Method Article

Protokoll für Einzelzell-Dissoziation, RNA-Sequenzierung und Isolierung von Myoepithelzellen und Fibroblasten aus den gealterten Lacrimal- und Speicheldrüsen

DOI:

10.3791/70441

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April 24th, 2026

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1Department of Molecular and Cellular Biology, Scripps Research Institute

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Dissoziation alter Maus-Tränendrüsen, um lebensfähige Einzelzellen für die Sequenzierung einzelner RNA zu erhalten. Sequentielle enzymatische Verdauung und sanfte Handhabung erhalten die Zellintegrität und liefern hochwertige Suspensionen, die für zelltypspezifische Isolation und transkriptomische Analyse altersassoziierter Veränderungen in Tränendrüsenpopulationen geeignet sind.

Abstract

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Die Alterung der Tränendrüse (LG) ist mit einer verminderten Tränensekretion und chronischer Entzündung verbunden, was zu trockenen Augen beiträgt. Altersbedingte LG-Veränderungen umfassen Immunzellinfiltration, Zellschädigung, Lipidansammlung in Acinarzellen, extrazelluläre Matrixablagerung und Duktaldilatation. Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bietet einen leistungsstarken Ansatz zur Profilierung zellulärer Heterogenität und transkriptioneller Veränderungen während des Alterns; die Herstellung lebensfähiger Einzelzellsuspensionen aus gealtertem LG-Gewebe ist jedoch technisch schwierig aufgrund erhöhter Fibrose, zellulärer Fragilität und Lipidansammlung. Diese Studie präsentiert ein optimiertes, reproduzierbares Protokoll für die effiziente Dissoziation alter Maus-LGs und die Isolierung mehrerer Zelltypen, geeignet für nachgelagerte scRNA-seq-Analysen. Wichtig ist, dass dieses Protokoll auch auf junge Tränendrüsen, Bindehautgewebe und andere exokrine Gewebe anwendbar ist. Der Arbeitsablauf verwendet eine schrittweise enzymatische Dissoziationsstrategie mit Kollagenase IV, Dispase II und DNase I für die anfängliche Gewebeverdauung, gefolgt von Accutase zur Dissoziation der verbleibenden Zellcluster und einer abschließenden DNase-I-Behandlung zur Erlangung einer sauberen Einzelzellsuspension. Um Zellschäden zu minimieren, wird alle Kunststoffwaren mit PBS vorbeschichtet, das Rinderserumalbumin enthält, und die Gewebeverarbeitung erfolgt unter kontrollierten Temperatur- und Bewegungsbedingungen. Die Lyse der roten Blutkörperchen und sequentielle Filtration durch mehrere Siebe verbessern die Zellreinheit zusätzlich. Eine zelltypspezifische Isolierung wird durch Reporter-Mauslinien in Kombination mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) erreicht. Mit Acta2-GFP- und Pdgfra-EGFP-Mäusen isolierten wir erfolgreich Myoepithelzellen bzw. Fibroblasten nach einer Immunfärbung mit einem EpCAM-Antikörper. FACS ermöglichte die Trennung der EpCAM⁺/αSMA⁺-Myoepithelpopulation, während EGFP⁺-Zellen aus Pdgfra-EGFP-Mäusen die Fibroblastenpopulation repräsentierten. Dieses Protokoll liefert hochwertige, lebensfähige Einzelzell-Suspensionen aus gealterten LGs und kann leicht an andere fibrotische oder alternde exokrine Gewebe angepasst werden, die eine sanfte Dissoziation und gezielte Zellisolation erfordern.

Introduction

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Die Tränendrüse (LG) ist eine exokrine Tubuloacinardrüse, die für die Absonderung der wässrigen Schicht des Tränenfilms verantwortlich ist. Im Laufe ihres Lebens sind die Hornhautinoberfläche und das LG bakteriellen und viralen Infektionen ausgesetzt, was zu systemischer Störung der Epithelzellen, der Auslösung chronischer Entzündungsreaktionen, der Infiltration von Immunzellen in den LG und einem Mangel an Regeneration führen kann. Altern geht mit einer erhöhten Häufigkeit chronischer entzündlicher Erkrankungeneinher 1. Unter diesen ist die Trockene-Augen-Erkrankung (DED) eine der zehn häufigsten Ursachen für Sehbeeinträchtigungen weltweit und trägt maßgeblich zu verminderter Unabhängigkeit, Mobilität und alltäglicher Funktionsfähigkeit in älteren Bevölkerungenbei. Eine Hauptursache für DED ist LG-Dysfunktion3.

