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Evaluierung von 3D-Sphäroiden für AAV-Transduktionsstudien

81 Ansichten

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DOI:

10.3791/70517

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14. August 2026

 , 
1Office of Gene Therapy, Office of Therapeutic Products, Center for Biologics Evaluation and Research

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dreidimensionale Sphäroid-Kultursysteme verbessern konventionelle zweidimensionale Modelle für die Entwicklung der AAV-Gen Therapie. Diese Methode ermöglicht einen empfindlichen Nachweis der AAV-Transduktion bei niedrigen Dosen, eine erhöhte physiologische Relevanz sowie eine robuste Langzeitüberwachung. Die Plattform unterstützt die Wirksamkeitsbewertung, Hochdurchsatz-Screenings und die Vektoroptimierung über verschiedene Zelllinien und AAV-Serotypen hinweg.

Zusammenfassung

Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind leistungsfähige Vektoren, die für die Gentransfertherapie in Gentherapeutika verwendet werden. Ihre Entwicklung erfordert in vitro -Systeme, die zuverlässig Unterschiede in Vektordesign, Serotyp-Leistung, Stärke regulatorischer Elemente und Expressionskinetik nachweisen können. Diese Systeme müssen außerdem Anwendungen wie die Wirksamkeitsprüfung und Vektoroptimierung unterstützen. Hier beschreiben wir eine optimierte dreidimensionale Sphäroid-Plattform, die zur Bewertung der AAV-Wirksamkeit, der Kinetik der Transgenexpression und der serotypspezifischen Transduktionseffizienz in verschiedenen Zelllinien dient. Gleichmäßige Sphäroide werden mithilfe von Platten mit ultra-niedriger Anheftung erzeugt und unter Bedingungen kultiviert, die eine stabile Architektur und Langzeit-Bildgebung ermöglichen. Nach der AAV-Transduktion werden fluoreszierende oder lumineszierende Signale in Echtzeit mittels Live-Cell-Bildgebungssystemen überwacht. Dies ermöglicht eine quantitative Beurteilung des Reporter-Signals, der Dosisabhängigkeit, der Aktivität regulatorischer Elemente und des Einsetzzeitpunkts durch kontinuierliche kinetische Bildgebung. Die Plattform kann effektiv zwischen wirksamen und schwachen Vektorgenom-Designs sowie zwischen mehreren AAV-Serotypen unterscheiden. Diese Methode zeigt eine robuste Leistung sowohl in langsam als auch in schnell teilenden Zelllinien. Diese Ergebnisse belegen ihre Eignung als skalierbares und physiologisch relevante System für die präklinische Bewertung und Entwicklung von Gentherapien.

Einleitung

AAV-Vektoren haben sich aufgrund ihres Sicherheitsprofils und ihrer Fähigkeit, eine dauerhafte Genexpression zu erreichen, zu einem der bevorzugten Systeme für die Genübertragung in vivo entwickelt1. Die AAV-Gen Therapie zeigt Erfolge bei der Behandlung mehrerer seltener Erkrankungen, wobei sich hunderte Produkte in der Entwicklungsphase befinden2. Zudem umfassen neuartige Anwendungen die in vivo-Abgabe von Komponenten der Genom-Editierung, wie beispielsweise Cas9, die ein großes Potenzial besitzen, bei der Behandlung schwer therapierbarer Erkrankungen zu helfen3. Zu den zentralen Entwicklungsherausforderungen zählen hohe Herstellungskosten sowie die begrenzte Vorhersagekraft aktueller in vitro-Assays hinsichtlich Produktqualität und klinischer Wirksamkeit4.

Die Weiterentwicklung von AAV-Therapeutika wird grundlegend durch den Mangel an vorhersagbaren, standardisierten Aktivitätsassays eingeschränkt, die die klinische Wirksamkeit genau prognostizieren können4,5. Solche Assays sind eine entscheidende Komponente der Entwicklungs-Pipeline, da sie für mehrere Zwecke eingesetzt werden, darunter das Durchmustern von Bibliotheken modifizierter Vektoren, die Optimierung von Kapsid-Modifikationen zur Verbesserung der Zielgerichtetheit und die Bewertung der gewebespezifischen Tropismus. Sie dienen zudem dazu, den Einfluss regulatorischer Sequenzen auf die Transgenexpression zu charakterisieren6. Über die Kandidatenauswahl hinaus unterstützen AAV-Transduktionsassays auch wesentliche Qualitätskontrollen in der Herstellung, und zwar durch Potenzassays, die für die Freigabe von Chargen, Chargenvergleichsstudien und Stabilitätsbewertungen verwendet werden6,7.

Die wissenschaftliche Herausforderung besteht darin, Assays zu entwickeln, die die Komplexität der Wechselwirkungen zwischen Vektor und Wirt erfassen, gleichzeitig aber praktikabel genug sind, um routinemäßig eingesetzt werden zu können7,8. Zu den derzeitigen Ansätzen zählt die Nutzung immortaler Zelllinien, die das Zielorgan in herkömmlichen zweidimensionalen Monoschichtkulturen repräsentieren. Diese Kulturbedingungen weisen eine geringe physiologische Relevanz auf und erfordern hohe Wirkstoffdosen. Dies führt zu einer erheblichen Diskrepanz zwischen Laborvorhersagen und klinischer Übertragbarkeit. Neuartige, gezielt modifizierte Zelllinien, wie Systeme mit Überexpression von AAVR oder CRISPR-Aktivierung, stellen wichtige Fortschritte dar, können jedoch die dreidimensionale Architektur und die Wechselwirkungen mit der extrazellulären Matrix, wie sie in nativen Geweben vorkommen, nicht nachbilden9,10,11. Modelle der nächsten Generation, die in vivo-Mikroumgebungen besser simulieren, könnten diese translationale Kluft überbrücken12,13,14.

