Forschungsartikel

Biochemische und histopathologische Effekte der Hirudotherapie in einem Rattenmodell von chronischem körperlich bedingtem physiologischem Stress

123 Ansichten

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DOI:

10.3791/70494

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22. Mai 2026

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1Faculty of Medicine, Department of Medical Parasitology, Kırşehir Ahi Evran University, 2Faculty of Medicine, Department of Histology and Embriyology, Kırşehir Ahi Evran University, 3Faculty of Sports Sciences, Department of Coaching Education, Kırşehir Ahi Evran University, 4Faculty of Medicine, Department of Medical Biochemistry, Kırşehir Ahi Evran University, 5Faculty of Medicine, Department of Physiology, Kırşehir Ahi Evran University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll etabliert ein Rattenmodell für chronisch-aktivitätsinduzierten physiologischen Stress, um Stressreaktionen zu untersuchen. Es ermöglicht eine kontrollierte Bewertung der Hirudotherapie-Trainings-Interaktionen durch serumbiochemische Profilierung und histopathologische Analysen. Es bietet einen reproduzierbaren Rahmen zur Untersuchung der Erholungsmechanismen nach dem Training.

Zusammenfassung

Chronische Betätigung kann physiologischen Stress auslösen, der durch Muskelschäden, oxidatives Ungleichgewicht und hormonelle Veränderungen gekennzeichnet ist und die Erholung sowie die Leistung beeinträchtigen kann. Die Hirudotherapie, eine traditionelle biotherapeutische Intervention, die entzündungshemmende, antioxidative und zirkulationsfördernde Bestandteile enthält, hat als potenzielle natürliche Genesungsstrategie Interesse geweckt. Diese Studie zielte darauf ab, die biochemischen und histopathologischen Effekte der Hirudotherapie nach chronischer Belastung in einem Rattenmodell des durch Bewegung induzierten physiologischen Stresses zu bewerten. Zweiunddreißig männliche Ratten wurden in vier Gruppen eingeteilt: Kontroll, Hirudotherapie, Bewegung und Hirudotherapie plus Bewegung. Serumbiochemische Parameter und oxidative Stressmarker wurden analysiert, und Skelettmuskulatur sowie Lebergewebe wurden histopathologisch untersucht, um durch Belastung induzierte Veränderungen und mögliche modulatorische Effekte der Hirudotherapie zu bewerten. Ratten, die chronischer Belastung ausgesetzt waren, zeigten biochemische und strukturelle Anzeichen physiologischen Stresses. Die Hirudotherapie war mit einer partiellen Abschwächung dieser Veränderungen verbunden, insbesondere bei histopathologischen Befunden, während Veränderungen der oxidativen Stressmarker statistisch nicht signifikant waren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hirudotherapie eine modulative Wirkung auf die Erholungsprozesse nach dem Training haben könnte; weitere Studien sind jedoch erforderlich, um seine Auswirkungen auf die Signale des oxidativen Stresses zu klären.

Einleitung

Traditionelle medizinische Praktiken wurden in einer Vielzahl klinischer Kontexte zur Behandlung verschiedener akuter und chronischer Erkrankungeneingesetzt 1,2. Dazu gehört die medizinische Blutegeltherapie (Hirudotherapie) und hat eine lange Geschichte der Anwendung in verschiedenen Kulturen und medizinischen Systemen. In den letzten Jahren hat dieser traditionelle Ansatz aufgrund seiner potenziellen therapeutischen Wirkung bei verschiedenen klinischen Erkrankungen, darunter entzündliche Erkrankungen, Arthrose und Gefäßerkrankungen 1,2,3, wieder wissenschaftliches Interesse erregt. Diese Effekte werden hauptsächlich auf die komplexe Mischung bioaktiver Moleküle im Leech-Speichel zurückgeführt, die antikoagulante, entzündungshemmende und antimikrobielle Eigenschaften aufweisen 3,4,5. Darüber hinaus haben experimentelle Studien in Tiermodellen gezeigt, dass die Hirudotherapie durch antioxidative, entzündungshemmende und antiapoptotische Mechanismen schützende Wirkungen gegen Gewebeschäden habenkann.

