Dieser Artikel beschreibt ein effizientes Protokoll zur dissektion der imaginären Bandscheiben und zur Färbung von Antikörpern, das mit Reagenzien sparsam ist und den Umgang mit imaginären Bandscheiben in kleinen Mengen erleichtert.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Kleinskalige Dissektion und Antikörperfärbung der Augen-, Antennen- und Flügel-Imaginalscheiben von Drosophila melanogaster
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Drosophila-Imaginalscheiben werden seit langem als Modelle für die Entwicklung, Musterung und Regeneration von Epithel untersucht. Die Markierung und Bildgebung von Antikörpern sezierter imaginärer Bandscheiben ist wichtig, um Expressionsmuster von Proteinen als Marker für Entwicklungs- und physiologische Prozesse zu visualisieren. Diese Methode der dissektion und Markierung imaginärer Scheiben wurde ursprünglich für die Immunelektronenmikroskopie von Augenantennen-imaginären Scheiben von Tomlinson und Ready entwickelt. Die Verwendung von 60-Mikrowell-Platten und durch das Übertragen von Geweben zwischen Lösungen statt der Lösung ist individuelle Aufmerksamkeit für Gewebeproben mit sehr geringem Verlust möglich. Sogar einzelne imaginale Scheiben können verarbeitet werden. Die Methode benötigt nur kleine Mengen an Antikörpern und anderen Reagenzien. Als Beispiel für die Anwendung der Methode auf andere Kleingewebe zeigt der Artikel auch, wie Flügel-imaginale Bandscheiben mit derselben Methode seziert und beschriftet werden können. Ein ähnlicher Ansatz kann auf jedes kleine Gewebe ähnlicher Größe angewendet werden und auch auf andere histochemische und Markierungsverfahren neben der Antikörperfärbung.
Einleitung
Drosophila-Imaginalscheiben sind Vorläufergewebe, die während der Embryogenese beiseitegelegt werden, in der Larve ohne Differenzierung wachsen und während des Puppenstadiums1 zu den epidermalen Strukturen der Erwachsenen beitragen. Ihre Studie hat viele Einblicke in entwicklungsbedingte Mustermechanismen geliefert, wobei besonders gut die imaginären Bandscheiben von Auge und Flügel untersucht wurden: 2,3,4,5,6. Die Immunhistochemie ist besonders nützlich, um räumliche und zeitliche Muster der Genexpression in imaginären Bandscheiben zu untersuchen sowie Zellverhalten wie Zellteilung und Zelltod zu charakterisieren.
Um die zusätzlichen Anforderungen der elektronenmikroskopischen Analyse von antikörperbeschrifteten imaginären Augenscheiben zu erfüllen, entwickelten Tomlinson und Ready ein kleinmaßstäbliches Protokoll, das besonders wirtschaftlich mit Reagenzien umgeht und ein sehr hohes Maß an Zuverlässigkeit und Anpassungbietet. Ihre Methode wird gedruckt beschrieben, aber es ist kein Video verfügbar, 3,8,9. Die Methode lässt sich leicht für die Markierung anderer imaginärer Scheiben (oder anderer Gewebe) anpassen und kann zusätzlich zu Augenantennen-Imaginalscheiben auch auf Flügel-imaginale Scheiben angewendet werden.
