Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Bewertung der synergistischen Aktivität von Fosfomycin in Kombination mit Ceftriaxon, Meropenem und Gentamicin gegen carbapenemresistente Escherichia-coli-Isolate mittels der Agar-Verdünnungsmethode. Synergie wurde mit Meropenem und Gentamicin beobachtet, jedoch nicht mit Ceftriaxon.
Übersichtsartikel
Protokoll für Agar-Verdünnungs-Checkerboard-Analyse von fosfomycinbasierten Antibiotikakombinationen gegen carbapenemresistente Escherichia coli
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
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Aufgrund der begrenzten Behandlungsmöglichkeiten für carbapenemresistente Enterobacteralen haben Kombinationstherapien zunehmend an Bedeutung gewonnen. Diese Studie hatte zum Ziel, die Osfomycin-Resistenzraten zu untersuchen und die in-vitro-synergistischen Interaktionen von Fosfomycin in Kombination mit Meropenem, Gentamicin und Ceftriaxon gegen carbapenemresistente Escherichia-coli-Isolate zu evaluieren. Sechzig carbapenemresistente E.-coli-Stämme , die aus verschiedenen klinischen Proben (Urin, Blut, Aspirat, Wund, Libraspinalflüssigkeit, endotrachealer Aspirat) isoliert wurden, die von Patienten in klinischen Stationen und Intensivstationen der medizinischen Fakultät der Dicle University gewonnen wurden, wurden in die Studie aufgenommen. Die Artenidentifikation erfolgte mittels eines automatisierten mikrobiellen Identifikationssystems. Antibiotikaanfälligkeitstests und Bestätigung der Carbapenemresistenz wurden durch Bandscheibendiffusion mit Ertapenem, Imipenem und Meropenem durchgeführt. Fosfomycin-Resistenz und Wechselwirkungen zwischen Antibiotika wurden durch Agar-Verdünnung untersucht. Zusätzlich wurden Antibiotikakombinationen über serielle zweifache Konzentrationsgradienten mit dem agar-verdünnungsbasierten Protokoll ausgewertet, und fraktionierte inhibitorische Konzentrationsindizes (FICI) wurden berechnet, um Synergie, Gleichgültigkeit oder Antagonismus zu bestimmen. Die Resistenzraten betrugen 76,6 % für Fosfomycin, 61,6 % für Meropenem, 85,0 % für Gentamicin und 98,3 % für Ceftriaxon. Synergistische Interaktionen wurden in 35 % der Isolate für die Fosfomycin–Meropenem-Kombination, 33,4 % für die Fosfomycin–Gentamicin-Kombination und 1,7 % für die Fosfomycin–Ceftriaxon-Kombination beobachtet. Antagonismus wurde nur in einem Isolat in der Fosfomycin–Meropenem-Kombination nachgewiesen. Kombinationen von Fosfomycin mit Meropenem und Gentamicin zeigten in vitro synergetische Aktivität gegen carbapenemresistente E. coli. Weitere In-vitro-Studien sind erforderlich, um diese Ergebnisse zu bestätigen.
Einleitung
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Die Familie der Enterobacterales umfasst eine sehr vielfältige Gruppe von gramnegativen Bazillen, von denen viele von erheblicher klinischer Bedeutung sind1. Darunter ist Escherichia coli die am häufigsten isolierte Art in klinischen mikrobiologischen Laboren und wird häufig mit Infektionen in nahezu allen Organsystemen assoziiert, darunter Harnwegsinfektionen, Wundinfektionen, Lungenentzündungen bei immungeschwächten Patienten, Gastroenteritis und neonatale Meningitis. Sie ist auch eine Hauptursache für gramnegative Sepsis und endotoxinvermittelten septischen Schock. Über die menschliche Medizin hinaus ist E. coli auch ein wichtiger veterinärer Erreger, der Atemwegs- und systemische Infektionen bei verschiedenen Tierarten, einschließlich Pferden, verursacht und so das Wirtsspektrum der Pathogenese von E. coli über menschliche und tierische Wirte hinweg erweitert.
