Effiziente Isolierung von fett-abgeleiteten Stammzellen und Adipozyten aus schweine-fetthaltigem Gewebe

Summary

Hier präsentieren wir eine Standardmethode zur effizienten Isolierung von fettabgeleiteten Stammzellen und Adipozyten, gekennzeichnet durch >90 % Verkürzung der Verarbeitungszeit, hohe Zelllebensfähigkeit und breite Kompatibilität.

Abstract

Fett-abgeleitete Stammzellen (ADSCs) haben sich aufgrund ihrer reichlich vorhandenen Quellen, minimalinvasiver Ernte, multilinealer Differenzierungspotenzial und immunmodulatorischer Eigenschaften als ideale Samenzellen in der regenerativen Medizin etabliert. Ihre Anwendungen umfassen Gewebereparatur, Krankheitsmodellierung und Zelltherapie; dennoch bleibt die effiziente Isolierung hoch-viabilitäts-ADSCs entscheidend für die Förderung von Forschung und klinischer Übersetzung. Konventionelle Isolationsmethoden, wie enzymatische Verdauung in Kombination mit mechanischer Dissoziation durch Pipettieren, sind durch lange Verarbeitungszeiten (1–3 Stunden), schlechte Zelllebensfähigkeit (oft <70 %) und erhebliche Variabilität von Charge zu Charge begrenzt, was nachgelagerte Experimente beeinträchtigt.

Hier stellen wir das SoniConvert-System vor (ein mechanisch-wellenbasiertes Zelltrennsystem), das mechanische Wellen- und enzymatische Verdauung kombiniert, um diese Herausforderungen zu bewältigen. Das System integriert eine mikroprozessorbasierte Steuereinheit, die die mechanische wellenvermittelte Dissoziation über digitales Feedback reguliert, zusammen mit einem gewebespezifischen Lockerungsreagenz, das für Fettgewebe optimiert ist (5–15 Minuten Inkubation). Dieser Ansatz ermöglicht eine schnelle Umwandlung von Gewebe in eine Einzelzellsuspension, wobei die mechanische Dissoziation in 3–9 Sekunden abgeschlossen wird.

Das System bietet drei Vorteile: (1) ultraschnelle Verarbeitung, wobei der Kernisolationsprozess – von der enzymatischen Verdauung bis zur initialen Zellfraktionstrennung – in etwa 30 Minuten abgeschlossen wird (>90 % Reduktion im Vergleich zu herkömmlichen Methoden); (2) hohe Erhaltung der Lebensfähigkeit, wobei die Trypan-Blau-Färbung die Zelllebensfähigkeit von 80–95 % bestätigt und die traditionellen Protokolle übertrifft; und (3) breite Kompatibilität, da die daraus resultierenden Einzelzellsuspensionen Anforderungen für primäre Zellkultur, Durchflusszytometrie, zytotoxische Tests und Aufbau von Adiposorganoiden erfüllen. Durch die Verkürzung der Verarbeitungszeit, die Verbesserung der Zellintegrität und die Begrenzung der Variabilität bietet dieses System eine praktische Grundlage für fettbezogene Forschung.

Introduction

Fett-abgeleitete Stammzellen (ADSCs), eine kritische Teilmenge von mesenchymalen Stammzellen (MSCs), die aus Fettgewebe isoliert werden, zeigen aufgrund ihrer Zugänglichkeit, minimalinvasiven Ernte, robuster Proliferationskapazität, multilinealem Differenzierungspotenzial sowie starken parakrinen und immunmodulatorischen Eigenschaften^erhebliches therapeutisches Potenzial 1,2,3,4 . Diese Eigenschaften haben ADSCs als vielversprechende Kandidaten für regenerative Medizin, Tissue Engineering und Immuntherapie positioniert. Der translationale Nutzen von ADSCs hängt jedoch von der Fähigkeit ab, funktional intakte, hochreine Populationen zu isolieren – ein Prozess, der technisch weiterhin herausfordernd ist. Die einzigartige Biologie des Fettgewebes bringt zwei Haupthindernisse mit sich: (1) Der hohe Lipidgehalt der Adiposzyten macht sie anfällig für Rupten während der mechanischen Verarbeitung, wodurch freie Lipide freigesetzt werden, die die stromale Gefäßfraktion (SVF) kontaminieren und die Zelllebensfähigkeit beeinträchtigen, wodurch ^5,6 entstehen; und (2) die strukturelle Komplexität des Gewebes, bestehend aus Faszien, Endothelzellen, Immunzellen und Blutkomponenten⁷, erschwert die Trennung fett-abgeleiteter Zellen. Diese Einschränkungen unterstreichen den dringenden Bedarf an einer effizienten, schnellen und lebensfähig erhaltenden Methode zur Isolierung hochwertiger ADSCs und Adipozyten, die für nachgelagerte Anwendungen wie die Modellierung von Stoffwechselerkrankungen und zellbasierte Therapien ebenso wichtig sind.

