Methodenartikel

Untersuchung der netzwerkweiten Mechanismen der pallidalen Tiefenhirnstimulation mit hochdichten Mikroelektrodenarrays

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DOI:

10.3791/70507

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16. Juni 2026

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1Oscar Langendorff Institute of Physiology, University Medical Center Rostock, 2Institute of General Electrical Engineering, University of Rostock, 3Institute for Pharmacology, Pharmacy and Toxicology, University of Leipzig, 4Institute of Applied Microelectronics and Computer Engineering, University of Rostock

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für ex-vivo Hochdichte-Mikroelektroden-Array-Aufnahmen von akuten Kleinhirnschnitten eines dystonen Hamstermodells, das in vivo kontinuierliche pallidale tiefe Gehirnstimulation über 11 Tage erhielt.

Zusammenfassung

Dystonie ist eine neurologische Bewegungsstörung, die durch eine abnormale Muskelkontrolle gekennzeichnet ist, die willkürliche Bewegungen und anhaltende Haltungen beeinflusst. Obwohl Dystonie mit einer Dysfunktion der Basalganglien assoziiert ist, deuten zunehmende Hinweise darauf hin, dass das Kleinhirn an seiner Pathophysiologie beteiligt ist. Dieses Protokoll präsentiert in vivo pallidale Deep Brain Stimulation (DBS) in einem dystonen Hamstermodell (DTsz Hamster), kombiniert mit ex vivo High-Density Microelectrode Array (HD-MEA)-Aufnahmen, um die cerebellare Aktivität zu untersuchen. Das Protokoll umfasst (1) DBS-Chirurgie zur Implantation von Elektroden und Stimulatoren, (2) akute Kleinhirnschnittpräparation, (3) hochauflösende elektrophysiologische Aufzeichnungen und (4) Datenanalyse. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass 11 Tage pallidale DBS die Spike-Aktivität auf normale Werte in der molekularen, Purkinje- und Granularschicht wiederhergestellt haben, was mit einer Beteiligung des kleinhirnbedingten Netzwerks an der Dystonie übereinstimmt. Dieses Protokoll ermöglicht eine detaillierte Analyse der Kleinhirnaktivität und deren Modulation durch DBS und bietet eine Plattform zur Untersuchung netzwerkbasierter Mechanismen der Neuromodulationstherapien.

Einleitung

Dystonie ist die dritthäufigste Bewegungsstörung1 und zeichnet sich durch deutliche klinische Anzeichen und Symptome 2,3 aus, obwohl sie manchmal mit anderen motorischen Störungen verwechselt werden kann 4,5,6. Die auffälligsten klinischen Merkmale sind unwillkürliche Muskelkontraktionen, wiederholte Bewegungen sowie abnormale und/oder verdrehte Haltung7. Diese Merkmale können von Symptomen wie Schmerzen, eingeschränkter motorischer Leistungsfähigkeit und Müdigkeit begleitet werden, die sich während Phasen von Stress, Angst oder körperlicher Erschöpfung verschlimmern können 8,9,10,11. Die Pathophysiologie der Dystonie ist noch nicht vollständig verstanden12,13. Obwohl sich Studien traditionell auf die Basalganglien konzentriert haben, stützen zunehmend Belege ein netzwerkbezogenes Konzept der Erkrankung, das mehrere Hirnregionen umfasst, darunter das Kleinhirn 14,15,16,17. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Aktivität des extrazellulären Netzwerks über verschiedene Schichten des Kleinhirnrindes hinweg zu untersuchen, um deren Rolle in der Pathophysiologie der Dystonie zu erläutern und die netzwerkweiten Mechanismen der tiefen Gehirnstimulation (DBS) zu verstehen.

Tiefe Hirnstimulation (DBS), die auf den Globus pallidus internus (GPi) oder den subthalamischen Kern (STN) abzielt, wird häufig zur Behandlung bestimmter Formen der Dystonie18,19 eingesetzt, insbesondere solche, die resistent gegen Medikamente sind. Darüber hinaus ist das Behandlungsergebnis heterogen und unvorhersehbar, da Patienten mit ähnlichen klinischen Erscheinungen unterschiedlich auf denselben therapeutischen Ansatz20 reagieren können. Ein umfassenderes Verständnis des neuronalen Netzwerks, das der Dystonie zugrunde liegt, könnte die Behandlungsergebnisse verbessern21. Daher sind groß angelegte und experimentelle Ansätze erforderlich, die nur durch präklinische Studien in Tiermodellen erreicht werden können. Die Kombination von in vivo DBS-Experimenten mit ex vivo High-Density Microelectrode Array (HD-MEA)-Aufzeichnungen ermöglicht eine hochauflösende Überwachung der (fast) physiologischen neuronalen Netzwerkaktivität, um die Pathophysiologie der Dystonie und die Mechanismen des DBS besser zu verstehen.

Die Basalganglien und das Kleinhirn beeinflussen jeweils die motorische Kontrolle, zumindest teilweise über ihre Verbindungen zum primären motorischen Kortex (M1)22. Eine anatomische Studie mit einer striatalen Läsion und chirurgischer Entfernung des Kleinhirns stützt diese Theorie23. In unserer Studie verwenden wir das Tiermodell des dystonischen DTsz Hamsters24,25, das kleinhirnbedingte Anomalien aufweist, die mit Dystonie26 verbunden sind. Mit hochdichten Mikroelektrodenarrays (HD-MEAs) untersuchten wir die Aktivität des kleinhirnären kortikalen Netzwerks bei dystonen und gesunden Hamstern. Konventionelle elektrophysiologische Ansätze verfügen jedoch nicht über die räumliche Auflösung, um schichtspezifische Netzwerkdynamiken zu erfassen, während diese Methode diese Einschränkung adressiert. Andererseits untersuchten wir die Wirkung der tiefen Gehirnstimulation im Globus pallidus internus auf die kleinhirnartigen kortikalen Netzwerke.

Das HD-MEA-System bietet den Vorteil detaillierter elektrophysiologischer Aufzeichnungen parallel und ermöglicht eine Analyse über die Schichten des kleinhirnären Kortex (granulare, Purkinje- und molekulare Schichten), wobei jede Schicht eine wesentliche Rolle bei der Verarbeitung von Bewegungssequenzenspielt 27. Die körnige Schicht, dicht gepackt mit Granulatzellen, empfängt und übermittelt sensorische und motorische Informationen von moosigen Fasern, was die erste Signalintegration vor der weiteren Verarbeitungermöglicht. Die Purkinje-Schicht, die Purkinje-Zellen enthält, überträgt inhibitorische Signale an die tiefen kleinhirnkären, wo die granularen und molekularen Schichten das ausgehende Signal modulieren. Die Molekularschicht, reich an Dendriten und Interneuronen, unterstützt komplexe Modulation durch synaptische Wechselwirkungen mit Purkinje-Zellen, wodurch die motorische Leistung28 feinjustiert wird. HD-MEA ist im Gegensatz zu anderen Aufzeichnungstechniken nicht durch räumliche Auflösung oder Probefläche begrenzt, sodass die einzigartigen Beiträge jeder Schicht in den veränderten neuronalen Dynamiken der Dystonie15 erfasst werden können. Dieser Ansatz bietet eine höhere räumliche Auflösung und parallele Aufzeichnungsmöglichkeiten im Vergleich zu Einzelelektroden- oder niedrigdichten Aufzeichnungsmethoden. Es gibt HD-MEA-Systeme, die auf der komplementären Metalloxid-Halbleitertechnologie (CMOS)29,30 basieren, kombiniert mit dem Active Pixel Sensor (APS)-Konzept, die funktionelle Bildgebung zur Visualisierung der elektrischen Aktivität großer Neuronenpopulationen über die Zeitermöglichen. Mit dieser Technik kann die Dynamik jeder Schicht des Kleinhirnrindes überwacht und spezifische synaptische Übertragungsprozesse durch Waschen mit verschiedenen Substanzen untersucht werden. Diese Methode eignet sich besonders für Studien zur Untersuchung komplexer neuronaler Netzwerkaktivität und schichtspezifischer Veränderungen in neurologischen Krankheitsmodellen.