Extended-Spectrum Beta-Laktamase (ESBL)-produzierende Enterobacterales, insbesondere E. coli und Klebsiella pneumoniae, wurden mit erhöhter Sterblichkeit, verlängertem Krankenhausaufenthalt und höheren Gesundheitskosten in Verbindung gebracht. Der weitverbreitete Einsatz von Antibiotika ist ein wesentlicher Treiber der Multiarzneimittelresistenz (MDR) bei diesen Organismen1. Zu den Resistenzmechanismen gehören die Produktion von Carbapenemase, ESBLs, aminoglykosid-modifizierende Enzyme (AMEs), Mutationen, die Quinolonresistenz verleihen, sowie Veränderungen in Porin- und Effluxsystemen. Bei E. coli und Klebsiella pneumoniae ist die Resistenz hauptsächlich plasmidvermittelt, was den horizontalen Gentransfer erleichtert. Solche Resistenzmerkmale werden auch zunehmend bei E. coli aus tierischem Ursprungs, einschließlich Rinderisolaten, berichtet, was das One-Health-Konzept unterstützt und auf ein mögliches zoonotisches Übertragungsrisikohinweist 2,3.
Carbapeneme gelten als Last-Line-Mittel für schwere, multiresistente Infektionen. Carbapenem-resistente Enterobacterales (CRE) sind jedoch zu einem großen globalenGesundheitsproblem geworden. Diese Resistenz wird hauptsächlich durch Carbapenemasen vermittelt, darunter Klasse-B-Metallo-Beta-Laktamasen, die zu umfangreich medikamentenresistenten und panresistenten Phänotypen5 beitragen.
MDR-E.-coli-Stämme schränken therapeutische Optionen erheblich ein und erschweren das Infektionsmanagement. Dies unterstreicht die Notwendigkeit alternativer Behandlungsstrategien wie Kombinationstherapien, um die klinischen Ergebnisse zu verbessern. Darüber hinaus werden diese resistenten Stämme zunehmend nicht nur aus klinischen Einrichtungen, sondern auch aus Lebensmitteln wie Milchprodukten berichtet. Dies erweitert den epidemiologischen Kontext der Verbreitung von antimikrobiellen Resistenzen und unterstützt die Kombinationstherapie als mögliche Strategie zur Eindämmung ihrer Ausbreitung und klinischen Auswirkungen 6,7. Aminoglykoside, Tigecyclin und Polymyxine sind häufig verwendete therapeutische Wirkstoffe bei MDR-Infektionen8. Fosfomycin hat außerdem eine Aktivität gegen ESBL-produzierende E. coli, insbesondere bei Harnwegsinfektionen9.
Fosfomycin, erstmals 1969 entdeckt, hemmt die frühe bakterielle Zellwandsynthese und ist als vielversprechendes Mittel in derKombinationstherapie wieder aufgetaucht. Synergistische Effekte zwischen Fosfomycin und Aminoglykosiden oder β-Laktaminen wurden in MDR-Organismen11,12 berichtet. Darüber hinaus wurde Fosfomycin in großen klinischen Kohorten untersucht und zeigt eine Wirksamkeit bei schweren Infektionen, wenn es allein oder in Kombinationsregimenverwendet wird. Allerdings beziehen sich die meisten früheren Studien auf heterogene Bakterienpopulationen, und Daten, die speziell carbapenemresistente E. coli behandeln, sind weiterhin begrenzt.
Standard-Testmethoden für antimikrobielle Suszeptibilitätstests umfassen Agarverdünnung, Brühenverdünnung und Scheibendiffusion. Agar-Verdünnungs-basierte Kombinationstests ermöglichen eine quantitative Bewertung antimikrobieller Interaktionen durch Bestimmung von MICs und Berechnung von FICIs. Alternative Methoden wie Time-Kill und Gradient Diffusion liefern dynamische oder vereinfachte Interaktionsdaten, können sich jedoch in Reproduzierbarkeit und Standardisierungunterscheiden 13,14. Dieses Protokoll eignet sich am besten für kontrollierte In-vitro-Evaluation definierter Antibiotikakombinationen. Allerdings spiegelt sie nicht vollständig die pharmakokinetischen Bedingungen in vivowider. Unter diesen gilt die Agar-Verdünnung als Referenzmethode für die MIC-Bestimmung; seine Anwendung bei der Bewertung der Fosfomycin-Kombinationsaktivität gegen carbapenemresistente E. coli bleibt jedoch begrenzt.
Diese Studie bietet eine systematische Evaluation von fosfomycinbasierten Kombinationen im Vergleich zu klinisch bestätigten carbapenemresistenten E.- coli-Isolaten . Ein standardisierter Agar-Verdünnungsschachbrettansatz wurde verwendet, der direkte vergleichende Interaktionsdaten unter kontrollierten in-vitro-Bedingungen erzeugte.
