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Forschungsartikel

Regulatorischer Effekt der Moxibustion auf die Makrophagepolarisation und -migration bei RA-Modellratten und die Rolle von TIM-3

175 Ansichten

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DOI:

10.3791/70436

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27. März 2026

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1Acupuncture and Tuina School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie untersucht die regulatorischen Effekte der Moxibustion auf die Makrophagepolarisation und -migration in Rattenmodellen der rheumatoiden Arthritis, mit Schwerpunkt auf der Rolle von T-Cell-Immunglobulin und mucin-domänenhaltigem Protein 3 (TIM-3), um die therapeutischen Mechanismen der Moxibustion bei dieser Erkrankung zu erläutern.

Zusammenfassung

Diese Studie zielte darauf ab, die regulatorischen Effekte von Moxibustion auf die Makrophagepolarisation und -migration in einem Rattenmodell der rheumatoiden Arthritis sowie die Rolle des T-Zell-Immunglobulins und des mucin-domänenhaltigen Proteins 3 (TIM-3) in diesem Prozess zu untersuchen. Am Tag 0 des Experiments wurden Sprague–Dawley (SD) Ratten in fünf Gruppen eingeteilt. Das vollständige Freund-Adjuvans (CFA) wurde in die Hinterfußpolster injiziert, um das rheumatoide Arthritis-Modell zu etablieren. Zusätzlich wurde lentivirus-vermittelte Havcr2-RNA-Interferenz (LV-Havcr2-RNAi) in die hinteren Fußpolster injiziert, um die TIM-3-Expression zu hemmen. Ab Tag 7 unterzogen sich die Ratten einer Moxibustion-Behandlung in Zyklen, bestehend aus sechs Tagen Behandlung und einem Ruhetag, insgesamt drei vollständige Zyklen. Nach Abschluss der Moxibustion-Therapie wurde der Entzündungszustand durch histologische Analyse und Messung der Pfotendicke bewertet. Phänotypische Marker der M1- und M2-Makrophagen wurden mittels enzymgebundener Immunsorbent-Assay (ELISA) und Immunfluoreszenz bewertet. Die Expression von TIM-3 wurde mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) und Western Blot nachgewiesen. Darüber hinaus wurden peritoneale Exsudat-Makrophagen (PEMs) aus weiteren SD-Ratten isoliert, und die Makrophagemigration wurde mittels eines Transwell-Tests untersucht. Die Studie ergab, dass Ratten nach der CFA-Injektion eine signifikante Pfotenrötung und Schwellung sowie ein Ungleichgewicht in der Makrophage-Phänotyp-Expression aufwiesen. Zusätzlich zeigten Transwell-Migrationsanalysen, dass CFA-induzierte Modellratten eine erhöhte Makrophagemigration im Vergleich zu Kontrollproben zeigten. Die Moxibustionsbehandlung dämpfte diese Veränderungen jedoch. Die Ergebnisse zeigten außerdem, dass Moxibustion die TIM-3-Expression erhöhte, und nach einer lentiviralen Intervention waren die TIM-3-Spiegel deutlich reduziert, was zu einer Verschärfung der entzündlichen Manifestationen und einem Makrophage-Ungleichgewicht führte. Diese Ergebnisse zeigen, dass TIM-3 als Schlüsselvermittler bei der Moxibustion-Regulation der Makrophagenpolarisierung und -migration dient.