Diese Arbeit behandelt technische Herausforderungen hinsichtlich der Kapselung des Stimulationssystems sowie der Gewebevorbereitung, Datenerfassung und Analyse eines großen elektrophysiologischen Datensatzes. Mit dieser Arbeit präsentieren wir eine Möglichkeit zur in-vitro-Untersuchung hochkomplexer neuronaler Prozession, die in unserem Fall einerseits zu einem differenzierteren Verständnis der pathophysiologischen Dynamik in dystonen neuronalen Netzwerken beiträgt und andererseits Wissen über den therapeutischen Wirkmechanismus von DBS liefert.

Protokoll

Verwenden Sie dystonische DTSZ-Hamster und kontrollieren Sie syrische Goldhamster für Experimente26. Insgesamt wurden in der vorliegenden Studie vier experimentelle Gruppen untersucht: (1) nicht-dystone Kontrollhamster (Wildtyp, WT), (2) einheimische unbehandelte dtsz-Hamster , (3) dtsz-Sham (wurde implantiert, jedoch ohne aktive Stimulation) und (4) dtsz-DBS (mit kontinuierlichem DBS in vivo für 11 Tage vor der Schnittpräparation). Alle Tierversuche wurden gemäß der EU-Richtlinie 2010/63/EU und den Bundesgesetzen zum Schutz von Tieren unter der Lizenz 7221.3-1-029/20 durchgeführt.

1. Tiere

  1. Halten Sie die Tiere unter den Standardbedingungen von GV Solas33 bei einem 14-Stunden-Licht/10-Stunden-Dunkelzyklus und mit freiem Zugang zu Wasser und Futter (Standard-Hamster, Altromin).
  2. Untersuchen Sie die DTsz-mutierten Hamster auf dystonische Symptome mit der Triple StimulationTechnique 26, im Alter von 20 ± 1 und 27 ± 4 Tagen
    HINWEIS: Dieses standardisierte leichte Stressverfahren besteht darin, den Hamster aus seinem Stammkäfig zu nehmen und in einen neuen leeren Käfig zu bringen, gefolgt von einer intraperitonealen oder subkutanen Injektion von Kochsalzlösung und kurzfristiger Schlafentzug. Diese Abfolge milder, angstauslösender Reize induziert zuverlässig dystonische Attacken mit reproduzierbarer Latenz und wird daher für phänotypische Screenings vor der Aufnahme in experimentelle Gruppen verwendet. Nicht-dystonische Kontrollhamster durchlaufen dasselbe Verfahren, um vergleichbare experimentelle Bedingungen zwischen den Gruppen zu gewährleisten.
  3. Bei der Analgesie werden Tiere der dtsz-Sham- und dt sz-DBS-Gruppen mit 100 mg·kg-1 Peroral (p.o.) Metamizol behandelt. Implantieren Sie beide Gruppen gemäß dem unten beschriebenen chirurgischen Verfahren.

2. Einkapselung des STELLA-Stimulationssystems

  1. Die STELLA-Stimulationssysteme sind mit einem biokompatiblen Ansatz gekapselt, um die Geräte während der chronischen Einpflanzung vor Flüssigkeitspenetration zu schützen. Die Elektronik befindet sich in einer maßgefertigten 3D-gedruckten PETG-Kapsel.
    1. Schließen Sie zwischen Deckel und Kapsel mit Silikon ab.
    2. Dichte das Gehäuse zusätzlich am Kabelausgang mit Silikon ab.
    3. Wenn nach dem Trocknen Lücken im Silikon sichtbar sind, wiederhole die Schritte 1 und 2.
    4. Nach vollständiger Verhärtung des Silikons bereiten Sie das Epoxidharz mit einem Mischverhältnis von 100:35 (Gewicht) vor.
    5. Entfernen Sie Luftblasen aus dem Harz unter Vakuum (Vevor RS-1.5).
    6. Vor der Formmontage wird eine dünne Schicht Vaseline auf die Nahtfläche der maßgefertigten Silikonform aufgetragen, um die Abdichtung zu verbessern und das Entformen nach dem Aushärten des Epoxidharzes zu erleichtern. Setzen Sie die Stimulatorkapsel in die Silikonform und füllen Sie die Form langsam mit Epoxidharz, bis die Stimulator- und Kabelverbindungen vollständig abgedeckt sind. Vermeiden Sie Luftblasen beim Befüllen.
    7. Sobald das Harz ausgehärtet ist, nehmen Sie die Kapsel aus der Form und glätten Sie die Epoxidharzoberfläche mit einer feinen Feile oder einem Polierwerkzeug, um scharfe Kanten zu entfernen.
    8. Tragen Sie eine abschließende dünne Silikonbeschichtung auf die ausgehärtete Epoxidkapsel auf, indem Sie die Kapsel in flüssiges Silikon tauchen. Verwenden Sie eine Kunststoffpipeette, um zusätzliches Silikon um das Kabel in der Nähe des Verbindungsbereichs aufzutragen. Überschüssige Silikonansammlungen sollten vor dem Aushärten mit einem Stab entfernt werden, um die Beschichtungsdicke zu vermeiden.
    9. Führen Sie schließlich einen Funktionstest nach der Kapselung durch, um die korrekte Stimulationsausgabe vor Einpflanzung oder experimenteller Anwendung zu überprüfen. Setzen Sie das STELLA-Stimulationssystem in Ringers Lösung und aktivieren Sie die magnetische BIST-Funktion. Bestätigen Sie das korrekte LED-Blinkmuster (2 × 2), was auf den korrekten Stimulationsausgang und das Fehlen von Kurzschlüssen, offenen Stromkreisen oder niedrigen Batteriebedingungenhinweist 34.

3. Chirurgischer Eingriff zur Implantation eines Stimulationssystems

  1. Bereite chirurgische Instrumente vor (Abbildung 1) und das STELLA-Stimulationssystem (software-defined implantable modular platform)34.
    1. Sterilisieren Sie die Metallinstrumente aus Abbildung 1 für etwa 5 Minuten bei 200 °C, z. B. mit dem FST Sterilisator 250. Beachten Sie, dass die Instrumente beim Entfernen heiß sind.
    2. Desinfizieren Sie das STELLA-Stimulationssystem mit den beiden DBS-Elektroden mit 70 % Ethanol. Über Nacht werden Sie das getrocknete Stimulationssystem in ein Falcon (50 ml konisches Rohr) mit Ringer-Lösung gefüllt.
  2. Bereite das Tier vor (im Alter von 25–32 Tagen)
    1. Platziere die Anästhesiekammer (selbstgemacht) in den Hamsterkäfig. Der Hamster wird nach kurzer Zeit freiwillig in die Röhre gehen (Abbildung 2A).
    2. Wenn sich der Hamster im Röhrchen befindet, schließen Sie das Rohr am Ende und verbinden Sie das Rohr für 1–2 Minuten mit dem flüchtigen Isofluran-Ausgang (Induktion der Anästhesie mit 4 % Isofluran) (Abbildung 2B).
    3. Nehmen Sie das Tier vorsichtig aus dem Zylinder. Setzen Sie das Tier auf die temperaturkontrollierte
      Oberfläche (ca. 38 °C) und mit einer Atemmaske (GM-4; Erhaltung der Anästhesie mit 3 % Isofluran; Untersuchungstiefe der Anästhesie mit dem Interdigitalen Reflex).
    4. Rasieren Sie den chirurgischen Bereich am Kopf mit einem geeigneten Haarschneider (Abbildung 2C). Reinigen Sie den Bereich mit einem feuchten Abstrich und injizieren Sie 500 μL 0,25 % Bupivakain subkutan (s.c.) in die Kopfhaut zur zusätzlichen lokalen Betäubung des Periosts. Warte mindestens 5 Minuten, bevor du die Kopfhaut öffnest.
    5. Das Tier wird vorsichtig in den stereotaxischen Rahmen übertragen und mit den Ohrstäben fixiert, sodass Bregma und Lambda auf gleicher Höhe sind (Isofluran auf 1,5–2,5 % reduzieren, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten).
    6. Schützen Sie die Augen mit einem Tränenersatz (TVM Ocry-Gel).