Daher prüft die vorliegende Studie die Hypothese, dass Fosfomycin in Kombination mit Meropenem, Gentamicin oder Ceftriaxon in vitro synergistische Aktivität gegen CRE E. coli-Isolate zeigt.
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Überprüfung und Perspektive
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Die Genehmigung für diese Studie wurde vom Non-Interventional Clinical Research Ethics Committee der Medizinischen Fakultät der Universität Dicle eingeholt (Entscheidung Nr. 100, Datum: 01.01.2021).
Das folgende Protokoll beschreibt eine standardisierte Agar-Verdünnungs-Checkerboard-Methode zur Bewertung der Synergie der Fosfomycin-Kombinationen gegen carbapenemresistente E.-coli-Isolate .
Sammlung von Isolaten
Zwischen dem 15.02.2021 und dem 15.12.2021 wurden insgesamt 60 carbapenemresistente E. coli-Stämme aus verschiedenen klinischen Proben (Urin, Blut, Aspirat, Wund, Libramarkalflüssigkeit und endotrachealer Aspirate) von stationären Patienten der medizinischen Fakultät der Universität Dicle eingeschlossen. Die Identifikation erfolgte mit einem MALDI-TOF-Massenspektrometriesystem. Wenn mehrere Isolate vom selben Patienten gefunden wurden, wurde nur der erste Isolat eingeschlossen. Proben aus ambulanten Kliniken und Patienten, die weniger als 48 Stunden stationär waren, wurden ausgeschlossen. Alle carbapenemresistenten E. coli-Isolate, die während des Studienzeitraums die vordefinierten Einschlusskriterien erfüllten, wurden nacheinander eingeschlossen; Daher wurde die Stichprobengröße anhand der Gesamtzahl der verfügbaren geeigneten Isolate bestimmt, und es wurde keine a-priori-Stichprobengrößenberechnung durchgeführt. E. coli ATCC 13846 und E. coli ATCC 25922 wurden als Qualitätskontrollstränge verwendet. Qualitätskontrollstämme wurden parallel zu klinischen Isolaten unter identischen Agar-Verdünnungsbedingungen getestet. Alle Läufe wurden von zwei unabhängigen Beobachtern bewertet. Die Ergebnisse der Qualitätskontrollstämme zeigten in allen Experimenten erwartete Wachstumshemmungsmuster, und es wurden keine außerhalb des Bereichs liegenden oder ungültigen Ergebnisse festgestellt.
Alle Verfahren mit klinischen Isolaten wurden unter Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt. Geeignete persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz) wurde verwendet, und alle Manipulationen wurden in einem zertifizierten biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt.
Artbestimmung und antimikrobielle Anfälligkeitstests
Carbapenemresistenz- und antimikrobielle Anfälligkeitstests wurden mit einem automatisierten mikrobiellen Identifikations- und Empfänglichkeitstestsystem durchgeführt. Die vom System festgestellte Carbapenem-Resistenz wurde durch Scheibendiffusionstests mit Ertapenem-, Imipenem- und Meropenem-Scheiben bestätigt. Die Zonendurchmesser wurden gemäß den EUCAST-Breakpoints16,17 (Tabelle 1) interpretiert. Alle Isolate wurden in tryptischer Sojabrühe mit 20 % Glycerol konserviert und bei −20 °C gelagert.
Tabelle 1: Zonendurchmesser-Breakpoints für Carbapeneme, bestimmt für E. coli mittels Scheibendiffusionstest (DDT). Interpretative Kriterien zur Diskdiffusion für die Carbapenem-Empfindlichkeitstests. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Blutkulturflaschen, die für pädiatrische und aerobe Proben geeignet sind, wurden in einem automatisierten Blutkultursystem inkubiert. Positive Flaschen wurden subkultiviert auf EMB-Agar, 5%-Schafsblut-Agar und Sabouraud-Dextrose-Agar.
Urin- und Endotrachealaspiratproben wurden mit quantitativen Methoden kultiviert, während andere Proben mit halbquantitativen Methoden verarbeitet wurden. Endotracheale Aspiratproben wurden mittels Gram-Färbung untersucht, und nur Proben mit einem Bartlett-Wert > 0 und einem Murray-Wert > 3 wurden als signifikant angesehen und enthielten18.