Einleitung

Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine weit verbreitete systemische Autoimmunerkrankung, die klinisch mit symmetrischer entzündlicher Arthritis auftritt. Die Entzündung zielt hauptsächlich auf die Synovialmembran, den Knorpel und den Knochen ab, was zu Gewebezerstörung führt und in einer irreversiblen Gelenkdeformitätgipfelt 1. Die derzeitige pharmakologische Behandlung von RA basiert hauptsächlich auf krankheitsmodifizierenden antirheumatischen Medikamenten (DMARDs), die oft lebenslange Verabreichung erfordern. Diese therapeutischen Wirkstoffe sind jedoch mit verschiedenen Nebenwirkungen verbunden. Daher suchen viele Patienten sichere und wirksame komplementäre Therapien, um klinische Symptome zu lindern und möglicherweise ihre Abhängigkeit von konventionellen Medikamenten zu verringern. Als zentraler Bestandteil der traditionellen chinesischen Medizin könnte Moxibustion als vielversprechende ergänzende Therapie für RA dienen. Es übt seine therapeutischen Wirkungen durch systemische entzündungshemmende und immunmodulatorische Mechanismenaus 3. Belege deuten darauf hin, dass Moxibustion Symptome lindern und Gelenkstrukturen schützen kann4. Darüber hinaus bietet Moxibustion im Vergleich zur potenziellen hepatorenalen Toxizität, Infektionsrisiken und hohen Kosten im Zusammenhang mit DMARDs eine höhere Sicherheit und geringere Kosten. Moxibustion ist jedoch kein Allheilmittel und kann DMARDs bei der Behandlung von RA nicht vollständig ersetzen. Moxibustion erfordert typischerweise wiederholte, langfristige Behandlungssitzungen, um seine Wirkung zu erzielen. Während akuter Verschlechterungen der RA bietet sie möglicherweise keine schnelle Symptomkontrolle. Darüber hinaus hängt das therapeutische Ergebnis von Moxibustion stark von den Fähigkeiten und Erfahrungen des Praktikers ab, was zu Variabilität führt. Daher sollte die Integration von Moxibustion mit DMARDs in Betracht gezogen werden, um einen synergetischen "erhöhte Wirksamkeit mit reduzierter Toxizität"-Effekt zu erzielen, was sie zu einer tragfähigen Strategie für das langfristige Management von RA5 macht.

Obwohl zahlreiche Studien die therapeutische Wirksamkeit von Moxibustion bei RA 6,7,8 bestätigt haben, bleiben ihre genauen Wirkmechanismen unklar. Diese Studie untersucht die Auswirkungen von Moxibustion auf die Makrophagepolarisation und -Migration bei RA, wobei T-Zell-Immunglobulin und das mucin-domänenhaltige Protein 3 (TIM-3) als mechanistischen Einstiegspunkt verwendet werden. Dieser Ansatz soll einen möglichen immunmodulatorischen Weg aufklären, durch den Moxibustion seine antiarthritischen Effekte entfaltet.

Als zentrale Immunzellen spielen Makrophagen eine zentrale Rolle bei der Pathogenese und dem Fortschreiten von RA 9,10. Beim Beginn der Entzündung setzen Gewebe-residente Makrophagen eine Vielzahl von Zytokinen und Chemokinen frei. Diese Signalmoleküle wirken auf vaskuläre Endothelzellen, fördern die Differenzierung zirkulierender Monozyten zu Makrophagen und deren anschließende Rekrutierung in entzündetes Gewebe11,12. Diese infiltrierenden Makrophagen verstärken die Entzündungsreaktion weiter, indem sie zusätzliche Mediatoren produzieren, die wiederum weitere Makrophagen rekrutieren und die Gewebeinfiltration verstärken, wodurch ein Teufelskreis aus Entzündung und Gewebeinfiltration entsteht.

Je nach Umweltstimuli zeigen Makrophagen eine signifikante Plastizität, indem sie in unterschiedliche funktionelle Phänotypen polarisieren, hauptsächlich M1 (klassisch aktiviert) und M2 (alternativ aktiviert) Zustände13. Unter physiologischen Bedingungen hält die Makrophagenpolarisation ein dynamisches Gleichgewicht zwischen M1- und M2-Phänotypen aufrecht. Bei RA ist dieses Gleichgewicht jedoch gestört, gekennzeichnet durch eine verstärkte M1-Polarisation mit erhöhter Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren, darunter Interferon (IFN)-γ und induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS), die die Entzündungsreaktionen verstärken. Gleichzeitig wird die M2-Polarisation abgeschwächt, begleitet von einer verminderten Freisetzung entzündungshemmender Faktoren, darunter Interleukin (IL)-4 und CD206, was deren Fähigkeit zur Hemmung der T-Zell-Aktivierung und -Proliferation beeinträchtigt und so den Krankheitsverlauf14 verschärft. Eine Reihe von Untersuchungen hat gezeigt, dass die Modulation des M1/M2-Makrophagen-Gleichgewichts das Fortschreiten der RA15,16 abmildern kann.

