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Forschungsartikel
Diese Studie zeigt, dass die Shengdu Pingmu-Formel Verstopfung bei Ratten lindert, indem sie den Wassergehalt des Stuhls und den Darmantrieb erhöht. Die Effekte stehen im Zusammenhang mit der Aktivierung des PI3K/AKT-Weges, der Hochregulation von AQP3 und AQP8 sowie der Modulation der Zusammensetzung der Darmmikrobiota.
Verstopfung ist eine häufige Magen-Darm-Erkrankung, und aktuelle Behandlungen haben oft Einschränkungen. Die Shengdu Pingmu-Formel (SDPF), eine modifizierte Formulierung, die aus der traditionellen chinesischen Medizin abgeleitet ist, wurde klinisch zur Behandlung von Verstopfung eingesetzt, doch ihr Wirkmechanismus bleibt unklar. Diese Studie nutzte die UPLC-Q/TOF-MS-Analyse, um 188 Verbindungen in SDPF zu identifizieren, von denen 50 eindeutig bestätigt wurden. In Tierversuchen verbesserte die SDPF-Behandlung signifikant den Darmantrieb, erhöhte den Stuhlwassergehalt und verkürzte die Zeit bis zum ersten schwarzen Stuhl. Netzwerkpharmakologie und molekulare Andockungsanalysen deuteten auf die Beteiligung des PI3K/AKT-Signalwegs hin, der anschließend durch beobachtete Hochregulierung dieses Weges und erhöhte Expression von AQP3 und AQP8 im Rektum validiert wurde. Darüber hinaus zeigte die 16S-rRNA-Gensequenzierung, dass SDPF die Homöostase der Darmmikrobiota wiederherstellte, indem es nützliche Bakterien wie Lactobacillus und Bacteroides erhöhte und gleichzeitig Bakterien reduzierte, die mit Entzündungen assoziiert wurden. Insgesamt lindert SDPF effektiv Verstopfung durch Mechanismen, die den PI3K/AKT-Weg regulieren und die Darmmikrobiota modulieren.
Verstopfung ist eine weit verbreitete Magen-Darm-Erkrankung, die durch seltene Stuhlgange, Anspannung und harten Stuhl gekennzeichnet ist und etwa 20 % der Weltbevölkerung betrifft und erhebliche sozioökonomische Auswirkungenhat. Chronische Verstopfung verursacht nicht nur körperliche Komplikationen wie Hämorrhoiden, Analfissuren und Stuhlverstopfungen, sondern trägt auch zu psychischen Belastungen bei, einschließlich Angstzuständen und Depressionen, was die Lebensqualität der Patienten stark beeinträchtigt2. Konventionelle Therapien, darunter osmotische Abführmittel und Ballaststoffsupplemente, erzielen oft suboptimale Ergebnisse aufgrund begrenzter Wirksamkeit, möglicher Nebenwirkungen und Abhängigkeitsrisikos3. Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) bietet einen ganzheitlichen Ansatz, bei dem pflanzliche Formulierungen und Akupunktur verwendet werden, um die Darmbeweglichkeit durch Wiederherstellung des Qi-Flusses und der viszeralen Homöostasezu regulieren. Das Fehlen standardisierter Protokolle und mechanistischer Klarheit schränkt jedoch die breitere klinische Akzeptanz ein. Neue Forschungsergebnisse heben das Potenzial neuartiger Interventionen hervor, wie die Modulation der Darmmikrobiota und bioaktive, von TCM abgeleitete Verbindungen, die die Darmfunktion synergetisch mit minimalenNebenwirkungen verbessern können. Daher bietet die Entwicklung einer evidenzbasierten integrativen Therapie, die TCM-Prinzipien mit moderner Pharmakotherapie kombiniert, vielversprechende Chancen, das Management von Verstopfung zu revolutionieren.
