Forschungsartikel
Polygonales Gating (PGG) und kreuzförmiges Gating (CFG) sind Flusszytometriemethoden zur Erkennung der Integrität der Spermien-DNA. PGG misst den DNA-Fragmentationsindex (DFI) und den hohen DNA-Färbungsindex (HDS). CFG berichtet von schwerem DFI, leichtem DFI und insgesamt DFI. Diese Studie zielt darauf ab, die Ergebnisse und Korrelationen zwischen ihnen zu vergleichen.
Die Integrität der Spermien-DNA ist ein entscheidender Faktor für eine erfolgreiche Befruchtung, Embryonalentwicklung und fortlaufende Schwangerschaft. Die Spermienchromatinstrukturbewertung (SCSA) mittels Durchflusszytometrie nach DNA-Denaturierung und Acridin-Orangenfärbung gilt als Goldstandard zur Bewertung der Spermien-DNA. Zwei Gating-Strategien für die auf der Durchflusszytometrie basierende Bewertung des Spermien-DNA-Fragmentationsindex (DFI) wurden in der Literatur berichtet: polygonales Gating (PGG) und kreuzförmiges Gating (CFG). Ziel der vorliegenden Studie war es, die Zusammenhänge der Assay-Ergebnisse zwischen PGG und CFG zu vergleichen und deren Korrelationen mit den Parametern der grundlegenden Samenanalyse zu analysieren. Die von beiden Methoden unabhängig voneinander gewonnenen Daten wurden mittels statistischer Analyse verglichen und beinhaltet Bland-Altman-Diagramme und Regressionsanalysen. Insgesamt wurden 121 männliche ambulante Patienten, die sich im Fortpflanzungszentrum unseres Krankenhauses einer Fruchtbarkeitsbegutachtung unterzogen, mittels einer völlig zufälligen Stichprobe ausgewählt. Spermien-DFI und verwandte Indikatoren wurden mittels Durchflusszytometrie mit PGG bzw. CFG nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass DFI-Werte, die mit beiden Methoden erhalten wurden, eine gute Übereinstimmung zeigten. Die Korrelationskoeffizienten zwischen DFIp aus der PGG-Methode und DFIm, DFIs und DFIc aus der CFG-Methode betrugen jeweils 0,6497, 0,9404 und 0,9667 (alle p < 0,01). Der hohe DNA-Färbungsindex (HDS) zeigte eine leicht negative Korrelation mit DFIs (r = -0,3042, S. < 0,05). Der Anteil progressiv beweglicher Spermien korrelierte negativ mit DFIp, DFIs und DFIc (r = -0,3824, -0,3794, -0,3574, alle p < 0,05). Es wurde keine signifikante Korrelation zwischen HDS und Samenvolumen, Spermienkonzentration, Gesamtspermienzahl oder PR (%) beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DFIs enger mit männlicher Fruchtbarkeit verbunden sind, was darauf hindeutet, dass die CFG-Methode, die diesen Parameter liefert, für die klinische Beurteilung von Spermienschäden besser geeignet sein könnte.
Die Integrität der Spermien-DNA bezieht sich auf die Integrität und funktionelle Stabilität der Molekularstruktur der DNA im Spermienkern. Insbesondere zeichnet sie sich durch eine normale Chromatin-Konformation, intakte Basensequenzen ohne Brüche oder oxidative Schäden sowie die Fähigkeit aus, genetische Informationen genau an Nachkommen zu übertragen. Während der Spermatogenese, wenn oxidativer Stresszunimmt 1, die Chromatin-Remodellierung abnormal ist2 oder die Spermien von Umwelttoxinen betroffen sind3, wird die Integrität der Spermien-DNA beschädigt, was zu Basen-Mismatch, Verlust, Modifikation, DNA-Addition und Vernetzung, Einstrang- und Doppelstrang-Brüchen usw. führt. Darüber hinaus kann beschädigte Spermien-DNA die männliche Fruchtbarkeit beeinträchtigen und die Schwangerschaftsergebnisse in der assistierten Fortpflanzungstechnologie (ART)4 negativ beeinflussen und gleichzeitig das Risiko eines wiederkehrenden Schwangerschaftsverlusts erhöhen5. Im Jahr 2021 empfahl die European Association of Urology (EAU) die Aufnahme von DFI-Tests in das männliche Fruchtbarkeitsbewertungssystem6.