TIM-3, identifiziert als T-Zell-Oberflächenglykoprotein, wird weit verbreitet auf einem Spektrum von Immunzellen exprimiert, darunter T-Zellen, Makrophagen und natürliche Killerzellen, wo es an spezifische Liganden bindet, um immunregulatorische Funktionen auszuüben17. Die TIM-3-Signalübertragung übt einen eindeutigen Einfluss auf die Expression und Polarisation von Zytokinen in den Makrophagen aus. Bemerkenswert ist, dass TIM-3 bei M2-Makrophagen hoch exprimiert wird, wo es den M2-Phänotyp fördert und den M1-Phänotyp unterdrückt. Umgekehrt zeigen Forschungen, dass die Hemmung von TIM-3 den gegenteiligen Effekt bewirkt, indem sie die M1-Polarisation voranführt und die M2-Polarisation 18,19,20 abschwächt. Darüber hinaus zeigen Beweise, dass TIM-3 ein wichtiger Regulator des Migrationsverhaltens von Makrophagenist 21,22. Daher zeigt eine therapeutische Intervention, die auf TIM-3 abzielt, um die Makrophagenpolarisation und Migrationsdynamik zu kontrollieren, großes Potenzial als RA-Behandlungsstrategie.

Basierend auf der oben genannten Begründung wurde diese Studie durchgeführt, um zum wachsenden Wissensstand über die Mechanismen beizutragen, durch die Moxibustion seine therapeutischen Wirkungen bei RA entfaltet.

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Protokoll

Ethische Aussage und Sicherheitsvorkehrungen
Alle Tierversuche wurden vom Ethikausschuss der Chengdu Universität für traditionelle chinesische Medizin (2024029) genehmigt. Während aller Injektionsverfahren, einschließlich der Verabreichung von CFA und Lentivirus, müssen die Bediener persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen, bestehend aus Einweghandschuhen, Schutzbrillen und Laborkitteln. Diese Verfahren müssen in einem Biosicherheitsschrank oder in einer gut belüfteten Umgebung durchgeführt werden. Alle Spitzen, die mit Reagenzien in Kontakt gekommen sind, müssen sofort in dafür vorgesehene Behälter entsorgt werden. Während der Moxibustion-Behandlung überwachte der Bediener die Reaktion des Tieres genau. Der Moxa-Kegel wurde umgehend ersetzt, um thermische Schäden an der Haut zu verhindern. Darüber hinaus sollten brennbare Materialien vom brennenden Moxa ferngehalten werden, um Brandgefahren zu vermeiden.

1. Einführung des RA-Modells

Dreißig männliche SD-Ratten (Gewicht: 200 ± 20 g), sechs Wochen alt (Lizenznummer: SCXK 2020-030), wurden zufällig in fünf Gruppen (n = 6) eingeteilt: Kontrollgruppe, RA-Modellgruppe (RA-Gruppe), RA + Moxibustion-Behandlungsgruppe (Mox-Gruppe), RA + TIM-3 Lentivirus-Interferenzgruppe (RA + TIM-3-Gruppe) und RA + TIM-3 Lentivirus-Interferenz + Moxibustion-Behandlungsgruppe (RA + TIM-3– + Mox-Gruppe). Vor dem Experiment wurden die Ratten sieben Tage lang in einer kontrollierten Umgebung mit einer Temperatur von 22–24 °C, 20 % Luftfeuchtigkeit und einem natürlichen Licht-/Dunkelzyklus akklimatisiert, mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. Am 23. Tag des Experiments wurden weitere fünf drei Wochen alte männliche SD-Ratten von derselben Firma gekauft. Diese Ratten wurden fünf Tage lang unter identischen Wohnverhältnissen akklimatisiert, bevor sie zur PEM-Extraktion verwendet wurden. Ein schematisches Diagramm, das das experimentelle Verfahren zusammenfasst, sowie repräsentative Verfahrensfotos sind in Abbildung 1 dargestellt.