Die langsame Transitverstopfung (STC) ist ein wichtiges pathologisches Modell in der Grundlagenforschung, das effektiv die charakteristische Motilitätsstörung der menschlichen Verstopfung simuliert – signifikant verzögerte Colonic Transit6. Er dient als "Decoder" zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der Verstopfung und ermöglicht es Forschern, pathologische Veränderungen im rektalen Gewebe7, im enterischen Nervensystem8, in den interstitialen Zellen von Cajal9 und in wichtigen Signalwegen10 direkt zu untersuchen und so makroskopische Symptome mit zellulären und molekularen Anomalien zu überbrücken, die fürklinische Studien unerreichbar sind.. International umfassen etablierte Methoden zur Entwicklung von STC-Rattenmodellen hauptsächlich chemisch induzierte Ansätze12, insbesondere die Verwendung von Loperamid – einem peripheren Opioidrezeptor-Agonisten, der die neuronale Aktivität und die Freisetzung von Acetylcholin unterdrückt, um innerhalb von 5–7 Tagen einen verzögerten Transit konsequent zu induzieren – sowie ätiologieähnliche Strategien13, wie die langfristige, hochdosierte stimulierende Verabreichung von Abführmitteln, die zu einer Beeinträchtigung des Darmnervs führt, Melanosis coli, und daraus resultierende abführmittelabhängige Darmträgheit. So bietet das STC-Rattenmodell nicht nur einen Einblick in die komplexe Ätiologie der Verstopfung, sondern dient auch als entscheidende Brücke, die grundlegende mechanistische Erkenntnisse mit klinischen Anwendungen verbindet.
Die Shengdu Pingmu-Formel (SDPF), bestehend aus Radix Paeoniae Alba (Baishao), Curcuma longa (Jianghuang), Rhizoma cibotii (Tanggouji), Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao) und Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian), ist eine modifizierte Krankenhauszubereitung, die aus der Theorie der traditionellen chinesischen Medizin abgeleitet ist und seit langem in unserer Abteilung für verwandte Erkrankungen verwendet wird. Vorläufige klinische Beobachtungen aus unserem Krankenhaus deuteten darauf hin, dass SDPF Verstopfungssymptome lindern könnte (unveröffentlichte Daten). Forschungen haben gezeigt, dass der PI3K/AKT-Signalweg an der Regulation der Darmbeweglichkeit14 beteiligt ist, bei der die Darmmikrobiota und ihre Metaboliten eine entscheidende Rolle spielen können, indem sie enterische neuronale und glatte Muskelaktivitätenmodulieren. Dennoch sind die genauen Regulationsmechanismen weiterhin unvollständig verstanden. Wir schlagen vor, dass der PI3K/AKT-Weg und die Darmmikrobiota zusammen eine wesentliche Achse zur Regulation der Darmbeweglichkeit bilden. Es wird vermutet, dass die therapeutischen Effekte von TCM-Formulierungen auf die Colon-Dysmotilität mit der Modulation des PI3K/AKT-Wegs und der Neuausrichtung der Mikrobiota-Darm-Achse verbunden sein könnten. Diese Studie schließt diese Lücke, indem sie eine neuartige, integrierte Hypothese vorschlägt und testet: dass der PI3K/AKT-Weg und die Darmmikrobiota als kritische, voneinander abhängige Achse für die Darmbeweglichkeit fungieren. Das Hauptziel dieser Arbeit ist zu bestimmen, ob die therapeutische Wirkung von SDPF auf Verstopfung im langsamen Transit durch die duale Modulation dieser Achse vermittelt wird. Konkret haben wir mit einem Rattenmodell die Auswirkungen von SDPF auf wichtige PI3K/AKT-Signalproteine, Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota und die Funktion der Darmmotilität untersucht. Durch die Aufklärung dieses kombinierten Mechanismus liefert diese Forschung, soweit wir wissen, den ersten experimentellen Nachweis für eine Mikrobiota-PI3K/AKT-Achse als einheitliches Ziel einer TCM-basierten Intervention und bietet damit eine umfassendere molekulare Grundlage für die Behandlung von Darmmotilitätsstörungen.
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Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Nutzung von Labortieren (National Institutes of Health, überarbeitet 2011) durchgeführt und vom Ethikprüfungsausschuss der Shandong University of Traditional Chinese Medicine genehmigt (Lizenznummer für Wohlfahrtsethik: SDUTCM20250421238).