Mit fortschreitendem Alter durchlaufen Maus und menschliches LG ausgeprägte strukturelle und funktionelle Veränderungen, darunter Akinarzellatrophie, duktale Dilatation, Immunzellinfiltration, Fibrose und Lipidablagerung 4,5,6,7. Diese degenerativen Veränderungen gehen auch mit chronischer Entzündung des LG und Gewebefibrose 3,5,8,9 einher. Trotz der klaren Verbindung zwischen Alterung und LG-Pathologie sind die molekularen und zellulären Mechanismen, die diese Veränderungen antreiben, weiterhin schlecht verstanden.

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung ermöglicht eine umfassende Profilierung von Zellpopulationen und deren transkriptionellen Veränderungen im Alter von10 Jahren. Dieser Ansatz ermöglicht eine unvoreingenommene Identifizierung unterschiedlicher Zelltypen und Zustände innerhalb der Tränendrüse und zeigt auf, wie das Altern Genexpressionsprofile, die Infiltration von Immunzellen und epithelial-mesenchymale Interaktionen verändert.

Derzeit stehen zahlreiche Gewebedissoziationsmethoden zur Verfügung, darunter mechanische Dissoziationsmethoden11 und Protokolle mit warmer enzymatischer Verdauung bei 37 °C und Enzymen wie Kollagenase, Dispase oder Trypsin12. Verschiedene Dissoziationsstrategien wurden für eine Vielzahl von Geweben beschrieben, darunter Leber-, Lungen-, Nieren-, Herz- und mehrere Tumortypen 13,14,15. Die Herstellung lebensfähiger Einzelzell-Suspensionen aus gealtertem Tränendrüsengewebe bleibt jedoch technisch schwierig aufgrund erhöhter Fibrose und zellulärer Fragilität. Außerdem kann, wie bereits berichtet, die Wiederherstellung fragiler Acinarzellen herausfordernd sein, da dissoziationsassoziierte Veränderungen der Membranpermeabilität die RNA-Freisetzung aus diesen großen, sekretorischen Zellen erhöhen können, was zum Hintergrundsignal in nachgelagerten Einzelzelldatensätzenbeiträgt 16. Obwohl mehrere Studien scRNA-seq-Atlanten alternder Tränendrüsen berichtet haben, wurde die Qualität dieser Datensätze durch suboptimale Dissoziationsmethoden begrenzt, was zu einer geringeren Ausbeute von Epithelzellen als von stromalen Populationen führt. Hier präsentieren wir ein detailliertes, optimiertes Protokoll zur effizienten Dissoziation gealterter Maus-LG und zur Isolierung unterschiedlicher Zellpopulationen für nachgelagerte scRNA-seq- und Bulk-RNA-seq-Analysen (Abbildung 1). Dieser Ansatz bietet ein leistungsstarkes Werkzeug, um die molekularen Mechanismen der altersbedingten Tränendrüsendysfunktion zu untersuchen.

Das Protokoll ermöglicht die Erzeugung hochwertiger, lebensfähiger Einzelzell-Suspensionen aus gealterten Tränendrüsen und bietet eine verlässliche Grundlage für umfassende transkriptomische Analysen. Es ermöglicht eine detaillierte Identifizierung und molekulare Charakterisierung verschiedener Zellpopulationen, darunter Myoepithelzellen, Fibroblasten und andere epitheliale und stromale Zelltypen, die altersbedingte Veränderungen durchlaufen. Der optimierte Arbeitsablauf erhält die Zellintegrität und minimiert stressbedingte Transkriptionsartefakte, wodurch eine genaue Darstellung der zellulären Zustände in vivo gewährleistet wird. Darüber hinaus ist die Methodik breit anwendbar und kann auf andere exokrine Drüsen oder fibrotisches Gewebe angepasst werden, wo sanfte Gewebedissoziation und präzise Isolierung unterschiedlicher Zellpopulationen für nachgelagerte Einzelzellstudien entscheidend sind.

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Protocol

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Alle Tierversuche wurden gemäß den vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Scripps Research Institute genehmigten Protokollen durchgeführt (Protokoll Nr. 08-0123; genehmigt am 29. August 2023). Die Tierpflege am Scripps Research Institute ist von der Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International (AAALAC), akkreditiert. Die Mäuse wurden nach einem standardisierten 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkelzyklus gehalten, wobei Nahrung und Wasser ad libitum bereitgestellt wurden. Für Experimente wurden transgene Mauslinien von PdgfraEGFP und Acta2GFP verwendet. Die detaillierten Informationen zu Mauslinien finden sich im Abschnitt "Materialtabelle".