Kürzlich haben wir ein auf die AAV-Transduktion optimiertes 3D-Sphäroid-System entwickelt, um die Übertragbarkeit von AAV-Transduktionsassays zu verbessern. Im Vergleich zu den etablierten 2D-Assays steigert dieses System die Effizienz der AAV-Transduktion signifikant über mehrere Zelllinien und AAV-Serotypen hinweg. Neben der erhöhten Empfindlichkeit und der geringeren Menge an benötigtem Produkt ermöglichen diese Modelle im Gegensatz zu 2D-Monolagen realistische Zell-Zell-Interaktionen, die je nach zellulärem Ort innerhalb des Sphäroids variieren. Zudem erlauben sie aussagekräftige Untersuchungen zur Penetration von Wirkstoffen unter Bedingungen, die tatsächlichen Organverhältnissen ähneln11,15,16. Darüber hinaus bietet der Sphäroid-Ansatz praktische Vorteile gegenüber komplexeren Organoid- oder Ko-Kultursystemen, da er auf Standardlaborgeräten basiert und auf spezialisierte Kulturmedien oder Trägermaterialien verzichtet. Diese Einfachheit gewährleistet Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit und macht das System besonders geeignet für routinemäßige Tests in der Gentherapie sowie für die Entwicklung von Vektoren17.

Diese 3D-Sphäroid-Plattform eignet sich besonders gut für Anwendungen, die eine empfindliche Detektion der AAV-Transduktion bei niedrigen Dosen und eine vergleichende Bewertung von Vektorgenom-Designs erfordern. Sie ermöglicht außerdem die Beurteilung serotypabhängiger Tropismen. Besonders vorteilhaft ist sie für Zelllinien mit relativ geringer Transduktionseffizienz, die in herkömmlichen 2D-Kulturen hohe AAV-Dosen benötigen. In diesen Fällen sind die erhöhte Empfindlichkeit und die verbesserte physiologische Relevanz der 3D-Plattform entscheidend. Dieses System ist jedoch weniger geeignet für Studien, die Immunbestandteile, vaskuläre Zufuhr oder vollständige Gewebekomplexität erfordern, da Sphäroide die in vivo -Umgebung nicht vollständig nachbilden.

Daher stellen wir ein einfaches 3D-Sphäroid-Protokoll vor, das für AAV-Transduktionsassays optimiert ist und zwei entscheidende und komplementäre Endpunkte umfasst: die Transduktionseffizienz (hier definiert als Gesamtsignal des Reportergens pro Sphäroid) und die Transduktionskinetik. Diese Methode bietet eine kostengünstige, physiologisch relevante und aussagekräftige Plattform zur Bewertung der AAV-Potenz, Vektordesigns und Neutralisationsassays.

Protokoll

Diese Studie verwendete etablierte humane Zelllinien (HEK293T, HeLa, Huh7, HEP3B, HEPG2 und A375), die von kommerziellen Quellen oder aus früheren Veröffentlichungen stammten. Es wurden keine primären menschlichen oder tierischen Proben verwendet, weshalb keine ethische Genehmigung erforderlich war.

1. Sterile Versuchsanordnung und anfängliche Haubenpräparation

  1. Aktivieren Sie den Sicherheitswerkbank.
  2. Schalten Sie die mikrobiologische Sicherheitswerkbank der Klasse II mit laminarer Luftströmung 15 Minuten vor Arbeitsbeginn ein, um eine ausreichende Stabilisierung der Luftströmung zu gewährleisten.
  3. Besprühen Sie alle inneren Oberflächen der Haube mit 70 % (v/v) Ethanol.
  4. Stellen Sie eine 5 %ige (v/v) Bleichmittel-Desinfektionslösung in einem 500 mL-Glaskolben her, um Zellüberstände und zelluläre Rückstände zu entsorgen.
  5. Reinigen Sie Geräte, indem Sie alle Mikropipetten und Pipettenspitzenkästen gründlich mit 70 % (v/v) Ethanol desinfizieren.

2. Herstellung des Zellkulturmediums

  1. 500 mL Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glucosespiegel als Basismedium herstellen.
  2. Das Basismedium mit 10 mL hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum (FBS), 1 mL Penicillin/Streptomycin-Lösung (100 Einheiten/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin) und 5 mL 2 mM L-Glutamin ergänzen.
    ANMERKUNG: Während aller Verfahren müssen aseptische Techniken eingehalten werden. Für jedes Experiment ist frisches Medium anzusetzen. Spezifische Geräteangaben finden Sie in der Tabelle der Materialien.

3. Herstellung von Sphäroiden

  1. Bereiten Sie das vollständige DMEM-Medium wie oben beschrieben zu.
  2. Erwärmen Sie das Kulturmedium 10–15 min im 37 °C warmen Wasserbad.
  3. Entnehmen Sie die gewünschten Zelllinien aus dem flüssigen Stickstofftank.
  4. Tauen Sie kryokonservierte HEK293T-, Huh7-, HEP3B-, HEPG2-, A375- und HeLa-Zellen schnell im 37 °C warmen Wasserbad auf.
  5. Entfernen Sie die Zellen unverzüglich aus dem Wasserbad, sobald der letzte Eiskristall geschmolzen ist.
  6. Verdünnen Sie 1 mL der aufgetauten Zellen in 9 mL vollständigem DMEM-Medium.
    HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten Zelllinien werden unter denselben DMEM-Medien- und Kulturbedingungen gehalten.
  7. Zentrifugieren Sie die Zellen 5 min bei Raumtemperatur mit 350 × g.
  8. Entfernen Sie den Überstand.
  9. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 mL vollständigem DMEM-Medium.
  10. Säen Sie die Zellen in einem T75-Zellkulturgefäß aus.
  11. Stellen Sie die beimpften Gefäße in einen Zellkulturinkubator, der bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit gehalten wird.