Der Speichel von Hirudo verbana, der am häufigsten in der Therapie eingesetzten Art, enthält eine Vielzahl bioaktiver Bestandteile, darunter Hirudin, Bdellin, Eglin und Calin sowie Enzyme wie Hyaluronidase und verschiedene Metaboliten mit niedrigem Molekulargewicht. Diese Bestandteile zeigen antikoagulierende, entzündungshemmende, antioxidative, fibrinolytische, analgetische und krebshemmende Wirkungen 2,7. Dieses breite biologische Aktivitätsprofil deutet darauf hin, dass Leech-Speichel (LS) als ergänzendes therapeutisches Werkzeug in modernen biomedizinischen Anwendungen dienen kann; Seine systemischen Effekte unter bestimmten physiologischen Stressbedingungen sind jedoch noch unvollständig verstanden3.

Intensive oder langanhaltende körperliche Aktivität kann mikrostrukturelle Schäden an den Muskelmembranen hervorrufen, was zu signifikanten Erhöhungen der Serumspiegel von Enzymen wie Kreatinkinas (CK), Laktatdehydrogenase (LDH) und Aspartataminotransferase (AST) führt. Alanin-Aminotransferase (ALT) kann ebenfalls als Reaktion auf Muskelverletzungen zunehmen, allerdings typischerweise in geringerem Maße als AST 5,8,9. Darüber hinaus löst hochintensives oder langanhaltendes Training Cortisolerhöhungen aus, ein wichtiges Stresshormon, wobei die Reaktionen je nach Trainingsintensität, Dauer und individuellem physiologischem Statusvariieren 10,11. Nach dem Training können auch erhöhte Blutzuckeranstiege auftreten, die größtenteils durch Cortisol-vermittelte Glukoneogenese verursacht werden und ein Markenzeichen der metabolischen Stressreaktion12 darstellen. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass sowohl biochemische Marker für Muskelschäden als auch Indikatoren für metabolischen Stress nach anstrengendem Trainingansteigen.

Verschiedene Strategien, darunter Massage, Kaltwassertauchen und antioxidantienreiche Nahrungsergänzungsmittel (z. B. Polyphenole, Säurekirschextrakt und Curcumin), wurden hinsichtlich ihres Potenzials zur Unterstützung der Erholung nach dem Training untersucht. Systematische Übersichten legen nahe, dass diese Interventionen oxidativen Stress und Muskelschädigungsparameter beeinflussen können; Ihre Wirksamkeit variiert jedoch erheblich von Person zu Person und bietet möglicherweise nicht konstant ausreichenden biochemischen Schutz 13,14,15. Dementsprechend wächst das Interesse daran, alternative oder komplementäre Ansätze zu erforschen, die unter Bedingungen von körperlich ausgelöstem physiologischem Stress zusätzliche Vorteile bieten können. In diesem Zusammenhang wurde berichtet, dass bioaktive Verbindungen im Leech-Speichel oxidativen Stress und Entzündungsreaktionen modulieren7. Darüber hinaus deuten klinische Beobachtungen darauf hin, dass die Hirudotherapie Schmerzen und Entzündungen reduzieren kann, insbesondere bei muskuloskelettalen und vaskulären Erkrankungen1.

Mehrere in LS identifizierte Verbindungen, darunter Flavonoide, phenolische Moleküle und andere bioaktive Bestandteile, tragen durch die Modulation der oxidativen Stresswege zur Abschwächung entzündlicher Reaktionen bei. Diese antioxidativen Eigenschaften können synergetisch mit anderen Speichelkomponenten wirken und das gesamte entzündungshemmende Potenzial der Hirudotherapie 7,16 steigern. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Proteaseinhibitoren wie Bdellin und Eglin die Aktivität von neutrophil-abgeleiteten Enzymen verringern und somit Gewebeschädenbegrenzen 4. Darüber hinaus wurde berichtet, dass verschiedene Peptide und lipidabgeleitete Moleküle, die in Blutsaugergeweben identifiziert wurden, hemmende Effekte auf entzündliche Signalwegeausüben 17.