4. Implantieren des STELLA-Stimulationssystems

  1. Mache einen 2 cm langen Hautschnitt mittelmäßig auf der Kopfhaut. Ein Retraktor (Abbildung 1, Nr. 14 und Abbildung 2D) zieht die Haut weg. Bereiten Sie den Schädel vor, indem Sie das Periost lokal mit der Klinge durch Kratzen entfernen. Stoppe mögliche Blutungen mit Abstrichen.
  2. Trage 3 % H2O2 mit einem Baumwollspitzenapplikator zum Rauen auf.
  3. Nimm das Stimulationssystem aus Ringers Lösung und schütze die DBS-Elektroden mit Parafilm.
  4. Führe eine stumpfe Schere durch den gerade am Kopf entstandenen Hautschnitt ein und forme eine 5 cm große Hauttasche subkutan zum Hals und der Flanke hin.
  5. Setzen Sie den Stimulator ein, der aus dem Falcon entfernt und mit dermaler Desinfektion getränkt wurde.
  6. Tragen Sie etwa 500 μL Antibiotikum (10 mg·g-1 Fusidinsäure) mit einem Baumwollspitzenapplikator auf die Hauttasche auf.
  7. Bohren Sie zwei 7-mm-Löcher (mit FST#19007-07) im Schädel für DBS-Elektroden bei AP: −0,6 mm und ML: ± 2,2 mm laut Bregma.
  8. Bohren Sie zwei weitere Löcher (9 mm; FST#19007-09) seitlich auf jedem Elektrodenloch. Schrauben Sie vier Schrauben (DIN 84 A2 M1x2) in die vorbereiteten Löcher (Abbildung 2D).
  9. Zwei DBS-Elektroden (SNEX-100) mit DV implantieren: 6,0 mm laut Bregma. Bitte beachten Sie, dass der Elektrodenhalter Ihres spezifischen stereotaktischen Rahmens bestimmt, auf welcher Seite die Elektrode zuerst implantiert wird (der Abstand zwischen den Elektroden beträgt 4,4 mm).
  10. Befestigen Sie die Elektrode mit UV-Lichthärtung (Heliobond) an den beiden Schrauben. Wenn beide Elektroden implantiert sind, wird eine letzte Schicht mit UV-Licht-Aushärtung zwischen ihnen aufgebracht. Abschließend werden die Elektroden mit Compoglass Flow zementiert (Abbildung 2E).
  11. Aktivieren Sie den Stimulator der DBS-Gruppe magnetisch nach mindestens drei Tagen Erholung für 11 durchgehende 11 Tage DBS. In dieser Studie verwendeten wir Stimulationsparameter, die denen in Kliniken ähnelten (130 Hz, 50 μA und 60 μs).
  12. Überprüfen Sie das Lichtmuster des Stimulators, indem Sie täglich mit einem Magneten über die Flanke des Hamsters streichen (Abbildung 2F).

5. Herstellung akuter Kleinhirnschnitte

  1. Bereiten Sie für jedes Tier 1 Liter künstliche Rückenmarksflüssigkeit (ACSF) und 0,5 Liter Saccharose vor (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2 für Details).
  2. Verwenden Sie eine Saccharoselösung bei etwa 4 °C während der Hirnextraktion und des Schneidens mit kontinuierlicher Carbogenation. Zusätzlich bereiten Sie eiskalte, schlammige Saccharose vor, um während der schnellen Dissektion eine niedrige Gewebetemperatur zu erhalten.
  3. Bereiten Sie den Arbeitsplatz mit Dissektionswerkzeugen, Saccharoselösung, Petrischalen und Vibratom-Aufbau vor (siehe Abbildung 3A).
  4. Das Opfer der Tiere muss innerhalb von etwa 15 Minuten nach dem Absetzen des Kleinhirns erfolgen, und die Kleinhirnextraktion sollte unmittelbar danach beginnen. Das Tier wird in einer tiefen Anästhesie enthauptet, die mit flüchtigem Isofluran induziert wird. Legen Sie den Kopf in eine höhere Petrischale, gefüllt mit eiskaltem, schlammiger Accharose.
  5. Sezieren Sie das Gehirn, indem Sie mediale Schnitte durch den Rückenkanal vermeiden, um das kleinhirnige Gewebe vor Schäden zu schützen.
  6. Übertragen Sie das Gehirn in eine neue Petrischale, gefüllt mit eiskalten Slush-Saccharose, mit einem Filterpapier am Boden, um zu verhindern, dass das Kleinhirn beim Schneiden verrutscht.
  7. Zuerst entfernen Sie das Kleinhirn durch koronale Schnitte durch den Pons mit einer Klinge (Abbildung 3B). Anschließend werden die kleinhirnhalbkugeln durch parasagittale Schnitte mit einer Klinge entfernt (Abbildung 3C).
  8. Bereite die Vibratomplatte mit einem Tropfen Sekundenkleber vor. Entfernen Sie vorsichtig das kleinhirnige Blatt aus der Petrischale. Tupfen Sie die parasagittale Querschnittsebene auf ein Filterpapier zum Trocknen, bevor Sie diese Seite kleben (Abbildung 3D).
  9. Legen Sie die Vibratomi-Platte in das Tablett und füllen Sie sie mit genug Saccharose (halb schlammig, halb gelöst), um die Vermis vollständig zu untertauchen. Vergessen Sie nicht, mit Carbogen (CB) zu tanken.
  10. Parasagittale Kleinhirnschnitte mit einer Dicke von 200 μm werden bei einer konstanten Geschwindigkeit von 0,08 mm·s-1 geschnitten (Abbildung 3E). Lagern Sie die Scheiben in ACSF in einem Becher, der ständig mit CB bei Raumtemperatur begast wird (Abbildung 3F).
  11. Lassen Sie die Scheiben etwa 40 Minuten in kohlensäurehaltigem ACSF bei Raumtemperatur erholen, bevor sie in den HD-MEA übergeben, der als Wiederwärm- und Stabilisierungsphase vor der Aufnahme dient. Während dieses Zeitraums sollten Sie den ACSF auf Raumtemperatur halten.