Mehrere etablierte Methoden sind derzeit zur Isolierung von fettabgeleiteten Zellen verfügbar, darunter enzymatische Verdauung, Explantkultur und mechanische Trennung ^8,9,10. Die enzymatische Verdauung, der am weitesten verbreitete Ansatz, verwendet Kollagenase, um extrazelluläre Matrixkomponenten (ECM) abzubauen und so kapselte Stammzellen freizusetzen. Diese Methode beinhaltet typischerweise das Zerkleinern des Gewebes, die Kollagenese-Verdauung (37 °C, 1–2 H), die SVF-Isolierung mittels Zentrifugation und die Adhärente Kulturreinigung. Obwohl wirksam für den ECM-Abbau, leidet die enzymatische Verdauung unter bemerkenswerten Nachteilen: verlängerte Verarbeitungszeit (insgesamt 3–4 Stunden), Abhängigkeit von großen Probenmengen und Risiken enzymatischer Zytotoxizität oder Batch-zu-Charge-Variabilität durch tierische Kollagenasen – all dies behindert die klinische Translation. Explant-Kultur, die die Stammzellmigration aus Gewebefragmenten nutzt, liefert Zellen mit erhaltener Lebensfähigkeit, leidet jedoch unter geringem Durchsatz und verzögerter Zellerholung (7–10 Tage). Mechanische Dissoziation, die auf physischen Störungen (z. B. Schwingung, Scherung) beruht, verkürzt die Verarbeitungszeit, beeinträchtigt aber oft die Zellintegrität, was zu einer verminderten Lebensfähigkeit und unreinen Populationen führt. Zusammen gelingt es diesen Methoden nicht, Effizienz, Reinheit und Lebensfähigkeit in Einklang zu bringen – entscheidende Kriterien für die klinische Zellisolation. Daher schlagen wir eine neuartige Methode zur Isolierung von fettabgeleiteten Zellen (Adipozyten und ADSC) vor, die enzymatische Verdauung mit mechanisch-wellenvermittelter Dissoziation¹¹ kombiniert. Dieser Ansatz erzielt zwei wesentliche Fortschritte: (1) Zeiteffizienz: Durch die Kombination von voroptimierten, tierfreien Enzymcocktails mit niederfrequenten mechanischen Wellen wird die gesamte Verarbeitungszeit von 3–4 Stunden auf ~30 Minuten reduziert (Abbildung 1); (2) Erhaltung der Lebensfähigkeit: Sanfte mechanische Dispersion minimiert Adipozytenruptur und Lipidfreisetzung. Wichtig ist, dass sich der 30-minütige Zeitrahmen auf den Ablauf der Kernisolation (Verdauung, mechanische Dissoziation, Filtration und Anfangszentrifugation) zur Gewinnung von rohen Adipozyten- und SVF-Fraktionen bezieht; optionale nachgelagerte Reinigungsschritte, wie die Lyse der roten Blutkörperchen (RBC), erfordern zusätzliche Handhabungszeit.

Unsere optimierte Methode zur Isolation von Fettzellen zeigt erhebliches Anwendungspotenzial in mehreren Forschungs- und klinischen Bereichen. In der Grundlagenforschung zeigen die gewonnenen hochviabilitätsfähigen Zellen außergewöhnliche Leistungen in adipogenen und osteogenen Differenzierungsstudien und bieten eine zuverlässige Zellquelle für Anwendungen der Gewebetechnik. In der translationalen Medizin haben klinische Studien das therapeutische Potenzial von ADSCs bei der Behandlung von Erkrankungen wie Arthrose¹², Herz-Kreislauf-Erkrankungen¹³, Multipler Sklerose¹⁴ und entzündlicher Darmerkrankung (IBD)/Morbus Crohn¹⁵ nachgewiesen. Die schnell isolierten ADSCs dienen als ideale Bausteine für den Aufbau von Fettgewebeorganoiden und die Umsetzung von Zelltherapieanwendungen, was die Forschung zum Arzneimittelscreening und zur Krankheitsmodellierung erheblich voranbringt. Darüber hinaus eignen sich hochwertige Einzelzell-Suspensionen für die RNA-Sequenzierung von Einzelzellen. Zusammenfassend schafft dieser integrierte Ansatz eine robuste technologische Plattform für Fettgewebe, die sowohl die Grundlagenforschung als auch die klinische Umsetzung in der regenerativen Medizin unterstützt.

Protocol

Alle Tierversuche wurden gemäß den Vorschriften zur Verwaltung von Angelegenheiten für Versuchstiere (Ministerium für Wissenschaft und Technologie, China, überarbeitet im März 2017) durchgeführt und vom Ausschuss für Tierethik und Wohlbefinden der Landwirtschaftsuniversität Sichuan genehmigt (Genehmigungsnummer: 20230089). Dieses Protokoll erfordert die Verwendung des SoniConvert-Systems, eines kommerziell erhältlichen Geräts für mechanische wellenunterstützte Gewebedissoziation (im Folgenden als mechanisches Dissoziationssystem bezeichnet). Das Protokoll ist für schweinedes Fettgewebe optimiert, und seine Abhängigkeit von dieser spezialisierten Ausrüstung ist eine wesentliche Einschränkung.