Für Wundproben wurde die Gram-Färbung nach dem Q-Bewertungssystem durchgeführt; Stichproben mit einem Q-Wert größer als 0 wurden19 eingeschlossen.
Bakterielle Isolate wurden mittels Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Massenspektrometrie identifiziert. Ein Wert von ≥2,0 galt als zuverlässig für die Identifikation von Gattungen und Arten, während Werte zwischen 1,7 und 2,0 eine zuverlässige Identifikation auf Gattungsebene20,21 anzeigten. Nur Isolate mit Werten von ≥2,0 wurden einbezogen.
Bestimmung der Fosfomycin-Suszeptibilität mittels Agar-Verdünnungsmethode
Laut dem Europäischen Ausschuss für antimikrobielle Susceptibilitätstests (EUCAST) wird die Agar-Verdünnungsmethode zur Bestimmung der Fosfomycin-Anfälligkeit bei Mitgliedern der Familie Enterobacterales16 empfohlen.
Herstellung von Fosfomycin und anderen antibiotischen Wirksamkeitsmitteln
Für die Agar-Verdünnungsmethode wurde pulverisiertes Fosfomycin-Dinatrium-Salzhydrat verwendet, und steriles destilliertes Wasser wurde zur Verdünnung verwendet. Für jedes Antibiotikum waren acht verschiedene Verdünnungen geplant, die von 4-fach unter und 3-fach über dem von EUCAST bestimmten MIC-Grenzwert reichten.
Eine Fosfomycin-Lagerlösung (mit 2560 μg/mL Fosfomycin) wurde hergestellt, indem 51,2 mg steriles Fosfomycin-Disodium gelöst wurden, berechnet mit der Volumen-/Gewichts-/Potenzformel (Volumen (mL) = Gewicht (mg) × Potenz (μg/mg)/ Konzentration (μg/mL)) und unter sterilen Bedingungen in 20 ml sterilem destilliertem Wasser gewogen. Die endgültige Konzentration war mit 256 μg/mL geplant, bedingt durch eine 10-fache Verdünnung der Grundlösung bei der Zugabe von MHA.
Dementsprechend wurden Verdünnungsbereiche für Fosfomycin (2–256 μg/mL), Meropenem und Gentamicin (0,125–16 μg/mL) sowie Ceftriaxon (0,0625–8 μg/mL) bestimmt.
Verdünnungen wurden durch serielle zweifache Verdünnungen in sterilen konischen Röhrchen mit 10 ml sterilem destilliertem Wasser hergestellt. Insgesamt wurden sieben serielle zweifache Verdünnungen in den Röhren durchgeführt, bis eine Konzentration von 2 μg/mL erreicht wurde. Die verbleibenden 10 ml im letzten Rohr wurden entsorgt. Dies führte zu acht verschiedenen Antibiotikakonzentrationen: 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4 und 2 μg/mL.
Die gleiche Methode wie Fosfomycin wurde für die anderen Antibiotika zur Herstellung der ursprünglichen Serienlösung verwendet. 1,6 mg Pulverantibiotika wurden auf Ceftriaxon und 3,2 mg auf Meropenem und Gentamicin mit einer Präzisionswaage gewogen. Für jedes Antibiotikum wurden sieben Verdünnungen vorgenommen. So wurden acht verschiedene Konzentrationen von Antibiotikumverdünnungen für Meropenem, Gentamicin und Ceftriaxon erhalten (Abbildung 1).
Abbildung 1: Vorbereitungsschritte von Fosfomycin-Verdünnungslösungen. Serielle Verdünnungsschritte werden verwendet, um Arbeitskonzentrationen zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Herstellung von Agarmedium
Kationenjustierter Mueller-Hinton Agar (CAMHA) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Er wurde bei 121 °C und 1 atm für 15–20 Minuten mit einem Autoklaven sterilisiert und anschließend in einem Wasserbad bei 45–55 °C gehalten.
Alle biologischen Materialien wurden durch Autoklavierung bei 121 °C für 15–20 Minuten vor der Entsorgung sterilisiert. Antibiotikahaltige Abfälle wurden gemäß institutionellen Biosicherheits- und Chemikalienabfallprotokollen entsorgt.
Entscheidender Schritt: Halten Sie die Agar-Temperatur zwischen 45–55 °C vor der Zugabe von Antibiotikum. Übermäßige Hitze kann die Fosfomycin-Aktivität verringern und die MIC-Ergebnisse beeinflussen.
