Isolierung und Charakterisierung exosomangereicherter extrazellulärer Vesikel aus Dengue-Virus-Typ-2-infizierten Säugetierzellen

Summary

Hier beschreiben wir die Isolierung exosomangereicherter extrazellulärer Vesikel aus dem Dengue-Virus-Typ-2-infizierten Zellkultur-Supernatant, gefolgt von der Charakterisierung der Integrität und Größenverteilung der Vesikeln sowie der Bewertung des Fehlens eines nachweisbaren infektiösen Virus durch einen Plaque-Test unter definierten experimentellen Bedingungen.

Abstract

Exosom-angereicherte EVs sind Vesikel, die von verschiedenen Zelltypen in extrazelluläre Flüssigkeiten wie Plasma, Urin, Speichel, Zellkulturmedien und andere Körperflüssigkeiten freigesetzt werden. Ihre Durchmesser reichen von 30 nm bis 150 nm. Sie wurden an verschiedene zelluläre Prozesse beteiligt, darunter zelluläre Kommunikation und Immunmodulation während einer Infektion. Aufgrund dieser Effekte wurden sie verwendet, um die Pathogenese mehrerer Viren zu untersuchen. Es ist schwierig, exosomenangereicherte EVs aus virusinfizierten Zellsupernatanten mit aktuellen Reinigungstechniken zu isolieren. Dies liegt vor allem an der Überschneidung in der Größe zwischen bestimmten Viren und exosomenreichen EVs. Hier wollen wir exosomenreiche EVs aus dem Dengue-Typ-2-infizierten Zellkultur-Supernatant reinigen. Exosom-angereicherte Elektrofahrzeuge wurden mit einem kommerziellen Exosomen-Isolationskit isoliert. Für die isolierten exosomenreichen EVs in diesem Protokoll wurde kein infektiöses Virus durch den Plaque-Test unter den getesteten Bedingungen nachgewiesen. Die gereinigten, exosomangereicherten EVs wurden mittels Western Blotting für Tetraspanine, Nanopartikel-Tracking-Analyse und Transmissionselektronenmikroskopie zur Größenbestätigung charakterisiert. Wir haben gezeigt, dass unsere exosomenangereicherten EVs intakt sind und sich im normalen Exosomendurchmesserbereich von 30–150 nm befinden. Insgesamt bietet unser Protokoll eine kostengünstige Methode zur Reinigung exosomangereicherter EVs aus virusinfizierten Zellkultur-Supernatanten, die für nachgelagerte funktionelle Assays verwendet werden können.

Introduction

Exosom-angereicherte EVs sind nanogroße Vesikel, die von jeder Zelle im Körper freigesetzt werden. Sie sind Untertypen extrazellulärer Vesikel (EVs) endozytischer Herkunft. Exosom-angereicherte EVs wurden erstmals in Retikulozytenkulturmedien¹ entdeckt. In den letzten Jahrzehnten wurden exosomangereicherte EVs aus verschiedenen Körperflüssigkeiten gereinigt, darunter Blut, Urin, Speichel, Muttermilch, Samenflüssigkeiten und Fruchtwasser 2,3,4,5. Sie haben einen Durchmesser von 30 nm bis 150 nm⁶. Ihre Freisetzung in das extrazelluläre Kompartiment erfolgt durch die Fusion von mehrvesikularen Körpern (MVBs) mit der Zellplasmamembran. Im Zusammenhang mit Infektionen und Immunreaktionen ist bekannt, dass exosomangereicherte EVs eine spezifische Reaktion in Säugetierzellen hervorrufen. Solche Reaktionen umfassen die Freisetzung von Zytokinen oder Veränderungen der Anfälligkeit für Infektionen ^7,8,9.

Der Gehalt exosom-angereicherter EVs wird von mehreren Faktoren beeinflusst, vor allem vom Typ und Zustand der Zelle, die sie produziert.^10,11. Außerdem bestimmt ihr Inhalt auch die Auswirkungen auf naive Empfängerzellen. Derzeit werden verschiedene Methoden verwendet, um exosomangereicherte Elektrofahrzeuge aus biologischen Flüssigkeiten zu isolieren. Gängige Methoden sind differentielle Ultrazentrifugation, Präzipitation, Immunaffinitätserfassung, Größenausschlusschromatographie, magnetbasierte Isolation und mikrofluidische basierte Isolation.