Vorbereitung der SDPF
Die Kräutermischung besteht aus Radix Paeoniae Alba (Baishao) 20 g, Curcuma longa (Jianghuang) 10 g, Rhizoma cibotii (Tanggouji) 10 g, Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao) 30 g und Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian) 30 g. Dieses Kombinationsverhältnis wurde auf Basis klinischer Erfahrung bestimmt. Die Formel wurde gewonnen, indem zunächst 30 Minuten in deionisiertem Wasser im Feststoff-zu-Flüssig-Verhältnis von 1:9 (g/mL) eingeweicht und anschließend 60 Minuten gekocht wurde. Die resultierende Lösung wurde sofort durch Gaze gefiltert und bei 4.500 ×g für 5 Minuten mit 4.500 g zentrifugiert, um das Überwassermittel zu sammeln. Der Rückstand wurde dann zweimal unter denselben Bedingungen (1:9-Verhältnis, deionisiertes Wasser) mit einer reduzierten Siedezeit von 30 Minuten pro nachfolgenden Extraktion erneut extrahiert. Die Supernatanten aus allen drei Extraktionen wurden kombiniert, konzentriert und 5–7 Tage lang vakuumgefriertrocknet, um das SDPF-Pulver zu gewinnen, das für den weiteren Gebrauch unter Kühlung gelagert wurde.
Bestandteilsanalyse der SDPF
Zur Herstellung fester Proben wurde eine geeignete Menge homogenisierten Materials in ein 2-mL-Zentrifugenrohr übergeben, kombiniert mit 1 ml 70 % Methanol in Wasser und 3 mm Edelstahlperlen, dann 3 Minuten in einem automatischen Mühlen verarbeitet, gefolgt von 10 Minuten Vortex. Flüssigproben wurden mit reinem Methanol verdünnt und 10 Minuten lang vortexiert. Anschließend wurden alle Proben bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, und die resultierenden Übersupernatanten wurden durch einen 0,22-μm-Filter gefiltert. Vor der instrumentellen Analyse wurde 2-Chlorophenylalanin (interner Standard, 100 μg/mL) in das Filtrat eingebracht, um eine Endkonzentration von 1 mg/L zu erreichen. Die chromatographische Trennung erfolgte auf einem LC-MS-System mit einer C18-Säule (1,8 μm × 2,1 mm × 100 mm), die bei 30 °C gehalten wurde und eine Durchflussrate von 0,3 mL/min. Die mobile Phase bestand aus 0,1 % Ameisensäure in Wasser (A) und reinem Acetonitril (B). Das Einspritzvolumen wurde auf 2 μL eingestellt, und der Autosampler wurde bei 4 °C gehalten. Die Massenspektrometrie-Detektion erfolgte sowohl im positiven als auch im negativen Ionisationsmodus unter folgenden Bedingungen: Heiztemperatur bei 325 °C, Mantelgas bei 45 beliebigen Einheiten, Hilfsgas bei 15 arb, Sweep-Gas bei 1 arb, Elektrosprühspannung bei 3,5 kV, Kapillartemperatur bei 330 °C und S-Objektiv-RF-Pegel bei 55 %. Die Daten wurden im Full-Scan-MS-Modus mit einer Auflösung von 120.000 MHz über einen m/z-Bereich von 100–1500 erhoben, während die MS/MS-Fragmentierung im datenabhängigen Erfassungsmodus (dd-MS2, TopN=5) mit 60.000 Sekunden Auflösung mittels höherenergetischer Kollisionsdissoziation durchgeführt wurde.