Die Antikörperkennzeichnung der imaginären Bandscheiben von Drosophila folgt dem allgemeinen Grundriss, der auf jedes Gewebe10 gilt (Abbildung 1). Das Gewebe muss vor der Inkubation mit Antikörpern, die spezifisch für interessante Proteine sind, disziert und fixiert werden. Nachdem der ungebundene Antikörper abgewaschen wurde, wird ein markierter (oft fluoreszierender) sekundärer Antikörper hinzugefügt, der an den primären Antikörper bindet, der wiederum an das interessante Protein im fixierten Gewebe gebunden ist. Nach der Reinigung zur Entfernung der ungebundenen sekundären Antikörper kann das Gewebe zur mikroskopischen Untersuchung montiert werden und die interessanten Proteine sichtbar gemacht werden. Viele allgemeine Beschreibungen dieses Prozesses sind verfügbar und können auf imaginäre Bandscheiben und andere Drosophila-Gewebe 11 angewendet werden. Hier wird ein Protokoll für die Tomlinson-&-Ready-Methode bereitgestellt, bei der Gewebeproben einzeln zwischen kleinen Inkubationsbrunnen auf einer Mikrowellplatte übertragen und bei jedem Schritt von einem Stereomikroskop beobachtet werden (Abbildung 2). Dieser Ansatz funktioniert am besten für das Färben kleinerer Mengen von Geweben gleichzeitig (Dutzende von Proben) und ist für große Chargen (also Hunderte) nicht ideal. Dieser Ansatz erfordert nur kleine Lösungsvolumina von 13 μL in jedem Brunnen und kann daher mit sehr wenig Antikörpern durchgeführt werden. Da der Gewebeverlust minimal ist, gibt es keine Mindeststichprobengröße, und selbst einzelne imaginäre Bandscheiben können zuverlässig verarbeitet werden.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Herstellung des Übertragungswerkzeugs
- Mit einer Zange schneiden Sie ~2,5 cm Wolframdraht mit 0,005" Durchmesser. Verwenden Sie eine Pinzette, um ein Ende des Drahts zu einem Haken oder einer Schlaufe zu formen (Abbildung 3). Stecke das andere Ende in einen Nadelhalter. Dies wird verwendet, um die Scheiben mit wenig oder gar keiner Flüssigkeitsübertragung zu übertragen. Die Schleife ist vielleicht die einfachere von beiden, aber der Haken transportiert weniger Flüssigkeit zwischen den Lösungen.
2. Sezieren und Fixieren von augen-antennalen imaginären Scheiben
- Spülen Sie die Larven mit ~7,5 mL 0,1 m Natriumphosphatpuffer (pH7,2) in einer Petrischale (60 mm Durchmesser), um Fliegenmedien oder andere Rückstände zu entfernen. Siehe Schritt 6 für die Dissektion von Flügel-Imaginalscheiben anstelle von Augen-Antennen-Scheiben. Beide imaginären Bandscheiben befinden sich im vorderen Teil des Körpers (Abbildung 4).
HINWEIS: PBS kann in den Schritten 2.1–2.3 auch anstelle eines Phosphatpuffers verwendet werden. - Übertrage die Larven in eine Petrischale mit frischem Puffer.
HINWEIS: Einige Arbeiter bevorzugen es, einzelne Larven in einzelnen Puffertropfen in einer 60-mm-Petrischale zu sezieren; Andere verwenden Depression Well Slides. - Halten Sie die Larven beim Beobachten unter einem Seziermikroskop ~50 % des Körpers mit einer Pinzette hinunter. Benutze ein zweites Paar feiner Pinzette, um die Mundhaken zu greifen und zu ziehen. Die Augenantennenscheiben werden an den Mundteilen befestigt. Das Gehirn kann auch an den Augenscheiben verbunden bleiben.
- Verwenden Sie das Drahtwerkzeug, um das dissektionierte Gewebe in eine kleine Petrischale (35 mm Durchmesser) zu übertragen, die ~3 mL Fixativ, z. B. 3,7 % Formaldehyd in einem 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH7,2) enthält, hergestellt durch Verdünnung von 37 % Formaldehydlösung in einem Puffer.
