Vergleich der Ergebnisse der Sperma-DNA-Analyse unter Verwendung verschiedener Gating-Strategien in der Durchflusszytometrie

Summary

Polygonale Gating (PGG) und Kreuzförmiges Gating (CFG) sind Durchflusszytometrie-Methoden zur Erfassung der DNA-Integrität von Spermien. PGG misst den DNA-Fragmentierungsindex (DFI) und den Index der starken DNA-Färbung (HDS). CFG berichtet über schweren DFI, leichten DFI und den gesamten DFI. Diese Studie zielt darauf ab, die Ergebnisse und die Korrelationen zwischen ihnen zu vergleichen.

Abstract

Die Integrität der Sperma-DNA ist ein Schlüsselfaktor für eine erfolgreiche Befruchtung, Embryonalentwicklung und fortlaufende Schwangerschaft. Die Beurteilung der Sperma-Chromatinstruktur (SCSA) mittels Durchflusszytometrie nach DNA-Denaturierung und Akridin-Orange-Färbung gilt als Goldstandard-Methode zur Bewertung der Sperma-DNA. In der Literatur wurden zwei Gating-Strategien für die durchflusszytometriebasierte Beurteilung des Sperma-DNA-Fragmentierungsindex (DFI) beschrieben: Polygonales Gating (PGG) und Kruzifix-Gating (CFG). Ziel der vorliegenden Studie war es, die Beziehungen der Assay-Ergebnisse zwischen PGG und CFG zu vergleichen und ihre Korrelationen mit Parametern der grundlegenden Samenanalytik zu analysieren. Daten, die unabhängig durch die beiden Methoden erhalten wurden, wurden mittels statistischer Analyse verglichen, einschließlich Bland-Altman-Plots und Regressionsanalyse. Insgesamt wurden 121 männliche Ambulanzpatienten, die eine Fruchtbarkeitsuntersuchung in unserem Krankenhauszentrum durchführten, mittels vollständig zufälliger Stichprobenmethode ausgewählt. Sperma-DFI und verwandte Indikatoren wurden durch Durchflusszytometrie mittels PGG und CFG detektiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die DFI-Werte, die mit den beiden Methoden erhalten wurden, eine gute Übereinstimmung aufwiesen. Die Korrelationskoeffizienten zwischen DFIp aus der PGG-Methode und DFIm, DFIs und DFIc aus der CFG-Methode betrugen 0,6497, 0,9404 und 0,9667, jeweils (Alle p < 0,01). Ein hoher DNA-Färbeindex (HDS) zeigte eine leichte negative Korrelation mit DFIs (r  = -0,3042, p < 0,05). Der Prozentsatz der fortschreitend beweglichen Spermien korrelierte negativ mit DFIp, DFIs und DFIc (r = -0,3824, -0,3794, -0,3574, jeweils alle p < 0,05). Es wurde keine signifikante Korrelation zwischen HDS und Samenflüssigkeitsvolumen, Spermienkonzentration, Gesamtspermienzahl oder PR (%) beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DFIs enger mit männlicher Fruchtbarkeit assoziiert sind, was darauf hindeutet, dass die CFG-Methode, die diesen Parameter liefert, für die klinische Beurteilung von Sperma-DNA-Schäden besser geeignet sein könnte.

Introduction

Die Integrität der Sperma-DNA bezieht sich auf die Integrität und funktionelle Stabilität der DNA-Molekülstruktur im Spermienkern. Konkret zeichnet sie sich durch eine normale Chromatin-Konformation, intakte Basensequenzen ohne Brüche oder oxidative Schäden und die Fähigkeit aus, genetische Informationen genau an den Nachwuchs zu übertragen. Während der Spermatogenese, wenn oxidativer Stress zunimmt¹, ist die Chromatin-Remodellierung abnormal² oder das Sperma ist von Umweltgiften betroffen³, wird die Integrität der Sperma-DNA geschädigt, was zu Basenfehlern, Verlust, Modifikation, DNA-Zusatz und Quervernetzung, Einzelstrang- und Doppelstrangbrüchen usw. führt. Darüber hinaus kann geschädigte Sperma-DNA die männliche Fruchtbarkeit beeinträchtigen und ungünstige Auswirkungen auf Schwangerschaftsergebnisse bei assistierten Reproduktionstechnologien (ART)⁴ haben, während auch das Risiko wiederholter Schwangerschaftsabbrüche steigt⁵. Im Jahr 2021 empfahl die Europäische Vereinigung für Urologie (EAU) die Aufnahme von DFI-Tests in das männliche Fruchtbarkeitsbewertungssystem⁶.