Die differentielle Ultrazentrifugation gilt als eine der am häufigsten genutzten^Techniken 12,13,14. Die Ultrazentrifugen-Reinigungsmethode ist teuer und erfordert erhebliche technische Kompetenz. Diese Methode führt auch zu einem erheblichen Verlust von Elektrofahrzeugen aufgrund mehrerer Ultrazentrifugationsschritte. Schließlich sind die resultierenden exosomangereicherten EVs aufgrund ihrer ähnlichen phänotypischen Eigenschaften nicht frei von aktiven Viruspartikeln. Dies hat die Reinigung von exosomenreichen EVs aus virusinfizierten Zellsupernatanten erschwert. Daher ist es wichtig, ein optimiertes Protokoll zu entwickeln, um die Dengue-Virus-(DENV)-Werte in der exosomenreichen EV-Lösung effektiv auf nicht nachweisbare Werte zu reduzieren, da Viren ähnliche Größen und Dichten wie^{Exosomen 15,16} aufweisen.

Im Vergleich zu anderen häufig verwendeten Techniken bietet dieses Protokoll mehrere Vorteile, darunter eine verkürzte Reinigungszeit, die Abhängigkeit von kostengünstigen und weit zugänglichen Laborgeräten sowie die Möglichkeit, exosomenangereicherte Elektrofahrzeuge ohne nachweisbare lebende Viruskontamination zu isolieren. Darüber hinaus erfordern Methoden wie Dichtegradientenzentrifugation und magnetbasierte Isolierung zwar Vorteile wie erhöhten Ertrag und höhere Reinheit, aber diese Ansätze erfordern einen anfänglichen Ultrazentrifugationsschritt. Ziel dieses Artikels ist es, eine Methode zur Isolierung exosom-angereicherter EVs aus infizierten Supernatanten ohne nachweisbares Infektionsvirus mittels Plaque-Assay unter den getesteten Bedingungen vorzustellen.

Protocol

1. Vorbereitung exosomenfreier Medien

1. Befestigen Sie einen 0,1-μm-Filter an der Empfängerbasis im Klasse-II-Biosicherheitsschrank (BSC).
2. Aseptisch das hitzeinaktivierte fetale Rinderserum (FBS) auf den Filter geben und es an die Vakuumpumpe im BSC anschließen.
3. Wiederhole Schritt 1.2 mit dem Durchfluss noch zweimal.
4. Bereiten Sie komplettes Medium vor, das 10 % des dreifach gefilterten FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % L-Glutamin enthält.
   HINWEIS: Die Dreifachfiltrationsmethode wird verwendet, um die Notwendigkeit von Instrumenten wie einer Ultrazentrifuge zu vermeiden.

2. Dengue-Virus-Infektion von Säugetierzellen

1. Vero-Zellen über Nacht in einem T75 cm 2-Kulturkolben in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 %_CO2 wachsen lassen.
2. Am folgenden Tag prüfen Sie, ob die Zelle zwischen 70 % und 80 % konfluent ist, infizieren Sie die Zellen mit 0,1 Multiplizität der Infektion (MOI) DENV-2 in 5 ml Vollmedium und inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO2_{für 2} Stunden.
3. Nach 2 Stunden entferne ich das Supernatant und wasche die Flasche dreimal mit steriler Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS).
4. Gib 50 ml vollständiges Medium in den Kolben und inkubiere bei 37 °C mit 5 % CO2_{für 4} Tage (kurz bevor zytopathische Effekte beobachtet werden).

3. Kit-basierte Exosomenreinigung

1. Übertragen Sie das Zellkulturmedium aus dem Kolben in ein 50-mL konisches Rohr und zentrifugieren Sie bei 200 × g für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
2. Übertragen Sie das Medium in ein neues konisches Rohr. Fügen Sie 125 μL EV-Niederschlagsreagenz hinzu, gefolgt von 600 μL des Harz. Wirbel 10 Sekunden lang und lass ihn 10 Minuten im BSC bei Raumtemperatur stehen.
3. Vortex weitere 10 Sekunden und Zentrifuge bei etwa 450 × g für 2 Minuten bei Raumtemperatur. Übertragen auf den BSC, entsorgen Sie das Supernatant und übertragen Sie 600 μL Resuspensionspuffer auf das Pellet.
4. Vortex für 10 Sekunden und 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
5. Wirbel weitere 10 Sekunden und Zentrifuge bei etwa 25 × g für 2 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Übertrage den Supernatant in eine Filter-Spin-Säule und zentrifugiere bei etwa 4.500 × g für 1 Minute bei Raumtemperatur. Sammeln Sie den Durchfluss mit intakten, exosomenangereicherten Elektrofahrzeugen auf und lagern Sie ihn bei -80 °C, bis er einsatzbereit ist.
7. Bestätigen Sie, dass das exosomenreiche EV frei von lebendem Virus ist, indem Sie einen Plaque-Assay¹⁷ durchführen.
8. Charakterisierung des exosomangereicherten EV mittels Elektronenmikroskopie für die Größe und der Nanopartikelverfolgung für Größenverteilung und Konzentration¹⁸.