HINWEIS: Befolgen Sie lokal genehmigte Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Formaldehyd. 3,7 % Formaldehyd ist ein einfaches Fixativ, das in vielen Fällen zufriedenstellend ist, aber andere Fixivan können für bestimmte Antigene optimal sein. PBS oder PEM (0,1 M PIPES pH 7,0, 2 mM MgSO4, 1 mM EGTA) können als Fixationspuffer anstelle von 0,1 M Natriumphosphat verwendet werden, oder eine Formaldehydlösung kann durch Auflösung fester Paraformaldehyd gewonnen werden, anstatt aus einer konzentrierten Lagerlösung. Das fixative Paraformaldehyd-Lysin-Periodat (PLP) kombiniert mildere Proteinfixierung mit Kohlenhydratvernetzung und erhält so die Membranstrukturen besser12. Das Drosophila-Glykoprotein Scabrous zum Beispiel bleibt nach der PLP-Fixierung antigen, aber nicht nach der Formaldehydfixierung. PLP frisch wie folgt zubereiten: (1) 2 g Paraformaldehydpulver zu 25 ml deionisiertem Wasser in einer konischen Flasche in einer Dampfhaube geben und bei niedriger Hitze rühren; (2) Eine Pipette in eine 50%ige Natriumhydroxid-Lösung tauchen und eine Spur der Flüssigkeit (deutlich weniger als einen Tropfen) auf die Mischung übertragen. Das Paraformaldehyd sollte sich innerhalb weniger Minuten auflösen, ohne dass die Lösung kocht. Während des Abkühlens der 8%igen Formaldehydlösung lösen Sie 0,36 g Lysin in 10 mL deionisiertem Wasser, 7,5 mL 0,1 m Natriumphosphat pH 7,2, 2,5 mL 0,1 M Na2HPO4 und lassen Sie es auf Eis legen. Mischen Sie 15 ml dieser kaltgepufferten Lysinlösung mit 5 ml frischem 8%-Formaldehyd und 50 mg Natriumperiodat in einem 50-mL Schraubverschlussrohr, mischen Sie es durch Vortexen und verwenden Sie es frisch. - Nach 15–20 Minuten bei Zimmertemperatur wird das dissektionierte Gewebe in eine andere Petrischale mit 0,1 m Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) übertragen.
HINWEIS: PBS kann auch anstelle von Phosphatpuffer verwendet werden. Eine Fixierung auf Eis kann für einige Antigene vorzuziehen sein, oder wenn es gewünscht ist, die endogene Fluoreszenz von GFP oder RFP, die im Gewebe exprimiert wird, abzubilden. Die PLP-Fixierung erfolgt immer 45 Minuten auf Eis.
3. Blockieren und Inkubieren mit dem primären Antikörper
- Gewebe in eine 35 mm Petrischale mit ~3 ml NSG-Antikörper-Waschpuffer zur Blockierung übertragen. Inkubieren Sie die Petrischale mindestens 15 Minuten auf Eis. NSG ist 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,2), 0,1 % Saponin, 5 % normales Ziegenserum. Waschpufferbestände werden filtersterilisiert bei 4 °C gelagert.
HINWEIS: Verschiedene Waschpuffer können für bestimmte Antikörper optimal sein. Zum Beispiel ist Saponin ein mildes, nicht-ionisches Reinigungsmittel, das die Plasmamembran besonders löslich macht, während andere Reinigungsmittel zum Nachweis von Antigenen im Kern vorzuziehen sind. Als weiteres Beispiel ist der von Jarman et al.13 entwickelte Antikörper gegen das nukleare atonale Protein am immunreaktivsten in Puffern, die NP40 als Detergent enthalten. Siehe die Materialtabelle für Rezepte für alternative Waschpuffer: PDT, PBT oder NSG. Bei der Verwendung eines normalen Serums als Blockproteins sollte es idealerweise von der Spezies stammen, in der der sekundäre Antikörper produziert wird, z. B. normales Ziegenserum, wenn Ziegen-Sekundärantikörper verwendet werden sollen, oder normales Esel-Serum, wenn Esel-Sekundärantikörper verwendet werden sollen. In der Praxis macht das kaum einen Unterschied. - Entfernen Sie während des Blockierens unerwünschte Gewebe von den Antennenscheiben mit feinen Pinzetten, außer den Mundhaken. Lassen Sie die Mundwerkzeuge vorerst angebracht, um den Transfer zu erleichtern.
HINWEIS: Überflüssiges Gewebe, z. B. das Gehirn, kann ebenfalls bis zur Montage des Verschlusses (Schritt 5.4) zurückgelassen werden, solange es keine Verfärbung oder Sichtbarkeit beeinträchtigt. - Während des Blockierens bereiten Sie eine 1:100-Verdünnung einer mAb40-1a-Antikörperlösung in NSG vor, z. B. 1 μL Antikörper in 100 μL NSG. Mischen Sie durch Pipetteren, nicht durch Vortexen.