Zurzeit wird die Integrität der Sperma-DNA hauptsächlich durch die Erkennung des Sperma-DNA-Fragmentierungsindex (DFI) bewertet. Der Sperma-Chromatin-Struktur-Assay (SCSA) mittels Durchflusszytometrie ist die primäre Methode zur Beurteilung des DFI⁷. In der Literatur wurden zwei Durchflusszytometrie-Gating-Methoden für die Sperma-DFI-Erkennung berichtet. Eine ist die polygonale Gating-Methode (PGG), die zwei wichtige Indikatoren wie Sperma-DFI und HDS gleichzeitig melden kann⁸. PGG ist ein klassischer SCSA-Ansatz, der sich durch einen kleineren Koeffizienten der Variationserkennung und überlegene Wiederholbarkeit auszeichnet⁹. Sie kann jedoch nicht die Schwere des DNA-Schadens unterscheiden. Eine andere Art ist die kreuzförmige Gating-Methode (CFG), die schwere Schadensmarker des Sperma-DNA (DFIs), leichte Schadensmarker des Sperma-DNA (DFIm) und die Gesamtsumme des DFI der kreuzförmigen Gating-Methode (DFIc) melden kann. DFIc ist gleich der Summe von DFIs und DFIm. Im Vergleich zu aktuellen Technologien zur Beurteilung der Sperma-DNA-Integrität kann die CFG-Methode die Schwere der Sperma-DNA-Schäden widerspiegeln¹⁰.

Um zu bestimmen, welche Methode besser zur Bewertung der Spermaqualität geeignet ist, verwendete diese Studie sowohl die PGG-Methode als auch die CFG-Methode, um DFI und verwandte Parameter im Sperma zu messen. Der Zusammenhang zwischen den Ergebnissen dieser beiden Methoden und konventionellen Samenanalyse-Parametern wurde verglichen. Nach bestem Wissen ist dies die erste Studie, die den Zusammenhang der Erkennungsergebnisse zwischen den beiden Methoden, PGG und CFG, analysiert.

Protocol

Diese Studie wurde vom Ethikausschuss des angeschlossenen Huai'an First People's Hospital der Nanjing Medical University genehmigt (Genehmigungsnummer: KY-2024-181-01). Von den Patienten, deren Proben in dieser Studie verwendet wurden, wurde eine informierte Einwilligung eingeholt. Allgemeines Schema des in Abbildung 1 dargestellten Arbeitsablaufs. Die Details der verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.

CFG-Einstellungen für den Durchflusszytometer
Nach der Säurebehandlung zeigt das Kernchromatin von Spermien mit beschädigter DNA einzelsträngige DNA, während das Kernchromatin von Spermien mit unbeschädigter DNA seine intakte doppelsträngige Struktur beibehält. Der fluoreszierende Farbstoff Acridinorange (AO) bindet an einzelsträngige DNA und emittiert rote Fluoreszenz bei Anregung durch einen 488 nm Laser. Bei Bindung an doppelsträngige DNA emittiert es bei Anregung durch einen 488 nm Laser grüne Fluoreszenz. Basierend auf der Anzahl der von dem Durchflusszytometer erfassten roten und grünen Fluoreszenzsignale wird das Verhältnis der roten zur Gesamtfluoreszenz von rot und grün berechnet, was den Sperma-DFI darstellt.