Tierversuch
Zweiundsiebzig männliche Sprague-Dawley-Ratten (6 Wochen alt, Anfangsgewicht 180–200 g; RRID: IMSR_JAX:000664) wurden unter SPF-Bedingungen (24 ± 1 °C, 12 h Hell/Dunkel-Zyklus) untergebracht und hatten freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Nach einer Woche der Akklimatisierung wurden sie zufällig in sechs Gruppen (n=12/Gruppe) basierend auf dem Körpergewicht eingeteilt: (1) Blankkontrolle (Normalsalzlösung), (2) Verstopfungsmodellgruppe (10 mg/kg Lotermamidhydrochlorid), (3) niedrig(SDPF-L)-, (4) mittel(SDPF-M)- und (5) hochdosierte SDPF-Gruppen (6, 9 bzw. 12 g/kg) und (6) positive Kontrolle (2 mg/kg Mosapridcitrat). SDPF wurde frisch als Suspension in destilliertem Wasser mit Konzentrationen von 3, 4,5 und 6 g/mL vorbereitet und mit einem festen Volumen von 2 mL/kg oral verabreicht, entsprechend Dosen von 6, 9 bzw. 12 g/kg. Loperamid-Hydrochlorid wurde frisch als Suspension in destilliertem Wasser mit einer Konzentration von 5 mg/mL vorbereitet und oral mit einem festen Volumen von 2 mL/kg (entspricht 10 mg/kg) verabreicht. Nach einer Woche der Akklimatisierung wurde die Verstopfung in den Gruppen (2) – (6) durch orale Gavage von Lopramidhydrochlorid einmal täglich für eine Woche ausgelöst. Die Blank-Kontrollgruppe erhielt ein äquivalentes Volumen normaler Kochsalzlösung. In der folgenden Woche erhielten Ratten in den Gruppen (3)–(5) eine SDPF-Behandlung per oraler Gavage einmal täglich, die positive Kontrollgruppe (6) erhielt zusätzlich gleichzeitig Mosapridcitrat (2 mg/kg), während Ratten in den Gruppen (2) – (6) weiterhin einmal täglich Loperamidhydrochlorid (10 mg/kg) erhielten, um das Verstopfungsmodell aufrechtzuerhalten. Die Blindkontrollgruppe erhielt weiterhin normale Kochsalzlösung. Am Ende der Behandlungsphase wurden alle Ratten über Nacht gefastet und hatten freien Zugang zu Wasser. Die Tiere wurden anschließend mit einer intraperitonealen Injektion von Natriumpentobarbital (40 mg/kg Körpergewicht) betäubt. Nach einer tiefen Anästhesie, die durch das Fehlen von Pedalreflexen bestätigt wurde, wurden die Ratten durch eine zervikale Verrenkung eingeschläfert. Unmittelbar danach wurden rektale Gewebe schnell entnommen. Für histologische und immunhistochemische Analysen wurden Gewebesegmente in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Für die Proteinexpressionsanalyse wurden Gewebeproben in flüssigem Stickstoff gefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.
Erster schwarzer Hocker
Die Zeit bis zur Ausscheidung des ersten schwarzen Stuhls wurde für drei Ratten pro Gruppe aufgezeichnet. Vor dem Experiment wurden alle Ratten 12 Stunden lang mit freiem Zugang zu Wasser gefastet. Jedes Tier erhielt anschließend eine intragastrische Verabreichung einer vorbereiteten Tintensuspension (5 % Aktivkohle und 5 % Gummi Arabisch) mit einer Dosis von 10 ml/kg Körpergewicht, wobei der genaue Zeitpunkt der Verabreichung erfasst wurde. Nach dem Gavage wurden die Ratten einzeln in getrennten Käfigen mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser untergebracht. Das Auftreten des ersten schwarzen Stuhls jeder Ratte wurde sorgfältig beobachtet und dokumentiert, um die Darmtransitzeit zu berechnen.