4. Überwachung des Zellwachstums

  1. Fügen Sie alle 3 Tage 15 mL Kulturmedium hinzu.
  2. Pasagieren Sie HEK293T-, Huh7-, HEP3B-, HEPG2-, A375- und HeLa-Zellen, wenn sie eine Konfluenz von 70 % erreicht haben; aspirieren Sie das komplette DMEM-Medium aus den T75-Flasks. 
  3. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 5 mL PBS zu den T75-Flasks hinzufügen, die die Zellen enthalten.
  4. Aspirieren Sie das 5 mL PBS 30 s nach der Zugabe zu den T75-Flasks. 
  5. Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal.
  6. Behandeln Sie die Zellen mit 5 mL 0,05 % Trypsin-EDTA für 5 min, um sie abzulösen. 
  7. Inkubieren Sie die Flasks 5 min in einem 37 °C warmen Inkubator, um eine vollständige Zellablösung zu ermöglichen.
  8. Fügen Sie 5 mL komplettes DMEM-Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.
  9. Zentrifugieren Sie die Zellen 5 min bei 350 × g, um das Trypsin zu entfernen. 
  10. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 mL DMEM. 
  11. Teilen Sie die Zellen im Verdünnungsverhältnis 1:10 für die routinemäßige Zellpasagierung auf. 
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Zellen zweimal zu pasagieren, bevor Experimente durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Zellen die exponentielle Wachstumsphase erreichen und metabolisch aktiv werden. 
  12. Setzen Sie die Inkubation unter diesen kontrollierten Bedingungen fort, bis die Zellen eine Konfluenz von 70 % erreichen, und führen Sie anschließend die weiteren experimentellen Schritte durch.
    HINWEIS: Die Zellmorphologie und Wachstumsmuster sollten regelmäßig überwacht werden. Achten Sie auf eine korrekte Positionierung der Flasks für einen optimalen Gasaustausch. Sterile Bedingungen sind während des gesamten Inkubationszeitraums unerlässlich.

5. Zellgewinnung und anfängliche Zellpräparation

  1. Entfernen Sie das Kulturmedium, indem Sie das vorhandene Kulturmedium aus den T75-Flaschen abpipettieren.
  2. Waschen Sie die HEK293T-, Huh7-, HEP3B-, A375,- HEPG2- und HeLa-Zellen dreimal mit PBS, um restliches Medium und Zelltrümmer zu entfernen.
  3. Geben Sie 5 mL vorgewärmte 1× Trypsin-Lösung zu diesen Zellen, um die anhaftenden Zellen von der Flächenoberfläche der Flasche zu lösen.
    ANMERKUNG: Stellen Sie sicher, dass das Trypsin vorgewärmt ist, um die optimale enzymatische Aktivität aufrechtzuerhalten. Legen Sie die Flaschen für 5 Minuten in einen 37 °C-Inkubator, um eine vollständige Ablösung der Zellen zu ermöglichen. Überwachen Sie die Trypsinierungszeit sorgfältig, um eine Überverdauung zu vermeiden.
  4. Geben Sie 5 mL komplettes Kulturmedium hinzu, um das Trypsinenzym zu inaktivieren.
  5. Pipettieren Sie die Mischung mehrmals auf und ab, um die Lösung zu homogenisieren.
  6. Sammeln Sie jede Zellsuspension, indem Sie die gesamte Zellsuspension in separat beschriftete Zentrifugenröhrchen überführen.
    ANMERKUNG: Die Zellen sollten während der Resuspension schonend behandelt werden, um die Vitalität zu erhalten.
  7. Zentrifugieren Sie die Zellen mit 350 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren.
  8. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 5 mL frischem Kulturmedium.

6. Zellzählung und Bestimmung der Zellviabilität mithilfe eines Zellzählgeräts

  1. Homogenisieren Sie die Suspension, indem Sie sie vorsichtig mehrmals auf- und abpipettieren, um eine gleichmäßige Zellverteilung in der Zentrifugenprobe sicherzustellen.
  2. Bereiten Sie Zählröhrchen für HEK293T-, Huh7-, HEP3B-, HEPG2-, A375- und HeLa-Zellen vor.
  3. Stellen Sie eine 1:10-Verdünnung der Probe in vollständigem DMEM-Kulturmedium her. Zum Beispiel 40 µL Zellsuspension in 360 µL vollständigem DMEM-Medium.
  4. Pipettieren Sie das Gemisch vorsichtig viermal auf und ab, um eine homogene Verdünnung sicherzustellen.
  5. Kennzeichnen Sie die Probe beim Login, und geben Sie den verwendeten Zelltyp, die Verdünnung und den Probennamen an.
  6. Geben Sie die Probe in den Zellzähler ein, und platzieren Sie das Röhrchen mit der verdünnten Zellsuspension in die zugewiesene Nummer.
    HINWEIS: Der Zellzähler ist ein automatisierter Zellzähler, der Zellproben ansaugt und mit Trypanblau mischt, wodurch die Variabilität zwischen verschiedenen Bedienern verringert wird.
  7. Lassen Sie die Zellsuspension vor der Zählung 1 Minute lang sedimentieren.
  8. Resuspendieren Sie die Zellen gleichmäßig, bevor Sie die Zählung durchführen, um genaue Ergebnisse zu erhalten.
  9. Berechnen Sie die Gesamtzellzahl.
  10. Verwenden Sie die Gesamtkonzentration an lebensfähigen Zellen, um die Zellansaat für Experimente zu bestimmen.
  11. Verwenden Sie lebensfähige Zellen mit einer Vitalität von > 90 %.
  12. Unterscheiden Sie zwischen lebensfähigen (nicht angefärbten) und nicht lebensfähigen (blau angefärbten) Zellen.
    HINWEIS: Die Zählkriterien sollten bei allen Proben konsistent angewendet werden.