1. Fettgewebesammlung und -vorbereitung

1. Präoperative Desinfektion und Haarentfernung
   1. Euthanasiere das Schwein durch eine intravenöse Überdosis von Pentobarbitalnatrium (100 mg/kg Körpergewicht). Bestätigen Sie den Tod vor der Gewebeentnahme.
   2. Tragen Sie sterile Mullbinde auf, die in 2%iger Iodophor getränkt ist, um die Spiraldesinfektion des Schweinedorsums zu entfalten, die sich 15 cm von der Mittellinie erstreckt. Lass 30 Sekunden trocknen.
   3. Verwenden Sie einen sterilen Rasierer, um das Haar von 16 cm × 8 cm zu rasieren. Stellen Sie sicher, dass alle Haare aus dem Operationsbereich entfernt werden.
   4. Wische die Rückseite zweimal mit 75 % Ethanol mit steriler Mullbinde ab.
2. Fettgewebesammlung
   1. Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen 20 cm breiten Querschnitt entlang der dorsalen Mittellinie.
   2. Heben Sie den Schnittrand mit einer sterilen Zange an. Sezizieren Sie entlang der natürlichen Ebene zwischen Fettgewebe und Dermis, um eine vollständige obere Schicht des unterkältigen Fettgewebes (ULB) von etwa 2–3 mm Dicke zu erhalten.
   3. Spülen Sie das ULB einmal in eiskaltem sterilem Kochsalzlösungszustand ab und geben Sie es in eine sterile Kulturschale (Abbildung 2).

Abbildung 2: Sammlung von Pig ULB zur Zellisolation. (A) Illustration der Struktur des Fettgewebes auf dem Schweinerücken; (B) Schnittstelle des Bama-Minischweins; (C) Präsentation von Rückenfettgewebe, der subkutane Fett des Schweinerückens enthält zwei Schichten, die obere Schicht (ULB) und die innere Schicht (ILB); (D) Sammelte ULB. Abkürzung: ULB = obere Rückenschicht; ILB = innere Schicht des Rückens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Pausenpunkt: Das gesammelte Fettgewebe kann für kurze Zeit in eiskalter, steriler Kochsalzlösung oder D-Hanks-Lösung bei 4 °C aufbewahrt werden, bevor weitere Sektionen durchgeführt werden.
HINWEIS: Das Ziel ist es, das ULB zu sammeln. Vermeiden Sie es, während der Dissektion die untere Schicht des unteren subkutanen Fettgewebes (ILB) einzubringen.

3. Dissektion und Reinigung von Fettgewebe
   1. Gib 10 ml eiskalte D-Hanks Buffer pro 1,8 g Gewebe in die Schale und stelle sicher, dass das Gewebe vollständig untergetaucht ist.
   2. Identifizieren und entfernen Sie alle sichtbaren Blutgefäße aus dem Gewebe mit steriler chirurgischer Schere. Entfernen Sie jegliches Bindegewebe und fibrotische Bestandteile. Entsorgen Sie die entfernten Materialien in ausgewiesene Biogefährdenbehälter.
      HINWEIS: Seien Sie äußerst vorsichtig beim Umgang mit scharfen Instrumenten; Schneiden Sie immer vom Körper ab und entsorgen Sie gebrauchte Klingen und Scheren unmittelbar nach Gebrauch in scharfen Behältern.
   3. Spülen Sie das Gewebe im D-Hanks-Puffer ab, um Rückstände von Blut und Ablagerungen zu entfernen.
      HINWEIS: Bei Proben mit übermäßigem Hämatom ersetzen Sie den Puffer 1–3 Mal, um eine visuelle Klarheit zu erzielen. Halten Sie alle Dissektionsschritte auf Eis, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten.
4. Mechanische Dissoziation des Fettgewebes
   1. Übertragen Sie 1,8 g der ausgespülten Gewebefragmente in ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie 800 μL A-Typ Tissue Dissociation Buffer (A-Buffer) in den Tubus ein.
   2. Mit einer sterilen Augenschere wird das Gewebe im Tube in kleine Stücke von etwa 1–2 mm^Größe zerkleinert.
      HINWEIS: Wenn während oder nach dem Hacken erhebliche Lipidleckage festgestellt wird, wird das Gewebe erneut mit 1 ml vorgekühlter D-Hanks-Lösung gewaschen, bevor mit der enzymatischen Verdauung begonnen wird, um Lipide aus gebrochenen Adipozyten zu entfernen. Dieser Schritt erhält die Integrität der Adipozyten für die nachgelagerte Analyse.

