselverdauung, um eventuelle verbleibende Verdauungen aufzusammeln.
11. Die Zentrifuge verdaut bei 200 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Achten Sie auf die Verwendung geeigneter Zentrifugenflaschenadapter und -polster zur Sicherheit.
12. Geben Sie das Supernatant vorsichtig ab und suspendieren Sie das Pellet erneut in 100 ml Waschmedium mit derselben 14-G-Spinalnadel wie zuvor.
13. Filtern Sie die Suspension durch ein steriles 500-μm-Sieb, das über einen sterilen 600-mL-Becher gelegt wird, um großes, unverdautes Gewebe zu entfernen.
    HINWEIS: Wenn die Perfusion und Reinigung der Bauchspeicheldrüse optimal durchgeführt werden, verbleibt nur minimales Fettgewebe und keine unperfundierte Bauchspeicheldrüse auf dem Sieb.
14. Spülen Sie das Sieb mit 10 ml Waschmedium ab, um das eingeschlossene Gewebe zurückzugewinnen.
15. Transferiere das Filtrat in neue 200-mL konische Röhren.
16. Zentrifugiere bei 200 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
17. Dekantieren Sie das Überdachungsmittel und lassen Sie das Pellet in einem 100-mL-Waschmedium mit einer 10-mL-serologischen Pipette wieder suspendieren.
    HINWEIS: Sorgen Sie für minimalen Zellverlust, indem Sie die Pipettenspitzen mit einem FBS-haltigen Puffer vor der Exposition gegenüber Inselchen vorbenetzen.
18. Zentrifugiere bei 600 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
19. Aspirieren Sie vorsichtig das Überlagermittel, um ein trockenes Pellet zu erhalten.
20. Stellen Sie die Zentrifugentemperatur auf 22 °C ein, um die Gradiententrennung vorzubereiten.
    HINWEIS: Dies kann beschleunigt werden, indem die Zentrifuge bei 2000 x g für 15 Minuten bei 22 °C ohne Proben betrieben wird.

5. Inselreinigung

1. Siehe Tabelle 3 , um die Anzahl der benötigten 50-mL konischen Röhren zu bestimmen.
   HINWEIS: Siehe Tabelle 3 , um das gesamte Pelletvolumen gleichmäßig zu verteilen und sicherzustellen, dass etwa 2–3 ml Pellet-Verdauung auf jedes Gradientrohr aufgeteilt werden. Wenn später eine schwache Inselbandtrennung festgestellt wird, verwenden Sie zusätzliche Gradientröhren, um die Trennungsauflösung zu verbessern.
2. Vorbefeuchten Sie eine 10 mL serologische Pipettenspitze mit der 1,108 g/cm³ Dichtegradientenlösung, um zu verhindern, dass Inselchen an der Innenseite der Spitze haften.
3. Jedes Gewebepellet wird in 15 mL 1,108 g/cm³ Gradientenlösung pro 2 ml Pelletvolumen mit der vorbenetzten 10 mL serologischen Pipette erneut suspendiert. Trotz des Gesamtvolumens von über 10 ml ermöglicht die kleinere Pipettenbreite kontrolliertere Mischung und eine effizientere Pellet-Dissoziation. Sanft verrühren, bis es gleichmäßig ist.
4. Geben Sie vorsichtig 15 ml der Zellsuspension in den Boden jedes 50-mL-konischen Rohrs und vermeiden Sie den Kontakt mit den Röhrenwänden, um saubere Gefälle zu gewährleisten.
5. Mit den vorgeladenen Gradientenspritzen wird nacheinander 10 mL mit 1,096 g/cm³ Gradient überlagert, gefolgt von 10 mL mit 1,069 g/cm³ Gradient.
6. Geben Sie jeden Gradienten mit einer Geschwindigkeit von 5 mL/min mit einer Spritzenpumpe ab und positionieren Sie die 16-G-Nadelspitze an der Innenwand des Rohrs, um eine Gradientenmischung zu verhindern.
7. Zentrifugieren Sie die Röhren bei 700 × g für 15 Minuten bei 22 °C, wobei die Zentrifugenbeschleunigung auf 3 und die Verzögerung auf 0 eingestellt ist, um Gradientenmischung zu verhindern.
   HINWEIS: Angesichts der verlängerten Verzögerungszeit dauert der gesamte Zentrifugationszyklus etwa 45 Minuten. Überwachen Sie die Zeit genau, da Inseln schnell gesammelt werden müssen, um Gradientenmischung und mögliche Zellschäden zu verhindern. Falls nötig, bereiten Sie Gegengewichtsrohre nach Gewicht und nicht nach Volumen vor, um Dichteunterschiede zu berücksichtigen. Nach dem Entfernen der Röhren wird die Zentrifuge auf 4 °C zurückgesetzt und die Beschleunigung sowie Verzögerung auf 9 für die nächsten Schritte reduziert.
8. Nach der Zentrifugation identifizieren Sie die Inselschicht, die sich an den Grenzflächen zwischen den Gradientenschichten von 1,069–1,096 g/cm³ und 1,096–1,108 g/cm³ befindet (siehe Abbildung 3D).
9. Aspirieren und entsorgen Sie vorsichtig das Gewebe, das sich in der obersten Schicht gesammelt hat, mit einer Pasteur-Pipette, die mit Waschmedium vorbenetzt ist.
10. Befeuchten Sie eine weitere Pasteur-Pipette, sammeln Sie die Inselschicht auf und übertragen Sie sie in ein vorgekühltes 200 ml konisches Rohr mit 5 ml Waschmedium.
11. Erhöhe das vorgekühlte 200 mL konische Rohrvolumen mit Waschmedium auf 200 mL.
12. Zentrifugiere mit 600 × g für 5 Minuten und dekantiere das Supernatant.
13. Die Kugel wird in 30 ml Waschmedium mit einer vorbenetzten 10 mL serologischen Spitze wieder aufgehängt.
14. Übertragen Sie die Resuspension auf ein neues 50-mL-konisches Rohr mit einer vorbenetzten 10-mL-serologischen Spitze für eine bessere Inselpelletierung.
15. Spülen Sie dasselbe 200 ml konische Rohr mit 20 ml Waschmedium und übertragen Sie es auf das 50 ml konische Rohr mit den verbleibenden Inselchen.
16. Zentrifugiere die 50 mL konische Flüssigkeit mit Inselchen und Waschmedium bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
17. Dekantieren Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Inselpellet in 50 ml Inselkulturmedium (siehe Tabelle 1).
    HINWEIS: Entfernen Sie während dieses Schritts 100 μL-Aliquots, wenn Sie die Inselchen mit der manuellen Quantifizierungsmethode zählen.
18. Gleichmäßig werden die Inselchen in 100 mm Petrischalen mit Nichtgewebekultur-Kultur getrichtert, wobei ein Teller für jeweils fünf verarbeitete Lewis-Ratten-Pankreasen verwendet wird.
    1. Berechnen Sie das gesamte benötigte Medienvolumen der Insel mit der Formel (Anzahl der Bauchspeicheldrüsen ÷ 5 × 10 mL).
    2. Suspendieren Sie das Inselpellet wieder auf die Hälfte des berechneten Medienvolumens und verteilen Sie die Federung dann gleichmäßig auf die festgelegte Anzahl der Platten.
    3. Spülen Sie das 50 ml konische Rohr mit den Restinseln mit der restlichen Hälfte des berechneten Mediums und pipettieren Sie diese Wäsche über dieselben Platten, um ein Endvolumen von 10 mL pro Schüssel zu erreichen (siehe Abbildung 3E).
19. Über Nacht bei 25 °C in 5 % CO₂ inkubieren. Füge alle 24 Stunden 3 ml Inselkulturmedium neben jede Petrischale hinzu und schwenke es dann vorsichtig, um das Medium wieder aufzufüllen.
20. Fahren Sie mit der Inselzählung fort (Schritt 6).