Stuhlwassergehalt
Nach erfolgreicher Modellbildung und am Ende der Behandlung wurden frische Kotproben, die innerhalb von 2 Stunden ausgeschieden wurden, von jeder Gruppe von Ratten entnommen (n = 6) und in vorgewogene, trockene EP-Röhrchen gelegt. Das nasse Gewicht des Kotes wurde sofort registriert. Anschließend wurden die Proben in einen Trocknungsofen übergeben und bei 60 °C für 36 Stunden getrocknet. Nach der anfänglichen Trocknungsphase wurden die Proben gewogen und in den Ofen zurückgegeben, wobei alle 2 Stunden Gewichtsmessungen wiederholt wurden, bis ein konstantes Gewicht erreicht wurde (was auf vollständige Dehydration hinweist). Der Prozentsatz des Kotwassergehalts wurde anschließend mit folgender Formel berechnet:
Fäkalwassergehalt (%) = [(Nasses Gewicht - Trockengewicht) / Nasses Gewicht] × 100 %
Intestinale Antriebsrate
Nach einer 12-stündigen Fastenzeit (mit freiem Zugang zu Wasser) erhielten Ratten jeder Gruppe (n = 6) eine intragastrische Dosis (10 ml/kg) Tintesuspension mit 5 % Aktivkohle und 5 % Gummi arabicum. Fünfundzwanzig Minuten später wurden die Tiere durch eine intraperitoneale Injektion von 5 % Chloralhydrat narkosiert. Der Bauchbereich wurde vor der Gewebeentnahme mit 75 % Ethanol desinfiziert, und die Gliedmaßen wurden anschließend an einer Dissektionstafel befestigt. Die Bauchhöhle wurde vorsichtig mit einer chirurgischen Schere freigelegt, und der Darmtrakt vom Pylorus bis zum ileozekalen Übergang wurde entfernt. Der isolierte Darm wurde auf sterilem Filterpapier begradigt und zwei Messungen erfasst: (1) die Gesamtlänge des Dünndarms und (2) die Strecke, die die Tintenfront zurücklegte. Das Intestinal-Antriebsverhältnis wurde dann mit folgender Formel berechnet:
Darmantriebsrate (%) = (Tintewanderentfernung / Gesamtdarmlänge) × 100 %
HE-Fleck
Für die Kontroll-, Modell-, SDPF-M- und Mos-Gruppen (n = 3 pro Gruppe) wurden rektale Proben entnommen und zur Färbung von Hämatoxylin und Eosin (HE) verarbeitet. Die Proben waren in 4 % Paraformaldehyd fixiert, in gradiertem Ethanol dehydriert und in Paraffinblöcke eingebettet. Dünne Schnitte mit einer Dicke von 4–5 μm wurden vorbereitet und an Glasobjektträgern befestigt, bevor sie der konventionellen Hämatoxylin- und Eosin-Färbung unterzogen wurden. Das Verfahren begann mit der Deparaffinisierung mit Xylol, gefolgt von der Rehydrierung durch eine Reihe absteigender Ethanolkonzentrationen. Die Kerne wurden durch 5–8 Minuten mit Hämatoxylin ausgesetzte Schnitte gefärbt. Nach der Differenzierung von 1 % Säurealkohol und Bläun in 0,2 % Ammoniakwasser wurden das Zytoplasma und die extrazelluläre Matrix für 1–2 Minuten mit Eosin gegenfärbt. Schließlich wurden die gefärbten Abschnitte ausgetrocknet, befreit und mit Deckdecken zur mikroskopischen Beobachtung befestigt. Dieser Ansatz ermöglichte eine detaillierte Bewertung der Darmschleimhautmorphologie, einschließlich der Struktur von Villi und Krypten, des Zustands der Epithelzellen und des Vorhandenseins entzündlicher Infiltrationen in der Lamina propria.
KEGG-Weg- und GO-Anreicherungsanalyse
Unter Verwendung des zuvor etablierten chemischen Profils von SDPF wurden Silico-Vorhersagen der Proteinziele für jeden Bestandteil mit der Plattform SwissTargetPrediction durchgeführt. Vermutete Ziele, die für Verstopfung relevant sind, wurden gefiltert und mit der funktionalen Annotation in der DAVID 6.8-Datenbank unterzogen, mit einer Signifikanzgrenze von P < 0,05. Der daraus resultierende Gensatz wurde anschließend der GO-Klassifikation unterzogen, um seine Rolle in biologischen Prozessen, molekularen Funktionen und zellulären Komponenten zu erläutern. Um ihre Beteiligung an der Krankheitspathogenese weiter zu verdeutlichen, wurden diese Ziele anschließend auf KEGG-Signalwege abgebildet, wobei mehrere Signalkaskaden aufgedeckt wurden, die signifikant angereichert waren und möglicherweise an Beginn und Entwicklung von Verstopfung beteiligt waren.
Bau des "Component-Target-Pathway"-Netzwerks
Ein "Component-Target-Pathway"-Netzwerk wurde in Cytoscape (Version 3.6.1) zusammengestellt, indem die chemischen Bestandteile von SDPF, deren entsprechende therapeutische Ziele für Verstopfung und die entsprechenden angereicherten Signalwege systematisch integriert wurden. Innerhalb dieses grafischen Modells wurden verschiedene Knotengeometrien verwendet, um die drei Datentypen darzustellen: Kreise für Verbindungen, Dreiecke für Ziele und Rechtecke für Pfade. Die Stärke der Verbindungen zwischen diesen Knoten wurde durch Kantengewichtung quantifiziert, was einen ganzheitlichen Überblick über die komplexen, vielschichtigen pharmakologischen Wechselwirkungen bietet.