1. Allgemeine Überlegungen

  1. Befolgen Sie die universellen NIH-Vorsichtsmaßnahmen17 beim Umgang mit biologisch gefährlichen Materialien und tierischem Gewebe. Führen Sie alle Tierarbeiten gemäß den genehmigten IACUC-Protokollen und den festgelegten Tierbiosicherheitswerten durch.
  2. Befolgen Sie die üblichen Sicherheitspraktiken im Labor, indem Sie Mundpipettierungen vermeiden, den Einsatz von scharfen Gegenständen minimieren, einen biologischen Sicherheitsschrank für Aerosolbildung verwenden, geeignete PSA tragen, scharfe Gegenstände in punktfesten Behältern entsorgen und alle biologisch gefährlichen Abfälle vor der Entsorgung ordnungsgemäß kennzeichnen und dekontaminieren.
  3. Dekontaminieren Sie Arbeitsflächen und Geräte routinemäßig mit geeigneten Desinfektionsmitteln (z. B. 10%-Bleichmittel).
  4. Führen Sie alle Zentrifugationsschritte bei 4 °C in einer vorgekühlten gekühlten Zentrifuge durch, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten und temperaturbedingte Belastung zu minimieren.
  5. Optimieren Sie die Flusszytometer- und Zellsortiereinstellungen für die spezifische Instrumentenkonfiguration und passen Sie die Parameter für jedes Antikörper-Fluorophor-Konjugat mit geeigneten Kontrollproben an. Verwenden Sie dasselbe Zytometer und Sortierinstrument mit festen, optimierten Einstellungen während einer experimentellen Serie, um die Variabilität zu minimieren.
  6. Bereiten Sie ausgewählte Lösungen bis zu einem Tag im Voraus vor und lagern Sie sie bis zur Anwendung angemessen auf. Bereiten Sie alle Lösungen unter sterilen Bedingungen in einem Biosicherheitsschrank vor.
  7. Halten Sie Ca2+/Mg2+-haltige Lösungen getrennt von EDTA-haltigen Puffern, um Chelatbildung während enzymatischer Schritte zu verhindern. Alle für dieses Verfahren benötigten Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

2. Kunststoffwaren

  1. Unter sterilen Bedingungen sollten Sie Schalen, Tuben und Spritzen mit 1x PBS + 1 % BSA für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) vorbeschichten. Aspirieren und alles steril halten, bis Sie es verwenden.
  2. Pipettenspitzen vorbeschichten. Aspirieren und dosieren Sie 1x PBS + 1 % BSA dreimal mit jeder Spitze, um die Innenseite zu beschichten. Legen Sie die beschichteten Spitzen zurück in die sterile Spitzenbox und lassen Sie sie über Nacht in einem sterilen Inkubator trocknen. Verwenden Sie diese vorbeschichteten Spitzen am nächsten Tag während des Zellisolationsverfahrens.