Die CFG-Einstellungen wurden gemäß der von Yang et al.¹⁰ bereitgestellten Übersicht implementiert. Das Durchflusszytometer sollte mit der niedrigsten grünen Fluoreszenz und der höchsten roten Fluoreszenz, die bei AO-gefärbten normalen Spermien gemessen wurden, als Grenzreferenzen konfiguriert werden (Abbildung 2). Im Folgenden ist eine Liste der zellulären Eigenschaften jedes Quadranten im CFG aufgeführt:
Quadrant Q1 ist ein Indikator für normale Spermien. Es wurde beobachtet, dass die Spermien-DNA intakt war und die Bindungsmenge von AO minimal war, was zu grüner Fluoreszenz führte.
Spermien im Quadranten Q2 haben teilweise fragmentierte DNA und erscheinen unter der Fluoreszenzmikroskopie orange. Solche DNA kann reparierbar sein, diese Spermien werden als milde DNA-Fragmentierung (DFIm)¹⁰ klassifiziert.
Quadrant Q3 ist definiert als die nicht spezifische Fluoreszenz, die unterzogen wurde Subtraktion.
Spermien im Quadranten Q4 haben fragmentierte DNA und erscheinen unter der Fluoreszenzmikroskopie rot, was auf eine schwere DNA-Fragmentierung (DFIs) hinweist.

Es wird vorgeschlagen, dass Spermien in den Quadranten Q2 und Q4 beide fragmentierte DNA enthalten und ihre Summe als DFIc definiert wird.

Einstellungen des PGG für das Durchflusszytometer
Das Polygontor für die Durchflusszytometrie-Analyse wurde nach der von Evenson et al.⁸ beschriebenen Methode etabliert. Wie in Abbildung 3 gezeigt, sind die mit jedem Tor verbundenen zellulären Eigenschaften wie folgt:
P3 ist ein Indikator für den Prozentsatz der Zellen mit denaturierter DNA.
P4 repräsentiert Spermien mit hoher DNA-Färbbarkeit (HDS). Diese Gruppe von Spermien fehlt der normale Austausch von Histonen gegen Protamine.
Die vorherrschenden Zellpopulationen außerhalb der P3- und P4-Tore bestehen aus normalen Spermatozoen, die eine reduzierte rote Fluoreszenz aufweisen und vorwiegend grüne Fluoreszenz emittieren.

Samenprobenentnahme und -analyse
Alle 121 Samenpruben stammten von Männern, die das Reproduktionszentrum des Huai'an First Hospital Affiliated to Nanjing Medical University besuchten. Samenpruben wurden durch Masturbation nach einer Abstinenzperiode von 2-7 Tagen gesammelt. Die routinemäßige Samenanalytik wurde streng nach den Anforderungen des WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen^11,12 durchgeführt. Spermienkonzentration und Motilitätsanalysen wurden mit einem computergestützten Spermienanalysesystem (CASA) durchgeführt. Jede Probe wurde zweimal analysiert. Die Ergebnisse wurden nur als Mittelwert angegeben, wenn der Unterschied zwischen den beiden Ergebnissen innerhalb des 95% Konfidenzintervalls lag; andernfalls wurden erneut Probennahme und Analyse durchgeführt.

DFI-Analyse
Berechnen Sie das erforderliche Probenvolumen für die Samenprube, so dass die Endkonzentration der Spermien in Reagenz A aus dem Durchflusszytometrie-Kit 2–3 x 10⁶/mL beträgt. Berechnungsmethode: Unter der Annahme, dass die Spermienkonzentration in der ursprünglichen Samenprube M x 10⁶/mL beträgt, dann ist das erforderliche Samenprubenvolumen (µL) = 150/M. Fügen Sie das berechnete Samenprubenvolumen zu einem Durchflusszytometrie-Röhrchen hinzu, dann fügen Sie 50 µL Reagenz A hinzu und mischen Sie vorsichtig. Fügen Sie 100 µL Reagenz B hinzu, mischen Sie vorsichtig und inkubieren Sie für 30 s bei Raumtemperatur. Fügen Sie sofort 300 µL Reagenz C hinzu und mischen Sie vorsichtig. Erkennen Sie die Probe mit CFG und PGG auf dem Durchflusszytometer und analysieren Sie mindestens 5000 Spermatozoen.

Statistische Analyse
Die Daten wurden mit GraphPad Prism 6.0 statistisch ausgewertet. Bland-Altman-Plots wurden erstellt, um das Einvernehmensniveau zwischen PGG und CFG zu beurteilen, indem der Mittelwert und die Unterschiede berechnet wurden. Die Unterschiede zwischen den beiden Methoden wurden gegen ihre Durchschnittswerte aufgetragen. Darüber hinaus wurde die Pearson-Methode verwendet, um die Korrelation zwischen PGG und CFG zu analysieren. Es wurde festgestellt, dass ein p-Wert unter 0,05 statistisch signifikant war.