HINWEIS: mAb40-1a ist ein monoklonaler Antikörper, der gegen Beta-Galactosidase erhoben wurde. Die optimale Antikörperverdünnung und Waschpuffer variieren je nach verwendeten Antikörpern. - Fügen Sie 13 μL-Antikörperlösungen zu jedem von bis zu sechs Bohrlöchern in der ersten Spalte eines 60-Bohrloch-Mikrowellen-Minitrays hinzu. Konische Mikrobrunnen mit geraden Seiten sind wichtig für die optische Klarheit. Wenn mehr als sechs Brunnen benötigt werden, starten Sie ein zweites Minitray.
- Übertrage augenantennale imaginale Scheiben, vorzugsweise noch an Mundwerkzeugen befestigt, nacheinander mit der Drahtschlaufe oder dem Haken auf die primäre Antikörperlösung.
HINWEIS: Die Anzahl der imaginären Scheiben, die zu jedem Brunnen hinzugefügt werden können, hängt vom Antikörper ab. Zu viel Gewebe kann einige Antikörper so stark abbauen, dass die Markierung abnimmt. 5 Paare pro Brunnen sind normalerweise zufriedenstellend. Daher können ~60 Scheiben problemlos mit den 6 Reihen von 60-Well-Mikrotiterplatten beschriftet werden. Für jede der Reihen können unterschiedliche Antikörper verwendet werden. Ob Antikörperlösungen wiederverwendet werden können, erfordert empirische Tests für jeden Fall; Das ist in unserem Labor keine Routine. - Schließen Sie die Platte mit dem Deckel und schließen Sie sie mit Parafilm ab, um die Verdunstung zu begrenzen. Inkubieren Sie auf Eis oder bei 4 °C für 4 Stunden bis über Nacht. Schaukeln ist nicht nötig.
HINWEIS: Die optimale Zeit und Temperatur der Antikörperinkubation hängen vom Antikörper ab. In vielen Fällen reichen 1–2 Stunden bei Raumtemperatur aus, aber einige Antikörper liefern nach der Inkubation bei 4 °C bessere Ergebnisse, und es kann oft praktisch sein, bei 4 °C über Nacht zu inkubieren. In sehr wenigen Fällen können primäre Antikörperinkubationen von 2–3 Tagen optimal sein. Das Abschließen des Mikrobrunnendeckels ist nur für Inkubationen von länger als ~4 Stunden notwendig.
4. Waschen und Inkubieren mit sekundären Antikörpern
- Fügen Sie nach jedem Antikörperbohrloch 13 μL NSG-Puffer zu den nächsten drei Spalten von Bohrlöchern hinzu, da die Proben dreimal gewaschen werden. Übertragen Sie die Proben nacheinander in jedem Brunnen für 5 Minuten zum Waschen.
- Während des Waschens bereiten Sie eine 1:200–400 Verdünnung fluoreszenzkonjugierter sekundärer Antikörper im NSG-Puffer vor, z. B. 0,5 μL Antikörper in 100 μL NSG. Mischen Sie durch Pipetteren, nicht durch Vortexen. Zentrifugieren Sie die sekundäre Antikörper-Lagerlösung 60 Sekunden lang (mit maximaler Geschwindigkeit) vor der Verdünnung, da Antikörperaggregate unspezifisch an die Gewebeoberfläche binden können.
HINWEIS: Die optimale sekundäre Antikörperverdünnung kann je nach Hersteller variieren. Alexa- oder Cyanin-konjugierte Antikörper sind für andere Arten subtrahiert verfügbar, um die mehrfache Markierung zu erleichtern. - Fügen Sie 13 μL der sekundären Antikörperlösung in die nächste (5.) Kolonne von Brunnen hinzu.
- Proben über die Schleife oder einen Haken in den sekundären Antikörper übertragen.
- Schließen Sie die Platte mit dem Deckel und schließen Sie sie mit Parafilm ab, um die Verdunstung zu begrenzen. Über Nacht 4 Stunden auf Eis ausbrüten.
HINWEIS: Die optimale Zeit und Temperatur der Antikörperinkubation hängen vom Antikörper ab. In vielen Fällen reichen 1–2 Stunden bei Raumtemperatur aus, aber einige Antikörper liefern nach der Inkubation bei 4 °C bessere Ergebnisse, und es kann oft praktisch sein, bei 4 °C über Nacht zu inkubieren. Das Abschließen des Mikrobrunnendeckels ist nur für Inkubationen von länger als ~4 Stunden notwendig.