2. Zellisolierung und Homogenisierung

1. Enzymatische Verarbeitung
   1. Fügen Sie 200 μL des A-Typ-Gewebedissoziationsmittels (A-Typ-Lösung) in ein neues Mikrozentrifugenrohr ein. Drehen und schütteln Sie das Rohr vorsichtig von Hand dreimal, um den Inhalt zu mischen und sicherzustellen, dass die Fettfragmente vollständig in die Dissoziationslösung eingetaucht sind.
   2. Überprüfen Sie, ob der Rohrdeckel fest geschlossen ist. Stellen Sie das Rohr in ein 37 °C Metallbad und inkubieren Sie es 5–10 Minuten.
      HINWEIS: Überwachen Sie die Lösung, bis sie trüb wird und die Gewebefragmente teilweise verdaut erscheinen. Die A-Typ-Lösung enthält Kollagenase und neutrale Protease. Tragen Sie beim Umgang Nitrilhandschuhe, einen Laborkittel und eine Schutzbrille. Vermeiden Sie Hautkontakt; Wenn es zu einer Exposition kommt, spülen Sie sofort 15 Minuten lang mit großzügigem Wasser. A-Buffer wird nach dem Hinzufügen der A-Typ-Lösung nicht verworfen.
2. Ultraschallassistierte mechanische Dissoziation
   1. Übertragen Sie die teilweise verdauten Fettgewebefragmente zusammen mit dem umgebenden Puffer aus dem Mikrozentrifugenrohr in ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr, das für das mechanische Dissoziationssystem vorgesehen ist.
   2. Führe das voreingestellte Programm für Fettgewebe im mechanischen Dissoziationssystem aus, um mechanische Dissoziation mit einer 200-Hz-Sinuswelle durchzuführen.

3. Filtration zur Gewinnung einer Einzelzell-Suspension

1. Filtration und Zentrifugation
   1. Sammeln Sie die Zellsuspension auf und führen Sie sie durch ein 200 μm Zellsieb in ein neues 50-mL-Zentrifugenrohr, um große Ablagerungen und unverdauten Gewebeklumpen zu entfernen.
   2. Gib 5 ml vorgekühlte (4 °C) D-Hanks-Lösung zum Sieb hinzu. Spülen Sie das Sieb zweimal mit der D-Hanks-Lösung ab, um den Zellertrag zu maximieren.
   3. Zentrifugieren Sie die gefilterte Zellensuspension bei 500 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
      Pausenpunkt: Nach der Zentrifugation kann die Zellsuspension sofort verarbeitet oder kurzzeitig auf Eis gelegt werden, bevor die Schicht getrennt wird.
   4. Adipozytensammlung: Um die Adipozyten zu sammeln, wird die überlagernde Lipidschicht mit einer sterilen Pasteurpipette aspiriert und entsorgt, wobei 1 ml Puffer zum Schutz der Adipozytenschicht übrig bleibt. Sammeln Sie die zweite Schicht für die nachgelagerte Analyse der Adipozyten. Vermeiden Sie es, die dritte und vierte Ebene zu stören.
   5. SVF-Sammlung (stromale Gefäßfraktion): Nach Entfernung der oberen Schichten wird das untere Pellet mit der stromalen Gefäßfraktion (SVF) vorsichtig in 1 ml D-Hanks/PBS wieder suspendiert. Lassen Sie das Zellpellet vorsichtig in 1 ml D-Hanks/PBS wieder suspendieren, um eine Zellkonzentration von 2–5 × 10^{6 Zellen} /ml zu erreichen.
      HINWEIS: Idealerweise können nach der Zentrifugation vier Schichten beobachtet werden: die Lipidschicht oben; die zweite Schicht enthält Adipozyten; die dritte ist die hydrophile Pufferschicht; und die unterste Schicht ist das SVF, das Stammzellen enthält (Abbildung 1).
2. RBC-Lyse
   1. HINWEIS: Wenn das Zellpellet eine signifikante rote Farbe aufweist, was auf eine Kontamination der roten Blutkörperchen hinweist, führen Sie eine RBC-Lyse durch.
      Setzen Sie das Zellpellet in 1–3 mL Rotblutkörper (RBC) Lysepuffer mit einer P1000-Pipette mit breiten Bohrenden wieder auf. Inkubiere 15 Minuten auf Eis mit gelegentlichem Mischen.
   2. Alle Lösungen vorkühlen und Zentrifugenrotoren auf 4 °C vorkühlen, um die Stoffwechselaktivität während der Verarbeitung zu minimieren.
   3. Zentrifugiere bei 500 × g für 10 Minuten bei 4 °C. Aspiriere das Supernatant vollständig.
   4. Waschen Sie die Zellen erneut, indem Sie das Pellet in 5 ml vorgekühlter D-Hanks-Lösung erneut suspendieren und bei 500 × g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugieren. Entsorge das Supernatant.
3. Endgültige Neuaufstellung
   1. Für nachgelagerte Anwendungen die Endzelle in D-Hanks/PBS wieder aufhängen.