3. Lösungen und Puffer

  1. DNase I Aktie (5 mg/mL)
    1. Bereiten Sie 150 mM NaCl aus dem 5M NaCl-Material vor und filtern Sie die Lösung steril.
    2. Fügen Sie 1 M CaCl₂ zur gefilterten 150 mM NaCl-Lösung hinzu, um eine Endkonzentration von 5 mM CaCl₂ zu erhalten.
    3. 100 mg DNase I in 20 ml 150 mM NaCl / 5 mM CaCl₂-Puffer resuspendieren, um eine 5 mg/mL DNase-I-Stocklösung zu erhalten.
    4. Bereiten Sie 500 μL Aliquots vor und lagern Sie sie bis zu 6 Monate bei −20 °C. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen, um einen Verlust der Enzymaktivität zu verhindern.
  2. Verdauungsmedium
    1. Am Tag vor dem Experiment bereite die Medium-Basismischung vor, indem du DMEM/F12 mit 0,5 % BSA mischst und filterst.
    2. Fügen Sie 1M HEPES und 1M CaCl₂ zum Basismedium DMEM/F12 / 0,5 % BSA hinzu, um Endkonzentrationen von 15 mM bzw. 3 mM zu erhalten.
    3. Fügen Sie alle folgenden Enzyme direkt vor der Anwendung hinzu: Kollagenase IV (1 mg/mL; 125 U/mL), Dispase II (2,5 mg/mL; 1,25 U/mL) und DNase I (20 U/mL; 0,05 mg/mL aus dem 5 mg/mL Lager).
  3. Blockmedium 1 (BM1)
    1. Fügen Sie 1M HEPES und 0,5M EDTA zu 1x HBSS hinzu, um die Endkonzentrationen von 15 mM bzw. 3 mM zu erhalten.
  4. Blockmedium 2 (BM2)
    1. Füge FBS und 1M HEPES zu DMEM/F12 hinzu, um Endkonzentrationen von 10 % bzw. 15 mM zu erhalten.
  5. Medium für die Behandlung von DNase
    1. Am Tag vor dem Experiment bereite das Basismedium vor, indem du 1x HBSS mit 0,5 % BSA mischst und filterst.
    2. Fügen Sie 1M HEPES, 1M CaCl₂ und 1M MgCl₂ dem Basismedium 1x HBSS / 0,5 % BSA hinzu, um die Endkonzentrationen von 10 mM, 1,5 mM bzw. 2 mM zu erhalten.
    3. Direkt vor der Anwendung wird DNase I (200 U/mL; 0,5 mg/mL aus dem 5 mg/mL Fond) in die zubereitete Mischung gegeben.
  6. Blockmedium 3 (BM3)
    1. Verwenden Sie dasselbe gefilterte Basenmedium 1x HBSS / 0,5 % BSA und fügen Sie 1M HEPES und 0,5M EDTA hinzu, um Endkonzentrationen von 10 mM bzw. 1 mM zu erhalten.
  7. Blocking Medium 4 (BM4)
    1. Verwenden Sie dasselbe gefilterte Basismedium 1x HBSS / 0,5 % BSA und fügen Sie 1M HEPES hinzu, um die Endkonzentration von 10 mM zu erhalten.
  8. FACS-Puffer
    1. Am Tag vor dem Experiment bereiten Sie das Basismedium vor, indem Sie 1x DPBS mit 0,5 % BSA mischen und filtern.
    2. Fügen Sie 1M HEPES und 0,5M EDTA zu 1x DPBS / 0,5 % BSA hinzu, um die Endkonzentrationen von 25 mM bzw. 1 mM zu erhalten.
  9. Medium für scRNAseq (MSC)
    1. Am Tag vor dem Experiment bereiten Sie das Medium vor, indem Sie 1x DPBS mit 0,4 % BSA mischen und filtern.

4. Gewebeentnahme und Mikrodissektion (~ 40 - 50 Min.)

  1. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran und euthanatieren Sie die Maus durch Zervikalluxation gemäß den institutionellen IACUC-Richtlinien.
  2. Verwenden Sie feine Pinzetten und Scheren, um die Haut zwischen Auge und Ohr einzuschneiden, und ziehen Sie sie vorsichtig zurück, um die Tränendrüse freizulegen.
  3. Um die Drüse zu isolieren, heben Sie sie leicht mit einer stumpf gespitzten Zange an und trennen Sie vorsichtig das umliegende Bindegewebe, indem Sie sie vorsichtig in einer kreisförmigen Bewegung wegziehen. Die Grenzen der Tränendrüse sind deutlich sichtbar, was eine einfache Trennung von benachbarten Geweben, einschließlich der Parotisdrüse, ermöglicht.
  4. Übertragen Sie die Tränendrüse (jede Drüse wiegt etwa 10–25 mg, abhängig von Mausgewicht, Geschlecht und Alter) in eine 35 mm Petrischale mit 2 ml kaltem 1x PBS auf Eis. Unter einem Seziermikroskop entfernen Sie das verbleibende Fett und ziehen Sie vorsichtig die Bindegewebekapsel mit zwei Pinzetten ab.
  5. Bestätigen Sie die Zellkennzeichnung, indem Sie ein kleines Gewebefragment unter einem Fluoreszenzmikroskop untersuchen und das erwartete Reporter- oder Fluoreszenzsignal überprüfen, bevor mit der enzymatischen Verdauung übergegangen wird.
  6. Legen Sie eine sterile 35-mm-Petrischale auf Eis und geben Sie 800-1000 μL kaltes 1x PBS (Volumen angepasst an die Drüsengröße) in die Mitte der Schale hin. Übertragen Sie eine tränendrüse in die 1x PBS.
  7. Mit zwei sterilen Skalpellen zerkleinern Sie die Drüse fein in kleine Fragmente, bis sie eine weiche, pastenartige Konsistenz erreicht hat. Stellen Sie sicher, dass die Gewebefragmente während des gesamten Hackvorgangs in PBS versunken bleiben, aber nicht frei über die Schüssel schwimmen.
  8. Sammeln Sie Gewebefragmente an einer Seite der Schüssel, aspirieren Sie Rest-PBS und waschen Sie die Fragmente mit 1 ml frisch-kaltem PBS.
  9. Transferiere gewaschene Gewebefragmente in eine 6-Well-Platte mit jeweils 2 ml pro Brunnen vorgewärmtes Verdauungsmediums. Lasse die Platte auf Eis, bis alle Proben verarbeitet sind.