Hinzufügung von G6P zum Medium
Zur Bestimmung der Fosfomycin-Suszeptibilität empfiehlt EUCAST, 25 μg/mL Glukose-6-phosphat (G6P) zu Agar- und Brühenmedium5 hinzuzufügen. Für jeden Liter Agar wurden 25 mg G6P in 20 ml MHA aufgelöst, zum Sterilisieren gefiltert und dann in die Hauptcharge des Agars gemischt.
Herstellung von Agar-Verdünnungsplatten
Um die MIC-Werte der Monotherapie für Fosfomycin, Meropenem, Gentamicin und Ceftriaxon zu bestimmen, wurde pro Verdünnung eine Petriplatte verwendet (z. B. 8 Verdünnungen für Fosfomycin, von 2–256 μg/mL). Die Antibiotikakonzentrationen wurden auf den Platten vermerkt.
Für die Kombinationsstudie wurden die Konzentrationen von Fosfomycin und dem anderen untersuchten Antibiotikum auf den Platten festgestellt (z. B. Fosfomycin 256 μg/mL und Meropenem 32 μg/mL). Daher wurden für jede Kombination 64 Platten vorbereitet, und die Konzentration von Fosfomycin und dem anderen verwendeten Antibiotikum wurde auf den Platten vermerkt. Insgesamt wurden 32 Meropenem-Gentamicinetri-Platten für die Monotherapie und 192 für die Kombination vorbereitet. Eine Standardzeichnung mit 56 kleinen 1 cm großen Quadraten wurde auf einer Marmoroberfläche angefertigt. Alle Platten wurden direkt auf diese Zeichnung geimpft. Daher wurden Lesen und Impfungen standardisiert (Abbildung 2 und Abbildung 3).
Abbildung 2: Standarddiagramm, erstellt für Impf- und Lesezwecke. Standardisiertes System für Impfung und Evaluation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 3: Bewertungsmethode von Agar-Verdünnungsplatten. Bewertung des bakteriellen Wachstums zur Bestimmung des MIC. F = Fosfomycin; M = Meropenem. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Zwei Milliliter Antibiotikalösung wurden mit 18 ml geschmolzenem CAMHA gemischt, um die endgültige Arbeitskonzentration zu erhalten. Dieses Medium, das gemäß dem Herstellerbeilage zubereitet wurde, wurde in einem Warmwasserbad auf 45−55 °C gekühlt. Ein Teil (2 ml) der Antibiotikamischung wurde verwendet, und 9 Teile (18 ml) MHA wurden in den Petrischalen gemischt (das Antibiotikum wurde 1/10 verdünnt). Das endgültige Agarplattenvolumen wurde auf etwa 20 mL pro Platte standardisiert (18 mL Agar + 2 mL Antibiotikalösung), und die endgültigen Antibiotikakonzentrationen wurden nach Verdünnung berechnet. Auf diese Weise wurden Antibiotikakonzentrationen in den Agar-Verdünnungsplatten erreicht (2–256 μg/mL für Fosfomycin, 0,0625–8 μg/mL für Ceftriaxon und 0,125–16 μg/mL für Meropenem und Gentamicin). Platten, die aus dem Medium ohne antibiotische Lösung hergestellt wurden, wurden als Wachstumskontrolle verwendet (Abbildung 4). Die Mischungen aus Medium und antibiotischer Lösung konnten bei Raumtemperatur fest werden.
Abbildung 4: Kontrollmedium ohne antibiotische Lösung. Medium ohne Antibiotika wird verwendet, um die bakterielle Lebensfähigkeit zu bestätigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Kritischer Schritt: Ungleichmäßige Agar-Tiefe oder unzureichende Mischung von Antibiotika kann zu ungenauer MIC-Interpretation und falschen Wechselwirkungsergebnissen führen.
Herstellung und Impfung von Isolaten
Zuvor gelagerte reine Stämme wurden bei Raumtemperatur auf 5%-Schafsblutagar überführt und bei 37 °C 16–24 Stunden inkubiert. Kolonien aus frischen Kulturen wurden in steriler Kochsalzlösung suspendiert, und mit einem optischen Leser wurde eine Trübung von 0,5 McFarland erreicht.