7. Aussaat von Sphäroiden und Optimierung der Größe

  1. Pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals auf und ab, um die Lösung zu homogenisieren.
  2. Säen Sie verschiedene Zelldichten von HEK293T-, Huh7-, HEP3B-, HEPG2- oder HeLa-Zellen aus.
  3. Beginnen Sie mit der Aussaat von 1 × 104 Zellen in 200 µL in einer ultra-niedrig bindenden (ULA) 96-Well-Rundbodenplatte.
  4. Führen Sie eine serielle Verdünnung der 1 × 104 Zellen/Well in Zweifachverdünnungen durch, bis die gewünschte Zelldichte für die Experimente erreicht ist.
  5. Geben Sie 1 Volumen vollständiges Medium zu allen Reihen (1B–1H) hinzu, mit Ausnahme der obersten Reihe.
  6. Geben Sie 2 Volumina von 1 × 104 Zellen/Well in Reihe 1A (oberste Reihe) hinzu.
  7. Verdünnen Sie Reihe 1A seriell, indem Sie 1 Volumen aus Reihe 1A in Reihe 1B überführen und so weiter. Siehe Beispiel für die experimentelle Anordnung unten in Supplementary Figure 1.
    HINWEIS: Sorgen Sie durch vorsichtiges Antippen der Plattenwände für eine gleichmäßige Resuspension.
  8. Zentrifugieren Sie die ULA-Platte bei 350 × g für 5 min, um die Zellen in die Mitte zu ziehen und den Zell-Zell-Kontakt zu fördern.
    HINWEIS: Bei Verwendung anderer Zelllinien als der hier beschriebenen kann eine Optimierung der Parameter erforderlich sein, da unterschiedliche Zelllinien variierende Wachstums- und Sphäroidbildungsraten aufweisen.
  9. Vermeiden Sie es, die Platten in den ersten 24–48 Stunden zu stören, um die anfängliche Sphäroidbildung zu ermöglichen. Lassen Sie die Sphäroide 3 Tage lang reifen, bis sie einen Durchmesser von etwa 400 µm erreichen.
  10. Überprüfen Sie die Gleichmäßigkeit der Sphäroidgröße. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig resuspendiert sind und dass die Platten nicht verformt sind.
    HINWEIS: Verwenden Sie keine Platten mit Sphäroiden unterschiedlicher Größe. Achten Sie darauf, dass die Sphäroide innerhalb jedes Wells annähernd gleichmäßig im Durchmesser sind.
  11. Beobachten Sie die Sphäroidmorphologie.
    HINWEIS: Gut ausgebildete Sphäroide erscheinen rund mit scharf definierten Rändern.
  12. Bilden Sie reife Sphäroide mit enger Zell-Zell-Adhäsion, nicht lockere Zellaggregate.
  13. Erhöhen Sie die Aussaatdichte oder verlängern Sie die Bildungszeit. Falls die Sphäroide nicht kompakt sind, erhöhen Sie die Aussaatdichte oder verlängern Sie die Bildungszeit.
  14. Verringern Sie mehrere kleine Aggregate durch Reduzierung der Aussaatdichte oder durch Verlängerung des Zentrifugationsschritts.

8. Echtzeit-Überwachung von Sphäroiden in lebenden Zellen

  1. Nachdem die Zellsuspensionen zentrifugiert wurden, überführen Sie die Platte in einen 37 °C warmen Inkubator (5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit), der ein Live-Cell-Imaging-Gerät für die automatisierte Live-Cell-Bildgebung enthält.
  2. Legen Sie die Parameter für die Live-Cell-Bildgebung von Sphäroiden je nach Experiment fest:
    HINWEIS: Die folgenden Parameter wurden für alle getesteten Zelllinien verwendet.
  3. Melden Sie sich bei der Aufnahmesoftware an.
  4. Wählen Sie die folgenden Befehle aus:|Zeitplan für Aufnahme| | Neues Gefäß hinzufügen | Scan nach Zeitplan | Gefäß erstellen: Neu.
  5. |Scan-Typ auswählen|: Sphäroid. |Wählen Sie die gewünschten Kanäle aus|: Phase + Hellfeld (zur Verfolgung des Sphäroidwachstums), Grün/Rot (zur Verfolgung der AAV-Transduktion, Aufnahmezeit 300 ms bzw. 400 ms).
  6. Wählen Sie die gewünschte Vergrößerung: 10x.
  7. Wählen Sie das Plattenmodell und dessen Position in der Schublade aus.
  8. Wählen Sie die zu bildenden Wells und die gewünschte Anzahl der Bilder pro Well aus.
  9. Geben Sie die Beschreibung des Experiments ein: Name, Zelltyp, Anzahl der Zellen.
  10. Wählen Sie für die Analyseeinrichtung Analyse auf später verschieben.
  11. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zeitleiste und wählen Sie die Option „Ausgewählte Scan-Gruppe: Intervall festlegen“.
  12. Stellen Sie jeden 6. Stunden einen weiteren Scan ein und führen Sie die Scans unbegrenzt durch. Legen Sie die gewünschte Startzeit fest (mindestens 1 Stunde nach Inkubation im automatisierten Imaging-Gerät).
  13. Überprüfen Sie täglich das Sphäroidwachstum, indem Sie sich in die Imaging-Software einloggen.
  14. Wählen Sie die Option „Letzte Scans anzeigen“ und doppelklicken Sie auf das gewünschte Experiment. |Wählen Sie Hellfeld im Bildkanal-Feld aus| und verwenden Sie dann das |Bild messen| -Werkzeug zur Bestimmung des Durchmessers der Sphäroide.
    HINWEIS: Möglicherweise ist eine optimale Reifedauer erforderlich, um kompakte Sphäroide aus den gewünschten Zellen zu erzeugen.
  15. Entfernen Sie die Platte am Tag der optimalen Sphäroidbildung und verwenden Sie sie für die AAV-Transduktion.