5. Erste enzymatische Verdauung (~1,5 - 2 H)

  1. Inkubieren Sie den Teller in einem Schüttelwasserbad bei 37 °C, 60 U/min für 30 Minuten.
  2. Triturieren Sie das Gewebe vorsichtig 15 Mal mit einer breiten 1-mL-Spitze und legen Sie die Platte dann für weitere 30 Minuten zurück ins Schüttelwasserbad bei 37 °C, 60 U/min.
  3. Triturieren Sie die Probe vorsichtig 10 Mal mit einer normalen 1-mL-Spitze und legen Sie die Platte dann wieder in das Schüttelwasserbad bei 37 °C, 60 U/min für weitere 30 Minuten.
  4. Triturieren Sie die Probe vorsichtig 10 Mal und übertragen Sie die Zellsuspension in 2-mL Dolphin-Mikrozentrifugenröhren.
  5. Gib 1 ml kaltes BM1 zu jedem Brunnen der Platte, um das verbleibende Verdauungsmedium mit Restzellen aufzufangen. Lege die Platte bis zum nächsten Schritt auf Eis.
    HINWEIS: Wenn in diesem Stadium noch große Zellcluster oder Gewebefragmente beobachtet werden, verlängern Sie jeden Inkubationsschritt um weitere 10–20 Minuten. Überschreite nicht die angegebene Anzahl der Triturationsdurchgänge (maximal 10–15 sanfte Durchgänge), da zusätzlicher mechanischer Stress die Zelllebensfähigkeit beeinträchtigt.

6. Beendigung der enzymatischen Aktivität und Primärwäschen (~ 15 Min)

  1. Zentrifugiere die Röhren mit der Zellsuspension bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
  2. Entsorgen Sie das Supernatant. Übertragen Sie das BM1 aus jedem Brunnen der Anfangsplatte (mit Restzellen) in das entsprechende Rohr und lassen Sie die Zellpellets vorsichtig wieder suspendieren.
  3. Spülen Sie jeden Brunnen mit zusätzlichen 600 μL kaltem BM1 ab und kombinieren Sie das Wash mit dem entsprechenden Rohr, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln.
  4. Die Zellsuspension vorsichtig wieder aufhängen, erneut bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugieren und das Supernatant entsorgen.

7. Accutase- und DNase-Behandlung (~ 30 - 35 Min)

  1. Gib 1 ml Accutase zu den Zellpellets und suspendiere vorsichtig wieder. Inkubiere das Rohr nur 5–10 Minuten bei 37 °C und 60 U/min.
    HINWEIS: Legen Sie das Rohr während der Inkubation auf die Seite, um zu verhindern, dass sich die Zellen absetzen und am Boden kleben.
  2. Triturieren Sie vorsichtig 10 Mal mit einer 1-ml-Pipettenspitze.
  3. Fügen Sie 1 ml kaltes BM2 hinzu, um die enzymatische Reaktion durch Verdünnung der Accutase zu beenden.
  4. Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C und entsorge das Überwasser.
  5. Suspendiere die Zellen im Medium für die Behandlung mit DNase neu und fülle das Rohr bis nach oben.
  6. Inkubiere 10 Minuten bei RT und suspendiere nach 5 Minuten sanft wieder.
  7. Währenddessen wird ein 70-μm-Zellsieb mit 1 ml BM3 über einem 15 mL konischen Rohr vorbefeuchtet.
  8. Übertragen Sie die Zellsuspension auf das Sieb.
  9. Spüle das ursprüngliche Sammelrohr mit 1 ml BM3 ab und übertrage die Spülung auf dasselbe Sieb.
  10. Waschen Sie das Sieb mit zusätzlichen 5 ml BM3.