5. Waschen und Montieren von Gewebe für die Mikroskopie
- Bereiten Sie die nächsten drei Kolonnen von Brunnen nach dem sekundären Antikörperbohrloch mit 13 μL NSG vor. Übertragen Sie die Proben für 5 Minuten durch jede Bohröffnung.
- Übertragen Sie die Proben in eine Endwäsche im 9. Brunnen mit 13 μL 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,2). Diese Pufferreinigung ist notwendig, wenn Waschpuffer Komponenten enthalten, die im Montagemedium ausfällen.
- . Fügen Sie 13 μL Montagemedium zur letzten (10.) Säule der Brunnen hinzu. Das Montagemedium wird hergestellt, indem 2 % n-Propolgallat in 75 % Glycerol und 25 % 0,1 m Natriumphosphatpuffer mit pH 7,2 gelöst werden. Bereiten Sie jede Woche frisches Montagemedium vor, indem Sie die Komponenten auf einer rotierenden Plattform mischen. Lassen Sie alle Luftblasen vor der Nutzung verschwinden.
HINWEIS: Montagemedien sind auch kommerziell erhältlich. - Pipette 20 μL Montagemedium auf einem sauberen Mikroskopobjektträger. Übertrage die Proben in das Medium auf dem Objektträger. Dies ist eine letzte Gelegenheit, unerwünschtes Gewebe zu entfernen. Kutikuläre Mundwerkzeuge müssen von Augenantennenscheiben entfernt werden.
- Um die Proben so anzuordnen, dass sie nicht abdriften, wenn das Deckglas überlagert wird, verwenden Sie das Drahtwerkzeug, um Proben aus dem Hauptabtropfen der Halterung zu ziehen. Lassen Sie vorsichtig ein sauberes, 22 mm x 40 mm dickes Deckglas mit einer Zange auf den Schlitten absetzen, ohne Luftblasen zu erzeugen.
- Lassen Sie die Verschlüsse eine Stunde in einem Pappträger stehen, damit das Montagemedium einsetzt. Vermeiden Sie es, die Objektträger zu stören, da die empfindlichen Proben beschädigt werden können, wenn sich das Deckglas bewegt.
- Sobald das Deckglas eingesackt ist, versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack. Bewege oder drücke dabei nicht auf das Abdeckungsglas. Lassen Sie den Nagellack mindestens eine Stunde vor der Bildgebung trocknen.
HINWEIS: Leider verwenden die meisten kosmetischen Nagellacke mittlerweile Lösungsmittel, die sich nicht gleichmäßig auf Glasfolien verteilen und nicht mehr nützlich sind, daher muss wissenschaftlicher Nagellack beansprucht werden. - Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C. Proben können normalerweise monatelang abgebildet und erneut abgebildet werden.
HINWEIS: Objektträger können auch bei -20 °C gelagert werden.
6. Zerlegen und Fixieren imaginärer Flügelscheiben
- Um Flügel-imaginale Scheiben statt Augen-Antennen-Imaginalscheiben zu zerlegen, folgen Sie den folgenden Schritten anstelle der oben genannten Schritte 2.3–2.5.
- Unter einem Seziermikroskop greifen Sie die Larvenmundwerkzeuge mit feinen Pinzetten. Mit einer Mikrodissektionsschere wird die Larven 30–40 % des vorderen Abschnitts halbiert.
- Wenden Sie den vorderen Teil der Larve um, indem Sie das offene, abgeschnittene Ende der Larven mit einer zweiten Zange spreizen und Kopf und Mundwerkzeuge hindurchdrücken, ähnlich wie beim Umdrehen einer Socke
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die umgekehrten vorderen Larven in ein Fixationsmittel in eine kleine Petrischale (35 mm Durchmesser) zu übertragen, die ~2,5 ml Fixativ enthält, z. B. 3,7 % Formaldehyd in einem 0,1 m Natriumphosphatpuffer (pH 7,2), hergestellt durch Verdünnung von 37 % Formaldehyd-Lagerlösung in PBS.