Trotz dieser Ergebnisse bleibt die potenzielle Rolle der Hirudotherapie bei körperlich bedingtem physiologischem Stress unzureichend erforscht, insbesondere in kontrollierten experimentellen Modellen 1,2,4. Obwohl frühere Studien ihre entzündungshemmende, antikoagulanten und mikrozirkulatorischen Wirkungen gezeigt haben und Bewegung bekannt dafür ist, Muskelschäden und oxidative Stressreaktionen auszulösen18, sind Studien, die biochemische, hormonelle und histopathologische Ergebnisse in einem einzigen experimentellen Rahmen integrieren, begrenzt.

Daher wurde die vorliegende Studie darauf ausgelegt, eine umfassende experimentelle Bewertung der Hirudotherapie in einem kontrollierten Modell des durch Bewegung induzierten physiologischen Stresses zu liefern, indem biochemische, hormonelle und histopathologische Ergebnisse integriert werden. Dieser multidimensionale Ansatz zielt darauf ab, zum Verständnis der potenziellen modulatorischen Effekte der Hirudotherapie beizutragen und einen reproduzierbaren Rahmen zur Bewertung komplementärer biotherapeutischer Interventionen bereitzustellen.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien19 durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde vom lokalen Ethikkomitee für Tierversuche der Kırşehir Ahi Evran-Universität überprüft und genehmigt (Genehmigungsnummer: 03.06.2025-05-1, Türkei). Alle Verfahren entsprachen den institutionellen Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Tierauswahl und Unterbringung

Zweiunddreißig männliche Wistar-Albinoratten (RRID: RGD_2308852; 8–12 Wochen alt, 200–250 g) wurden verwendet. Die Tiere wurden einzeln in Polycarbonatkäfigen (40 cm × 25 cm × 20 cm) mit Holzscherbett untergebracht. Die Umweltbedingungen wurden bei 22–24 °C mit einem 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkelzyklus aufrechterhalten. Nahrung und Wasser wurden ad libitum bereitgestellt.

Vor Beginn der Experimente wurde eine einwöchige Eingewöhnungsphase durchgeführt. In dieser Zeit wurden die Tiere täglich auf Futteraufnahme, Flüssigkeitszufuhr, Pflegeverhalten und Bewegungsaktivität überwacht. In die Studie wurden nur Tiere mit normalem physiologischem Verhalten eingeschlossen.

2. Experimentelle Gruppen und Randomisierung

Die Tiere wurden zufällig vier experimentelle Gruppen (n = 8 pro Gruppe) mithilfe einer computergenerierten Randomisierungssequenz zugeteilt. Die Verschleierung der Zuteilung wurde sichergestellt, indem Tieren vor der Gruppenzuweisung numerische Kennungen zugewiesen wurden. Die experimentellen Gruppen bestanden aus der Kontrollgruppe (C), die keine Intervention erhielt; die Trainingsgruppe (E), die nur auf dem Laufband trainierte; die Hirudotherapiegruppe (H), die dreimal pro Woche allein die Hirudotherapie erhielt; und die kombinierte Hirudotherapie-plus-Trainingsgruppe (HE), die beide Interventionen gemäß dem Studienprotokoll durchlief. Alle Interventionen wurden über einen Zeitraum von zwei Wochen durchgeführt. Um die zirkadiane Variabilität zu minimieren, wurden alle Eingriffe zwischen 09:00 und 11:00 Uhr durchgeführt.