Abbildung 3: Bauchspeicheldrüsenverdauung und Reinigung isolierter Inselchen. Repräsentative Bilder der abeinanderfolgenden Schritte von der Verdauung der Pankreas in Pools bis zur Inselreinigung. (A) Gesammelte perfundierte Bauchspeicheldrüsen vor der enzymatischen Verdauung. (B) Fragmentierte Bauchspeicheldrüse nach der enzymatischen Verdauung. (C) Einheitliche Gewebesuspension, postmechanisch. (D) Dichtegradientenröhrchen vor der Zentrifugation (links) und nach der Zentrifugation (rechts), mit sichtbarem Inselband an der Gradientengrenze eingekreist. (E) Brightfield-Bild der Tag-0-Inselchen unmittelbar nach der Abholung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

6. Inselzählung

1. Manuelle Inselquantifizierung sammeln.
   1. Im Schritt 5.16 werden drei 100-μL-Aliquots der Inselaufhängung mit einer 200-μL-Pipette und normalen 200-μL-Spitzen entnommen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Inselchen gleichmäßig im Medium durch Pipettenmischung aufgehängt sind, wenn Aliquots zur Messung entnommen werden.
   2. Jedes Aliquot wird in eine eigene 2 mm × 2 mm gitterierte Petrischale mit 1 ml 1× PBS umgefüllt.
   3. Zählen Sie die Inselchen unter einem umgekehrten Mikroskop und katalogisieren Sie sie nach Durchmesser mit einem Okular-Retikel-Linseneinsatz.
      HINWEIS: Nicht alle Inselchen sind kreisförmig; Halten Sie sich während der gesamten Zählung an horizontale oder vertikale Messungen.
   4. Berechnen Sie die Gesamtzahl der 150 μm Inseläquivalente mit der standardisierten Umrechnungstabelle (siehe Tabelle 4).
      HINWEIS: Vergleichen Sie den IEQ jeder Stichprobe. Wenn sich der IEQ der Aliquots um mehr als 30 % unterscheidet, werden Sie mit dem Durchschnitt der ähnlichsten Aliquots fortfahren.

7. Sicherheitsvorkehrungen

1. Führen Sie alle chirurgischen und Gewebehandhabungsverfahren unter aseptischen Bedingungen in einem Biosicherheitsschrank durch, wenn dies erforderlich ist. Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Schutzbrillen, Laborkitteln, Handschuhe und chirurgische Masken, während der Handhabung von Reagenzien und Geweben.
2. Bauchspeicheldrüsenentnahme unter sterilen Bedingungen mit geeigneten chirurgischen Werkzeugen und PSA durchführen. Behandeln Sie Isofluran und andere Anästhetika gemäß den Einrichtungsrichtlinien, um eine Einatmungsexposition zu verhindern.
3. Entsorge tierisches Gewebe, Spitzen und Biohazard-Abfälle gemäß den institutionellen Biosicherheitsprotokollen. Enzymatische Reagenzien und biologische Materialien auf Eis, sofern nicht anders angegeben, um Aktivität und Lebensfähigkeit zu erhalten.