Results

Unter den 121 Studienteilnehmern (mittleres Alter: 32,5 ± 4,9 Jahre; Bereich: 26–44 Jahre) wurden bei 28 Personen eine Asthenozoospermie und bei 4 Personen eine Oligozoospermie diagnostiziert. Die demografischen Ausgangsmerkmale und die Parameter der Spermaanalyse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Wie in Abbildung 4 dargestellt, zeigte das Bland-Altman-Plot, dass die Ergebnisse der Sperma-DFI, die mit der PGG- und CFG-Methode erhalten wurden, eine ausgezeichnete Übereinstimmung aufwiesen (r = 0,9667, p = 0,0000). Nur zwei Proben zeigten Abweichungen von mehr als +10 % und drei Proben zeigten Abweichungen von weniger als -10 %, wobei die Anteile 1,7 % bzw. 2,5 % betrugen.

Tabelle 2 zeigt eine starke positive Korrelation zwischen DFIp von PGG und jedem der drei CFG-abgeleiteten Parameter: DFIm, DFIs und DFIc. Die Korrelationskoeffizienten betrugen 0,6497, 0,9404 und 0,9667, jeweils mit p-Werten unter 0,05. Die mit der PGG-Methode nachgewiesenen HDS-Ergebnisse wiesen eine signifikante negative Korrelation mit den durch die CFG-Methode nachgewiesenen DFIs und DFIc auf. Die Korrelationskoeffizienten betrugen -0,3042 bzw. -0,2120, jeweils mit p-Werten unter 0,05. Die Untersuchung ergab keine Korrelation zwischen HDS und DFIm (p-Wert war größer als 0,05).

Wie in Tabelle 3 gezeigt, war der Prozentsatz der fortbeweglichen Spermien signifikant negativ korreliert mit DFIp, DFIm, DFIs und DFIc (alle p-Werte waren kleiner als 0,05), aber nicht mit HDS (p-Wert war größer als 0,05). Das Spermavolumen zeigte eine signifikante positive Korrelation mit DFIp, DFIs und DFIc (alle p-Werte waren kleiner als 0,05), aber nicht mit HDS (p-Wert war größer als 0,05). Spermienkonzentration und Gesamtspermienzahl wurden nicht mit den Ergebnissen der PGG- und CFG-Analyse korreliert gefunden (p-Wert war größer als 0,05).

Die CFG-Methode zeigt eine ausgezeichnete Übereinstimmung mit PGG für die DFI-Bewertung. CFG ermöglicht die Unterscheidung des Grades der DNA-Schäden, und seine DFI-Parameter sind signifikant mit der Spermienmotilität korreliert. Die Indikatoren für schwere Spermien-DNA-Schäden, bekannt als DFIs, sind für die breite Anwendung in der klinischen Routine geeigneter.

Datenverfügbarkeit:
Die während dieses Forschungsverlaufs produzierten und/oder analysierten Datensätze enthalten klinische Daten auf Patientenebene und werden aufgrund institutioneller Datenschutz- und ethischer Überlegungen nicht an die Öffentlichkeit weitergegeben. Nach Einreichung einer vernünftigen Anfrage und Genehmigung durch den Ethikausschuss des Affiliated Huai'an No. 1 People's Hospital der Nanjing Medical University ist der entsprechende Autor berechtigt, anonymisierte Daten und Analyseergebnisse bereitzustellen. Diese Studie beinhaltete nicht die Entwicklung eines benutzerdefinierten Codes.