3. Chronisches Trainingsprotokoll

Die Übung erfolgte auf einem motorisierten Nagetierlaufband mit einem verstellbaren elektrischen Stimulationsgitter. Die Tiere wurden auf einzelne Spuren des Laufbandgeräts platziert (Abbildung 1). Eine zweitägige Anpassungsphase wurde mit einer Geschwindigkeit von 15 m/min für 15 Minuten pro Tag durchgeführt. Nach der Anpassungsphase wurde die Bewegungsintensität auf 20 m/min erhöht, und die Tiere wurden zwei Wochen lang täglich mit 45 Minuten pro Tag gelaufen. Ein leichter elektrischer Reiz (1,0 mA) wurde über das Gitter angelegt, wenn es notwendig war, um den kontinuierlichen Betrieb aufrechtzuerhalten.

  1. Erschöpfungskriterien
    Erschöpfung wurde definiert als die Unfähigkeit, das Schockgitter für drei aufeinanderfolgende Stimulationen (~5 Sekunden je) zu verlassen. Tiere, die diese Schwelle erreichten, wurden sofort entfernt. Dieses Protokoll wurde von zuvor etablierten Nagetier-Laufband-Trainingsmodellen mit definierten Anpassungs-, Intensitätsprogressions- und Erschöpfungskriterien20 adaptiert.
  2. Anwendung der Hirudotherapie
    Medizinische Blutegel (Hirudo verbana, ~2 g) wurden aus einer institutionell zertifizierten Quelle bezogen. Vor dem Auftragen wurde der dorsale Bereich jedes Tieres mit einem elektrischen Haarschneider rasiert und die Haut vorsichtig mit steriler Kochsalzlösung ohne Antiseptika gereinigt, um eine Abschreckung des Blutegelansatzes zu verhindern. Anschließend wurden die Tiere in ein transparentes Acryl-Fixierrohr gelegt, um die Bewegung zu begrenzen und gleichzeitig Stress zu minimieren. Ein einzelner Blutegel wurde auf der dorsalen Mittellinie platziert, und die erfolgreiche Befestigung wurde visuell durch orale Saugfixierung bestätigt. Das Füttern war für 10 Minuten erlaubt (Abbildung 2). Nach der Applikationsphase wurden die Blutegel abgetrennt, indem der Anheftungsbereich mit einem Baumwollapplikator, der etwa 1–2 cm von der Stelle entfernt gehalten wurde, 70 % Ethanoldampf ausgesetzt wurde. Nach der Abtrennung wurde die lokale Blutung etwa 1–2 Minuten mit sterilem Gaze unter sanftem Druck kontrolliert, ohne dass genäht wurde. Die Bewerbungen wurden dreimal pro Woche über zwei Wochen durchgeführt. Dieses Verfahren wurde auf Basis zuvor beschriebener experimenteller und klinischer Hirudotherapieprotokolle mit standardisierten Anwendungsparametern21 durchgeführt.

4. Euthanasie und Blutentnahme

Am Ende des Experiments (24 Stunden nach der letzten Intervention) wurden die Tiere intraperitoneal mit Ketamin (75 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) betäubt. Eine ausreichende Tiefe der Anästhesie wurde durch das Fehlen des Pedalrückzugs und der Hornhautreflexe bestätigt. Die intrakardiale Blutentnahme erfolgte anschließend mit einer sterilen 5-ml-Spritze über eine linke ventrikuläre Punktion. Die Euthanasie wurde durch Blutlosigkeit und anschließend Thorakotomie abgeschlossen. Anschließend wurden die medialen Gastrocnemius-Muskel- und Lebergewebe für weitere Analysen entnommen. Die Blutproben wurden innerhalb von 1 Stunde nach der Entnahme durch Übergabe in Gerinnselaktivatorröhren und Zentrifugation bei 1.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C verarbeitet. Das getrennte Serum wurde dann in 200 μL-Portionen aliquotiert und bis zur Analyse bei −80 °C gelagert.