Ergebnisse

Die folgenden Ergebnisse stellen eine typische Inselisolation dar, die mit der beschriebenen Methode durchgeführt wird, wobei zwölf Lewis-Ratten-Pankreasen parallel verarbeitet werden.

Ertrags- und Größenverteilung

Manuelles Aliquot-Zählen und IEQ-Umrechnung

Aus der gemischten Inselsuspension wurden zwei unabhängige 100-μL-Aliquoten gewonnen, wie im Abschnitt "Inselzählung", Schritt 6.1, beschrieben und mit Durchmesser-Bins (50-100 μm, 100-150 μm, 150-200 μm, 200-250 μm, 250-300 μm, 250-300 μm) beschrieben. Die Zählungen wurden in Inseläquivalente (IEQ; 150 μm Referenz) mit Standardäquivalenztabellen umgerechnet und auf das gesamte Aufhängungsvolumen extrapoliert (siehe Abbildung 4A). Über die Testisolation hinweg (n = 12) betrug die Ausbeute 3330 IEQ/Bauchspeicheldrüse mit einem mittleren Inseldurchmesser im 50–100 μm großen Bin. Repliziere Aliquots mit 18,8 % pro Bin (Variationskoeffizient), was auf moderate Variation hinweist, die mit manuellen Zählmethoden zu erwarten ist. In den vorherigen 14 Inselisolationen ergab diese Methode durchschnittlich 1353 (SD 607) IEQ/Pankreas.

Automatisierte Ganzplattenquantifizierung

Um manuelle IEQ zu benchmarken, wurden Hellfeldbilder bei D1 mit einem Mikroskop aufgenommen und zusammengestickt, um Ganzschüssel-Verbundbilder zu erzeugen (4× Objektiv; 1/100 s Belichtung). Automatisierte Größenmessung und Objektquantifizierung wurden mit Fiji und Codierung mit einer vordefinierten Größenschwelle von 50–600 μm durchgeführt. Die Bilder wurden zunächst vorverarbeitet, um Hintergrundvariationen zu reduzieren und die Kontrastgleichmäßigkeit zu verbessern. Inselstrukturen wurden anhand von Intensitätsunterschieden im Vergleich zum umgebenden Gewebe identifiziert, wodurch binäre Objektmasken erzeugt wurden. Benachbarte oder teilweise berührende Inselchen wurden getrennt, um eine Unterschätzung der Objektanzahl zu vermeiden. Objekte außerhalb des angegebenen Größenbereichs wurden ausgeschlossen, um Trümmer und Nicht-Inselgewebe zu entfernen. Für jedes erhaltene Objekt wurden morphometrische Parameter einschließlich Fläche sowie x- und y-Achsendurchmesser extrahiert. Die Inselchen wurden dann nach Durchmesser gekartet, und der IEQ wurde berechnet, indem die Anzahl der Inselchen in jedem Größenbehälter mit dem entsprechenden Umrechnungsfaktor multipliziert wurde. Die automatisierte Bemessung ergab insgesamt 98.832 Objekte mit mittleren x- und y-Achsendurchmessern von 117 μm bzw. 116 μm sowie einem geschätzten Gesamtwert von 16.350 IEQ, was stark mit manuellem IEQ bei D0 korrelierte (Spearman r = 0,937, p = 0,0048; siehe Abbildung 4A-C).

Inselzell-Shedding

Ganzplattenbilder wurden 2 Stunden nach der Reinigung und erneut am ersten Tag (D1) aufgenommen, wobei dieselbe Methodik in der "Automatisierten Ganzplattenquantifizierung" verwendet wurde, um die frühe Inselstabilisierung ("Shedding") zu bewerten. Die Objektanzahl änderte sich um 0,9 % und IEQ um -6,11 % von 2 Stunden auf D1 (siehe Abbildung 4D). Der gepaarte Vergleich der Inseldurchmesser zwischen D0 und D1 zeigte eine statistisch signifikante Medianabnahme von 2 μm (Wilcoxon-Signed-Rank-Test, p = 0,0136, n = 2820). Allerdings ist das geringe Ausmaß dieser Veränderung vermutlich weder biologisch noch klinisch bedeutsam.

Abbildung 4: Quantitative Bewertung der Inselgrößenverteilung, der Korrelation und des frühen Haarausfalls. Grafische Zusammenfassung der Inselmessungen, die durch manuelle und automatisierte Analysen gewonnen wurden. (A) Tag 0 (D0) Inselgrößenverteilung basierend auf manueller Quantifizierung über standardisierte, inseläquivalente IEQ-Behälter. (B) Tag 1 (D1) Inselgrößenverteilung, bestimmt durch automatisierte, bildbasierte Messungen über dieselben standardisierten IEQ-Größenbehälter. (C) Korrelation der Zählungen zwischen manueller D0- und automatisierter D1-Quantifizierung über IEQ-Größen-Bins. (D) Box-Diagramm der Verteilung der Inseldurchmesser zwischen D0 und D1 für automatisierte Messungen derselben Platte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Reinheit (endokrin vs. exokriner Inhalt)

Dithizon (DTZ) Färbung

Auf D1 wurde ein Aliquot von Inselchen (n = 451) bei Raumtemperatur 30 Sekunden lang mit DTZ gefärbt und sofort mit Hellfeldmikroskopie (4× Objektiv; 1/20 s Belichtung) abbildet. In Fidschi wurden Hintergrundpixel entfernt, sodass die verbleibende Pixelfläche der gesamten Inselfläche entsprach. DTZ-negative exokrine Geweberegionen, die durch dunkleren Farbkontrast identifiziert wurden, wurden manuell mit einem Lasso-Werkzeug ausgewählt, und die Fläche jeder interessanten Region wurde automatisch in Pixeln erfasst. Die endokrine Reinheit wurde als Prozentsatz der DTZ-positiven Pixel im Verhältnis zu den Gesamtpixeln der Inseln berechnet, was eine Reinheit von 98,56 ± 0,38 % ergibt (Abbildung 5A).