Derzeit wird die Integrität der Spermien-DNA hauptsächlich durch den Nachweis des Spermien-DNA-Fragmentationsindex (DFI) bewertet. Der Spermienchromatin-Strukturassay (SCSA) mittels Durchflusszytometrie ist die primäre Methode zur Beurteilung von DFI7. In der Literatur wurden zwei Flowzytometrie-Gating-Methoden zur Erkennung von Spermien-DFI dokumentiert. Eine davon ist die polygonale Gating-Methode (PGG), die gleichzeitig zwei Schlüsselindikatoren wie Spermien-DFI und HDS8 melden kann. PGG ist ein klassischer SCSA-Ansatz, der sich durch einen geringeren Detektionskoeffizienten und eine überlegene Wiederholbarkeitvon 9 auszeichnet. Allerdings kann sie die Schwere der DNA-Schäden nicht bestimmen. Ein weiterer Typ ist die kreuzförmige Gating-Methode (CFG), die einen schweren Schadensmarker der Spermien-DNA (DFIs), den leichten Schädigungsmarker der Spermien-DNA (DFIm) und den Gesamt-DFI der kreuzförmigen Gating-Methode (DFIc) melden kann. DFIc ist gleich der Summe von DFIs und DFIm. Im Vergleich zu aktuellen Technologien zur Bewertung der Integrität der Spermien-DNA kann die CFG-Methode die Schwere der Spermien-DNA-Schädenwiderspiegeln.
Um zu bestimmen, welche Methode besser zur Beurteilung der Spermienqualität geeignet ist, verwendete diese Studie sowohl die PGG-Methode als auch die CFG-Methode, um DFI und verwandte Parameter bei Spermien zu messen. Die Korrelation zwischen den Ergebnissen dieser beiden Methoden und konventionellen Samenanalyseparametern wurde verglichen. Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Studie, die die Korrelation der Nachweisergebnisse zwischen den beiden Methodologien PGG und CFG analysiert.
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Diese Studie wurde vom Medizinischen Ethikkomitee des angeschlossenen Huai'an First People's Hospital der Nanjing Medical University genehmigt (Genehmigungsnummer: KY-2024-181-01). Die informierte Zustimmung wurde von den Patienten eingeholt, deren Proben in dieser Studie verwendet wurden. Gesamtdiagramm des Workflows dargestellt in Abbildung 1. Die Details der verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle dargestellt.
CFG-Einstellungen für das Durchflusszytometer
Nach der Säurebehandlung zeigt das nukleare Chromatin von Spermien mit beschädigter DNA einsträngige DNA, während das nukleare Chromatin von Spermien mit unbeschädigter DNA seine intakte doppelsträngige Struktur behält. Der fluoreszierende Farbstoff Acridinorange (AO) bindet an einzelsträngige DNA und strahlt rote Fluoreszenz aus, wenn er von einem 488-nm-Laser angeregt wird. Wenn sie an doppelsträngige DNA gebunden ist, strahlt sie grüne Fluoreszenz ab, wenn sie von einem 488-nm-Laser angeregt wird. Basierend auf der Anzahl der vom Durchflusszytometer erfassten roten und grünen Fluoreszenzsignale wird das Verhältnis von roter Fluoreszenz zur Gesamtzahl der roten und grünen Fluoreszenz berechnet, was die Spermien-DFI darstellt.
Die CFG-Einstellungen wurden gemäß der Übersicht von Yang et al.10 implementiert. Das Durchflusszytometer sollte mit der niedrigsten grünen Fluoreszenz und der höchsten roten Fluoreszenz, gemessen in AO-gefärbten normalen Spermien, als Grenzreferenzen konfiguriert werden (Abbildung 2). Im Folgenden eine Liste der zellulären Eigenschaften jedes Quadranten im CFG:
Quadrant Q1 deutet auf normale Spermien hin. Es wurde beobachtet, dass die Spermien-DNA intakt war und die Bindungsmenge an AO minimal war, was zu grüner Fluoreszenz führte.
Spermien im Quadranten Q2 haben teilweise fragmentierte DNA und erscheinen unter der Fluoreszenzmikroskopie orange. Solche DNA könnte reparierbar sein, diese Spermien werden als leicht DNA-fragmentiert (DFIm)10 klassifiziert.
Quadrant Q3 ist definiert als die unspezifische Fluoreszenz, die subtraktioniert wurde.
Spermien im Quadranten Q4 weisen fragmentierte DNA auf und erscheinen unter der Fluoreszenzmikroskopie rot, was auf eine schwere DNA-Fragmentierung (DFIs) hinweist.
Es wird vorgeschlagen, dass Spermien in den Quadranten Q2 und Q4 beide fragmentierte DNA enthalten und ihre Summe als DFIc definiert ist.
Einstellungen des PGG für das Durchflusszytometer
Das polygonale Tor für die Flowzytometrie wurde nach der von Evenson et al.8 beschriebenen Methode etabliert. Wie in Abbildung 3 dargestellt, sind die zellulären Eigenschaften jedes Gatters wie folgt:
P3 ist ein Indikator für den Prozentsatz der Zellen mit denaturierter DNA.