8. Zellzählung und Viabilitätsprüfung

  1. Nehmen Sie 10 μL der gefilterten Zellsuspension in BM3 und mischen Sie sie mit 10 μL Trypan Blue. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und -viabilität unter Verwendung des Trypan-Blue-Ausschlusses und quantifizieren Sie sie manuell oder mit einem automatisierten Zellzähler (z. B. Countess 3 Automated Cell Counter). Fahren Sie nur dann weiter, wenn die Viabilität die erforderliche Schwelle für nachgelagerte Anwendungen erfüllt (typischerweise ≥70–80%).
    HINWEIS: Berücksichtigen Sie bei der Berechnung des Sprengvolumens ~7–9 mL im 15-mL-Rohr.
  2. Fahren Sie gemäß der nachgelagerten Anwendung fort. Für scRNA-seq fahren Sie weiter zu Abschnitt 9. Für die Zellsortierung auf Flusszytometrie fahren Sie zu Abschnitt 10 fort.
    HINWEIS: Der ScRNA-Seq-Workflow umfasst die Lyse von Rotblasen und die Entfernung magnetischer toter Zellen, um Rückstände und Umgebungs-RNA zu reduzieren und die Datenqualität zu verbessern. Diese Schritte können jedoch die Zelltyprepräsentation verzerren, indem sie bevorzugt fragile oder seltene Epithelpopulationen, einschließlich Acinarzellen, betreffen. Für die Sortierung auf Flusszytometrie wurden diese Schritte weggelassen, um die Wiederherstellung zu maximieren und Zelloberflächen-Epitope zu erhalten. Die Auswahl des Arbeitsablaufs sollte daher von experimentellen Zielen geleitet werden, wobei die Datenqualität für scRNA-seq oder Zellwiederherstellung sowie die Viabilität für Sortierung und nachgelagerte Anwendungen priorisiert wird.

9. Vorbereitung von Zellen für scRNA-seq (~ 1 - 1,5 H)

  1. Bereite 1x RBC-Lösung vor, indem du 10x Lösung mit milliQ Wasser rekonstituierst.
  2. Zentrifugiere das 15-mL-Rohr mit der Zellsuspension bei 400 × g für 5 Minuten bei 4 °C und entsorge das Überlagerungsmittel.
  3. Das Zellpellet in 5 mL 1x Rotkörperpuffer wieder suspendieren und 5 Minuten bei RT inkubieren.
  4. Zentrifugieren Sie erneut bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C und entsorgen Sie den Übernaten.
  5. Das Zellpellet in 2 ml kaltem BM4 wieder suspendieren.
  6. Nehmen Sie 10 μL der gefilterten Zellsuspension in BM4 und mischen Sie sie mit 10 μL Trypan Blue, um die Zellkonzentration und Viabilität zu bewerten.
  7. Vorbefeuchten Sie das MACS-30-μm-Sieb mit 1 mL 1x HBSS und filtern Sie die Zellsuspension durch das Sieb in ein 15-mL-Rohr.
  8. Spüle das vorherige Sammelrohr mit 2 ml kaltem BM4 und führe das Spülmittel durch dasselbe Sieb in das 15-mL-Rohr.
  9. Wasche das Sieb mit zusätzlich 10 ml kaltem BM4.
  10. Zentrifugiere das 15-mL-Rohr bei 400 × g für 5 Minuten bei 4 °C und entferne das Supernatant vollständig.
  11. Das Pellet vorsichtig in 100 μL MACS-Mikroperlen wieder suspendieren und 15 Minuten bei RT inkubieren.
  12. Bereiten Sie in der Zwischenzeit 1x Bindungspuffer (BB) aus dem Dead Cell Removal Kit mit sterilem, doppelt destilliertem Wasser vor.
  13. Waschen Sie eine MACS MS-Säule mit 500 μL 1x BB zum Gleichgewicht.
  14. Fügen Sie der Probe 400 μL BB hinzu, suspendieren Sie die Zellen mit Mikroperlen wieder und legen Sie das gesamte Volumen auf die ausgeglichene MS-Säule. Sammeln Sie den Durchfluss in ein 15-mL-Rohr.
  15. Waschen Sie die Säule viermal mit jeweils 500 μL BB und sammeln Sie alle Durchflussfraktionen.
  16. Zentrifugieren Sie den gesammelten Durchfluss bei 400 × g für 5 Minuten bei 4 °C und entsorgen Sie den Überflussmittel.
  17. Die Zellen werden in 400 μL MSC-Puffer wieder suspendiert und die Suspension auf ein 1,5-mL-Rohr übertragen.
  18. Spüle das vorherige Rohr mit einem 700 μL MSC-Puffer ab und teile die Spülung mit der Probe.
  19. Zentrifugiere bei 400 × g für 5 Minuten bei 4 °C und entsorge das Überwasser.
  20. Das Zellpellet wird in einem MSC-Puffer mit einer breiten Bohrspitze bis zu einem Endvolumen von etwa 1,5 ml wieder suspendiert.
  21. Zentrifugieren Sie erneut bei 400 × g für 5 Minuten bei 4 °C und entsorgen Sie das Supernatantum.
  22. Lassen Sie ~100 μL Supernatant zurück, lassen Sie das Pellet vorsichtig wieder suspendieren und zählen Sie die Zellen erneut, indem Sie 6 μL-Zellen mit 6 μL Trypan Blue mischen.
  23. Stellen Sie das Endvolumen mit MSC-Puffer an, um 700–1200 Zellen/μL zu erreichen, und zählen Sie die Zellen erneut, um die Zellkonzentration zu bestätigen.
  24. Stellen Sie sicher, dass die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Rotkörperchen-Lyse und der Entfernung der toten Zellen ≥ 70 % (typischerweise 70–95 %) vor dem Laden für 10-fache Chrom-Verarbeitung (Chrom Single Cell 3' Solution V3) beträgt.
  25. Wenden Sie grundlegende ScRNA-seq-Qualitätskontrollkriterien an: nUMI > 500, nGene > 200 und mitochondriale Genfraktion <15 %. Verwenden Sie eine permissive mitochondriale Schwelle (15 %), um epitheliale Populationen mit höherer metabolischer Aktivität zu erhalten. Beziehen Sie in nachgelagerte Analysen nur Zellen ein, die alle QC-Kriterien erfüllen.
    HINWEIS: Diese QC-Schwellenwerte stellen Beispielwerte dar, die aus unseren Datensätzen abgeleitet wurden (ergänzende Abbildung 1) und in unserer vorherigen Publikation18 berichtet wurden.