Tragfähigkeit und funktionale Leistung

Glukosestimulierte Insulinsekretion (GSIS)

Zu jedem Zeitpunkt (D1, D3, D7) wurden 15 größengleiche Inselchen handverlesen, die in einzelne Brunnen einer 24-Brunnen-Platte platziert wurden, die vierfach vorbereitet wurden. Die Inselchen wurden bei 37 °C 5 % CO2_im Krebspuffer unter einem niedrig-hoch-niedrigen Glukosestimulationsprotokoll inkubiert: zuerst bei niedriger Glukose (2,8 mM, 60 min), gefolgt von hoher Glukose (16,7 mM, 60 min, siehe Tabelle 1). Am Ende jeder Inkubationsphase wurden Abflussfraktionen gesammelt, und die Insulinkonzentrationen wurden mittels eines Ratteninsulin-ELISA-Tests quantifiziert. Die Stimulationsindizes wurden als Verhältnis der Insulinsekretion unter hohen zu niedrigen Glukosebedingungen berechnet. Die Stimulationsindizes lagen an den Tagen 1, 3 und 7 bei 9,37, 8,34 und 6,7, ohne signifikante Unterschiede (Abbildung 5B).

Lebende/Tote Flecken

Bei D1, D3 und D7 wurden 15 Inselchen handverlesenen und mit dem Live/Dead-Viability-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers befleckt. Kurz wurden die Inselchen 30 Minuten lang in der Live/Dead-Färbungslösung bei 25 °C inkubiert und anschließend unter konsistenten Mikroskopeinstellungen fotografiert, um die Vergleichbarkeit über Zeitpunkte zu gewährleisten (4X-Objektiv; 1/30 s Belichtung, Texas Red- und GFP-Filter). Die Viabilität wurde mit einem Python-Skript quantifiziert, das Scikit-Image für die Inselsegmentierung und Fluoreszenzmessung verwendete. Die Inselchen wurden identifiziert, indem die grünen und roten Fluoreszenzkanäle kombiniert wurden, Li's Schwellenmethode zur Erzeugung einer binären Maske verwendet und Einzugsgebiete segmentiert wurden, um berührende Inselchen zu trennen. Objekte wurden nach Gebiet gefiltert, um Trümmer und Artefakte auszuschließen. Für jedes Inselchen wurde die Viabilität als Prozentsatz der lebenden integrierten Dichte (grüne Pixel) relativ zur gesamten integrierten Dichte (grün plus rote Pixel) berechnet. Die Ergebnisse zeigten eine Lebensfähigkeit von 68 ± 9 % bei D1, 98,2 ± 0,6 % bei D3 und 100 % bei D7. Eine positive Kontrollprobe, die 10 Minuten mit 70 % Ethanol behandelt wurde, zeigte eine Viabilität von 2,7 ± 7,2 % (siehe Abbildung 5C-F).

Abbildung 5: Bewertung der Reinheit, Lebensfähigkeit und funktionellen Reaktionsfähigkeit der Inselchen. Repräsentative Bilder und quantitative Zusammenfassungen isolierter Inselmerkmale im Zeitverlauf. (A) Repräsentatives 10× Hellfeldbild von mit Dithizon (DTZ) gefärbten Inselchen, die rot gefärbte endokrine Inselchen und ungefärbtes exokrines Gewebe zeigt. (B) Glukosestimulierte Insulinsekretionswerte (GSIS) mit hohem Glukose/niedriger Glukose (HG/LG) Stimulationsindex für die Tage 1, 3 und 7. (C-E) Lebendige/tote Fluoreszenzbilder von Inselchen am Tag 1 (C), Tag 3 (D) und Tag 7 (E). (F) Live/Dead Fluoreszenzbild von positiv-kontrollierten Inseln, behandelt mit Ethanol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

(A) Waschmedium
Komponente	Abschließende Schwerpunkte	Menge (mL)
RPMI 1640	-	500 mL
Fetales Rinderserum	10%	50 mL
Pen-Streptokokken (10.000 U/mL)	1%	5,5 mL
HEPES	25 mM	12,5 mL aus 1M-Serien.
L-Glutamin	2 mM	5 mL aus 200 mM Serien.
(B) Insel-Kulturmedien
Komponente	Abschließende Schwerpunkte	Menge (mL oder g)
RPMI 1640, keine Glukose	-	500 mL
Fetales Rinderserum	10%	50 mL
Pen-Streptokokken (10.000 U/mL)	1%	5,5 mL
HEPES	20 mM	11 ml aus 1M-Serien.
Natriumpyruvat	1 mM	5,5 mL aus 100-mM-Serien.
Glukose	5,5 mM	2,75 mL aus 200 g/L-Lager
(C) Penicillin-Streptomycin-Spüllösung
Komponente	Abschließende Schwerpunkte	Menge (mL oder g)
Kochsalzlösung, 0,9 %	-	500 mL
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)	2%	10 mL
(D) Abschreckpuffer
Komponente	Abschließende Schwerpunkte	Menge (mL oder g)
HBSS	-	500 mL
Fetales Rinderserum	20%	100 mL
HEPES (1 M)	2.50%	2,5 mL
(E) Krebspuffer
Komponente	Abschließende Schwerpunkte	Menge (mL oder g)
dH2O	-	975 mL
NaCl	115 mM	6,72 g
NaHCO3	24 mM	2,02 g
KCl	5 mM	0,3728 g
HEPES (1 M)	25 mM	25 mL
MgCl2	1 mM	0,0952 g
BSA	0.10%	1 g
CaCl2	2,5 mM	0,2775 g