4. Nachgelagerte Anwendungen und Analyse

1. SVF-Zelllebensfähigkeit und Bewertung des Zellertrags
   1. Bereite die SVF-Zellsuspension vor, die in einem 1,5-mL-Mikrozentrifugenrohr gewonnen wird. Lassen Sie die Suspension bis zur Nutzung auf Eis.
   2. Mischen Sie 10 μL der SVF-Zellsuspension mit 10 μL 0,4 % Trypan Blue-Lösung in einem sterilen 0,5-mL Mikrozentrifugenrohr. Pipette vorsichtig dreimal hoch und runter, um ein gleichmäßiges Mischen zu gewährleisten.
      HINWEIS: Die Endkonzentration von Trypan Blue in der Mischung beträgt 0,2 %. Vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen beim Mischen jedoch, da diese die automatische Zellzählung beeinträchtigen können.
      Übertragen Sie 10 μL der gefärbten Zellmischung auf eine Zählfolie, die für den automatisierten Zellzähler geeignet ist. Stellen Sie sicher, dass die Probe die Kammer vollständig ausfüllt, ohne Überlauf zu verursachen.
   3. Stecken Sie den Zählschieber in den Zellzähler. Wählen Sie den Trypan Blue-Testtyp und passen Sie bei Bedarf den Zellkonzentrationsbereich an.
   4. Drücken Sie den Zählknopf, um die automatische Zellzählung zu starten. Das Instrument erfasst Bilder der Zählkammer und unterscheidet automatisch lebende Zellen von toten Zellen.
   5. Notieren Sie den Zellviabilitätsprozentsatz und zählen Sie die Gesamtzahl der auf dem Instrumentenbildschirm angezeigten lebensfähigen Zellen. Führen Sie für jede Probe drei unabhängige Messungen durch und berechnen Sie die mittlere Lebensfähigkeit sowie die Zellausbeute pro Gramm Fettgewebe.
      HINWEIS: Reinigen Sie den Zählträger und die Ladeöffnung des Instruments nach jedem Gebrauch mit 70 % Ethanol, um Kreuzkontaminationen zwischen den Proben zu vermeiden.
2. Beobachtung der Morphologie der Adipozyten
   1. Färben Sie die isolierten Adipozyten mit 5 μg/mL Hoechst für Kerne und 1 μM BODIPY für Lipide in D-Hanks/PBS für 15 Minuten bei 37 °C.
      Pausepunkt: Nach der Färbung sollten die Proben umgehend abgebildet werden; bei Bedarf können sie bei 4 °C kurzzeitig vor Licht geschützt bleiben, bevor sie mikroskopisch durchgeführt werden.
   2. Verwenden Sie ein selbstgebautes, adipozytenfreundliches Glassystem mit Objektträgerabdeckung zur Präparatpräparate, um eine Kompression der Zellen zu vermeiden.
   3. Beobachten Sie die Kerne (gefärbt mit Hoechst) und die Lipidtröpfchen (gefärbt mit BODIPY) unter einem Fluoreszenzmikroskop.
      HINWEIS: Aufgrund der großen Größe (20–300 μm) und des hohen Lipidgehalts sind Adipozyten fragil, neigen zum Schwimmen und stapeln sich in mehrere Schichten, wodurch herkömmliche Montagemethoden für klare mikroskopische Beobachtungen ungeeignet sind (Abbildung 3A). Um dem entgegenzuwirken, wurde ein selbstgebautes, adipozytenfreundliches Montagesystem mit Standard-Folien und Deckblättern entwickelt (Abbildung 3B).
3. Reinigung stromaler Gefäßkomponenten und morphologische Beobachtung von ADSCs
   1. Säe das frisch isolierte SVF in einer T25-Zellkulturkolbe mit 5 ml DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin. Inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO₂.
   2. Nach 48 Stunden die Flasche vorsichtig zweimal mit vorgewärmtem PBS waschen, um nicht haftende Zellen zu entfernen. Frisches Kulturmedium hinzufügen und die Inkubation fortsetzen.
   3. Das Kulturmedium alle 2–3 Tage ersetzen. Überwachen Sie die Zellmorphologie und -konfluenz unter einem umgekehrten Mikroskop.
   4. Wenn die Zellen 80–90 % Konfluenz erreichen (typischerweise nach 7–10 Tagen), trennen Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA für 3–5 Minuten bei 37 °C. Neutralisieren Sie mit einem Kulturmedium und sammeln Sie die Zellsuspension.
   5. Führen Sie eine Trypan-Blue-Färbung durch, um die Zelllebensfähigkeit vor der FACS-Erkennung und -Sortierung zu erkennen.
   6. Beobachten Sie die Morphologie der gereinigten kultivierten ADSCs unter einem optischen Mikroskop.
   7. Filtern Sie die gesammelte Zellsuspension durch ein 70 μm Zellsieb, um verbleibende Aggregate zu entfernen. Setzen Sie die Zellen in PBS mit 2 % FBS für die FACS-Analyse wieder auf.