Die Agar-Verdünnungsmethode erforderte ein bakterielles Inokulum von etwa 10–4 CFU pro Fleck. Ein Wert von 0,5 McFarland enthält etwa 10à 8 CFU/ml Bakterien. Eine bakterielle Dichte von 107 CFU/mL wurde erreicht, indem die Lösung 1:10 mit steriler Kochsalzlösung verdünnt wurde.
2 μL jeder bakteriellen Suspension wurden mit einer automatischen Pipette aus dem Rohr entnommen. Dieses Volumen entspricht ungefähr 2 × 104 CFU pro Spot. Die Inokulation erfolgte an gezielten Bereichen der Agaroberfläche, beginnend mit der Platte mit der niedrigsten Fosfomycinkonzentration und weiter bis zur höchsten.
Daher wurde die Impfung als CFU pro Fleck definiert, wobei jeder Impfpunkt etwa 10 bis4 CFU enthält. Die Impfung jeder bakteriellen Suspension war innerhalb von 15 Minuten abgeschlossen.
Vor der Impfung der fosfomycinhaltigen Platten wurde eine Wachstumskontrollplatte geimpft, um auf Kontamination zu prüfen. Die Impfung wurde bei Zimmertemperatur trocknen lassen. Die Inkubation erfolgte bei 35–37 °C für 16–24 Stunden unter aeroben Bedingungen, und die Trübung wurde mit einem kalibrierten Densitometer gemessen.
Eine übermäßige Inokulumdichte kann zu nachlaufendem Wachstum führen und die Bestimmung des Endpunkts erschweren. Die Trübung auf 0,5 McFarland neu anpassen und die Impfung wiederholen, falls ein konfluentes Wachstum auftritt.
Kombinationstests
Die pulverisierten Antibiotika Meropenem, Fosfomycin, Gentamicin, Ceftriaxon und Glucose-6-phosphat wurden verwendet.
Die Antibiotikamengen wurden mit der Formel Volumen/Gewicht/Potenz berechnet. Nach der Vorbereitung der Lagerlösungen wurden Antibiotikalösungen in Konzentrationen von drei doppelfachen Verdünnungen oberhalb und vier zweifachen Verdünnungen unterhalb des anfälligen MIC-Bereichs hergestellt. Die Verdünnungsbereiche wurden mit 2–256 μg/mL für Fosfomycin, 0,0625–8 μg/mL für Ceftriaxon und 0,125–16 μg/mL für Gentamicin und Meropenem berechnet (Tabelle 2, Tabelle 3 und Tabelle 4).
Tabelle 2: Herstellung von Antibiotikalösungen für die Kombination von Fosfomycin-Gentamicin. Vorbereitungsschritte und -konzentrationen, die für Material und Arbeitslösungen verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: Herstellung von Antibiotikalösungen für die Kombination von Fosfomycin-Meropenem. Vorbereitungsschritte und -konzentrationen, die für Material und Arbeitslösungen verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 4: Herstellung von Antibiotikalösungen für die Kombination von Fosfomycin-Ceftriaxon. Vorbereitungsschritte und -konzentrationen, die für Material und Arbeitslösungen verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
In dieser Studie wurden separate Fosfomycin-Lagerlösungen für Monotherapie- und Kombinationsexperimente hergestellt, um Unterschiede in den Endverdünnungsfaktoren während der Agar-basierten Tests auszugleichen. Für Monotherapie-Experimente wurde eine Standard-Stocklösung verwendet, während für Kombinationsexperimente eine angepasste, höher konzentrierte Stocklösung verwendet wurde, um die zusätzliche Verdünnung während der Antibiotika-Vormischung auszugleichen.
Serienlösungen wurden als erster Schritt für die serielle Verdünnung vorbereitet. Für Fosfomycin wurden 256 mg Pulver unter sterilen Bedingungen genau mit einer analytischen Waage gewogen und in 50 ml sterilem destilliertem Wasser mit kontinuierlichem Mischen (magnetischer Rührer) gelöst, bis eine vollständige Auflösung erreicht war, was zu einer Endkonzentration von 5120 μg/mL Fosfomycin-Disodium führte. Separate Lagerlösungen aus Gentamicin, Meropenem und Ceftriaxon wurden hergestellt.