Tabelle 1: Lösungsliste. Zusammensetzungs- und Vorbereitungsdetails für alle im gesamten Isolierungs- und Reinigungsprotokoll verwendeten Lösungen. Jeder Unterabschnitt listet Komponenten, Endkonzentrationen, Vorbereitungsvolumina und Katalognummern auf. (A) Waschmedium, das zum Abspülen und Waschen von Tüchern während der Verdauung und Reinigung verwendet wird. (B) Islet Culture Media, verwendet für die Pflege und Lebensfähigkeit von Inselchen nach der Isolation. (C) Penicillin-Streptomycin-Spüllösung, verwendet zur Sterilisation und Spülung entnommener Bauchspeicheldrüsen. (D) Quenching Buffer, verwendet zur Beendigung der enzymatischen Verdauung und zur Erhaltung der Zelllebensfähigkeit. (E) Krebspuffer, verwendet bei glukosestimulierten Insulinsekretionstests (GSIS).

Anzahl der Bauchspeicheldrüsen	Kollagenase (15,38 mg/mL)	Thermolysin (1 mg/mL)	DNAse (100 mg/mL)	Arbeitspuffer	600-mL-Becher zur Nutzung	Lautstärke/Becher
30	4,5 mL	2,25 mL	450 μL	450 mL	5	25 mL
24	3,6 mL	1,8 mL	360 μL	360 mL	4	25 mL
20	3 mL	1,5 mL	300 μL	300 mL	3	25 mL
16	2,4 mL	1,2 mL	240 μL	240 mL	2	25 mL
12	1,8 mL	0,9 mL	180 μL	180 mL	2	25 mL
10	1,5 mL	0,75 mL	150 μL	150 mL	2	25 mL
Abschließende Schlussfolgerung.	0,15 mg/mL	5 mg/mL	0,1 mg/mL

Tabelle 2: Verdauungsenzymlösung nach Bauchspeicheldrüsenmenge. Volumina von Kollagenase, Thermolysin und DNase I erforderlich, um das Working Dissociation Medium (WDM) für unterschiedliche Mengen an Rattenpankreasen vorzubereiten. Die endgültigen Konzentrationen jedes Enzyms sind am unteren Rand der Tabelle aufgeführt.

Anzahl der Bauchspeicheldrüsen	Nummer 50 mL Röhren	Volumen/Spritze	Anzahl von 1.096 Spritzen	Anzahl von 1.068 Spritzen
30	10 Röhren	50 mL	2	2
24	8 Röhren	40 mL	2	2
20	6 Röhren	30 mL	2	2
16	4 Röhren	40 mL	1	1
12	4 Röhren	40 mL	1	1
10	2 Röhren	20 mL	1	1

Tabelle 3: Gradientenbelastung nach Bauchspeicheldrüsenmenge. Anzahl der 50-mL konischen Röhren und entsprechende Gradientenvolumen, die für die Inselreinigung benötigt werden, basierend auf der Anzahl der verarbeiteten Bauchspeicheldrüsen.

Inseldurchmesserbereich (μm)	Inselpartikelzahl (KI)	IEQ-Umwandlungsfaktor	IEQ pro Bereich
50-100	a	* 0.167	a * 0,167
101-150	b	* 0.648	b * 0,648
151-200	c	* 1.685	c * 1,685
201-250	d	* 3.500	d * 3,500
251-300	e	* 6.315	e * 6,315
301-350	f	* 10.352	f * 10,352
> 350	g	* 15.833	g * 15,833

Tabelle 4: Umwandlung der Inseläquivalenz. Umwandlung der Inseldurchmesserbereiche in standardisierte Inseläquivalente (IEQ). Die Tabelle listet die beobachteten Inseldurchmesser-Bins, die Anzahl der Inselpartikel pro Bereich, den entsprechenden IEQ-Umrechnungsfaktor für jede Größenzone und den resultierenden IEQ-Beitrag pro Bereich auf.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatzansatz zur Isolierung und Reinigung von Bauchspeicheldrüseninseln von Lewis-Ratten. Der Erfolg der Methode hängt von mehreren entscheidenden Schritten ab, die gemeinsam die Integrität und Funktion der Insel bewahren. Dazu gehören die präzise und vollständige intraduktale Durchströmung der Bauchspeicheldrüse, die sorgfältige Reinigung der perfundierten Bauchspeicheldrüse und die exakte enzymatische Verdauungszeit. Eine konstante Ganzorgan-Perfusion ist entscheidend, um eine gleichmäßige Dehnung der Bauchspeicheldrüse zu erreichen und eine gleichmäßige Verteilung der Kollagen-Thermolysin-DNase-Mischung sicherzustellen, die jeweils die extrazelluläre Matrix verdauen, die Enzymdurchdringung verbessert und die DNA-vermittelte Viskosität^{reduziert 21,22}. Unterperfusion kann zu einer unvollständigen Gewebeverdauung und dem Verlust eines bedeutenden Teils der Inselchen führen, da das unterverdaute Gewebe mit dem Sieb herausgefiltert wird. Ebenso kann eine unzureichende Entfernung von Fett- oder Gefäßgewebe vor der Verdauung nicht-endokrine Verunreinigungen einführen, die die Reinheit senken. Schließlich führt eine längere Verdauung durch übermäßigen Bruch der extrazellulären Matrix zur Desegregation der Insel, während eine suboptimale Verdauung zu unverdautem Gewebe führt, das der mechanischen Verdauung durch die Spinalnadel widerstandsfähig ist. Diese Schritte stellen die häufigsten technischen Fallstricke dar und sollten während des Trainings und der Optimierung sorgfältig überwacht werden.