6. Vorbereitung des CorePlateTM Single-Well des BioCAM DupleX MEA-Systems für die Aufzeichnung

  1. Schalten Sie das BioCAM DupleX-Aufnahmesystem mit der Brainwave 5-Software (BW5) mindestens 30 Minuten vor Beginn der Experimente ein.
  2. Bevor die Gewebescheibe auf das CorePlateTM Single-Well zur Aufnahme gelegt wird, beurteilen Sie den Hintergrundrauschpegel, indem Sie den Single-Well in das Aufnahmegerät einsetzen. Der optimale Rauschpegel für eine hochwertige Aufnahme sollte 9–20 μV betragen.
  3. Reinigen Sie die vergoldeten Pads mit 100 % Ethanol (Abbildung 4A-1), das Elektrodenarray mit 70 % Ethanol und einer weichen Bürste (Abbildung 4A-2). Zum Schluss spülen Sie das Elektrodenarray mit MilliQ-Wasser.
  4. Schließen Sie das HD-MEA/CorePlateTM Single-Well an das Aufnahmesystem an (Abbildung 4D-1).
  5. Pipettieren Sie etwa 2 mL ACSF in das Bohrloch. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen auf den Elektroden oder dem Boden befinden (Abbildung 4D-2).
  6. Starte die Live-Aufnahme und nimm mindestens 30 Sekunden mit BW5 auf.

7. Analyse der Peak-zu-Peak-Amplitude

  1. Um die Rauschschnittstelle zu analysieren, öffnet man die aufgenommene *.bxr-Datei, die 30 Sekunden intrinsischer Rauschaufzeichnung enthält (erzeugt von den widerstandsfähigen Komponenten der Elektroden und Verstärkerschaltungen).
  2. Wählen Sie "Activity Map" und unter "Metric" wählen Sie Peak-to-Peak Amplitude. Die Skala ist auf 500 μV eingestellt, was die Visualisierung der Signalvariabilität über das Elektrodenarray ermöglicht (Abbildung 5A).
  3. Im Fenster "Activity Map" positionieren Sie den Mauszeiger über der aufgezeichneten Elektrode, um den Amplitudenwert "Well Wide Mean" anzuzeigen.
  4. Alternativ können Sie den durchschnittlichen Amplitudenwert bestimmen, indem Sie eine Excel-Datei (*.xlsx) unter "Graph Export" erstellen. Öffnen Sie dann diese Excel-Datei und berechnen Sie den mittleren Amplitudenwert [=Average(Number1; Nummer 2;...)].

8. Analyse des Basisrauschens (Signal-Standardabweichung)

  1. Analysieren Sie das Basisrauschen, indem Sie auf "Playback" klicken, um die *.brw-Datei zu generieren. Wählen Sie dann "Activity Map" und unter "Metric" "Standard Deviation". Die Skala wird automatisch auf 30 μV eingestellt, was die Visualisierung der Signalvariabilität über das Elektrodenarray ermöglicht (Abbildung 5B).
  2. Im Fenster "Activity Map" fahren Sie mit dem Mauszeiger über die aufgenommene Elektrode, um die Standardabweichung "Well Wide Mean" anzuzeigen.
  3. Alternativ können Sie die durchschnittliche Standardabweichung mit "Chart Export" bestimmen und die *.xlsx Excel-Datei erstellen. Öffnen Sie dann die Excel-Datei und berechnen Sie die mittlere Standardabweichung [=Average(Number1; Nummer 2;...)].

9. Zur Bewertung der Signalqualität:

  1. Berechnen Sie das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR)
    figure-protocol-1
    SNR ≥ 5: Gute Qualität
    SNR zwischen 2 und 5: Mittlere Qualität
    SNR < 2: Schlechte Qualität

10. Slice-Positionierung im CorePlate-Single-Well für Datenerfassung

  1. Mit Hilfe einer Pasteur-Pipette wird der Schnitt am Elektrodenarray so positioniert, dass der Interessenbereich von Aufzeichnungselektroden bedeckt wird (Abbildung 4, B-1). Entferne die Lösung aus dem Brunnen (Abbildung 4, B-2). Mach ein Foto mit einem aufrechten Mikroskop.
  2. Fixieren Sie das Gewebe mit dem Schnittanker (Abbildung 4C).
  3. Mit einer 3-ml-Pasteur-Pipette geben Sie einen Tropfen ACSF zur Scheibe.
  4. Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pasteur-Pipette mit kleinerem Volumen. Entfernen Sie die verbleibende Flüssigkeit mit einem Stück verdrehtes Papier (wiederholen Sie dies 7-10 Mal) (Abbildung 4C-2).
  5. Für die Perfusion während der Aufnahmen verwenden Sie ACSF bei Raumtemperatur und stellen Sie die Rate auf 2 mL·min-1 ein. Die Zuflussposition befindet sich oberhalb der Gewebescheibe, und der Abfluss befindet sich an der Wand des Brunnens (Abbildung 4D).
  6. Eine zusätzliche Erdung des Ein- und Abflusses wird empfohlen, um perfusionsinduzierte Rauschen zu minimieren, was durch eine Verbindung mit dem Aufnahmesystem über einen Draht erreicht werden kann (Abbildung 4D-1).
  7. Um Störungen zu reduzieren, schalten Sie das Mikroskop und das Licht im Raum aus.

11. Aufzeichnungen der Netzwerkaktivitäten mit dem CorePlateTM Single-Well

  1. Stellen Sie die Aufnahmeparameter auf eine Abtastfrequenz von 20.000 Hz mit einem Hochpassfilter bei 100 Hz ein.
    1. In der BrainWave 5-Software gehe ich zu File und öffne eine neue Aufnahmesitzung.
    2. Klicken Sie auf "Quelle".
    3. Öffnen: Chip Pilot und für folgende Einstellungen auswählen:
      Aufzeichnung spontaner neuronaler Aktivität mit einer Abtastfrequenz: 20.000 Hz/Elektrode.
      Hardware-Hochpassfilter-Abschaltung: 100 Hz.
      Lichtkompensationsrate: kurz (direkte Lichtstimulation).
  2. Um den Chip-Kalibrierungskanal und den Typ der rohen Leiterbahn auszuwählen.
    1. Öffnen: Steuersignal und auswählen: Bei interner Chip-Kalibrierung, Ausgangskanal: 1.1.
    2. Klicken Sie auf "+" und "Charting".
    3. Öffnen: Chart-Setting.
    4. Wähle rohe Spuren: roh und Spitzen.

12. Fügen Sie das Mikroskopbild auf der Aktivitätskarte ein und richten Sie es aus.

  1. Klicken Sie auf "+".
  2. "Überlagerungen und Anmerkungen", um das Mikroskopbild in die Aktivitätskarte auf BW5 einzufügen:
  3. Gehe zu Brunnenschichten:
    1. Wähle Ebenen verwalten und das kleinhirnige Bild.
    2. Ausgewählte Bildebene ausrichten: Klicken Sie auf Start.
    3. Klicken Sie auf die vier Ecken des Bildes und folgen Sie der Zahlenfolge.

13. Datenkompressionseinrichtung vor der Aufnahme

  1. Um die Daten zu komprimieren, gehen Sie zur ersten Seite von RECORDER:
    1. Cockpit-Modus: fortschrittlich
    2. Roh komprimiert speichern: Wavelet-Kompression + Ereignisse: Spitzen.
    3. Spiele 10 Minuten lang, bevor du mit der Aufnahme startest.
  2. Reinigen Sie die vergoldeten Pads nach Abschluss der Aufnahmen mit 100 % Ethanol. Als Nächstes füllen Sie den Brunnen mit reinem Wasser und bürsten Sie ihn 30 Sekunden lang.
  3. Als Nächstes füllen Sie den Brunnen mit 70 % Ethanol und bürsten Sie das Elektrodenarray vorsichtig etwa 30 Sekunden lang. Zum Schluss füllen Sie den Brunnen mit reinem Wasser und bürsten Sie vorsichtig 30 Sekunden lang (diesen Schritt 2 oder 3 Mal wiederholen).
  4. Halten Sie den CorePlateTM Single-Well trocken im passenden Behälter.