9. AAV-Transduktion

  1. Beziehen oder herstellen Sie AAV-Serotypen3 und gewünschte Transgene.
  2. Stellen Sie ein DMEM-Medium mit 2 % FBS für AAV-Transduktionen her, indem Sie 10 mL FBS zu 490 mL DMEM hinzufügen.
    HINWEIS: Für die Untersuchung von Kapsiden oder genomischen regulatorischen Elementen eignet sich ein GFP-Transgen hervorragend, wie im Abschnitt „Repräsentative Ergebnisse“ gezeigt. Verdünnen Sie das gewünschte AAV in DMEM-Medium mit 2 % FBS, ohne Antibiotika.
  3. Verdünnen Sie in einer geeigneten 96-Well-Rundplatte für serielle Verdünnungen.
  4. Erstellen Sie 1:10-Verdünnungen ausgehend vom initialen MOI, um AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 und AAV9 zu titrieren.
  5. Siehe Beispiel für experimentellen Aufbau unten in Ergänzende Abbildung 2. Berechnen Sie den für die AAV-Transduktion erforderlichen MOI, wie im Abschnitt „Diskussion“ dargestellt.
  6. Geben Sie 33 µL AAV-Stammlösung zu 297 µL Medium, um insgesamt 330 µL mit einem MOI von 1 × 106 zu erhalten.
  7. Führen Sie zehnfache serielle Verdünnungen durch, beginnend mit einem MOI von 1 × 106, indem Sie 33 µL in 297 µL DMEM-Medium mit 2 % FBS geben.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, hohe MOIs zu vermeiden, um eine verminderte Zellviabilität zu verhindern. Eine Optimierung der experimentellen Bedingungen kann je nach Zelltyp und AAV-Serotyp erforderlich sein, da diese den optimalen MOI erheblich beeinflussen können. Nicht alle viralen Genome sind infektiös; funktionelle Titer können sich vom angegebenen Wert in vg/mL unterscheiden.

10. AAV-Dosierung

  1. Entfernen Sie mit einer Mehrkanalpipette sämtliches Medium aus der bereits vorbereiteten Sphäroid-Platte.
  2. Fügen Sie 100 µL des gewünschten MOI hinzu, indem Sie dieses Volumen mit einer Mehrkanalpipette von der Verdünnungsplatte auf die Behandlungsplatte übertragen.
  3. Stellen Sie die Platten zurück in das Bildgebungsinstrument und beginnen Sie mit der Überwachung der Transduktion, indem Sie die grüne Fluoreszenzintensität über einen Zeitraum von 72 h verfolgen.
  4. Geben Sie alle 3 Tage 100 µL vollständiges DMEM-Medium pro Vertiefung hinzu, um die Nährstoffe aufzufüllen, falls die Überwachung länger als 3 Tage dauert.

11. Live-Cell-Bildgebung, Transduktionsüberwachung und Datenanalyse

  1. Stellen Sie die Platte nach Zugabe des gewünschten AAV und MOI zur Behandlungsgruppe wieder in das Gerät.
  2. Beginnen Sie alle 6 Stunden mit der Aufzeichnung der Transduktionseffizienz.
    HINWEIS: Es dauert gewöhnlich zwischen 3 und 5 Tagen, um eine optimale GFP-Expression zu erreichen. Dies hängt vom verwendeten Promotor und der Genomkonfiguration ab.
  3. Analysieren Sie die Daten, indem Sie eine Analysedefinition erstellen, die spezifisch für die Zellen und Reportergene von Interesse ist.
    HINWEIS: Alternativ können Sie die Platte in einem standardmäßigen 37 °C-Inkubator belassen und die Transduktionseffizienz mittels qPCR, Western Blot oder ELISA bestimmen.
  4. Definieren Sie die Analyseparameter, indem Sie eine Hellfeldanalyse zur primären Sphäroiddetektion durchführen.
  5. Optimieren Sie die Segmentierungsparameter wie folgt:
    1. Analysentyp: "Spheroid Brightfield."
    2. Segmentierungsmethode: "Adaptiver Schwellwert."
    3. Schwellwertbereich: 0,3–0,8 (anfänglich automatische Anpassung empfohlen)
    4. Top-hat-Filter: 200–500 µm (entfernt ungleichmäßige Beleuchtung)
  6. Optimieren Sie die Hellfeldparameter wie folgt:
    1. Laden Sie repräsentative Bilder aus verschiedenen Zeitpunkten.
    2. Testen Sie den Schwellwertbereich (0,2–0,9), um die optimale Detektion zu finden.
    3. Passen Sie die Größenfilter basierend auf dem erwarteten Sphäroidgrößenbereich an.
    4. Validieren Sie die Segmentierung durch visuelle Überlagerungsprüfung.
  7. Optimieren Sie den grünen Kanal zur Beurteilung der AAV-Transduktion wie folgt:
    1. Bestimmen Sie die Hintergrundwerte in unbehandelten Vertiefungen (MOI=0).
    2. Setzen Sie den Schwellwert 2–3× über dem Hintergrundrauschen.
    3. Testen Sie dies mit der Probe, die mit dem höchsten MOI behandelt wurde.
  8. Optimieren Sie die Belichtungszeit , um Sättigung zu vermeiden und gleichzeitig das Signal beizubehalten
    HINWEIS: Berichten Sie bei AAV-Transduktionen das gesamte Fluoreszenzsignal pro Sphäroid als Maß für die Transduktionseffizienz.