Molekulare Andockung
Für die molekulare Andockungsanalyse wurden vier bioaktive Verbindungen – nämlich Cyclocurcumin, Albiflorin, Chlorogensäure und Quercetin – als Ligandenmoleküle ausgewählt, deren Strukturen aus der PubChem-Datenbank mit entsprechenden CAS-Registernummern heruntergeladen wurden. Um die Proteinrezeptoren vorzubereiten, wurde die UniProt-Wissensdatenbank konsultiert, um die Zielproteine PI3K und AKT zu bestätigen, und ihre dreidimensionalen Strukturen wurden anschließend aus der RCSB Protein Data Bank abgerufen. Diese Protein- und Verbindungsstrukturen wurden dann im Discovery Studio 2019 verarbeitet, wo Wasserstoffatome hinzugefügt, Ladungen zugewiesen und Atomtypen definiert wurden; Zusätzlich wurden potenzielle Bindungstaschen an den Rezeptoren identifiziert. Die vorbereiteten Liganden und Rezeptoren wurden anschließend im PDBQT-Format für Andocksimulationen gespeichert. Das Andockverfahren wurde mit folgender Konfiguration durchgeführt: ein Pose-Cluster-Radius von 0,5, Erzeugung von 10 zufälligen Ligand-Konformationen und 10 Verfeinerungsorientierungen. Nach Abschluss der Andockläufe wurden die Kandidatenkomplexe bewertet und nach ihren vorhergesagten Bindungsfreien Energien bewertet. Die energetisch günstigsten Bindungspositionen wurden schließlich ausgewählt und mit PyMOL visualisiert, um wichtige intermolekulare Interaktionen zu veranschaulichen.
Immunhistochemie
Paraffin-eingebettete rektale Proben, die auf eine Dicke von 4 μm geschnitten und aus den Behandlungskohorten Control, Model und SDPF-M gewonnen wurden, wurden zunächst paraffinfrei und progressiv hydratisiert. Antigen-Stellen wurden enttarnt, indem die Objektträger im auf pH 6,0 angepassten Citratpuffer erhitzt wurden. Zur Bekämpfung endogener Peroxidasen wurden die Gewebe mit einer 3%igen Wasserstoffperoxidlösung behandelt, gefolgt von der Inkubation mit normalem Ziegenserum, um die unspezifische Antikörperbindung zu reduzieren. Die Schnitte wurden dann über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern inkubiert, die sich auf phosphorylierte PI3K und AKT konzentrieren; parallele Sektionen, die mit PBS inkubiert wurden, dienten als negative Kontrollen. Nach gründlicher Wäsche wurden sekundäre Antikörper mit Meerrettichperoxidase-Konjugation aufgetragen, und eine Immunfärbung wurde unter mikroskopischer Beobachtung mit einem DAB-Chromogen entwickelt, um die Reaktionszeit zu steuern. Abschließend wurden die Gewebe leicht mit Hämatoxylin gekontert, durch gradualisierte Alkohole dehydriert, geklärt und montiert. Die Expressionsniveaus von p-PI3K und p-AKT wurden qualitativ von zwei unabhängigen Forschern bewertet, die auf die experimentellen Gruppen geblindet waren, und repräsentative Bilder wurden ausgewählt, um Unterschiede zwischen den Gruppen zu veranschaulichen.