14. Offline-Analyse aufgezeichneter Daten

  1. Öffne die gewünschte Datei mit dem BW5.
  2. Teilen Sie den kleinhirnrinden in drei Gruppen, indem Sie Elektroden nach anatomischer Schichtzuweisung auswählen (Molekularschicht, Purkinje-Zellschicht, Granule-Zellschicht).
    HINWEIS: Die Anzahl der Elektroden innerhalb der interessierenden Bereiche (ROIs) pro Schicht hing von der spontanen Aktivität in jeder Schicht ab und variierte daher je nach Aufnahme. Typischerweise wurden 25–250 Elektroden pro ROI von einer einzelnen Scheibe analysiert. Elektroden, die sich in Regionen über zwei anatomische Schichten befinden, wurden ausgeschlossen, um Mehrdeutigkeiten bei der Schichtzuweisung zu vermeiden. Nur Elektroden, die eindeutig einer bestimmten Kleinhirnschicht zugeordnet sind, wurden für weitere Untersuchungen eingelegt.
    1. Auswahl und Gruppierung: Geh zu den Einheitengruppen.
    2. Unter Einheitengruppen verwalten klicken Sie auf "+", um eine Gruppe zu bilden und sie zu benennen.
    3. Um weitere Elektroden in die Gruppe aufzunehmen, wählen Sie die Elektroden aus und klicken Sie auf "ausgewählte Einheiten hinzufügen oder entfernen".
  3. Analysieren Sie rohe Spuren mit der Spike-Erkennungsmethode, bekannt als präzise Timing-Spike-Detektion (PTBS). Er konzentriert sich darauf, relative Maxima und Minima mit Peak-zu-Peak-Amplituden zu erkennen, die eine vordefinierte Schwelle überschreiten, um eine präzise und präzise Spike-Identifikation sicherzustellen.
    1. Datenverarbeitung: Gehe zur Spike-Erkennung und stelle den Modus auf fortgeschritten.
    2. Nutze Daten von: Raw.
    3. Algorithmus: PTBS (Präzise Erkennung von Timing-Spikes).
    4. Standardabweichungsfaktor: 8,0.
    5. Spitzenlebensdauer: 2,0 ms.
    6. Refraktärphase: 1,0 ms.
    7. Spitzenzuweisung: negativer Peak.
    8. Dauer der Welle vor dem Spitzenzeitpunkt: 1,0 ms.
    9. Dauer der Welle nach dem Spitzenzeitpunkt: 1,5 ms.
  4. Geh zum Spike-Sortieren und stelle den Modus auf fortgeschritten. Passen Sie folgenden Parameter an:
    1. Dauer der Vor-Peak-Welle: 0,5 ms.
    2. Dauer der Wellenaufnahme nach dem Peak: 1,0 ms.
    3. Algorithmus zur Extraktion von Merkmalen: Legendre-Momente.
    4. Anzahl der Funktionen: 3.
    5. Clustering-Algorithmus: K-Means & Silhouette.
    6. Mindestanzahl von Spitzen pro Cluster: 20.
    7. Maximale Anzahl von Clustern: 3.
    8. Umrissschwelle: 2.
  5. Daten exportieren in Excel.
    1. Klicken Sie auf "Charting".
    2. Gehe zu Chart-Export.
    3. Wählen Sie die Tabelle aus und exportieren Sie.

Ergebnisse

Pallidale DBS erhöhte die Anzahl der Spitzen auf normale Werte in den kortikalen Schichten zwischen den Gruppen.

Wir analysierten die Gesamtzahl der Spitzen in drei Schichten des kleinhirnkortex – Molekularschicht (ML), Purkinje-Zellschicht (PL) und granulare Zellschicht (GL) – in vier experimentellen Gruppen: Wildtyp (WT, N = 8), dtsz (N = 8), dtsz-Sham (N = 7) und dtsz-DBS (N = 7), wobei Analysen an Schnitten durchgeführt wurden, die von diesen Tieren gewonnen wurden.

Während dystones Gewebe (dtsz) signifikant weniger Spitzen erzeugte, erhöhte pallidale DBS die Anzahl der Spitzen auf ein Niveau, das mit denen gesunder Kontrollpersonen vergleichbar ist (Tabelle 3). Der Kruskal-Wallis-H-Test bestätigte dies weiter und zeigte einen statistisch signifikanten Anstieg der Anzahl der Spitzen im ML für die dtsz DBS-Gruppe im Vergleich zu sowohl der dtsz - als auch der dtsz-Sham-Gruppe (χ2(3) = 20,728, p = 0,001; Abbildung 6A). Die dtsz-DBS-Gruppe zeigte ebenfalls einen ähnlichen Anstieg von Spitzen in PL (χ2(3) = 16,855, p = 0,001; Abbildung 6B) und GL (χ2(3) = 13,164, p. = 0,004; Abbildung 6C), erreicht Werte vergleichbar mit denen der WT-Gruppe (Tabelle 3).