Am Tag 0 des Experiments wurden 0,5 mL/kg CFA in die Hinterpfotenpolster aller Ratten außer denen der Kontrollgruppe injiziert, um RA auszulösen. Die gleiche Menge Kochsalzlösung wurde bei Kontrollgruppenratten am selben Ort verabreicht. Die Pfotendicke wurde als Kriterium für die erfolgreiche Etablierung des RA-Modells23 verwendet.

2. Lentivirus-Injektion

Ratten in den Gruppen RA + TIM-3- und RA + TIM-3- + Mox erhielten am ersten Tag des Experiments eine Injektion von LV-Havcr2-RNAi (94435-1) in die Hinterpfotenpolster (3,5 × 107 TU/mL; 10 μL pro Pad). Alle anderen Ratten erhielten identische Injektionen von normaler Kochsalzlösung an derselben anatomischenStelle 24.

3. Moxibustion

Am siebten Tag des Experiments erhielten die Ratten in den Mox- und RA-+ + TIM-3- + Mox-Gruppen eine Moxibustion-Behandlung. Zur Erleichterung des Eingriffs wurde das Haar in einem Bereich von etwa 1 × 1 cm um die BL23- und ST36-Akupunkte rasiert (dieses Verfahren wurde auch bei Ratten in den übrigen Gruppen durchgeführt). Während der Moxibustion wurde jede Ratte vorsichtig an einem Holzblock befestigt, der etwas größer als ihre Körpergröße war, mit zwei elastischen Bändern, um die Behandlungsbereiche vollständig freizulegen (Ratten in anderen Gruppen wurden ähnlich gefesselt). Anschließend wurden an beiden Akupunkten kornförmige Moxa-Kegel angebracht. Um eine konsistente Wärmestimulation bei den Individuen zu gewährleisten, wurde jeder Moxa-Kegel (Durchmesser: 2 mm; Höhe: 5 mm; Moxa-Wollegehalt: 60 %) aus einem standardisierten 5-mg-Anteil Moxawolle hergestellt. Jeden Tag wurden fünf Zapfen an den beiden Akupunktpunkten auf einer Körperseite angebracht, wobei die Behandlung am folgenden Tag zur kontralateralen Seite wechselte. Dieses abwechselnde Behandlungsprotokoll wurde drei Wochen lang beibehalten, mit einer eintägigen Ruhezeit alle siebten Tage.

Nach drei Zyklen Moxibustion-Behandlung wurden die Ratten mit Isofluran (4 % Induktion, 2 % Erhaltung, Inhalation) betäubt, und 5 ml arterielles Blut wurden aus der Bauchaorta entnommen. Nach der Zentrifugation (2.000 × g, 15 min, 4 °C) wurde das Überlagerungsserum in Mikrozentrifugenröhren übertragen und bei −20 °C gelagert. Nach der Blutentnahme wurden die Ratten durch eine zervikale Verrenkung eingeschläfert. Die Knöchelgelenke wurden sorgfältig seziert und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Synovialgewebe und Milzen wurden schnell mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei −80 °C gelagert.

4. Messung der Rattenpfotendicke

Die Mittelpunkte der Hinterpfoten der Ratten waren mit einem wasserdichten Marker markiert, um eine gleichmäßige Messposition zu gewährleisten. Die Pfotendicke wurde vor der Modellierung, nach erfolgreicher Modellierung und zwischen den einzelnen Behandlungsphasen (an den Tagen 0, 7, 14, 21 und 28) mit Vernier-Schiebern gemessen.