Westliche Blotting
Rektale Gewebeproben von Ratten wurden zweimal mit gekühltem, phosphatgepufferter Kochsalzlösung abgespült, bevor sie 10 Minuten lang auf Eis in einem geeigneten Volumen RIPA-Lysepuffer homogenisiert wurden. Nach der Homogenisierung wurde das Gemisch bei 15.000 × g zentrifugiert, und das Supernatant wurde zur Analyse zurückgehalten. Die Proteinquantifizierung erfolgte mit der Methode der Bicinconinsäure. Anschließend wurden die Proben mit dem SDS-Ladepuffer kombiniert und durch eine Inkubation bei 95 °C für 5 Minuten denaturiert. Äquivalente Proteinmengen wurden dann durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgelöst und auf Polyvinyliden-Difluoridmembranen mit einer Porengröße von 0,45 μm elektrotransferiert. Nach dem Transfer wurden die Membranen an der Luft trocknen, bevor sie mit 5 % fettarmer Trockenmilch in TBST für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur blockiert wurden. Nach diesem Schritt wurden die Membranen mit TBST gespült und dann über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern inkubiert, die auf AQP3 (RRID: AB_2837708) und AQP8 (RRID: AB_605941) abzielten. Am nächsten Tag wurden die Membranen nach weiteren Waschen mit TBST mit dem entsprechenden Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörper für 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Immunreaktive Bänder wurden schließlich mit einem Bildgebungssystem entdeckt und erfasst.
Immunfluoreszenz
Das Immunfluoreszenzfärbungsverfahren wurde an rektalen Gewebeschnitten von Kontroll-, Modell- und SDPF-M-behandelten Ratten wie folgt durchgeführt: Nach der Kryosektion wurden Gewebe in 4 % Paraformaldehyd fixiert, mit 0,1 % Triton X-100 permeabilisiert und mit einem geeigneten Blockpuffer blockiert, um eine unspezifische Bindung zu verhindern. Die Schnitte wurden anschließend über Nacht bei 4 °C mit einer Mischung aus primären Antikörpern gegen AQP3 und AQP8 inkubiert, danach wurden die ungebundenen Antikörper weggespült und das Gewebe 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur im Dunkeln mit einer Mischung sekundärer Antikörper inkubiert – insbesondere Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit Alexa Fluor 594 (rot) zur Markierung von AQP3, und ziegen-anti-maus-IgG, konjugiert mit Alexa Fluor 488 (grün) zur Markierung von AQP8. Nach der sekundären Antikörperinkubation und anschließenden Wascharbeiten wurden die Zellkerne mit DAPI gegenfärbt, und die Objektträger wurden vor der Visualisierung und Bildaufnahme mit einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop mit einem wässrigen Montagemedium gedeckt.
16S rRNA-Sequenzierung der fäkalen Mikrobiota
Für jede Versuchsgruppe (n = 8) wurde bakterielle genomische DNA aus Rattenkotmaterial mit einem kommerziellen Boden-DNA-Extraktionskit isoliert, wobei alle Verfahren strikt dem Protokoll des Lieferanten folgten. Die PCR-Amplifikation, die die V3–V4 hypervariablen Regionen des 16S-rRNA-Gens zielt, wurde auf einem thermischen Zykler unter Verwendung des Primerpaares 338F/806R durchgeführt. Die Amplicon-Sequenzierung wurde auf der Illumina MiSeq-Plattform gemäß den Richtlinien des Herstellers durchgeführt, wodurch eine ausreichende Sequenzierungstiefe erzeugt wurde, um eine Sättigung der Verdünnungskurve zu erreichen und eine zuverlässige Analyse der mikrobiellen Diversität zu gewährleisten. Nach Abschluss der Sequenzierung wurden die Rohlesungen qualitätsgefiltert, mit Adaptern entfernt und mit Trimmomatic und FLASH zusammengeführt. Hochwertige Sequenzen wurden anschließend mit UPARSE zu operativen taxonomischen Einheiten (OTUs) mit einer Ähnlichkeitsschwelle von 97 % gruppiert, und potenzielle chimerische Sequenzen wurden mit UCHIME identifiziert und entfernt. Die taxonomische Zuordnung repräsentativer Sequenzen erfolgte mit dem RDP-Klassifikator anhand der SILVA-Referenzdatenbank, mit einer Konfidenzschwelle von 70 %. Zur Bewertung der Alpha-Diversität innerhalb mikrobieller Gemeinschaften wurden der Chao1-Reichtumsschätzer und der Shannon-Diversitätsindex mit dem Mothur-Softwarepaket (v.1.30.2) berechnet. Für die Beta-Diversitätsanalyse wurde die Hauptkoordinatenanalyse durchgeführt, um kompositionelle Unterschiede zwischen Gruppen zu visualisieren. Ein Venn-Diagramm wurde erstellt, um die Verteilung einzigartiger und gemeinsamer OTUs über verschiedene experimentelle Bedingungen hinweg zu veranschaulichen. Die Identifizierung unterschiedlich häufiger Taxa zwischen Kohorten erfolgte mittels der linearen Diskriminantenanalyse der Effektgröße. Schließlich wurde die prädiktive Profilierung mikrobieller Gemeinschaftsfunktionen mit PICRUSt2 durchgeführt, das das funktionale Potenzial aus KEGG-Orthologieannotationen ableitete.