Abbildung 1: Überblick über den Arbeitsablauf. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Kreuzförmige Gating (CFG) der Durchflusszytometrie zur Erkennung von DFI. Q1 – Normale Spermien. Q2 – Leichte DNA-Fragmentierung (DFIm). Q3 – nicht spezifische Fluoreszenz, die subtrahiert wurde. Q4 – Schwere DNA-Fragmentierung (DFIs). Spermien mit DNA-Schäden fallen sowohl in Q2 als auch in Q4. Ihre Summe repräsentiert die gesamte DNA-fragmentierte Spermienpopulation (DFIc). Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Polygonale Gating (PGG) der Durchflusszytometrie zur Erkennung von DFI. P3: Spermien mit denaturierter DNA. P4: Hohe DNA-Färbbarkeit (HDS) Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Bland-Altman-Plots der Ergebnisse von PGG- und CFG-Assays für DFI. X-Achse: Mittelwert der Messergebnisse, die mit der PGG-Methode und der CFG-Methode erhalten wurden. Y-Achse: Unterschied in den Messergebnissen zwischen der PGG-Methode und der CFG-Methode Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Item	Mean±SD	Range
Alter(Jahre)	32,5±4,9	26-44
Tage der Enthaltsamkeit(Tag)	4,1±1,3	3-7
Spermavolumen(mL)	3,8±1,6	0,5-6,8
Spermienkonzentration(×106/mL)	52,0±35,5	10,3-185,1
Fortbeweglichkeit(%)	42,8

Discussion

Die 6. Auflage des WHO-Laborhandbuchs zur Untersuchung und Verarbeitung von menschlichem Sperma¹² empfiehlt vier Methoden zur Beurteilung der DNA-Integrität von Spermien: terminale Desoxynucleotidyltransferase (dUTP) Nick-End-Labeling (TUNEL), Einzelzell-Gelelektrophorese (Comet) Assays, SCSA und Spermien-Chromatin-Dispersions-Test (SCD). Unter diesen hat sich SCSA in Andrologielaboren aufgrund seiner Verwendung von Durchflusszytometrie zur Analyse weit verbreitet, da es hohe Durchsatzleistung, Effizienz und Objektivität bietet sowie die Fähigkeit, gleichzeitig Parameter wie DFI und HDS⁷ zu melden. Laut einer weltweiten Umfrage⁷ wählten fast ein Viertel (24,1%) der weltweiten Reproduktionsärzte SCSA als Methode zur Bewertung der DNA-Integrität von Spermien.

Der wichtigste Schritt im SCSA-Verfahren ist die Festlegung der geeigneten Durchflusszytometrie-Gating. Die traditionelle PGG-Methode kann sowohl gebrochene Fragmente (DFI) von DNA-Strängen als auch Spermien mit abnormal hoher DNA-Färbung (HDS) nachweisen, die sich durch den Mangel an normalem Histon- und Protamin-Austausch auszeichnen¹³. Sie kann jedoch nicht zwischen Einzel- und Doppelstrangbrüchen in der Spermien-DNA unterscheiden. In den letzten Jahren etablierten Yang et al.¹⁰ eine CFG-Methode zur Analyse der DFI von Spermien mittels Durchflusszytometrie, die den Schweregrad der DNA-Schädigung von Spermien unterscheiden kann. Der Schlüsselschritt dieser Methode besteht darin, ein kreuzförmiges Tor für den Durchflusszytometer einzurichten. Die CFG-Methode zeigt eine ausgezeichnete Wiederholbarkeit (Variationskoeffizient war weniger als 5%) und einen linearen Bereich für die DFI-Erkennung von 8,93% bis 53,90%. Diese Methode meldet drei Indikatoren – DFIm, DFIs und DFIc – liefert jedoch keine HDS-Ergebnisse¹⁰.

Diese Studie ergab, dass der Gesamt-DFI der CFG-Methode (DFIc) gut mit dem der PGG-Methode (DFIp) übereinstimmt. Die Korrelationsanalyse zeigte, dass die Korrelationskoeffizienten von DFIs und DFIp signifikant höher waren als die von DFIm. Weder die Spermienkonzentration noch die Gesamtzahl der Spermien korrelierten mit den Ergebnissen der CFG- oder PGG-Methode. PR (%) und die vier Arten von DFI (DFIm, DFIs, DFIc, DFIp) waren alle signifikant negativ korreliert. PR (%) war signifikant negativ mit allen vier Arten von DFI (DFIm, DFIs, DFIc, DFIp) korreliert. Die Korrelation mit DFIm (r = -0,1975) war signifikant schwächer als die von DFIs, DFIc und DFIp (r = -0,3794, -0,3574, -0,3824, jeweils). Diese Ergebnisse stimmen mit denen von Yang et al. überein¹⁰. Darüber hinaus zeigten DFIs und DFIc eine gute Korrelation mit dem Samenflüssigkeitsvolumen, während DFIm dies nicht tat. Obwohl die klinische Nützlichkeit eines Indikators, der eng mit grundlegenden Samenpartikeln korreliert, begrenzt sein mag, deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass der schwere Index der DNA-Schädigung von Spermien (DFIs) möglicherweise unterschiedliche pathologische Aspekte der Spermatogenese widerspiegelt. Noch wichtiger ist, wie unsere Korrelationsanalyse zeigt, dass DFIs eine signifikant stärkere Assoziation mit dem Prozentsatz der fortschreitend beweglichen Spermien im Vergleich zu DFIm aufweist, was seine potenzielle Verwendung als ergänzender Indikator bei der Beurteilung der männlichen Fruchtbarkeit über die konventionelle Samenanalytik hinaus weiter unterstützt.