5. Histologische Analyse

Nach der Fixierung in 4 % Paraformaldehyd wurden die Knöchelgelenke der Ratten in Zentrifugenröhren mit einem großen Volumen Entkalkungslösung (10 % Ameisensäure) eingesetzt. Die Röhren wurden auf einem Shaker montiert und bei Raumtemperatur 30 Stunden lang sanft bewegt. In dieser Zeit wurde die Entkalkungslösung regelmäßig ersetzt und der Gewebezustand überwacht, um eine Überkalkung zu verhindern. Anschließend wurden die Gewebe in eine 5%ige Natriumthiosulfatlösung zur Neutralisierung über 6 Stunden übertragen, gefolgt von einer gründlichen 4-stündigen Spülung unter laufendem Leitungswasser25. Das Gewebe wurde dann dehydriert und in Paraffinblöcke eingebettet. Querschnitte wurden quer mit einer Dicke von 5 μm geschnitten. Nach der Deparaffinisierung und Flüssigkeitszufuhr wurden die Abschnitte 3 Minuten lang mit Hämatoxylin gefärbt, mit Wasser abgespült, kurz differenziert (5 S), erneut abgespült und 5 Sekunden lang gebräutet, gefolgt von einer gründlichen Spülung unter laufendem Leitungswasser. Anschließend wurden die Schnitte 1 Minute lang mit 95 % Ethanol dehydriert und 15 Sekunden lang mit Eosin gekontert. Abschließend wurden die Abschnitte dehydriert, geräumt und mit einem Deckdeckel zur Beobachtung unter einem Lichtmikroskop montiert. Bei dieser Färbung erschienen die Kerne blau, während Zytoplasma, Kollagenfasern und rote Blutkörperchen in verschiedenen Rosatönen sichtbar wurden; Die keratinisierte Schicht war typischerweise leuchtend rot gefärbt.

6. ELISA

Nach dem Protokoll des Herstellers wurde von jeder Serumprobe ein 100 μL Aliquot (vorverdünnt 1:2) zu den vorgesehenen Bohrlöchern hinzugefügt. Blank- und Standardbohrungen wurden parallel eingebaut. Nach dem Versiegeln wurde die Platte 90 Minuten bei 37 °C inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde der Nachweisantikörper hinzugefügt und bei 37 °C für 60 Minuten inkubiert. Nach einer weiteren Wäsche wurde Streptavidin–HRP-Konjugat hinzugefügt. Nach gründlichem Waschen wurde die Substratlösung zur Farbentwicklung hinzugefügt, die jedoch durch die Zugabe der Stoplösung gestoppt wurde. Die Absorption wurde mit 450 nm (OD₄₅₀) gemessen. Die Probenkonzentrationen von IL-4 und IFN-γ wurden durch Interpolation aus der Standardkurve bestimmt, und die Endkonzentrationen wurden durch Multiplikation mit dem jeweiligen Verdünnungsfaktor berechnet.

7. qRT-PCR

Die Gesamt-RNA wurde aus Serumproben mit TRIzol-Reagenz nach einem modifizierten Protokoll extrahiert. Kurz gesagt: 100 μL Serum wurden durch intensives Pipetieren mit 1 ml TRIzol-Reagenz homogenisiert. Anschließend wurden 100 μL Chloroform hinzugefügt, und die Mischung wurde 15 s lang kräftig geschüttelt, gefolgt von einer 3-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur. Die Probe wurde anschließend bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, um eine Phasentrennung zu erreichen. Die obere wässrige Phase wurde vorsichtig in ein neues Rohr übertragen, mit 0,5 ml Isopropanol gemischt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Gesamt-RNA durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C pelletiert. Das resultierende RNA-Pellet wurde einmal mit 1 ml 75 % Ethanol (Zentrifugation bei 8.000 × g für 5 Minuten bei 4 °C) gewaschen und vor der endgültigen Auflösung an der Luft getrocknet. Die erhaltene RNA wurde mit einem cDNA-Synthesekit reverse-Transkriptionen durchgeführt. Die Genexpressionsanalyse wurde durch qRT-PCR mit Echtzeit-quantitativer PCR-Systemsoftware durchgeführt. β-Actin wurde als Haushaltsgen für die Normalisierung verwendet. Die relative Expression von TIM-3-mRNA wurde mit der 2−ΔΔCt-Methode berechnet. Die Details der Primer sind in Tabelle 1 hinzugefügt.