Obwohl diese Methode speziell für Lewis-Ratten entwickelt wurde, kann sie wahrscheinlich durch eine geringe Reoptimierung der Verdauungszeit und des Enzymverhältnisses^auf andere Stämme oder Arten angepasst ^werden. Einige Labore entscheiden sich dafür, das Verhältnis von Kollagenase, Thermolysin und DNase I im Working Dissociation Medium (WDM) anzupassen, um die Ausbeute für ihre spezifischen Enzym-Lot- oder Gewebeeigenschaften zu optimieren. Dazu können Labore sorgfältig dem Schritt-für-Schritt-Leitfaden des Herstellers zur Enzym- und Gewebeoptimierung folgen und in allen Fällen vermeiden, Komponenten wie 0,1 M EDTA, Cystein, Mercapptoethanol, Proteaseinhibitoren, Serum oder Albumin hinzuzufügen, da diese Kollagenase, Thermolysin und die Enzymaktivität²⁷ von DNase 1 hemmen können. Obwohl keine eindeutige Arbeitszeit für die Enzymmischung vor der Dissoziation veröffentlicht wurde, zeigen frühere Daten, dass die verlängerte Kälteerhaltung der Bauchspeicheldrüse die Inselerträge und -funktion^{negativ beeinflusst 28}. Empirisch haben wir festgestellt, dass in unserem Protokoll erfolgreiche Isolierungen konstant erreicht wurden, wenn die gesamte Zeit der Kälteischämie, definiert als das Intervall zwischen dem Kühlen der ersten Bauchspeicheldrüse zur Reinigung und dem Überführen in das 37 °C Wasserbad, unter 1,5 Stunden gehalten wurde. Eine weitere Optimierung dieses Parameters kann je nach Endanwendung gerechtfertigt sein.

Trotz seiner Robustheit hat dieses Protokoll mehrere praktische und technische Einschränkungen. Erstens sind die Enzymmischung (Kollagenase, Thermolysin und DNase I) und die Dichtegradienten für eine effiziente Gewebedissoziation und Isolierung der Inseln unerlässlich, verursachen jedoch erhebliche Kosten. Unsere Auswahl der Enzymkombination wurde durch die strukturellen Eigenschaften der pankreassen extrazellulären Matrix und die Notwendigkeit beeinflusst, eine effektive Gewebedissoziation mit der Erhaltung der Inselintegrität in Einklang zu bringen. Jede enzymatische Komponente übernimmt eine eigene Rolle: Kollagenase zielt auf fibrillare und Basalmembrankollagene ab, um Inselchen zu befreien; Thermolysin, eine neutrale Protease (neutrale Protease), spaltet nicht-kollagene Matrixproteine und Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle und reduziert so die erforderliche Kollagenase-Exposition; und DNase I minimiert die Viskosität, die durch DNA verursacht wird, die aus lysierten Zellen freigesetzt wird 29,30,31. Obwohl kostengünstigere Formulierungen von Verdauungsenzymen kommerziell erhältlich sind, variiert ihre Reinheit und kann die enzymatische Leistung^{beeinträchtigen.} Da Kollagenas aus Bakterienkulturen isoliert wird, reduzieren zusätzliche Reinigungsmaßnahmen die Endotoxinkontamination, erhöhen aber die Kosten^{erheblich 13,23}.

Für die Kollagenase empfehlen wir Präparate mit einer Aktivität von etwa 2.000 bis 4.000 Wünsch-Einheiten pro Flasche, was eine effiziente Dissoziation bei moderater Dosierung unterstützt und eine verlängerte Verdauung vermeidet. Bemerkenswert ist, dass die Mischung ein ausgewogenes Verhältnis von Kollagenase Klasse I zu Klasse II enthalten sollte, was einem Kollagenase-II/Gesamtkollagenase-Anteil von etwa 0,3–0,5 entspricht. Dieses Verhältnis sorgt für eine starke kollagenolytische Aktivität und begrenzt gleichzeitig den übermäßigen Abbau der nicht-kollagenen extrazellulären Matrix. Zusätzlich sollte die Kollagenase-Mischung durch ein moderates Maß an neutraler Proteaseaktivität (etwa 150.000–250.000 Einheiten) und DNase ergänzt werden, aus bereits genannten Gründen.