   8. Färben Sie die Zellen mit fluorochromkonjugierten Antikörpern gegen CD73, CD90, CD11b und CD45 für 30 Minuten bei 4 °C im Dunkeln.
   9. Wasche die Zellen zweimal mit einem Färbepuffer und suspendiere sie in PBS mit 2 % FBS.
   10. Führen Sie eine Durchflusszytometrie mit einer 70-μm-Düse bei 20 psi und einer Durchflussrate unter 3,0 durch.
   11. Zellreste werden durch Gating auf die Hauptpopulation mit den Parametern der Vorwärtsstreufläche (FSC-A) und der Seitenstreufläche (SSC-A) ausgeschlossen.
   12. Entfernen Sie Doublets durch FSC-A versus FSC-H-Gating und wählen Sie die lebensfähige Singlet-Population für die nachgelagerte Analyse aus.
   13. Analysieren Sie gegated cells anhand der Oberflächenmarkerexpression. Verwenden Sie CD73 und CD90 als positive Marker sowie CD11b und CD45 als negative Marker, um den ADSC-Phänotyp zu überprüfen.
   14. Beobachten Sie die Morphologie der angereicherten und kultivierten ADSCs unter einem optischen Mikroskop. Die charakteristische spindelförmige, fibroblastenartige Morphologie deutet auf eine erfolgreiche ADSC-Anreicherung hin.
4. ADSC-adipogene Differenzierung
   1. Säen Sie die dritte Generation der ADSCs mit einer Dichte von 1 × 10⁴ Zellen/cm^² aus. Wenn die Zellkonfluenz etwa 90 % erreicht, wird die adipogene Induktion eingeleitet.
   2. Bereiten Sie das adipogene Induktionsmedium mit hochglukosehaltigem Dulbeccos modifiziertem Eagle's-Medium (DMEM) vor, das 10 % fetales Rinderserum (FBS), 0,5 mM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX), 1 μM Dexamethason, 10 μg/mL Insulin und 1 μM Rosiglitazon enthält.
   3. Nach 3 Tagen Einleitung ersetze das Medium durch ein Erhaltungsmedium und wechsle die Lösung alle 2 Tage.
   4. Nach 14 Tagen Induktion färben Sie die Zellen mit Oil Red O und beobachten Sie die Lipidtropfen unter einem umgekehrten Mikroskop.
5. ADSC-osteogene Differenzierung
   1. Wenn die Zellkonfluenz 80–90 % erreicht, beginnt die osteogene Induktion. Formulieren Sie das osteogene Induktionsmedium mit einem hochglukosehaltigen DMEM, das 10 % FBS, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/mL Ascorbinsäure, 10 μM Calcitriol und 1 μM Dexamethason enthält.
   2. Wechseln Sie das Medium alle 2–3 Tage und setzen Sie den Einleitungsprozess etwa 14 Tage fort.
   3. Färben Sie die Zellen mit 2 % Alizarin Red S (pH 5,2) und beobachten Sie sie unter einem umgekehrten Mikroskop.
6. Aufbau und Identifikation von Organoiden
   1. Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension von ADSCs in einem vollständigen Kulturmedium vor und passen Sie die Zellkonzentration auf 2 × 10⁴ Zellen/20 μL an.
   2. Wenden Sie den Deckel einer 100-mm-Kulturschale um und geben Sie 20 μL Tropfen der Zellsuspension auf die Innenseite des Deckels.
   3. Gib steriles PBS auf den Boden der Schale, um die Luftfeuchtigkeit zu erhalten, decke den Deckel sorgfältig ab und brüte die hängenden Tropfen unter Standardkulturbedingungen.
   4. Beobachten Sie die Tropfen täglich und lassen Sie die Zellen 6 Tage lang aggregieren und Sphäroide bilden.
   5. Sammeln Sie die Sphäroide vorsichtig mit einer Pipette auf und geben Sie sie in vorgekühltes Matrigel auf Eis.
   6. Die Sphäroide werden in Matrigel eingebettet und die Mischung in Kulturplatten eingebaut, bevor man sie unter Standardkulturbedingungen inkubiert.
   7. Ersetzen Sie das Medium regelmäßig und überwachen Sie das Wachstum der Organoide bis zu den Tagen 18–28, wenn die Strukturen kompakt und ausgereift sind.
   8. Fixiere die Organoide mit 4 % Paraformaldehyd, permeabilisiere sie mit 0,1 % Triton X-100 und blockiere die unspezifische Bindung mit 5 % BSA.
   9. Inkubieren Sie die Proben mit primären Antikörpern gegen CD73, CD90, CD11b und CD45 und inkubieren Sie sie anschließend mit den entsprechenden fluoreszierenden sekundären Antikörpern.
   10. Färben Sie die Organoide mit Hoechst und BODIPY, um Kerne bzw. Lipidtröpfchen zu visualisieren, und betrachten Sie die gefärbten Proben unter einem Fluoreszenzmikroskop.
       HINWEIS: Führen Sie Zellsortierung und alle Manipulationen mit offenen Kulturen durch, einschließlich Aussaat, Fütterung und Färbevorbereitung, unter strengen aseptischen Bedingungen in einem Biosicherheitsschrank.