8. Westlicher Blot

Die extrahierte Milz wurde dreimal mit vorgekühltem, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, in kleine Stücke geschnitten und durch Zugabe eines Lysispuffers mit einem Volumen von zehnmal größerem Gewebe lysiert. Die Homogenisierung erfolgte mit einem Homogenisierrohr. Das Homogenat wurde für 30 Minuten zur Lyse auf Eis gelegt, mit fünf bis sechs Vortex-Runden, um eine vollständige Gewebestörung sicherzustellen. Die Proben wurden bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, und der Supernatant wurde als Gesamtproteinextrakt gesammelt. Die Zielproteinkonzentrationen wurden mit dem Bicinchoninsäure-(BCA)-Test gemäß dem Kit-Protokoll gemessen.

Nach der Trennung durch 10%ige Natriumdodecylsulfat–Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS–PAGE) wurden die extrahierten Proteinproben in eine Polyvinylidendifluoridmembran (PVDF) überführt. Die Membran wurde bei Zimmertemperatur 1 Stunde lang mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST) blockiert, ergänzt mit 5 % Magermilch, gefolgt von einer nächtlichen Inkubation bei 4 °C mit primären Antikörpern. Nach gründlicher Wäsche wurde die Membran mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten sekundären Antikörpern bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert. Abschließend wurden die Bilder mit einem chemilumineszenz-Bildgebungssystem aufgenommen und mit der ChemiScope-Analysesoftware auf Graustufenintensität analysiert. Details zu den primären und sekundären Antikörpern sind in Tabelle 1 aufgeführt.

9. Immunfluoreszenznachweis

Das extrahierte Synovialgewebe wurde in 4 % Paraformaldehyd eingetaucht, dehydriert und in Paraffin eingebettet, bevor es in 5 μm-dicke Scheiben aufgeschnitten wurde. Die Abschnitte wurden nacheinander in Xylol I, Xylen II und Xylen III (jeweils 10 Minuten) entwachst, gefolgt von drei Waschen mit absolutem Ethanol (jeweils 5 Minuten) und einer abschließenden Spülung mit destilliertem Wasser.

Nach der Antigengewinnung in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) wurden die Objektträger dreimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (jeweils 5 Minuten) mit sanfter Bewegung gewaschen. Die Abschnitte wurden anschließend durch Inkubation mit 3 % Rinderserumalbumin (BSA) für 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Nach der Blockierung wurden primäre Antikörper, darunter antiinduzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) (1:500) und Anti-CD206 (1:400), aufgetragen und bei 4 °C für 24 Stunden inkubiert.

Nach drei 5-minütigen PBS-Waschen wurden die Abschnitte 50 Minuten bei 37 °C im Dunkeln mit einem sekundären Antikörper (Cy3-konjugierte Ziegen-Antikaninchen-IgG, 1:300) inkubiert. Die nukleare Färbung erfolgte durch dreimaliges Waschen der Objektträger mit PBS (5 Minuten pro Wasch), gefolgt von einer Behandlung mit 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI)-Färbungslösung und 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln. Die Bilder wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.

10. PEM-Isolierung

Nach einer Euthanasie durch eine zervikale Verrenkung wurden die Ratten 10 Minuten lang mit 75 % Ethanol desinfiziert und in einen sterilen Biosicherheitsschrank gebracht. Die Bauchhaut wurde mit einer sterilen Schere eingeschnitten, gefolgt von einer intraperitonealen Injektion von 15 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einer Spritze. Der Bauch wurde sanft massiert, bevor die Peritonealflüssigkeit zurück in die Spritze aspiriert und in Zentrifugenröhren umgeleitet wurde, um Makrophagensuspensionen zu erhalten.