HINWEIS: Falls gewünscht, können umgekehrte Schlachtkörper auf 400 μL Fixativ in einem Mikrofugerohr übertragen werden, was die Fixierung in einer Abzugshaube erleichtert. Die gleichen fixativen Optionen, die für die Fixierung der Augen-imaginalen Bandscheiben verfügbar sind, gelten auch für die Flügelscheibenfixierung (siehe HINWEIS zu Schritt 2.4). Die optimale Fixierung und zur Beschriftung von augen-antennalen imaginären Scheiben ist in der Regel dieselbe für Flügelscheiben. - Nach 15–20 Minuten bei Zimmertemperatur wird das dissektionierte Gewebe in eine andere Petrischale mit 0,1 m Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) übertragen.
HINWEIS: Die gleichen Waschpuffer-Optionen, die für die Fixierung der Augen-imaginalen Scheiben verfügbar sind, gelten auch für die Flügelscheibenfixierung (siehe HINWEIS zu Schritt 2.4). Der optimale Waschpuffer zur Beschriftung augen-antennaler imaginärer Scheiben ist in der Regel derselbe wie bei Flügelscheiben. - Entfernen Sie die Flügelscheiben von den Larven mit einer feinen Pinzette. Wenn sie noch vorhanden sind, können die kleinere Haltere-Scheibe und die Beinscheibe entweder jetzt entfernt oder an den Flügelscheiben befestigt bleiben, um den Transfer zu erleichtern.
HINWEIS: Die Flügelscheiben sind im Kadaver möglicherweise erst gut sichtbar, wenn der Fettkörper oder anderes Gewebe entfernt wurde (identifizieren Sie immer ein Gewebe, bevor Sie es entfernen). Die Flügelscheiben sind die größten imaginären Bandscheiben und sind an der Körperwand befestigt, die eng mit der Luftröhre verbunden ist. Sie haben eine tropfenförmige Form, ähnlich der Umriss von South America1 (Abbildung 4). - Fahren Sie mit den oben genannten Schritten 3–5 fort.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Das Tomlinson-und-Ready-Verfahren liefert regelmäßig ausgezeichnete Antikörperfärbungsergebnisse. Hier sind dreifach beschriftete Augen-, Antennen- und Flügel-Imaginalscheiben dargestellt. In Abbildung 5A wurde eine imaginale Scheibe des dritten Augen-Antennenstadiums dreifach markiert, um den Transkriptionsfaktor Senseless (blau), den neuronalen Vorläufermarker Elav (rot) und die Anti-GFP-Markierung von Zellklonen zu erkennen, die RNAi für das Ocho-Tran...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die Antikörperfärbung von Drosophila-Geweben mittels 60-Well-konischer Bohrlochplatten mit der Tomlinson-und-Ready-Methode liefert hervorragende Ergebnisse und ist äußerst zuverlässig, da jede imaginäre Scheibe bei jeder Manipulation unter dem Sezionsmikroskop verfolgt wird. Die Methode erfordert nur geringe Mengen an Antikörperreagenzien und tauscht mit jedem Schritt die Lösungen umfassender aus, da die Proben mit sehr wenig zugehöriger Flüssigkeit übertragen werden. Es eignet ...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Danksagungen
NEB dankt Andrew Tomlinson für das Teilen der Methode und Lucy Firth für die Verfeinerungen. Wir danken Abhishek Bhattacharya für die Bereitstellung von Abbildung 5A. Wir danken Joyner Cruz, Jonathan Gonzalez, Chelsea Nguyen und Jensen Northrup. Die Forschung im Labor der Autoren wird durch Fördermittel des NIH (GM120451 und CA284362) finanziert. Abbildung 2 und Abbildung 4 wurden mit Biorender erstellt.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Dinatriumphosphat | Fisher | 7558-79-4 | Na2HPO4 – Natriumphosphat dibasisch wasserfrei. Andere Hydratationszustände können verwendet werden, verändern jedoch das Molekulargewicht |
| Pinzette: Dumont #5 Biologie-Zange | Feine wissenschaftliche Werkzeuge | 11252-20 | Stil: #5 |
| Spitzenform: Gerade | |||
| Länge: 11 cm | |||
| Autoklav-sicher: Ja | |||
| Tipps: Biologie | |||
| Tippmaße: | |||
| 0,05 x 0,02 mm | |||
| Legierung / Material: Inox | |||