Statistiken
Alle statistischen Analysen wurden mit SPSS 23.0 und GraphPad Prism 8.0 durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Die Normalität der Datenverteilung wurde mit dem Shapiro–Wilk-Test bewertet. Für Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurde der unabhängige Schüler-t-Test für normalverteilte Daten verwendet, und der Mann–Whitney-U-Test für nicht-normalverteilte Daten. Für Vergleiche mit drei oder mehr Gruppen wurde für normalverteilte Daten eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test verwendet, während für nicht-normalverteilte Daten der Kruskal–Wallis-Test gefolgt von Dunns Post-hoc-Test verwendet wurde. Für Mikrobiom-Analysen wurden unterschiedlich häufige Taxa mittels linearer Diskriminantenanalyse-Effektgröße (LEfSe) mit dem Standardschwellenwert (LDA-Wert > 2,0) identifiziert, und multiple Testkorrekturen wurden mit der Benjamini–Hochberg-Falschentdeckungsrate (FDR)-Methode angewendet. Mikrobiom-statistische Analysen wurden mit Mothur (v.1.30.2), LEfSe (Online-Tool, Huttenhower-Labor) und PICRUSt2 (v.2.5.0) durchgeführt. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
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SDPF-Extraktion und Lyophilisation
SDPF ist eine multipflanzliche Formulierung, die fünf Heilpflanzen umfasst: Radix Paeoniae Alba (Baishao), Curcuma longa (Jianghuang), Rhizoma cibotii (Tanggouji), Siegesbeckia orientalis L. (Xixiancao) und Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian) (Abbildung 1A). Die Mischung wurde mit gereinigtem Wasser extrahiert und zu Pulver geblendet, um sie weiter analysi...
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Chronische Verstopfung ist eine multifaktorielle Störung, die komplexe Wechselwirkungen zwischen Darmmikrobiota-Dysbiose, beeinträchtigter neuromuskulärer Funktion und veränderter Darmsekretion umfasst. Diese Manifestationen halten länger als sechs Monate an und beeinträchtigen die Lebensqualität der Patientenerheblich 19. Verstopfung lässt sich in mehrere Subtypen einteilen, darunter Slow-Transit, Normaltransit, Defäkationsstörung und gemischte Typen
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Finanzierung: Diese Forschung wurde vom Shenzhen Science and Technology Program unterstützt (Zuschussnummer JCYJ20220531092203007).
Wir sind Dr. Liqun Qu von der Shandong University of Traditional Chinese Medicine zutiefst dankbar für die technische Beratung bei der Entwicklung des Rattenverstopfungsmodells.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Automatische Mühle | Hochdurchsatz-Gewebehomogenisator für die Probenschleifung | JXFSTPRP-48 | |
| LC-MS-System | Thermo Fisher Scientific | Q Exaktives HF LC-MS-System | Ultra-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie; Massenspektrometriesystem |
| Massenspektrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exaktiver HF | Hochauflösendes Orbitrap-Massenspektrometer |
| C18-Säule | Agilent Technologien | Zorbax Eclipse Plus C18 (2,1 & mal; 100 mm, 1,8 μ m) | Umkehrphasen-Säule für die zusammengesetzte Trennung |
| Bildabbildungs-Scansystem | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | Gel- und Blot-Bildgebungssystem |
| Thermocycler | Angewandte Biosysteme (Thermo Fisher Scientific) | GeneAmp PCR System 9700 | PCR-Verstärkungsinstrument |
| Boden-DNA-Extraktionsset | Omega Bio-Tek | D5625 | Kit zur Extraktion von mikrobieller DNA aus Fäkal-/Bodenproben |
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