4. Charakterisierung des exosom-angereicherten EV durch Western Blot

1. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration des exosomangereicherten EV mit Assays wie BCA.
2. Mische gleiche Mengen exosom-angereicherter EV-Lösung und RIPA-Puffer und füge 4x LDS-Ladepuffer hinzu (4:1).
3. Trenne exosomangereicherte EV-Proteine mit einem 4-12%igen Bis-Tris-Gel.
4. Übertragen Sie die Proteine auf eine Nitrocellulosemembran.
5. Blocke 1 Stunde lang mit 5 % fettarmer Milch, gelöst in 1x Essel-Tween-Puffer bei Zimmertemperatur.
6. Verdünnen Sie die primären Antikörper mit 5 % fettfreier Trockenmilch auf eine Verdünnung von 1:1.1000 und untersuchen Sie die Membran über Nacht auf Exosomenproteine wie CD63 und CD9 bei 4 °C.
7. Entferne den primären Antikörper und wasche 5 x 5 Minuten mit 1x TBS-Tween Puffer auf einem Rocker.
8. Verdünnen Sie den sekundären Antikörper (Anti-Rabbit IgG HRP) mit fettarmer Trockenmilch auf eine Verdünnung von 1:5.000 und inkubieren Sie die Membran mit dieser Lösung 1 Stunde bei Zimmertemperatur.
9. Entferne den sekundären Antikörper und wasche 5 x 5 Minuten mit 1x TBS-Tween Puffer auf einem Rocker.
10. Entwickeln Sie die Membran mit dem ECL-Detektionsreagenz und detektieren Sie Proteinsignale mit dem chemilumineszenzbildenden Gerät.

5. Charakterisierung exosomangereicherter EVs mittels Transmissionselektronenmikroskopie

1. Fügen Sie 5 μL Exosomenproben zu den 200-Mesh-Kupfergittern mit Formvar und Kohlenstoffbeschichtung hinzu und lassen Sie sie bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
2. Färbe das Gitter mit 1 % wässrigem Uranylacetat für 60 Sekunden und trockne es an der Luft.
3. Nehmen Sie das Bild mit dem TEM bei 80 kV¹⁸ auf.

Results

Wir analysierten das isolierte, exosomangereicherte EV, wie im Protokoll beschrieben, mit einem Plaque-Assay, um festzustellen, ob wir aktive DENV-2-Partikel in der Mischung nachweisen konnten. Wie in Abbildung 1 dargestellt, wurden unter den getesteten Bedingungen im Vergleich zur positiven Kontrolle keine Plaques festgestellt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das infektiöse Virus unter der Nachweisgrenze des Plaque-...

Discussion

Jüngste Fortschritte in der Infektionskrankheitenforschung haben gezeigt, dass exosomangereicherte EVs, die aus virusinfizierten naiven Zellen freigesetzt werden, eine entscheidende Rolle bei der Modulation der^Immunantwort des Wirts ^spielen. Die exosom-angereicherten EVs können entweder die Immunabwehr durch die Förderung einer angemessenen antiviralen Reaktion stärken oder umgekehrt die virale ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Kaninchen-IgG-HRP-gebundener Antikörper	Zellsignalübertragung	7074S	Sekundärer Antikörper
CD63	Zellsignalübertragung	52090S	Primärer Antikörper
CD9	Zellsignalübertragung	13174S	Primärer Antikörper
Exosom-Reinigungskit für Zellkulturmedien	Norgen	60600	Exosomen-Reinigungskit
Dengue-Virus 2	ATCC	VR-1584	Virus
DMEM	Fisher Scientific	11-995-073	Kulturmedien
EMEM	ATCC	30-2003	Kulturmedien
FEI Talos F200X Transmissionselektronenmikroskop	Thermofisher Scientific
Fetales Rinder-Eerum	Neuromik	FBS002	Medienbeilage
Nanopartikel-Tracking-Analysator	Teilchenmetrix
Vero-Zellen	ATCC	CCL-81	Säugetierzelllinie