Für serielle zweifache Verdünnungen wurden sieben sterile konische Röhren mit 25 ml sterilem destilliertem Wasser vorbereitet. Aus der Standardlösung wurden 25 ml mit einer verstellbaren Pipette in das erste Rohr übertragen, gefolgt von sequentiellem Transfer in nachfolgende Röhren, um zweifache serielle Verdünnungen zu erreichen. Jede Röhre wurde nach jedem Transferschritt 5–10 Sekunden lang mit einem Vortexmischer vermischt. Aus dem Endrohr wurden 25 ml entsorgt, um gleiche Volumina zu gewährleisten. Auf diese Weise wurde eine Verdünnungsreihe gewonnen, die eine niedrigste Konzentration von 40 μg/mL ergab, und insgesamt wurden acht verschiedene Fosfomycin-Konzentrationen hergestellt.
Das gleiche Verfahren wurde bei Gentamicin, Meropenem und Ceftriaxon angewendet. Aufgrund von Unterschieden in den Zielkonzentrationsbereichen wurden jedoch 16 mg Gentamicin und Meropenem (im Bereich von 0,125–16 μg/mL) und 8 mg Ceftriaxon (für einen Bereich von 0,0625–8 μg/mL) separat in 50 mL sterilem destilliertem Wasser unter aseptischen Bedingungen bei Raumtemperatur gelöst. Serielle zweifache Verdünnungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Die endgültig niedrigsten Konzentrationen betrugen 2,5 μg/mL für Gentamicin und Meropenem sowie 1,25 μg/mL für Ceftriaxon. Für jedes Antibiotikum wurden acht Röhrchen mit 25 mL unterschiedlicher Konzentrationen vorbereitet. Da Fosfomycin in Kombination mit drei Antibiotika getestet wurde, wurden insgesamt 24 Fosfomycin-Verdünnungsröhrchen (8 × 3) vorbereitet.
Zur Agarpräparation wurden 18 ml Mueller–Hinton-Agar, ergänzt mit Glukose-6-phosphat (25 μg/mL), auf 45–50 °C vorgekühlt und in sterile Petrischalen gegeben. Anschließend wurden 1 ml Fosfomycin-Lösung und 1 ml der zweiten Antibiotikalösung mit sterilen Pipetten hinzugefügt. Die Platten wurden sanft durch Kreisrotation vermischt, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten, und konnten bei Raumtemperatur erstarren. Durch gleichvolumige Mischung und Agarzugabe wurden die Antibiotikakonzentrationen etwa um das 9-fache reduziert.
Für die Kombinationstests wurde 1 mL der niedrigsten Fosfomycinkonzentration (40 μg/mL) mit 1 mL jeder der acht Gentamicin-Verdünnungen (2,5–320 μg/mL) kombiniert, dann zu separaten Petrischalen hinzugefügt und sanft vermischt. Das gleiche Verfahren wurde für die nächste Fosfomycinkonzentration (80 μg/mL) wiederholt und schrittweise bis 5120 μg/mL fortgesetzt, um sicherzustellen, dass alle möglichen Konzentrationskombinationen getestet wurden. Für jede Übertragung wurde eine neue sterile Pipettenspitze verwendet, um Kreuzkontamination zu verhindern. Insgesamt wurden 64 Petrischalen (8 × 8 Kombinationen) für die Fosfomycin–Gentamicin-Kombination zubereitet (Tabelle 5).
Das gleiche Verfahren wurde auf Fosfomycin in Kombination mit Meropenem und Ceftriaxon angewendet, was zu 64 Platten pro Antibiotikakombination führte (Tabelle 6 und Tabelle 7).
Tabelle 5: Anordnung der Fosfomycin-Gentamicin-Kombination auf MHA-Medium. Anordnung der Antibiotikumkonzentrationen auf Mueller–Hinton-Agar. FF = Fosfomycin; GN = Gentamicin. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 6: Anordnung der Fosfomycin-Meropenem-Kombination auf MHA-Medium. Anordnung der Antibiotikumkonzentrationen auf Mueller–Hinton-Agar. FF = Fosfomycin; MEM = Meropenem. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 7: Anordnung der Fosfomycin-Ceftriaxon-Kombination auf MHA-Medium. Anordnung der Antibiotikumkonzentrationen auf Mueller–Hinton-Agar. FF = Fosfomycin; CRO = Ceftriaxon. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Nach der Herstellung der Antibiotikamischungen wurden 18 ml geschmolzenen Mueller–Hinton-Agar (45–50 °C) zu jeder Platte mit 1 ml der Antibiotikamischung hinzugefügt, um sicherzustellen, dass die Temperaturbedingungen die Wirkung der Antibiotika nicht beeinträchtigen. Dies führte zu einer etwa neunfachen Verdünnung der ursprünglichen antibiotischen Lösung.