10. Vorbereitung von Zellen für die flowzytometriebasierte Zellsortierung (~ 1 - 1,5 H)

  1. Für die flusszytometriebasierte Isolierung von MECs und Fibroblasten wurden PdgfraEGFP- bzw. Acta2-GFP-Reporter-Mauslinien verwendet, um eine präzise Identifikation jeder Population zu ermöglichen.
  2. Zentrifugiere das 15-ml-Rohr mit Zellsuspension bei 400 × g für 5 Minuten bei 4 °C und entsorge Supernatant.
  3. Das Zellpellet wird in einem kalten FACS-Puffer auf eine Endkonzentration von 5 x 10⁵ bis 2 x 106 Zellen pro 100 μL wieder suspendiert.
  4. Bereite die für die FACS-Kompensation erforderlichen Kontrollen vor: Negative Kontrolle – ungefärbte Zellen von einer Wildtyp-Maus, Hintergrund-Fluoreszenzkontrolle – ungefärbte Zellen vonActa2-GFP- und Pdgfra-EGFP-Mäusen, Einzelfärbungskontrolle – Zellen einer Wildtyp-Maus, einzeln gefärbt mit jedem im Experiment verwendeten Antikörper.
    HINWEIS: Für jede Kontrollprobe verwenden Sie mindestens 1 × 10⁵ Zellen, die in 100 μL FACS-Puffer resuspendiert sind.
  5. Füge FcBlock hinzu (1:100) und inkubiere 5 Minuten auf Eis.
  6. Fügen Sie CD326 (EpCAM)-APC monoklonalen Antikörper (1:100) oder CD140a (PDGFRα) monoklonalen Antikörper (1:100) hinzu. Inkubieren Sie 45 Minuten auf Eis, geschützt vor Licht.
  7. Lassen Sie die Zellen während der Antikörperinkubation alle 15 Minuten vorsichtig wieder suspendieren.
  8. Füllen Sie jedes Rohr bis zur Oberfläche mit einem kalten FACS-Puffer und zentrifugieren Sie bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
  9. Bereite FxCycle-Arbeitslösung (1:1000) im FACS-Puffer vor.
  10. Proben in 1 mL wieder suspendieren und in 500 μL kaltem FACS-Puffer mit FxCycle kontrolliert werden.
  11. Übertragen Sie alle Proben in FACS-Röhrchen und bewahren Sie sie auf Eis, geschützt vor Licht.
  12. Gehen Sie sofort zum Flow Cytometry Core zur Sortierung. Sammeln Sie die sortierten Zellen in FACS-Puffer, Kulturmedium, Lysepuffer oder RNAlater, je nach nachgelagerten Anwendungen.
    HINWEIS: Instrumenteneinstellungen (z. B. Düsengröße und Druck) und Ereignisraten hängen von der Sortierkonfiguration und der Zielzellpopulation ab; daher wird ein vorläufiger Pilotlauf empfohlen, um optimale Parameter für jedes Experiment zu bestimmen.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Dissoziation alter exokriner Drüsen ist aufgrund der Lipidansammlung und der umfangreichen ECM-Ablagerung schwierig. Gealterte Drüsen weisen eine ausgeprägte lymphozytäre Infiltration und eine ausgeprägte Ductaldilatation mit intraluminalem Material auf, was die strukturellen und entzündlichen Veränderungen widerspiegelt, die die Gewebedissoziation erschweren. Die Tränendrüse ist ein exokrines Organ, das aus drei Haupttypen der epithelialen Zellen besteht: azinären, duktalen und myoe...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier haben wir ein deutlich verbessertes Protokoll zur Erzeugung von Einzelzell-Suspensionen aus exokrinen Geweben optimiert und evaluiert, mit Fokus auf die Tränendrüse. Mit diesem Ansatz erzeugten wir saubere, hochwertige Einzelzell-Suspensionen sowohl aus alten als auch jungen LGs, die sich für Einzelzell-Sequenzierung und andere nachgelagerte Anwendungen eignen.