Aus Sicht der Qualitätskontrolle sollte jede Charge eine Dokumentation einer niedrigen Endotoxinbelastung (≤50 EU/mg), hoher Enzymreinheit (≥85 % bei HPLC) und einer bestätigten Lot-zu-Charge-Aktivität enthalten, da die Reinheit und Zusammensetzung von Enzymen je nach Hersteller erheblich variieren können. Schließlich können Unterschiede in der Grundstückszusammensetzung die Verdauungskonsistenz und den Inselertrag beeinflussen, was eine grundstücksspezifische interne Validierung erforderlich macht. Eine solche Validierung kann erreicht werden, indem die in diesem Protokoll beschriebenen standardisierten Verdauungsbedingungen befolgt und anschließend die Verdauungseffizienz und die Inselmorphologie bewertet werden. Indikatoren für die suboptimale Enzymleistung sind unvollständige Gewebedissoziation, Inselchen mit unregelmäßigen oder rauen Rändern oder die Notwendigkeit einer übermäßigen mechanischen Scherung, um eine Trennung zu erreichen, wobei eine Titration der Verdauungszeit notwendig sein kann.

Ähnliche Überlegungen gelten für Dichtegradienten. Wir wählten einen polysucrosebasierten Gradienten, einen nicht-ionischen, hochhydrophilen Saccharose-Epichlorhydrin-Copolymer, der stabile Gradienten bis zu 1,2 g/mL bildet und eine lange Erfolgsbilanz in der Inselisolation^32,33 vorweisen kann. Iodixanol ist eine gut validierte Alternative, und Studien an menschlichen Inseln zeigen, dass iodixanolbasierte Gradienten die Wiedererholung der Insel verbessern können, während gleichzeitig Lebensfähigkeit und Funktion^{erhalten bleiben können 34,35,36,37}. Die Nagetierdaten sind jedoch nicht eindeutig: Einige Studien berichten über bessere Ergebnisse mit Iodixanol und andere über bessere Lebensfähigkeit und Funktion mit polysucrosebasierten^{Gradienten 32,35}. Entscheidend ist, dass der Einsatz kommerziell hergestellter, qualitätskontrollierter Gradientenlösungen empfohlen wird, um die Reproduzierbarkeit in Laboren zu verbessern. Polysucrose-basierte Gradienten sind bei optimalen Dichten für die Inselisolation weit verbreitet, während Iodixanol-Gradienten typischerweise durch interne Verdünnung hergestellt werden, was zusätzliche Variabilität einführt. Eine zweite Einschränkung besteht darin, dass die chirurgische Entnahme ein hohes Maß an technischer Kompetenz erfordert, insbesondere für intraduktale Perfusion durch den Oddi-Schließmuskel und eine schnelle Exzision der Bauchspeicheldrüse. Selbst geringfügige Verzögerungen oder Fehlstellungen können zu Gewebeschäden, Leckage, ungleichmäßiger Durchströmung oder langanhaltender warmer Ischämie führen, was den Ertrag und die Lebensfähigkeit der Inseln beeinträchtigen kann. Um diese Einschränkung zu mildern, enthält das Protokoll detaillierte Verfahrensbeschreibungen und originale grafische Hilfsmittel mit farbcodierten anatomischen Orientierungspunkten, um das Verständnis zu erleichtern. Neue Betreiber werden ermutigt, sich vor vollständigen Isolierungen mit der Perfusionstechnik vertraut zu machen, und es wird empfohlen, vor dem Versuch mit Lebendfangen Übungen an Kadavern zu üben.

Drittens erfordert dieses Protokoll für maximale Effizienz koordinierte Teamarbeit. Während der Bauchspeicheldrüsenentnahme und der enzymatischen Verdauung sind in der Regel drei geschulte Operatoren erforderlich: einer, der eine sterile Operation durchführt, einer die Bauchspeicheldrüse unter sterilen Bedingungen reinigen und einer, der Tiere unter nicht-sterilen Bedingungen zirkuliert und einschläfert. Nach der Verdauung können nachgelagerte Reinigungsschritte in der Regel von weniger Bedienern durchgeführt werden, sobald die Kompetenz erreicht ist. Obwohl diese Koordination eine logistische Anforderung darstellt, ermöglicht sie die Isolierung vieler Inselchen von mehreren Tieren innerhalb relativ kurzer Zeit, was den Gesamtdurchsatz im Vergleich zu weniger koordinierten Arbeitsabläufen verbessert. Obwohl dieses Protokoll technisch anspruchsvoll und ressourcenintensiv ist, sind diese Einschränkungen bei allen Isolierungsmethoden der Inseln üblich. Durch die Betonung standardisierter Verdauungsbedingungen, strukturiertes Training und koordinierte Ausführung kann dieser Hochdurchsatzansatz Zeit und Arbeit pro Isolation reduzieren und bei geschultem Team konsistente, reproduzierbare Ergebnisse erzielen.