5. Biochemische und ELISA-Analyse

Biochemische Parameter, darunter ALT, AST, LDH, CK, Glukose, Elektrolyte und Cortisol, wurden mit einem automatisierten biochemischen Analysator nach standardisierten Laborverfahren analysiert. Alle ELISA-Tests für CAT, SOD, MDA und GPX wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers unter standardisierten Bedingungen durchgeführt. Serumproben wurden 1:5 mit Probenpuffer verdünnt, wenn es das Kit-Protokoll benötigt. Anschließend wurden 50 μL Standards und 50 μL Serumproben zu den vorgesehenen Bohrungen hinzugefügt und bei 37 °C für 60 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten fünfmal mit dem bereitgestellten Waschpuffer gewaschen, um ungebundene Komponenten zu entfernen. Der Nachweisantikörper (50 μL) wurde dann jedem Brunnen zugesetzt und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die Substratlösung hinzugefügt und die Reaktionsmischung unter dunklen Bedingungen 10–15 Minuten inkubiert, um die Farbentwicklung zu ermöglichen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μL Stoplösung beendet, und die optische Dichte wurde mit einem Mikroplattenleser bei 450 nm gemessen. Alle Proben wurden doppelt analysiert, um die analytische Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit sicherzustellen.

6. Histopathologische Analyse

Für die histopathologische Begutachtung wurden Gewebeproben gemäß den standardisierten histopathologischen Verfahren22 verarbeitet. Die Gewebe wurden zunächst 72 Stunden in 10 % neutralem gepuffertem Formalin fixiert, gefolgt von einer Dehydration durch eine graduierte Ethanolserie mit 50 %, 70 %, 80 %, 96 % und 100 % Ethanol, mit einer 1 Stunde Inkubation pro Konzentration. Nach der Dehydrierung wurden die Gewebe für zwei aufeinanderfolgende 30-minütige Phasen mit Xylol befreit und anschließend in Paraffinblöcke eingebettet. Schnitte mit einer Dicke von 5 μm wurden mit einem rotierenden Mikrotom gewonnen und mit Hämatoxylin, Eosin (H&E) und Masson's Trichrome für die histologische Untersuchung gefärbt. Abschließend wurden die gefärbten Objektträger mit einem Lichtmikroskop untersucht, das mit einem digitalen Bildgebungssystem ausgestattet war.

7. Statistische Analyse

Die Datenanalyse wurde mit statistischer Software durchgeführt. Die Datenverteilung wurde mit dem Kolmogorov–Smirnov-Test bewertet. Für normal verteilte Daten wurde ein Einweg-ANOVA gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test angewendet. Für nicht-normalverteilte Daten wurde der Kruskal–Wallis-Test verwendet, gefolgt vom Mann–Whitney-U-Test. Ein p-Wert < 0,05 galt als statistisch signifikant.

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Ergebnisse

Muskelschäden und Ermüdungsparameter

Serummuskelschädigungsmarker zeigten, dass sich die Kreatininkinase-(CK)-Werte zwischen den Gruppen signifikant unterschieden (p < 0,05). Obwohl LDH-, AST- und ALT-Werte in der Übungsgruppe (E) Aufwärtstrends zeigten, waren diese Veränderungen statistisch nicht signifikant (s. > 0,05). Die CK-Konzentrationen waren in der E-Gruppe am höchsten, während die HE-Gruppe deutlich niedrigere Werte...

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Diskussion

Diese Studie zeigte, dass die Hirudotherapie mit messbaren Veränderungen ausgewählter Parameter im Zusammenhang mit körperlich ausgelöstem physiologischem Stress assoziiert war. Die in der Trainingsgruppe beobachteten Erhöhungen bei CK, LDH, AST und ALT spiegeln eine sarkolemme Störung und Enzymleckage wider, was mit früheren Berichten übereinstimmt, die diese Marker als Indikatoren für eine Muskelzerrung 23,24,25 beschrieben.