Results

Abbildung 1: Schematische Darstellung des von Fett abgeleiteten Zellisolationsprozesses. Das Diagramm zeigt die traditionelle Methode und die heutige Methode als illustrative Arbeitsabläufe. Drei Hauptschritte sind bei der Isolierung von fettabgeleiteten Zellen beteiligt: Der erste ist die Vorbehandlung; die ...

Discussion

Die vorliegende Studie führt einen neuartigen, integrierten Ansatz zur Isolierung von fettabgeleiteten Zellen (hauptsächlich Adipozyten und ADSC) ein, der kritische Einschränkungen konventioneller Methoden adressiert. Durch die Kombination von gewebespezifischer enzymatischer Lockerung mit präziser mechanischer Wellendissoziation erreicht dieses System eine schnelle (Gesamtverarbeitungszeit ~30 Min), hohe Lebensfähigkeit (80–95 %) und reproduzierbare Zellisolation.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ein Typ-Gewebedissoziations-Set	Docsense	TM001	Enthält einen Typ-Gewebedissoziationsagent (A-Typ-Lösung) und einen Typ-Gewebedissoziationspuffer (A-Puffer).
Adipogenes Differenzierungsmedium-Kit	OriCell	GUXMD-90031	Verwendet für die adipogene Differenzierung, einschließlich des hochglukosereichen Dulbeccos modifizierten Eagle-Medium (unmodifiziertes) und Erhaltungsmediums
Alizarin Red S	OriCell	A5533ALIR-10001	Mineralisierungsfärbung für osteogene Differenzierung (pH 5,2)
Ascorbinsäure	Sigma-Aldrich	A4544	L-Ascorbinsäure, Zellkultur getestet, für osteogene Induktion
Bama Minipigs	Chengdu Dossy Versuchstier-Co., Ltd.		Einjährige, männliche, SPF-fähige Tiere, die unter standardisierten Impf-, Entwurmungs- und Reinigungsverfahren gehalten werden. https://www.cd-dossy.cn/animalpl_detail/12606067609851863 04.html
Bio-Rad TC20 Automatisierter Zellzähler	Bio-Rad Labore	1450011	Automatisierter Zellzähler für Viabilität und Ertragsbewertung
BODIPY	Thermo Fisher Scientific	D3922	Neutrale Lipidfärbung
BSA (5 %)	Sigma-Aldrich	A9418	Rinderserumalbumin, lyophilisiertes Pulver, zum Blockieren
Calcitriol	Sigma-Aldrich	C9756	1α,25-Dihydroxyvitamin D3, für osteogene Induktion
Zell-Sieb (70 & mu; m)	Corning	352350	Falcon 70 μ m-Zellsieb, steril, zur FACS-Probenvorbereitung
Zell-Sieb (200 & MU; m)	pluriSelect	43-50200-03	pluriStrainer, PET-Mesh, passt 50-ml-Schläuche, steril & nbsp;
Zentrifugenröhre (50 mL)	Corning	352098	Falcon 50 mL hochklares konisches Rohr, steril, Polypropylen
Zählfolie (für Bio-Rad TC20)	Bio-Rad Labore	1450011	Doppelkammer-Zählschieber für TC20 automatischen Zellzähler
Kulturschale (100 mm)	Corning	430167	Sterile Polystyrolschale zur Organoidbildung von hängenden Tropfen
Dexamethason	Sigma-Aldrich	D4902	≥ 98 % für adipogene und osteogene Induktion
D-Hanks Balanced Salt Solution oder PBS	Gibco	10010015	Vorgekühlt auf 4 °Π; C, pH 7,4.
DMEM	Gibco	11965084	Dies wird für den frisch isolierten Kultiver von SVF verwendet.
DNase I	Beyotime	D7073	Optional, empfohlen, wenn Klumpen festgestellt werden.
Ethanol	Sigma-Aldrich	459836	75 % für Oberflächendesinfektion.
Fetales Rinderserum (FBS)	Gibco	A4736201	Tet-System zugelassen, US-Herkunft, steril
Durchflusszytometer	BD Biosciences	BD FACSCanto II	3 Laser (405 nm, 488 nm, 633 nm), 8 Fluoreszenzkanäle für die Analyse von Oberflächenmarkern (CD73, CD90, CD11b, CD45), entspricht 70 m Düsenbedarf bei 20 psi
Fluoreszenzmikroskop	Olympus		Invertiertes oder aufrechtes Modell, das FITC- und DAPI-Filtersätze unterstützt.
Fluoreszierende sekundäre Antikörper	Thermo Fisher Scientific	A-11001 (Anti-Maus), A-11008 (Anti-Kaninchen)	Alexa Fluor konjugiert, für Immunfluoreszenz
Fluorochrom-konjugierte Antikörper (CD73, CD90, CD11b, CD45)	BD Biosciences	561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)	Für die durchflusszytometrische Analyse des ADSC-Phänotyps