HDS repräsentiert den Anteil an unreifen Spermien, denen der normale Austausch von Histon und Protamin fehlt. Der Protamin-1-Vorläufer in HDS-Spermien behält terminale Aminosäuren, die typischerweise gespalten werden⁸, was möglicherweise die ordnungsgemäße Chromatinkondensation verhindert und zu einer erhöhten Acridinorange-Färbung von dsDNA führt. Frühere Studien haben die Bedeutung von HDS bei der Beschreibung von Chromatindefekten in Spermien betont. Die Forschung von Lin et al.¹⁴ und Virro et al.¹⁵ zeigt, dass die Fehlgeburtsrate der In-vitro-Fertilisation (IVF) bei Männern mit HDS > 15% signifikant höher ist. Neuere Erkenntnisse deuten jedoch darauf hin, dass HDS aufgrund seiner schwachen Korrelation mit CMA3-, AB- und TB-Färbeergebnissen möglicherweise nicht zuverlässig auf nukleare Unreife hinweist¹⁶. Daher könnte HDS nicht als Indikator für die männliche Fruchtbarkeit geeignet sein¹⁷. Diese Studie zeigt auch keine signifikante Korrelation zwischen HDS und grundlegenden Samenpartikeln, einschließlich Samenflüssigkeitsvolumen, Spermienkonzentration und Motilität. Daher wird HDS nicht als Marker für die DNA-Integrität von Spermien empfohlen¹⁸.

Während des DFI-Erkennungsprozesses können Unstimmigkeiten in den Fluoreszenzgrenzen auftreten. Dieses Phänomen wird in erster Linie auf erhebliche Unterschiede in der Spermienkonzentration und -motilität zwischen verschiedenen Proben zurückgeführt. Um dieses Problem zu lösen, wird empfohlen, geeignete Gating zu verwenden, um tote Spermien, Trümmer und andere unspezifische Signale auszuschließen. Dieser Ansatz verbessert die Genauigkeit der Daten und mindert das Problem der uneinheitlichen Fluoreszenzgrenzen.

Nach unserem Wissen ist dies die erste Studie, die die Analyseergebnisse der PGG- und CFG-Methoden vergleicht. Ein Nachteil dieser Studie ist ihr einzeiliges, kleinstichprobenartiges Design, und ihre Schlussfolgerungen erfordern eine weitere Validierung durch multizentrische, großstichprobenartige Studien. Zukünftige Forschungsrichtungen umfassen die Sicherstellung der Konsistenz der Spermien-DFI-Testergebnisse auf verschiedenen Durchflusszytometern und die Untersuchung, ob Spermien-DFIs die Ergebnisse der assistierten Reproduktionstechnologie vorhersagen können.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die CFG-Methode mehr Parameter für die DNA-Integrität von Spermien liefert. Insbesondere reflektieren DFIm und DFIs die Anteile der Spermien mit leichter bzw. schwerer DNA-Schädigung. Die Ergebnisse von DFIc und DFIp weisen eine gute Konsistenz auf. Die CFG-Methode ist für die klinische Anwendung und Förderung geeignet.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computergestütztes Spermaanalysesystem	Beijing Suijia Software Co., Ltd	SA-II
Durchflusszytometer	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd	Cyto E6
Durchflusszytometrie-Kit	Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD
Makler-Zählkammer	Sefi Medical Instruments
Spermium-Kern-DNA-Integrität-Kit	Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD	-