12. Datenanalyse

  1. Wählen Sie die korrekten Parameter aus und passen Sie die Filter und Masken an, um die Zellen auf dem Bild und nicht das Hintergrundrauschen auszuwählen.
  2. Wählen Sie ein repräsentatives Bild, um die Software zu trainieren.
  3. Wenden Sie die optimierten Parameter auf alle Bilder der Studie an.
  4. Extrahieren Sie die Daten entweder als individuelle Werte oder in Gruppen und übertragen Sie sie in ein System zur statistischen Analyse für die weitere Aufbereitung der Daten.

13. Berechnung der Latenzzeit

  1. Berechnen Sie die Zeit, die benötigt wird, um das erste GFP-Signal pro MOI zu detektieren.
  2. Führen Sie eine Interpolation bei dem Mittelwert der unbehandelten Wells (MOI = 0) plus 3 Standardabweichungen (SD) durch.
  3. Kopieren Sie die grün fluoreszierende Intensität jedes Sphäroids zu jedem Zeitpunkt aus der Live-Cell-Imaging-Software in eine statistische Software.
  4. Mitteln Sie die Replikate.
  5. Berechnen Sie die mittleren Signale und deren Standardabweichung (SD) aller Wells mit unbehandelten Sphäroiden (MOI = 0).
  6. Verwenden Sie eine asymmetrische sigmoidale 5PL-Kurvenanpassung, um die Einsetzzeit für jedes MOI zu interpolieren.
  7. Beispielsweise wurden für Tabelle 1 folgende Interpolationswerte verwendet:
    1. Für scGFP: 254.955 (Mittelwert) + 3 × 288.055 (SD) = 1.412.120 (Interpolationssignal)
    2. Für ssGFP: 2.417.941 (Mittelwert) + 3 × 26.093  (SD) =  3.200.746 (Interpolationssignal)

14. Messen Sie die Fluoreszenz mit einem Plattenreader mit Fluoreszenzfunktion.

  1. Starten Sie die Software des fluoreszenzbasierenden Plattenreaders auf dem mit dem Plattenreader verbundenen Computer.
  2. Navigieren zu Datei > Öffnen Protokoll auswählen und den Platten-Typ (z. B. 96-Well, 384-Well) festlegen sowie sicherstellen, dass das korrekte Wells-Layout ausgewählt ist. 
  3. Stellen Sie die Integrationszeit für die Fluoreszenzdetektion ein, die bestimmt, wie lange das Gerät die Fluoreszenz von jedem Well sammelt.
  4. Anpassen jegliche Gewinn oder Empfindlichkeit Einstellungen
    wenn der Assay erfordert höher oder niedriger Signal Nachweis
  5. Stellen Sie die fluoreszenten Parameter für GFP wie folgt ein: Anregung: 485 nm und Emission: 528 nm.
  6. Klicken Sie in der Software auf „Run“, um die Messung zu starten.
  7. Messen Fluoreszenz von jeder gut.
    HINWEIS – Nach dem Durchlauf zeigt die Software die Rohfluoreszenzwerte an, die zur Erstellung von Grafiken verwendet werden können, indem Mittelwerte berechnet und die Hintergrundfluoreszenz subtrahiert wird.
  8. Export Ergebnisse in der, die, das bevorzugt Format für weiter Analyse oder Berichterstattung.
    HINWEIS: Falls das Beispielprotokoll geändert wurde, verwenden Sie Datei > Speichern unter, um eine eindeutige Version zu erstellen und die ursprüngliche Datei für die zukünftige Verwendung beizubehalten.

15. Lumineszente Transgen-Transduktion

  1. Befolgen Sie denselben Aussaat- und AAV-Dosierungsprotokoll wie oben beschrieben.
  2. Geben Sie 100 µL AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 und AAV9, die ein Nano-Luciferase-Transgen tragen, mit unterschiedlichen MOIs im Bereich von 0–106 zu 100 µL bereits in ULA-Platten gewachsenen HeLa-Sphäroiden hinzu.
  3. Inkubieren Sie die Platten in einem üblichen 37 °C-Inkubator und bewerten Sie die Transduktionseffizienz nach drei Tagen der Transduktion.