Hoechst	Thermo Fisher Scientific	H3570	Nuklearfarbe für die Bewertung von lebenden oder toten Zellen.
IBMX	Sigma-Aldrich	I5879	≥ 99 % (HPLC), für adipogenes Induktionsmedium
Eiskalte, sterile Kochsalzlösung	Baxter	2F7124	0,9 % Natriumchlorid-Injektion, USP, zum Spülen von Gewebe
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	Rekombinant, in Hefe exprimiert, zur adipogenen Induktion
Iodophor	Sigma-Aldrich	25104	2% Desinfektionslösung.
Matrigel	Corning	354230	Wachstumsfaktor reduziert, Phenol rotfrei, zur Einbettung von Sphäroiden;
Metallbad	Servicebio	SMB-H	Verwendet für die Inkubation bei 37 °C.
Oil Red O	OriCell	OILR-10001	Lipidfärbung zur Adipozytendifferenzierung
Optisches Mikroskop	Olympus		Standard-Brightfield-Mikroskop mit 10x– 40-fache Ziele.
Osteogenes Differenzierungsmedium-Kit	OriCell	GUXMD-90021	Verwendet zur osteogenen Differenzierung, einschließlich des hochglukosereichen Dulbeccos modifizierten Eagle-Medium (unverändert) und Erhaltungsmedium
P1000-Pipette mit breiten Bohrlöcherspitzen	Beckman Coulter	B01113	Biomek P1000 Span-8 Breitbohrungsspitzen, steril
Paraformaldehyd (4 %)	Thermo Fisher Scientific	J61899	Wässrige Lösung zur Fixierung von Organoiden
Pasteur-Pipette	Corning	7095S-5C	Steril, wegwerfbar.
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063	10.000 U/mL Penicillin, 10.000 μ g/mL Streptomycin, steril
Pentobarbitalnatrium	Hikma Pharmaceuticals USA Inc.	24201-010-20	Injizierbar, zur Euthanasie (100 mg/kg Körpergewicht, intravenös). ANDA 203619
Primäre Antikörper (CD73, CD90, CD11b, CD45)	BD Biosciences	561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)	Für organoide Immunfärbung
Rote Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer	Solarbio	R1010	Falls es für nachgelagerte Anwendungen erforderlich ist.
Gekühlte Zentrifuge	Eppendorf	5702R	Verwendet für Zentrifugationsschritte bei 4 °C.
Rosiglitazon	Cayman Chemical	71740	≥ 98 %, PPAR & Gamma; Agonist für adipogene Induktion
Sharps-Behälter	Becton Dickinson	305270	Stichsicherer Behälter für gebrauchte Klingen und Scheren
SoniConvert Single Cell Suspension Preparation System	Docsense	SC-L1W	Wird zur mechanischen Dissoziation von Gewebe verwendet.
Färbepuffer (Flusszytometrie-Färbepuffer)	eBioscience (Thermo Fisher Scientific)	00-4222-57	200 ml, einsatzbereit, enthält FBS und 0,09 % Natriumazid als Konservierungsmittel für Antikörper- und Zellverdünnung, Oberflächenfärbung und Waschschritte in der Durchflusszytometrie;
Sterile 1,5 mL Eppendorf-Röhre	Eppendorf	30121.517	Safe-Lock Mikrozentrifugenröhre, steril, zum Zerkleinern von Gewebe
Sterile Kulturschale	Corning	430167	100 mm x 20 mm sterile Kulturschale, zur Gewebeentnahme
Sterile Zange	Sklar	96-1719	Sterile Daumenzange, gezackt, zur Gewebehandhabung;
Sterile Mullbinde	Dukal Corporation	7060033	Sterile Mullbinden zum Desinfizieren und Abwischen
Sterile ophthalmische Schere	Sklar	10023-580	Vannas-ähnliche Federscheren, zum Zerkleinern von Gewebe in 1-2 mm³ Stücke
Steriler Rasierer	3M	9681	Chirurgischer Rasierer zur Haarentfernung aus dem Operationsbereich
Steriles Skalpell	Integra Miltex	4-415	Steriles Einwegskalpell zum Schneiden
Sterile chirurgische Schere	Sklar	10022-580	Merit Sterile Iris Scissors, zur Zerlegung von Blutgefäßen und Bindegewebe;
T25-Zellkulturkolbe	Corning	430639	Falcon T25 Zellkulturkolben, entlüfteter Deckel, steril
Triton X-100 (0,1 %)	Sigma-Aldrich	T8787	Laborqualität für Permeabilisierung
Trypan Blau	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15250061	0,4%-Lösung für die Zellviabilitätszählung.
Trypsin-EDTA (0,25 %)	Gibco	25200056	0,25 % Trypsin, 1 mM EDTA, zum Abtrennen von ADSCs
Β-Glycerophosphat	Sigma-Aldrich	G9422	Dinatriumsalzpentahydrat für osteogene Induktion