| Formaldehyd | Fisher | BP531-500 | Molekularbiologie-Qualität, 37 % Formaldehyd. 500ml |
| Formaldehydfixativ | Fisher | BP531-500 | 3,7 % Formaldehyd im 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2, hergestellt durch Verdünnung aus 37 % Lager. |
| Glycerol | Fisher-Bioreagenzien | BP229-1 | |
| Eis | Benutzerpräferenz | ||
| L-Lysin, 98 % | Thermowissenschaftlich | J62225.22 | |
| mAb40-1 | DHSB | 40-1a-s | Anti-Beta-Galaktosidase |
| Mikrozentrifugenröhren | USA Scientific | 1615-5520 | 1,5-ml-Röhren zum Aufnehmen von Proben. |
| Mikrodissektionsschere | Feine wissenschaftliche Werkzeuge | 15003-08 | 5 mm Schneide, gerade Spitze, 8,5 cm |
| Mononatriumphosphat | Fisher | 7558-80-7 | NaH2PO4 – Natriumphosphat monobasisch wasserfrei. Bei Verwendung einer hydratisierten Form würde sich das Gewicht, das für eine 0,1-Meter-Lösung benötigt wird, verändern. |
| Montagemedium | 75 % Glycerollösung in 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2 mit 2,5 % n-Propylgallat. Mische durch Inversion, um Blasen zu minimieren. | ||
| NSG | 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2, 0,1 % Saponin, 5 % NGS | ||
| n-Propylgallat | MP Biomedizin | 210274780 | |
| Nagellack | Ted Pella, von Fisher gekauft | NC0381432 | Zum Abdichten von Schlitten |
| Nadelhalter | Fisher | NC0099380 | Für Mikrodissektionsnadeln. Hohler Edelstahl; Grifflänge: 4 3/4" Länge |
| Nunc Microwell MiniTrays | Thermowissenschaftlich | 12565155 | MicroWell MiniTray für serologische Anwendungen. Brunnenzählung 60 |
| Parafilm | StatLab | PM996 | StatLab ParaFilm M Selbstabdichtender flexibler Film |
| Paraformaldehyd | Polysciences, Inc. | 00380-250 | |
| 10x PBS | Benutzerpräferenz | Bereiten Sie 800 ml destilliertes Wasser in einem geeigneten Behälter vor. | |
| Gib 1,37 M Natriumchlorid zur Lösung hinzu. | |||
| Gib 26,8 mM Kaliumchlorid zur Lösung hinzu. | |||
| Gib 101 mM Natriumphosphat-Dibasisch zur Lösung hinzu. | |||
| Fügen Sie 18,0 mM Kaliumphosphat monobasisch zur Lösung hinzu. | |||
| Lösung auf den gewünschten pH-Wert anpassen (typischerweise pH & Asymp; 7,4). | |||
| Geben Sie destilliertes Wasser, bis das Volumen 1 L beträgt. | |||
| PBT | Benutzerpräferenz | 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH7,2, 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,2 % Triton X-100. | |
| PDT | Benutzerpräferenz | 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH = 7,2), 0,3 % Desoxycholat und 0,3 % Triton x-100 | |
| Petrischale | Falcon | Corning 351007 | Petrischale; 60 mm; Nicht behandelt |
| Petrischale | Falcon | Corning 351008 | Petrischale; 35 mm; Nicht behandelt |
| Zange | Benutzerpräferenz | ||
| PLP | n/a | 2 % Paraformaldehyd 1,35 % Lysin im 0,05 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2 | |
| Sekundäre Antikörper | Jackson ImmunoResearch | 715-545-151 | 0,5 mg Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Maus IgG. |
| Dia-Abdeckungen | VWR | 48393-172 | VWR Deckglas #1.5 22x40 (GEHÄUSE) |
| Folien | Fisher | 125442 | Fisher Glass Slides 10bx/CS |
| Natriumdesoxycholat | Thermo Fisher Wissenschaft | 89904 | Natriumdeoxycholat-Waschmittel; 5 mg |
| Natriumperiodat | Sigma Aldrich | 71859-25G | Natriumperiodat – 25 Gramm |
| Natriumphosphatpuffer | 0,1M NaPO4-Puffer pH 7,2. Mische 28 ml 0,1 M Anyhdrous Monosodium Phosphat Fond (11,998 g NaH2PO4 bis 1 L destilliertes Wasser) mit 72 ml 0,1 M Anyhydrous Dinatriumphosphat-Fond (14,196 g Na2HPO4 bis 1L destilliertes Wasser), um 100 ml 0,1M NaPO4-Puffer zu erzeugen. Alternativ kann PBS verwendet werden. | ||
| Wolframdraht | Ted Pella | 27-11 | .005" DIA. |
| Triton x-100 | Thermo Fisher Wissenschaft | A16046AE | |
| Vortex | Benutzerpräferenz |
Referenzen
- Bate, M., Martinez Arias, A. The development of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. 747-841 (1993).