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Abbildung 1. Überblick über chirurgische Instrumente. Das Bild zeigt ein arrangiertes Tablett mit einer Reihe chirurgischer und mikrochirurgischer Instrumente, die speziell für Eingriffe mit der Implantation von tiefen Elektroden und Stimulatoren entwickelt wurden. Die Instrumente sind in der Reihenfolge der Nutzung organisiert, was die prozedurale Effizienz erhöht. Sie werden auf ein Taschentuch gelegt, um die Sauberkeit zu gewährleisten und während des Eingriffs einen leichten Zugang zu gewährleisten. Diese Regelung konzentriert sich auf Präzision, Sterilität und Bereitschaft für komplexe chirurgische Arbeitsabläufe. (1) Schere stumpf/stumpf, (2) Nahtschere, (3) Schere scharf/scharf, (4) Nadelhalter, (5) Nahtbindzang, (6) Splitterpinzette/gebogen, (7) gezackte Pinzette, (8) Standard-kurze Pinzette, (9) Standard-Langzange, (10) Mikro-Spatel, (11) Wiederverwendete Elektrode, (12) Schrauben, (13) Bohrzubehör, (14) Auszieherspitze/Klemme, (15) Glashöhlenblock wird mit 0,9 % NaCl und Xylocain gefüllt. Weitere Informationen finden Sie in der Materialliste. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2. Experimentelle Einrichtung zur Betäubung und Positionierung des Tieres im stereotaxischen Apparat zur Implantation von DBS-Elektroden und dem Stimulator. (A) Das Tier wird vorsichtig in eine speziell angefertigte Induktionskammer gelegt, um die Anästhesie einzuleiten. (B) Die Induktionskammer ist mit einer Atemmaske verbunden, um eine ordnungsgemäße Verabreichung der Anästhesie (Einleitung mit Isofluran bei 4 %) sicherzustellen und gleichzeitig die Sicherheit während der Handhabung zu gewährleisten. (C) Nach der Betäubung wird das Tier auf eine Heizplatte mit angeschlossener Atemmaske (Erhaltung mit Isofluran bei 3 %) verlegt, um Unterkühlung zu verhindern und eine kontinuierliche Anästhesie während der Rasur sicherzustellen. (D) Das Tier wird sorgfältig im stereotaxischen Rahmen positioniert. Es wird ein Längsschnitt gemacht, und Klemmen werden verwendet, um die Haut zurückzuziehen. Vier Punkte zeigen die Schraubenposition an. Schrauben werden in die markierten Bereiche eingesetzt, und zwei zusätzliche Punkte werden für die Elektrodenplatzierung markiert. (E) Die Elektrode wird in die GPi eingeführt und mit Kleber befestigt, bevor der stereotaktische Halter entfernt wird. Zur besseren Fixierung wird Zement um die Elektroden aufgetragen. Unterbrochene Längsnähte werden verwendet, um die Operationsstelle zu schließen, und (F) wird der Stimulator im subkutanen Flankenbereich des Tieres platziert. Das Tier bleibt nach der Operation am Leben, und der Pfeil zeigt den Standort des Stimulators an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-3
Abbildung 3. Illustration des Gehirnschnitts und -schneidens. (A) chirurgische Instrumente für das Dissektionsverfahren. (1*) Selbstgemachte Agar-Petrischale, (2*) Agar-Petrischale, (3*) Klemme zur Befestigung des Carbogen-Rohrs, (4*) Papierfilter, (5*) Klinge, (6*) Sekundenkleber, (7*) Vibratom-Platte/Halter, (8*) Gebogene Pinzette, (9*) Schere, scharf/stumpf. (B) Vorbereitung der Gehirnprobe: Nach der Dissektion wird das Gehirn geschnitten, und die gestrichelten Linien zeigen die Ausrichtung der koronalen Ebene an. (C) Parasagittale Schnitte: Das Gehirn wird entlang der angegebenen parasagittalen Ebene durchschnitten. (D) Gewebefixierung: Das entstehende Hirngewebe wird mit Kleber an einer Platte/Halterung befestigt, um es für eine präzise Sektionierung zu sichern. (E) Vibratomschnitt: Die Platte mit dem angesetzten Gewebe wird auf ein Vibratom übertragen, wo ultradünne Scheiben erhalten werden (200 μm). (F) Endschnitte: Präzise parasagittale kleinhirnschnitte werden produziert, bereit für elektrophysiologische Aufzeichnungen35. Weitere Informationen finden Sie in der Materialliste. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4. Illustration der Schritte, um eine gute Zellaktivität zu erreichen. (A) Reinigung: Dieser Schritt beinhaltet die Vorbereitung des HD-MEA, indem die Oberfläche gereinigt wird, um sicherzustellen, dass kein Schmutz die Befestigung (Kontaktpad, A-1) oder den Aufzeichnungsprozess (flache Fläche, A-2) beeinträchtigt. (B) Schnittposition: Der Gewebeschnitt wird sorgfältig auf der HD-MEA (B-1) positioniert, um eine korrekte Ausrichtung für einen effektiven Elektrodenkontakt (B-2) sicherzustellen. Eine dünne Spitze der Pipette (Pfeil) wird verwendet, um das verbleibende ACSF zu entfernen, sodass der Anker eingesetzt werden kann. (C) Befestigung der Scheibe: Die Scheibe wird mit dem Anker sicher auf dem HD-MEA positioniert. In diesem Schritt ist es entscheidend, einen Tropfen ACSF hinzuzufügen und die überschüssige Flüssigkeit vorsichtig mit einer Pipette (C-1; Pfeil) und einem gedrehten Stück Präzisionsabwischpapier (C-2) zu entfernen. Dies stellt sicher, dass der Schnitt stabil bleibt und gut mit den Elektroden verbunden ist, um eine genaue Aufzeichnung zu ermöglichen. (D) Perfusion: Schließlich wird ein Perfusionssystem angeschlossen und aktiviert, um die Lebensfähigkeit der Gewebescheibe während des Experiments aufrechtzuerhalten, wobei der Zufluss auf der Scheibe liegen muss und der Abfluss nahe an der Wand (D-2). Es ist außerdem wichtig, alle Blasen aus dem Boden zu entfernen, um während der Aufnahme Rauschen zu minimieren (angezeigt durch den Pfeil). Zusätzliche Erdung ist sowohl an dem Ein- als auch am Abflussrohr (D-1) angeschlossen. Die roten Maßstabsbalken sind 1,5 mm lang. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 5. Metriken für Amplitude und Standardabweichung in HD-MEA-Aufzeichnungen mit der Brain Wave 5-Software (BW5) zur Bewertung der Signalqualität. (A) Peak-to-Peak-Amplitudenmetrik ausgewählt, um intrinsische Elektrodenamplitudenwerte zu extrahieren (Skala: 500 μV). (B) Standardabweichungsmetrik, ausgewählt zur Quantifizierung des Basisrauschens über Elektroden (Skala: 30 μV). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 6: Auswirkungen von pallidaler DBS auf die Spike-Aktivität über kleinhirnkortikale Schichten: (A) Molekülschicht (ML), (B) Purkinje-Zellschicht (PL) und (C) Körnschicht (GL). Die Box-Whisker-Diagramme zeigen den Mittelwert bzw. Median mit einer Kreuz- bzw. horizontalen Linie sowie den 25. und 75. Perzentil. Die jeweiligen Gruppen sind Wildtyp (WT, n = 22 Slices), dtsz ohne Operation (n = 20 Slices), dtsz DBS inaktiv (Sham, n = 20 Slices) und dtsz-DBS aktiv (n = 20 Slices). Die statistische Signifikanz wurde mit dem Kruskal-Wallis-Test bestimmt, gefolgt von Dunns paarweisen Vergleichen (*p .< 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

NameMolekulargewicht [g/mol]Endkonzentration [mol/ l]
NaCl58.440.124
KCl74.550.003
Glukose180.160.01
CaCl2 (wasserfrei)110.980.0025
NaHCO384,0070.026
NaH2PO4119.980.00125
pH7,35 bis 7,40 (verstellbar mit HCl)
Osmolalität [Mosmol/ kg]290 bis 300

Tabelle 1: Künstliche Gerhirnspinalflüssigkeit (ACSF)-Lösung: Zusammensetzung und endgültige molare Konzentrationen der Komponenten, die zur Herstellung von ACSF für Kleinhirnschnitt-Experimente verwendet werden. Der pH-Wert wurde mit HCl auf 7,35–7,40 angepasst, und die Osmolalität wurde zwischen 290–300 mOsm·kg-1 gehalten.

NameMolekulargewicht [g/mol]Endkonzentration [mol/L]
Saccharose342.300.075
KCl74.550.0025
NaCl58.440.087
CaCl2 (wasserfrei)110.980.0005
MgCl295.210.007
Glukose180.160.01
NaHCO384.010.025
NaH2PO4119.980.00125
pH7,35 bis 7,40 (verstellbar mit HCl)
Osmolalität [Mosmol/ kg]320 bis 330

Tabelle 2: Sucroselösung. Zusammensetzung und endgültige molare Konzentrationen der Saccharoselösung, die bei der Kleinhirnschnittpräparation verwendet wird. der pH-Wert wurde auf 7,35–7,40 angepasst, und die Osmolalität wurde zwischen 320–330 mOsm·kg-1 gehalten.

Gruppen:WTdtsz dtsz-Shamdtsz-DBS
n22202020
Varianzkoeffizient
ML0.530.550.60.35
PL0.570.570.520.46
Viel Erfolg0.480.660.610.51
Anzahl der Spitzen
ML287240±32605163434±19998234209±31284345915±27113
PL413223±50171194277±24786304568±35692412707±42509
Viel Erfolg390817±40139211274±31193325533±44318373208±42220

Tabelle 3: Zusammenfassung der Spike-Metriken über kleinhirnige Schichten und experimentelle Gruppen. WT – Wildtyp, nicht-dystonische Kontrollhamster; DTSZ – heimische DTSZ-Hamster; dtsz-DBS – dtsz Hamster, die 11 Tage lang kontinuierlich stimuliert werden; dtsz-Sham – dtsz-Hamster, die sich der Operation unterziehen, jedoch ohne aktives DBS; ML – Molekülschicht; PL – Purkinje-Zellschicht; GL. – körnige Zellschicht.