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Danksagungen

Wir danken dem Personal des Experimentellen Forschungslabors der Universität Kırşehir Ahi Evran für ihre Unterstützung bei der Tierpflege und Probenentnahme. Wir erkennen auch die wertvolle technische Unterstützung der Histologie- und Biochemielabore während der Gewebeverarbeitung und biochemischen Analysen an. Diese Studie wurde von der Koordinationseinheit für wissenschaftliche Forschungsprojekte (BAP) der Kırşehir Ahi Evran-Universität im Rahmen des Projekts Nr. TIP unterstützt. A2.25.004.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
-80°F; C Tiefkühler (Modell DF590)Nü VeDF590Sample-Speicher bei & minus; 80&Degree; C
Acryl-RestrainerröhreN/AN/ATransparenter Acrylfixier (6 cm Durchmesser, 20 cm Länge), der zur Immobilisierung während der Hirudotherapie zur Immobilisierung verwendet wird
Automatisierter biochemischer Analysator (Alinity)AbbottN/AVerwendet für die biochemische Analyse von serumbiochemischen Parametern
Automatischer GewebeprozessorLeica BiosystemsN/AGewebedehydrierung und Paraffininfiltration
Zentrifuge (Modell FC5706)OHAUS CorporationFC5706Maximale Drehzahl: 6000 U/min (& Asymp; 4.000 & fach; g, je nach Rotorradius)
Digitale Mikroskopkamera (Axiocam 208 Farbe)Carl ZeissAxiocam 208 FarbeBildaufnahme für die Histopathologie
Eosin Y (gelblich)Merck / Sigma-Aldrich1.15935.0025H& E-Färbung (Eosin-Komponente)
Ethanol Absolute (99,5 %)Tekkim KimyaTK.200655.05001Verwendet für Ethanol-Dehydrationsserien
Formaldehydlösung (~37%)Merck / Sigma-Aldrich1.04002.2500Verwendet zur Gewebefixierung
Harris-HämatoxylinlösungBESTLABBS-002H& E-Färbung (Hämatoxylin-Komponente)
KetaminhydrochloridPharmazeutische Qualität (kommerzielle Quelle nicht angegeben)N/AVerwendet bei intraperitonealer Anästhesie (75 mg/kg)
Lichtmikroskop (Primo-Stern)Carl ZeissPrimo StarHistopathologische Bildgebung
Masson' s Trichrome FleckensetGBLREF 5022Verwendet zur Färbung von Bindegewebe
Motorisiertes NagetierlaufbandColumbus-InstrumenteExer-3/6Verwendet für standardisierte Laufbandübungen mit kontrollierter Geschwindigkeit und elektrischer Stimulation
Rat Catalase (KAT) ELISA KitBT LABE0869Ra96-Bohrlochplatten; Serum-CAT-Aktivitätsmessung
Rat Glutathion-Peroxidase (GPX1) ELISA-KitReed BiotechRE2557R96-Bohrlochplatten; Serum-CAT-Aktivitätsmessung
Rat Malondialdehyd (MDA) ELISA KitBT LABE0156Ra96-Bohrlochplatten; Serum-CAT-Aktivitätsmessung
Ratten-Superoxid-Dismutase (SOD) ELISA-KitBT LABE0168Ra96-Bohrlochplatten; Serum-CAT-Aktivitätsmessung
Rotierendes Mikrotome (Autocut)Leica BiosystemsRM AutocutCutting 5 & mu; m-Paraffinschnitte
RutschwärmerLeica BiosystemsHI1210Trocknung von Histologie-Objektträgern
XylazinhydrochloridPharmazeutische Qualität (kommerzielle Quelle nicht angegeben)N/AVerwendet zur intraperitonealen Anästhesie (10 mg/kg)
Xylol (Mischung von Isomeren)Tekkim KimyaTK.090270.05003Gewebereinigung vor der Einbettung von Paraffin

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Biochemische EffekteMarker f r oxidativen StressMuskelsch digungErholung nach der k rperlichen Belastungentz ndungshemmende Therapie

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