Die Zellsuspension wurde dreimal mit PBS gewaschen, bevor sie in Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) ausgesät wurde. Die Zellen wurden 24 Stunden lang in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ bei 37 °C kultiviert. Die nach dieser Inkubationszeit erhaltenen adhärenten Zellen wurden als Makrophagen identifiziert.

11. Transwell

Der Migrationstest wurde mit 24-Well-Platten durchgeführt. Nach 24 Stunden Serumverhungerung wurden 4 × 104 Makrophagen in 300 μL DMEM mit 1 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Antibiotika (50 U/mL Penicillin, 50 μg/mL Streptomycin) in die obere Kammer gegeben, während 700 μL DMEM mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika in die untere Kammer eingebracht wurden. Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit Serum aus verschiedenen Rattengruppen vorbehandelt. Anschließend wurden die Platten bei 37 °C in einer 5%igen CO₂-Umgebung für 24 Stunden inkubiert. Nach der kristallvioletten Färbung wurde die obere Kammer abgestrichen, um nicht migrierte Zellen zu entfernen. Wandernde Zellen wurden durch manuelles Zählen über vier zufällig ausgewählte Sichtfelder unter einem optischen Mikroskop quantifiziert.

12. Statistische Analyse

Statistische Analysen wurden mit SPSS Version 25.0 durchgeführt. Datensätze wurden zunächst auf Normalität und Homogenität der Varianzen getestet. Wenn diese parametrischen Annahmen erfüllt waren, wurden Intergruppenvergleiche mittels Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, gefolgt von der Least Significant Difference (LSD) Post-hoc-Analyse. Für Daten, die gegen diese Annahmen verstießen, wurde der nichtparametrische Kruskal–Wallis-Test angewendet, gefolgt von Mann–Whitney-U-Tests mit entsprechender Korrektur für Mehrfachvergleiche. Alle Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben, und P < 0,05 galt als statistisch signifikant.

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Ergebnisse

Datenverfügbarkeit
Die während der aktuellen Studie generierten Rohdaten sind im Figshare-Repository (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.31550197) verfügbar.

Artikuläre Pathologie und Pfotendicke bei Ratten nach Moxibustion-Behandlung
Ratten, die mit CFA injiziert wurden, entwickelten offensichtliche Pfotenschwellungen und Rötungen. Die Färbung von Hämatoxylin und Eosin ...

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Diskussion

Das aktuelle Management von RA basiert überwiegend auf DMARDs. Diese pharmakologischen Wirkstoffe sind jedoch oft kostspielig und mit nicht vernachlässigbaren Nebenwirkungen verbunden, darunter hepatorenale Beeinträchtigungen und schwere Infektionen2, was eine erhebliche Belastung für Einzelpersonen und Gesundheitssysteme darstellt. Im Gegensatz dazu zeigt Moxibustion als äußere Behandlung ein günstiges Sicherheitsprofil mit minimalem gemeldetem Risiko systemische...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung Chinas (Zuschuss Nr. 82374587) und der Naturwissenschaftlichen Stiftung der Provinz Sichuan (Zuschuss Nr. 2024NSFSC2113) unterstützt. Wir danken der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine für die Bereitstellung von Laboreinrichtungen und technischer Unterstützung. Besonderer Dank gilt der Akupunktur- und Tuina-Schule für ihre Anleitung bei den Moxibustion-Protokollen. Wir danken auch das Tierpflegeteam für seine Unterstützung bei der Pflege der Rattenmodelle. Abschließend danken wir allen Kollegen, die zu den histologischen und molekularen Analysen beigetragen haben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Vollständiger Freund' s Adjuvant (CFA)Sigma-AldrichF5881Verwendet zur Auslösung des rheumatoiden Arthritis-(RA)-Modells bei Ratten
Lentivirus (TIM-3 RNAi)GenChem Biotechnologie, Shanghai3.5 & Mal; 107 TU/mLVerwendet zur Stilllegung der TIM-3-Genexpression
Moxa-Zapfen (Weizengröße)Anbieter traditioneller chinesischer MedizinN/AVerwendet für Moxibustion an den Akupunkten BL23 und ST36

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