Im Vergleich zu herkömmlichen Isolationsprotokollen für Nagetierinseln bietet diese Methode erhebliche Vorteile bei Durchsatz, Reproduzierbarkeit und Konsistenz. Traditionelle Einzelorgan-Verdauungen basieren stark auf manueller Handzupfung und erzielen oft eine variable Reinheit^{von 13}. Im Gegensatz dazu nutzt unser Protokoll eine gepoolte Verdauung und Dichtegradientenreinigung, wodurch die Vorbereitungszeit und die Variabilität zwischen den Probeproben erheblich reduziert werden, während gleichzeitig eine hohe Insellebensfähigkeit und funktionelle Reaktionsfähigkeit erhalten bleiben. Die isolierten Inselchen wurden umfassend hinsichtlich Morphologie (Dithiazonfärbung), Lebensfähigkeit (lebend/toter Test) und Funktion (glukosestimulierte Insulinsekretion) charakterisiert, was die Robustheit der Methode bestätigte. Insgesamt ermöglicht dieser standardisierte Arbeitsablauf die Erzeugung zahlreicher, sauberer und funktionaler Inselvorbereitungen, die für nachgelagerte Anwendungen geeignet sind, einschließlich Kapselung, Transplantation und mikrophysiologischer Modellierung 38,39,40. Wichtig ist, dass mit dieser Technik isolierte Lewis-Ratteninselchen den Diabetes in präklinischen Modellen umgekehrt haben, was die translationale Relevanz dieses reproduzierbaren und skalierbaren Ansatzes⁴¹ unterstreicht.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
21 G x 2 Zoll. BD PrecisionGlide-Nadel	BD	305129
500 & Mikro; m Messingrahmen und 304 Edelstahl-Siebe, 3" Durchmesser x 1" tief (Siebnummer 35)	McMaster-Carr	34735K525
Air-Tite sterile Spritzen, Luer-Lock.	Fisher Scientific	14-817-178
Biogel PI UltraTouch M	Mö lnlycke	42665
Bonner Schere; Gerade; scharfe Spitzen; 15 mm Klingenlänge; 3 1/2" Gesamtlänge	Roboz	RS-5840
Braintree Scientific GERMINATOR 500 DRY STERIL	Fisher Scientific	NC9956482
Cell-IQ Serie 5,8 cu.ft. CO2-Laborinkubator	PHCBI	MCO-170AICUVHL-PA
Kern 100 mm Nicht TC-behandelte Kulturschale	Corning	430591
Corning Fetal Bovine Serum, 500 ml, regulär, USDA-Sicherheitstest (hitzeinaktiviert)	Corning	35011CV
Corning Islet-Gradient 1,069 (Dichte 1,069 g/cm3)	Corning	99-815-CIS	Erfordert eine Sonderanfrage von der Firma
Corning Islet Gradient 1,096 (Dichte 1,096 g/cm3)	Corning	99-691-CIS	Erfordert eine Sonderanfrage von der Firma
Corning Islet-Gradient 1,108 (Dichte 1,108 g/cm3)	Corning	99-692-CIS	Erfordert eine Sonderanfrage von der Firma
Covidien Tendersorb Unterpolster	Fisher Scientific	22-225-102
DNase I Grade II	Roche	10104159001
Falcon  50 mL hochklare, konische Zentrifugenröhren	Fisher Scientific	14-432-22
Fisherbrand Aluminiumfolie, Normal-Gauge-Rolle	Fisher Scientific	01-213-100
Fisherbrand  Nicht gewebte Mullschwämme	Fisher Scientific	22-028-559
Fisherbrand wiederverwendbare Glas-Schwerlastbecher mit niedriger Form	Fisher Scientific	FB101600
Fluoreszenz-Mirkoskop  BZ-X810	Schlüssel	BZ-X810
Glukoselösung	Gibco	A2494001
Halsey Mikronadelhalter	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	12500-12
HBSS, Kalzium, Magnesium, kein rotes Phenol	Gibco	14025092
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Hämostatische Zange Klassische Crile 5-1/2 Zoll Länge	McKesson	1231217
Hudson (Ewald) Zange	Roboz	RS-5238
Hypodermische Nadelmonojekt mit 1-1/2 Zoll Länge 16 Gauge Normalwand ohne Sicherung	McKesson	43481
L-Glutamin (200 mM)	Gibco	25030081
Liberase T-Flex, Forschungsqualität	Roche	5989132001
LIVE/DEAD Viability/Zytotoxizitätskit, für Säugetierzellen	Invitrogen	L3224
MATLAB-Softwarepaket	MathWorks	https://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML
NE-4000 Zweikanal-Programmierbare Spritzenpumpe	Spritzenpumpe	NE-4000-US
NADEL, HYPO STR DISP 27GX1/2" (100/BX) EXLINNE	McKesson	408877
Nunc-Zellkultur/Petrischalen	Thermowissenschaftlich	174926
Olympus CKX41 Invertiertphasenkontrastmikroskop	Olympus	CKX41-B
PBS, pH 7,4	Gibco	10010023
Penicillin' Streptomycin (10.000 U/mL)	Gibco	15140122
RPMI 1640	Gibco	11875093
RPMI 1640, keine Glukose	Gibco	11879020
Natriumpyruvat (100 mM)	Gibco	11360070
Natriumpyruvat (100 mM Lager)	Gibco	11360070
Sorval ST 16R	Thermowissenschaftlich	75004381
Edelstahl-304-Spritzennadel	Milipore Sigma	Z117013-1EA
CHIRURGISCHES VORHANG, WEGWEG, 36 IN X 100 YD	Covetrus	10408
Chirurgische Schere – ToughCut	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	14054-13
Daumenbinde 4,5" gezackte empfindliche 1,3 mm Spitzenbreite	Roboz	RS-8120
Thermowissenschaftliches Nunc 200mL Zentrifugenrohr	Thermowissenschaftlich	14-962-17
Thermo Scientific Nunc Zentrifugenflaschenadapter und Polster	Thermowissenschaftlich	12-565-283B
TSDUB15 15L Dubnoff Schüttelwasserbad	Fisher Scientific	300610298
TX-400 4 x 400 mL Schwing-Schaufel-Rotor	Thermowissenschaftlich	75003181
Tygon S-50-HL	Tygon	AAXoooo3
Ultra Sensitive Rat Insulin ELISA-Kit	Kristallchemie	90060