- Tripathi, B. K., Irvine, K. D. The wing imaginal disc. Genetics. 220 (4), iyac020(2022).
- Baker, N. E., Li, K., Quiquand, M., Ruggiero, R., Wang, L. H. Eye development. Methods. 68 (1), 252-259 (2014).
- Treisman, J. E. Retinal differentiation in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).
- Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
- Held, L. I. J. Imaginal discs: The genetic and cellular logic of pattern formation. , Cambridge University Press. (2002).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium. Developmental Biology. 120, 366-376 (1987).
- Rubin lab methods book. , Wellcome Collection. https://wellcomecollection.org/works/u7msrkak (1990).
- Rubin lab manual. , The Rubin Lab. https://www.yumpu.com/en/document/view/12357776/rubin-lab-manual-jfly-home-page (1990).
- Mitchison, T. J., Sedat, J. Localization of antigenic determinants in whole Drosophila embryos. Dev Biol. 99 (1), 261-264 (1983).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Mclean, I. W., Nakane, P. K. Periodate-lysine-paraform-aldehyde fixative a new fixative for immunoelectron microscopy. J. Histochem. Cytochem. 22, 1108-1077 (1974).
- Jarman, A. P., Grell, E. H., Ackerman, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Atonal is the proneural gene for Drosophila photoreceptors. Nature. 369, 398-400 (1994).
- Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Tie-dye: A combinatorial marking system to visualize and genetically manipulate clones during development in Drosophila melanogaster. Development. 140 (15), 3275-3284 (2013).
- Blanco, J., Cooper, J. C., Baker, N. E. Roles of c/ebp class bzip proteins in the growth and cell competition of rp ('minute') mutants in Drosophila. Elife. 9, e50535(2020).
- Jennings, B., Preiss, A., Delidakis, C., Bray, S. The notch signalling pathway is required for enhancer of split bhlh protein expression during neurogenesis in the Drosophila embryo. Development. 120 (12), 3537-3548 (1994).
- Kiparaki, M., Baker, N. E. Protocol for assessing translation in living Drosophila imaginal discs by o-propargyl-puromycin incorporation. STAR Protoc. 4 (4), 102653(2023).
- Spratford, C. M., Kumar, J. P. Dissection and immunostaining of imaginal discs from Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (91), e51792(2014).
- Yan, S. J., Li, W. X. Using Drosophila larval imaginal discs to study low-dose radiation-induced cell cycle arrest. Methods Mol Biol. 782, 93-103 (2011).
- Klein, T. Immunolabeling of imaginal discs. Methods Mol Biol. 420, 253-263 (2008).
- Phalle Bde, S. Immunostaining of whole-mount imaginal discs. Methods Mol Biol. 247, 373-387 (2004).
- Morimoto, K., Tamori, Y. Induction and diagnosis of tumors in Drosophila imaginal disc epithelia. J Vis Exp. (125), e55901(2017).
- Brown, N. L. Confocal microscopy methods and protocols. Methods in molecular biology. Paddow, S. W. , Humana Press. 75-91 (1999).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