16. Herstellung des extrazellulären Lumineszenzinhibitors und des Lumineszenzsubstrats zur Detektion in lebenden Zellen

  1. Entfernen Sie die Assayplatten am Tag 3 (Endpunkt) aus dem Inkubator.
  2. Geben Sie den extrazellulären Lumineszenzinhibitor und das Substrat direkt zu den Zellen hinzu.
    HINWEIS: Ein Mediumwechsel ist nicht erforderlich.
  3. Entnehmen Sie den extrazellulären Inhibitor aus der Lagerung bei −20 °C und lassen Sie ihn bei Raumtemperatur auftauen.
  4. Zentrifugieren Sie kurz, um die Flüssigkeit von Deckel und Wand des Röhrchens zu sammeln.
  5. Stellen Sie die gewünschte Menge an rekonstituiertem 15X extrazellulärem Lumineszenzinhibitor her, indem Sie 1 Teil Extrazellulärer Inhibitor mit 14 Teilen vollständigem DMEM-Medium mischen.
    1. Beispielsweise, wenn das Experiment 1,0 mL Reagenz erfordert, geben Sie 67 µL Inhibitor zu 933 µL DMEM. Für 1 Platte bereiten Sie 1 mL DMEM vor und geben 67 µL Inhibitor hinzu.
  6. Überführen Sie den in Schritt 16.5 hergestellten Inhibitor in ein steriles Reagenzreservoir.
  7. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 10 µL Inhibitor in die mit AAV transduzierten Vertiefungen abzugeben.
  8. Entnehmen Sie das Substrat für lebende Zellen aus der Lagerung bei −20 °C und mischen Sie es.
  9. Zentrifugieren Sie kurz, um die Flüssigkeit von Deckel und Wand des Röhrchens zu sammeln.
  10. Stellen Sie die gewünschte Menge an rekonstituiertem 3,6X Live-Cell-Reagenz her.
  11. Bereiten Sie 4 mL DMEM vor und geben Sie 144 µL Substrat für 1 Platte hinzu.
  12. Überführen Sie das in Schritt 16.11 hergestellte Substrat in ein steriles Reagenzreservoir.
  13. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 µL Substrat in dieselben mit AAV transduzierten Vertiefungen abzugeben.
    HINWEIS: Die Reagenzvolumina müssen möglicherweise angepasst werden, wenn mehrere Assayplatten gleichzeitig durchgeführt werden.
  14. Schütteln Sie die Platte 5 min bei Raumtemperatur mit 300 U/min.
  15. Lesen Sie die Platte innerhalb von 2 h nach Zugabe der Lumineszenznachweisreagenzien mit einem in vivo-Bildgebungssystem aus.
    HINWEIS: Die Lumineszenzintensität nimmt innerhalb von 2 h allmählich ab.

17. Biolumineszenzbildgebung

  1. Schalten Sie das Biolumineszenz-Bildgebungssystem mindestens 30 Minuten vor der Bildaufnahme ein, um der CCD-Kamera Zeit zum Abkühlen zu geben (−90 °C).
  2. Stellen Sie sicher, dass die Platten bereit für die Bildaufnahme sind (z. B. Substrat für die Lebendzell-Bildgebung zur Biolumineszenzdetektion hinzugefügt).
  3. Entfernen Sie den Plattendeckel, um Lichtreflexion und Streuung zu vermeiden.
  4. Reinigen Sie den Boden der Platte, falls von unten abgebildet wird.
  5. Platzieren Sie die Platte in der Bildgebungskammer auf dem Objekttisch.
  6. Richten Sie die Platte mittig unter der Kamera aus.
  7. Stellen Sie die Bildgebungseinstellungen für Lumineszenz ein: Automatische Belichtung oder manuelle Belichtungszeit (typischerweise 1–60 s), Binning (mittlere Stufe empfohlen), Blende (1 für maximale Empfindlichkeit).
  8. Nehmen Sie ein Foto zur anatomischen Referenz auf.
  9. Aufnahme des lumineszenten Bildes.

18. Analyse von Biolumineszenz-Bildgebungsdaten

  1. Verwenden Sie ROI-Werkzeuge, um Vertiefungen oder Bereiche von Interesse einzukreisen.
  2. Stellen Sie eine einheitliche ROI-Größe über alle Proben hinweg sicher, um Vergleiche zu ermöglichen.
  3. Messen Sie den gesamten Fluss (Photonen/Sekunde) für die Biolumineszenz.
  4. Messen Sie die Strahlungseffizienz.
  5. Exportieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulation zur statistischen Analyse.
  6. Speichern Sie Bilddateien und Analyseergebnisse.
  7. Exportieren Sie die Bilder als TIFF- oder JPEG-Dateien für Präsentationen.

Ergebnisse

Hier zeigen wir, dass 3D-Sphäroide als Werkzeug zur Beurteilung der AAV-Transduktion, zur Unterscheidung von Vektorgenom-Konstrukten wie selbstkomplementär (sc) und einsträngig (ss) sowie zur Bewertung der Transduktionskinetik verwendet werden können. Ein Überblick über den Prozess ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, werden die Zellen zunächst in 2D-Kulturen vermehrt und in Platten mit ultra-niedriger Anhaftung (ULA) ausgesät, um kompakte Sphäroide zu bilden (Abbildung 1A). Anschließend werden die Platten zentrifugiert, um die Aggregation zu fördern (Abbildung 1B), und anschließend in ein Live-Cell-Imaging-System überführt, um die Sphäroidbildung in Echtzeit zu überwachen (Abbildung 1C). Am Tag 3 werden die Sphäroide mit AAV bei variierenden MOIs transduziert (Abbildung 1D). Die Transduktionskinetik wird mittels Live-Cell-Imaging über einen längeren Zeitraum verfolgt (Abbildung 1E), und die Endpunktanalyse erfolgt mithilfe plattenbasierter Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignale (Abbildung 1F).

Abbildung 2 zeigt die Morphologie von Sphäroiden aus sechs verschiedenen Zelllinien, die eine Bandbreite an Dichten, Rundheit und Form aufweisen. Alle Zelllinien wurden über mehrere Passagen in vollständigem DMEM-Medium kultiviert, bevor sie in Experimenten verwendet wurden. Sobald die Zellen die log-phase erreicht hatten, wurden HEP3B-, HEK293T-, A375-, HeLa-, HEPG2- und Huh7-Zellen geerntet und seriell in ULA-Rundbodenplatten verdünnt, beginnend mit einer Zelldichte von 10.000 Zellen pro Vertiefung, wobei eine Verdünnung im Verhältnis 1:2 erfolgte (Plattenlayout siehe ergänzende Abbildung 1; repräsentative Ergebnisse sind in ergänzender Abbildung 2 dargestellt). Die Größe der Sphäroide kann bereits bei 50 µm liegen und dennoch eine stabile Sphäroidstruktur sowie eine ausgezeichnete Transduktionsanfälligkeit aufweisen. Nach der Zellseeding wurde die ULA-Rundbodenplatte 5 min bei 350 × g zentrifugiert, wodurch die Zellen sich in der Mitte der Vertiefung sammeln und zu Sphäroiden selbst assemblieren können. Dieser Schritt ist besonders vorteilhaft für Zellen, die sich nicht von Natur aus aggregieren. Die Zentrifugationsdauer kann bei stark resistenten Zellen, wie beispielsweise Lymphozyten, von 5 auf 15 min verlängert werden. Gut ausgebildete Sphäroide weisen ein rundes und kompaktes Phänotyp auf, wie er bei HEK293T- und Huh7-Zellen beobachtet wird, während schlecht gebildete Sphäroide locker aggregiert sind und während Mediumwechseln zur Desintegration neigen.