Zur systematischen Bewertung wurden die Platten in einem schachbrettartigen (zweidimensionalen Verdünnungs-)Format angeordnet. Die Fosfomycinkonzentrationen waren entlang der vertikalen Achse (Reihen A–H) organisiert, mit der höchsten Konzentration in Reihe A und abnehmenden Konzentrationen in Richtung Reihe H. Das zweite Antibiotikum wurde entlang der horizontalen Achse (Spalten 1–8) angeordnet, mit steigenden Konzentrationen von Spalte 1 bis Spalte 8. Jede well-äquivalente Position stellte daher eine einzigartige Kombination zweier Antibiotikakonzentrationen dar, was eine umfassende Bewertung der Wechselwirkungseffekte ermöglichte.
Ergebnisbewertung
Die Ergebnisse der minimalen inhibitorischen Konzentration wurden gemäß den Empfehlungen von EUCAST v.11 bewertet. Wachstumskontrollplatten zeigten sichtbares bakterielles Wachstum, während Sterilitätskontrollplatten (unimpft) kein Wachstum zeigten. Der MIC wurde als die niedrigste Konzentration definiert, bei der kein sichtbares Wachstum stattfand. Für Kombinationstests wurden die Interaktionseffekte anhand von FICI-Werten interpretiert. Synergie wurde definiert als FICI ≤ 0,5, Gleichgültigkeit als > 0,5–4 und Antagonismus als > 4. Für Fosfomycin galten MIC-Werte ≤ 32 μg/mL als anfällig, und solche > 32 μg/mL als resistent. Für Gentamicin und Meropenem (bei Meningitis-Infektionen) galten MIC-Werte ≤ 2 μg/mL als anfällig, und solche > 2 μg/mL als resistent. Für Meropenem (bei Nicht-Meningitis-Infektionen) galten MIC-Werte ≤ 2 μg/mL als anfällig. Werte > 8 μg/mL wurden als resistent eingestuft, MIC ≤ 1 μg/mL für Ceftriaxon (bei nicht-meningitisbedingten Infektionen) als anfällig, MIC ≤ 2 μg/mL für Ceftriaxon (bei Meningitisinfektionen) als anfällig, und MIC > 1 μg/mL für Ceftriaxon (bei Meningitisinfektionen) als resistent16.
Die statistische Analyse der Studiendaten erfolgte mit statistischer Software.
Statistik: Kategoriale Variablen wurden als Zahlen und Prozentsätze ausgedrückt. Pearsons Chi-Quadrat-Test wurde für Vergleiche verwendet, bei denen alle erwarteten Zellzählungen ≥5 betrugen. Fishers exakter Test wurde für Analysen mit kleinen Stichprobengrößen oder bei einer erwarteten Zellzahl von <5 verwendet. Konkret wurde der Chi-Quadrat-Test für Gesamtvergleiche der Fosfomycin-Resistenzraten verwendet, während Fishers exakter Test für Untergruppenanalysen synergistischer, additiver und antagonistischer Wechselwirkungsraten aufgrund niedrigfrequenter Verteilungen in einigen Kombinationen verwendet wurde. Ein P-Wert ≤ 0,05 galt als statistisch signifikant.
Interpretationshinweis: Winzige einzelne Kolonien innerhalb der Hemmungszonen wurden nicht als wachsend betrachtet, es sei denn, sie waren zusammenfließend oder in wiederholten Tests reproduzierbar.
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Schlussfolgerungen
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Insgesamt wurden 60 carbapenemresistente E. coli-Isolate in die Studie aufgenommen. Alle Isolate wurden von Patienten entnommen, die auf Intensivstationen oder klinischen Stationen der medizinischen Fakultätskliniken der Dicle University hospitalisiert wurden. Erwachsene Patienten machten 83,3 % der Fälle aus, während pädiatrische Patienten 16,7 % ausmachten (Tabelle 8 und Tabelle 9). Bei 80 % (n = 48) der Isolate wurde Multiarzneimittelresistenz beobach...
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Offenlegungen
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Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.
Danksagungen
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Diese Studie wurde von der Scientific Research Projects Coordination Unit (DÜBAP) der Universität Dicle mit der Projektnummer SBE.21.004 unterstützt.
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