Trotz der Verfügbarkeit zahlreicher Gewebedissoziationsprotokolle war es notwendig, diese zu m...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Health, das National Eye Institute (NEI), USA, Fördermittel 5R01EY026202, R01EY035333; die Fördermittel des National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01DE031044, 2R01DE014756, sowie vom National Cancer Institute (NCI) 5R01CA271500 unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Material
BSA Sigma-AldrichA4919
CaCl2 (1  M-Lösung)BioVisionB1010-100
Kollagenase IVSigma-AldrichC5138
Kit zur Entfernung toter ZellenMiltenyi Biotec130-090-101
Kit zur Entfernung toter ZellenMiltenyi Biotec130-090-101
Dispase IIRocheC756V28
DNase ISigma-AldrichDN25-100MG
DPBS Gibco, Thermo Fisher Scientific14190-144
Fetales Rinderserum, ultraniedriges IgGGibco# 16250078
Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS)Corning (Thermo Fisher Scientific)21-022-CV
HEPES (1  M-Lösung)Sigma-AldrichH0887
Isofluran-LösungCovertus# 11695067772
MACS® SmartStrainers (30 & micro; m)Miltenyi Biotec130-098-458
MACS® SmartStrainers (70 & Micro; m)Miltenyi Biotec130-110-916
Mittel/F12 (DMEM/F12)MilliporeDF-042-B
MgCl2 1MSigma-AldrichM1028-100ML
MS-KolumnenMiltenyi Biotec130-042-201
NaCl (5M Aktie)Invitrogen™AM9759
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) TablettenSigma-AldrichP8920-500ML
Rote Blutkörperchen-Lyselösung (10 & mal;)Miltenyi Biotec130-094-183
StemPro Accutase Gibco, Thermo Fisher ScientificA1110501
Trypan Blaue Lösung, 0,4 %Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061
Ultra-reines EDTA (0,5 M, pH 8,0)Invitrogen15575020
Antikörper
CD140a (PDGFRA) monoklonaler Antikörper (APA5), APC-eFluor™ 780, Rat / IgG2a, KappaeBioscience47-1401-82; RRID:AB_2784706
FcBlock (CD16/CD32 Fc-Blocker)BD Biosciences 553141; RRID:AB_394656
FxCycle™ VeilchenfleckThermo Fisher ScientificF10347
Ratte CD326 (EpCAM)-APC monoklonaler Antikörper (G8.8), Ratte IgG2a, kappaeBioscience17-579182; RRID:AB_2716944
Mäuse
Acta2GFP  Ein freundliches Geschenk von Dr. Ivo KalajzicPMID: 18571490
PdgfraEGFP  - B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/JDas Jackson-LaborRRID:IMSR_JAX:007669
Ausrüstung
Invitrogen™   Gräfin & Handel; 3 Automatisierter ZellenzählerFisher ScientificA49862; RRID:SCR_026963

References

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