Diskussion

Wir beschrieben einen methodischen Ansatz zur Untersuchung der Mechanismen der tiefen Hirnstimulation (DBS) im pathophysiologischen dystonen neuronalen Netzwerk desdt-sz-Hamsters . Kritische Schritte umfassen präzise Elektrodenimplantation, schnelle Zubereitung eines Kleinhirnschnitts und stabile HD-MEA-Aufzeichnungsbedingungen, um eine zuverlässige Datenerfassung sicherzustellen. Wir demonstrieren das Operationsverfahren, die Herstellung von Kleinhirnschnitten, die Aufzeichnung und Analysetechniken, um die ex vivo Kleinhirnaktivität und deren Modulation durch DBS zu untersuchen. Die elektrophysiologischen Messungen mit HD-MEA lieferten Echtzeitaufzeichnungen der spontanen Kleinhirnaktivität mit hoher temporaler und räumlicher Auflösung36, was wir für notwendig halten, um die Mechanismen der pallidalen tiefen Gehirnstimulation bei der Behandlung von Dystonie zu untersuchen.

Dystonie ist derzeit als Netzwerkstörung bekannt, die durch abnormale motorische Produktion gekennzeichnet ist, die durch dysfunktionale Wechselwirkungen zwischen Basalganglien, Kleinhirn- und kortikalen Schaltkreisen37,38 resultiert. Kleinhirnauffälligkeiten haben gezeigt, dass sie eine bedeutende Rolle bei Dystonie spielen, wie sowohl klinische als auch experimentelle Studienbestätigen 15,22,39. Darüber hinaus zeigt eine anatomische Studie zur Injektion des retrograden Tollwutvirus (RV) in den Kleinhirnrinde von Cebus-Affen, dass der subthalamische Kern der Basalganglien eine erhebliche Auswärtsbewegung zum kleinhirnlichen Kortex40 aufweist. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung, kleinhirnige Schaltkreise neben den Basalgangliennetzwerken zu untersuchen, wenn die therapeutischen Mechanismen von DBS 40,41,42 untersucht werden. Diese Methode eignet sich besonders gut für Studien zur Untersuchung neuronaler Interaktionen und Neuromodulationseffekte bei Bewegungsstörungen.

Bezüglich der netzwerkweiten Mechanismen des pallidalen DBS haben Studien gezeigt, dass DBS des internen Segments des Globus pallidus (GPi) weitreichende Veränderungen der Gehirnaktivität auslöst, nicht nur innerhalb der Basalganglien, sondern auch in miteinander verbundenen Regionen wie dem kortiko-striatalen Netzwerk43, dem Thalamus44 und dem Kleinhirn15. Diese Beobachtungen stützen die Hypothese, dass pallidale DBS die Aktivität im gesamten Basalganglien-Kleinhirn-Netzwerk modulieren kann und so zu seiner therapeutischen Wirksamkeit bei Dystonie beiträgt. Dies zeigt die Notwendigkeit präklinischer Studien zur Untersuchung von DBS-Mechanismen und den Vorteil von HD-MEA-Aufzeichnungen zur Erfassung netzwerkweiter elektrophysiologischer Veränderungen. Darüber hinaus unterstützt die Studie von Kotyra et al. (2025) das Vorhandensein einer langanhaltenden neuroplastischen Remodellierung, die durch längerfristige GPi-DBS im dystonen motorischen Netzwerk45 induziert wird. In-vivo-Ergebnisse zeigten, dass pallidale Stimulation die Schweregrad der Dystonie beiDT-Sz-Hamstern schrittweise verringerte und dass die positive Wirkung nach Abbruch der Stimulation anhielt, was darauf hindeutet, dass DBS-induzierte Effekte nicht auf die akute Stimulation allein beschränkt sind45. Darüber hinaus zeigten neuere elektrophysiologische Studien eine netzwerkweite Modulation der synaptischen Plastizität und der Spike-Muster nach längerfristiger DBS, einschließlich erhöhter cerebellärerAktivität 15, erhöhter exzitatorischer Input zu motorischen thalamischen Neuronen und einer stärkeren clusterigen exzitatorischen Eingabe zum kortikalen M146.

Repräsentative Ergebnisse deuten auf einen netzwerkweiten Einfluss der Tiefhirnstimulation (DBS) hin, wie die Normalisierung der Spitzenaktivität in der molekularen, Purkinje-Zell- und granularen Zellschicht des kleinhirnförmigen Kortex bei dystonen Hamstern zeigt (Abbildung 6). Die erhöhte Spitzenaktivität in der dtsz DBS-Gruppe erreichte Niveaus, die mit den Wildtyp-Kontrollen vergleichbar waren. Diese Normalisierung der Spike-Aktivität unterstützt das therapeutische Potenzial von DBS zur Behandlung von Dystonie. Bemerkenswert ist, dass die DT sz-Sham-Gruppe im Vergleich zur WT-Gruppe über alle Kleinhirnschichten hinweg intermediäre Spike-Werte aufwies, was darauf hindeutet, dass allein die Elektrodenimplantation die Aktivität des kleinhirnlichen Netzwerks beeinflussen kann. Diese Interpretation stimmt mit dem klinisch beschriebenen Mikroläsionseffekt bei Dystonie überein, bei dem die Elektrodenimplantation selbst die Symptome vorübergehend vor Beginnder Stimulation 47 verbessern kann. Obwohl der DTsz-Hamster Schlüsselmerkmale der paroxysmal generalisierten Dystonie reproduziert, spiegelt er nicht vollständig die klinische Heterogenität wider, die bei menschlichen Dystonie-Syndromen beobachtet wurde. Daher sollte bei der Übersetzung dieser Erkenntnisse auf menschliche Dystonie Vorsicht geboten werden.

Diese Arbeit behandelt technische Herausforderungen im Zusammenhang mit der Stimulatorkapselung, DBS-Chirurgie, Schnittvorbereitung und großflächiger elektrophysiologischer Datenanalyse. Die Kombination aus CMOS-basierter HD-MEA-Technologie bietet eine robuste Plattform für die In-vitro-Untersuchung hochkomplexer neuronaler Interaktionen48. Unsere Ergebnisse tragen zu einem nuancierteren Verständnis der pathophysiologischen Dynamik hinter der Dystonie bei und bieten wertvolle Einblicke in die netzwerkbasierten Mechanismen der DBS-Therapie. Eine detaillierte funktionelle Analyse spezifischer Hirnregionen und deren Interaktionen trägt zu einem differenzierteren Verständnis der pathophysiologischen Dynamik in dystonen neuronalen Netzwerken bei und liefert andererseits Einblicke in den therapeutischen Wirkmechanismus von DBS.

In dieser Studie führten technische Probleme zu erhöhtem Hintergrundrauschen und störten die stabile Signalaufnahme während HD-MEA-Aufnahmen. Übliche Schritte zur Fehlersuche sind das Beheben von Rauschquellen, die Sicherstellung einer ordnungsgemäßen Erdung und die Aufrechterhaltung eines stabilen Kontakts zwischen Gewebe und Elektroden. Bei hohen Rauschpegeln oder instabilen Messungen sollten zuerst Erdung, Kabelverbindungen und nahegelegene elektrische Geräte überprüft werden. Luftblasen auf dem Elektrodenarray können ebenfalls den Kontakt zwischen Gewebe und Elektrode sowie die Aufzeichnungsstabilität beeinträchtigen und müssen sorgfältig entfernt werden (Abbildung 4). Darüber hinaus muss eine stabile Datenübertragung vom Verstärker zum Computer über ein hochwertiges USB-C-zu-USB-C-Kabel gewährleistet werden. Elektroden mit anhaltendem Rauschen sollten von weiterer Analyse ausgeschlossen werden. Während die Aufzeichnung extrazellulärer Signale mit HD-MEA eine hohe räumliche Auflösung der Netzwerkaktivität und zusammen mit dem überlagerten mikroskopischen Bild der Zuordnung zu den einzelnen Schichten des kleinhirnkortex ermöglicht, kann nicht ausgeschlossen werden, dass die detektierte extrazelluläre Aktivität durch das Überschneiden von Axonen aus einer anderen als der zugewiesenen erzeugt wurde. Darüber hinaus wurden statistische Analysen auf Schnittebene durchgeführt, da jeder Schnitt eine unabhängige elektrophysiologische Aufzeichnung unter standardisierten experimentellen Bedingungen darstellte, obwohl einige Schnitte vom selben Tier stammten.