P4 steht für Spermien mit hoher DNA-Färbbarkeit (HDS). Diese Spermiengruppe besitzt nicht den normalen Austausch von Histon zu Protamin.
Die vorherrschenden Zellpopulationen außerhalb der P3- und P4-Tore bestehen aus normalen Spermien, die eine reduzierte rote Fluoreszenz aufweisen und überwiegend grüne Fluoreszenz emittieren.
Entnahme und Analyse von Samenproben
Alle 121 Samenproben stammten von den Männern, die das Reproduktionszentrum des Huai'an First Hospital, das der Nanjing Medical University angeschlossen ist, besuchten. Spermaproben wurden durch Masturbation nach einer Phase von 2-7 Tagen Enthaltsamkeit entnommen. Die routinemäßige Samenanalyse wurde strikt gemäß den Anforderungen des WHO-Laborhandbuchs zur Untersuchung und Verarbeitung von menschlichem Sperma11,12 durchgeführt. Spermienkonzentrations- und Motilitätsanalysen wurden mit einem computergestützten Spermienanalysesystem (CASA) durchgeführt. Jede Probe wurde zweimal analysiert. Die Ergebnisse wurden nur dann als Mittelwert angegeben, wenn die Differenz zwischen den beiden Ergebnissen innerhalb des 95%-Konfidenzintervalls lag; ansonsten wurden Neubeprobungen und Analysen durchgeführt.
DFI-Analyse
Berechnen Sie das erforderliche Probenvolumen für die Samenprobe so, dass die Endkonzentration der Spermien in Reagenz A aus dem Durchflusszytometrie-Kit 2–3 x 106/ml beträgt. Berechnungsmethode: Unter der Annahme, dass die Spermienkonzentration in der ursprünglichen Samenprobe M x 106/ml beträgt, gilt das erforderliche Samenvolumen (μL) = 150/M. Fügen Sie das berechnete Samenvolumen in ein Durchflusszytometerrohr ein, dann fügen Sie 50 μL Reagenz A hinzu und mischen Sie vorsichtig. Fügen Sie 100 μL Reagenz B hinzu, mischen Sie vorsichtig und inkubieren Sie 30 Sekunden bei Zimmertemperatur. Sofort 300 μL Reagenz C hinzufügen und vorsichtig mischen. Detektieren Sie die Probe mit CFG und PGG am Durchflusszytometer und analysieren Sie mindestens 5000 Spermien.
Statistische Analyse
Die Daten wurden mit GraphPad Prism 6.0 statistisch analysiert. Bland-Altman-Diagramme wurden erstellt, um das Maß an Übereinstimmung zwischen PGG und CFG durch Berechnung des Mittelwerts und der Unterschiede zu bewerten. Die Unterschiede zwischen den beiden Methoden wurden gegen ihre Durchschnittswerte abgebildet. Darüber hinaus wurde die Pearson-Methode verwendet, um die Korrelation zwischen PGG und CFG zu analysieren. Es wurde festgestellt, dass ein p-Wert unter 0,05 statistisch signifikant ist.
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Unter den 121 Studienteilnehmern (Durchschnittsalter: 32,5 ± 4,9 Jahre; Zeitraum: 26–44 Jahre) wurden bei 28 Asthenozoospermie und 4 Oligozoospermie diagnostiziert. Basismerkmale der Bevölkerung und Samenanalyseparameter sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Wie in Abbildung 4 gezeigt, zeigte das Bland-Altman-Diagramm, dass die mit den PGG- und CFG-Methoden erhaltenen DFI-Ergebnisse ausgezeichnete Konsistenz zeigten ...
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Die 6. Ausgabe des WHO-Laborhandbuchs zur Untersuchung und Verarbeitung von menschlichem Sperma12 empfiehlt vier Methoden zur Bewertung der Integrität der Spermien-DNA: terminale Deoxynukleotidyltransferase (dUTP) Nickend-Labeling (TUNEL), Einzelzell-Gelelektrophorese (Comet) Assays, SCSA und Spermienchromatin-Dispersion (SCD)-Test. Unter ihnen wurde SCSA in Andrologielaboren aufgrund der Nutzung von Flusszytometrie für die Analyse weit verbreitet übernommen, die ...
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Computergestütztes Spermaanalysesystem | Beijing Suijia Software Co., Ltd | SA-II | |
| Durchflusszytometer | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | Cyto E6 | |
| Durchflusszytometrie-Kit | Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD | ||
| Makler-Zählkammer | Sefi Medical Instruments | ||
| DNA-Integritäts-Kit für Spermienkern | Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD | - |
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