Während der DBS können weitere Probleme auftreten, da sich die Elektrode löst oder ein technischer Defekt im Stimulator besteht. Um diese Probleme zu minimieren, sollten Sie eine ordnungsgemäße Elektrodenfixierung sicherstellen und während des gesamten Eingriffs die sterilen Handhabungsbedingungen aufrechterhalten. Dies geschah in 5 % aller Studien der vorliegenden Studie. Um das Lösen der Elektroden zu minimieren, muss die Schädeloberfläche getrocknet werden, bevor die Elektrode mit Klebstoff oder Zahnkleber fixiert wird, um die Haftung zu verbessern und ein Verrutschen zu verhindern. Um die Sterilität zu gewährleisten und mechanische Kontaminationen zu vermeiden, dürfen der Stimulator, die Elektrodenspitze und der Monofilamentfaden nur mit einer Zange oder Hämostasenzange behandelt werden. Zusätzlich sollten Handschuhe mit Ethanol desinfiziert und vor der Handhabung des Tieres getrocknet werden, um das Infektionsrisiko zu minimieren. Eine schnelle Vorbereitung von Schnitten des kleinhirnbedingten Gehirns ist für hochwertige elektrophysiologische Aufzeichnungen unerlässlich. Dies bedeutete jedoch, dass die Position der implantierten DBS-Elektroden nicht nachträglich überprüft werden konnte. In einer weiteren Studie, die die Wirkung verschiedener Stimulationsparameter auf die Dystonie-Schwere beim DTsz-Hamster untersuchte, wurden dieselben Stimulationselektroden und chirurgischen Techniken verwendet. Hier konnten wir die korrekte Elektrodenposition in 94 % derVersuche 37 bestätigen.

Abschließend bietet dieses Protokoll eine leistungsstarke Plattform zur Untersuchung der elektrophysiologischen Mechanismen von DBS und liefert wertvolle Einblicke in seinen Wirkmechanismus. Der DTsz-Hamster ermöglicht auf einzigartige Weise präklinische Studien der pallidalen DBS-Effekte auf den dystonen Phänotyp sowie ex vivo hochauflösende Aufzeichnungen neuronaler Netzwerkaktivität. Unsere Ergebnisse unterstützen das Konzept der Kleinhirnbeteiligung bei Dystonie und heben die Bedeutung der Netzwerkanalyse für das Verständnis und die Optimierung von Neuromodulationstherapien hervor.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wird von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des Collaborative Research Center (SFB 1270/1,2 ELAINE 299150580) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3% H2O2Caelo15301730
50 ml KonusrohrGreiner Bio-OneFalcon-Typ Konusrohr
Agar PetrischaleHandgemacht 
NarkoseeinheitBioMedical InstrumentsUniventor 1200
BioCam DupleX3BrainBioCAM DupleXCMOS-HD-MEA-Plattform
Messerverblendung (5*)Apollo Herkenrath09-025-056
Brainwave Software 53BrainVersion 5CMOS-HD-MEA-Plattform
AtemmaskeNarishigeGM-4
Bulk Fill Flowable: Compula RefillDentsply Sirona267-0195Für Zement
Kapselspenderpistole Dentsply Sirona296-0003Für Zement
CarbogenAir LiquideAir Liqiuide (Haussystem)
KavitätsblockglasAIMAIM40 mm x 40 mm
Klammer (3*)DIEFFENBACH12-1003-04Edelstahl 4cm
ComputerDellPrecission 3431
CorePlateTM 1W 38/603BrainAccura HD-MEACMOS-HD-MEA-Chip
Bohrerzubehör (13)FST19007-07Spitze: 7mm
Bohrerzubehör (13)FST19007-09Spitze: 9mm
Eco wipes - WischspenderDr Schumacher00-915SE001 (1x1) 
Eco wipes - WischrollenDr Schumacher00-915SE001 (6x1)
ELASTOSILWackerRT 601 A/B
ElektrodeMicroprobesSNEX-100
EthanolCarl Roth GmbH + Co. KGArt-Nr. T913.3
Löffel (10)HLW Dental-Instruments GermanyS-10.28-6
Pinzette (5)FST18025-10Edelstahl 10cm
Pinzette (6)AesculapBD311R9cm
Pinzette (7)FST91100-12Edelstahl 12cm
Pinzette (8)FST11231-20Edelstahl 11cm
Pinzette (8*) Karl Hammacher9.160 160Wironit 10,5cm
Pinzette (9)FST11200-33Dumoxel 13,5cm
Pinzette (9)FST11200-33Dumoxel 13,5cm
Beheizter OP-Tisch+integrierte GasabsaugungBioMedical InstrumentsBioMedical Instruments
heliobondIvoclar Vivadent42040
EismaschineScotsmanAF 80 AS / WS
Zulauf- und AblaufnadelnBD Microlance 1,25 x70mm
Isathal 10mg/gDechraZul.-Nr. 400216.00.00Fucidin
IsofluranSedana medicalN001254
Mili-Q WasserfilterElgaPURELAB flex 3
Nadelhalter (4)FST12501-13Wolframkarbid 13cm
OcteniseptSchülke & MayrAntiseptische Lösung 
Papierfilter (4*)Carl Roth GmbH + Co. KGAP75.1
ParafilmSigma AldrichHS234526C
Platinum-Anker3Brain3Brain
Retraktorspitze (14)FST18200-102,5mm
Wiederverwendete Elektrode (11)MicroprobesSNEX-100Für Koordinaten
RingerB. Braun3570030
Schere (1)FST14078-10Edelstahl 10cm
Schere (2)AesculapBC144R
Schere (3)FST14058-09Edelstahl 9cm
Schere (9*)FST91401-12Edelstahl 12cm
Schraube (12)Online-Schrauben.deDIN 84 A2 M 1x2
RasiererExactaGT415
STELLA (softwaredefiniertes implantierbares modulares Plattform) Stimulationssystemnicht kommerziell; Entwicklung der Universität RostockOpen Source (https://github.com/SFB-ELAINE/STELLA)batteriebetriebener DBS-Stimulator
Sterilisator 250FST18000-45
StereotaxischNarishigeModell SR-AR
SuperkleberUHU64212
Tränencreme (Panthenol Nasencreme)Jenapharm5541249
Vibratom LaicaVT12005
Xylocain Gel 2%Aspen Pharma1138060
WägebootCarl Roth GmbH + Co. KGHYT9.1
WaageVoltcraftTS-5000/1
Verbindungen, die für die Lösungszubereitung verwendet werden
Kalziumchlorid (CaCl2)Sigma-Aldrich10043-52-4
D-Glukose(C6H12O6)Sigma-Aldrich50-99-7
Magnesiumchlorid (MgCl2)Sigma-Aldrich7786-30-3
Kaliumchlorid(KCl)Sigma-Aldrich7447-40-7
Natriumbicarbonat (NaHCO3)Sigma-Aldrich144-55-8
Natriumchlorid (NaCl)Sigma-Aldrich7647-14-5
Natriumphosphat monobasisch (NaH2</

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