Anschließend wird die Platte in einen 37 °C warmen Inkubator überführt, der mit einem Instrument zur Live-Cell-Überwachung ausgestattet ist. Die Platten werden täglich im Abstand von 6 Stunden überwacht, um die Sphäroidbildung für jede der hier beschriebenen Zelllinien zu beurteilen. Die meisten Zelllinien benötigen 3 Tage, um sich zu einem Sphäroid selbst zu organisieren. Wie in Abbildung 2 gezeigt, wiesen alle Zelllinien nach 3 Tagen Zellansaat unterschiedliche morphologische Merkmale und variierende Verdichtungsgrade auf. Hepatische Zelllinien (Huh7, HEPG2 und HEP3B) bildeten kompaktere, dichtere Sphäroide als die anderen Zelllinien. HEK293T bildete eine sehr runde, kugelförmige Struktur mit einem deutlichen nekrotischen Kern, während A375 ein unregelmäßig geformtes Zellaggregat bildete (zuvor als deformiertes Sphäroid beschrieben)18,19. Diese Unterschiede in der Morphologie gelten als Hinweise auf pathophysiologische Krankheitszustände und unterstreichen weiterhin den Nutzen von 3D-Modellen im Vergleich zu 2D-Kultursystemen18,19. Das Protokoll zur Sphäroidbildung ist über alle sechs getesteten Zelllinien hinweg hoch reproduzierbar und wurde auf alle hier gezeigten Transduktionen angewandt.

Nach der Optimierung der Zellkonzentration, der Zeit für die Sphäroidbildung und des Status der grünen/roten Autofluoreszenz (gezeigt in Supplementary Figure 3) testeten wir die AAV-Transduktion in Sphäroiden unter Verwendung eines Live-Cell-Imaging-Systems und eines Plattenlesegeräts (ein Beispiel für das Plattenlayout zur AAV-Titration ist in Supplementary Figure 4 dargestellt). Abbildung 3 zeigt das optimierte Sphäroidprotokoll, das in vier verschiedenen Zelllinien angewendet wurde (HEK293T, Huh7, HEP3B und HEPG2). Am dritten Tag der Sphäroidbildung wurden die Sphäroide mit zwei AAV2-Vektoren transduziert, die unterschiedliche Vektorgenom-Konstrukte tragen, mit GFP markiert sind und bei verschiedenen Multiplizitäten der Infektion (MOIs) appliziert wurden. Diese beiden AAV-Transgen-Konstrukte repräsentieren hochwirksame (scGFP) und schwach wirksame (ssGFP) GFP-Varianten. Nach der Transduktion der Zellen wurden die Platten in ein Live-Cell-Imaging-System zur Echtzeitüberwachung der AAV-Transduktion eingelegt. Zum Zeitpunkt von 72 Stunden wurde die grüne Fluoreszenzintensität mithilfe einer Live-Cell-Imaging-Software erfasst. In Abbildung 3, repräsentieren die blauen Linien sc-GFP-Genome, während die roten Linien ss-GFP-Genome darstellen. Die Sphäroide erwiesen sich als hochanfällig für die AAV-Transduktion, wobei eine starke Transduktion bereits bei sehr niedrigen AAV-Titern und über verschiedene Zelllinien hinweg für scGFP nachgewiesen wurde. Repräsentative Videos der AAV-Transduktion in verschiedenen Zelllinien und bei unterschiedlichen MOIs, die in Echtzeit aufgezeichnet wurden, sind in Supplementary Movie 1, Supplementary Movie 2, Supplementary Movie 3, Supplementary Movie 4, Supplementary Movie 5 und Supplementary Movie 6 zu sehen. Dagegen wurde die Transduktion von ssGFP-AAV auf niedrigerem Niveau beobachtet, was der erwarteten schwächeren/langsameren Transduktion dieses Typs regulatorischer Elemente entspricht20,21. Dies verdeutlicht die Eignung von 3D-Sphäroiden sowohl für starke als auch schwache AAV-Transduktionen sowie zur Unterscheidung zwischen stark transduzierenden Genen wie sc-GFP und weniger potenteren Genen wie ss-GFP. Wir beobachteten einen 100-fachen Unterschied in der relativen Fluoreszenz zwischen den sc- und ss-Transgenen bei einem MOI von 106 in HEK293T-Zellen und einen dreifachen Unterschied in schwerer zu transduzierenden Zelllinien wie HEP3B.

Als Nächstes untersuchten wir die AAV-Transduktion verschiedener Serotypen in einer dosisabhängigen Weise sowohl in HEK293T-Sphäroiden als auch in Huh7-Sphäroiden. Wie in Abbildung 4 dargestellt, waren 3D-Sphäroide für die AAV-scGFP-Transduktion mit vier verschiedenen Serotypen geeignet. Nach 72 Stunden Transduktion wurde scGFP mittels eines fluoreszenzbasierten Plattenlesegeräts (Abbildung 4A,B) und einer Live-Cell-Imaging-Software (Abbildung 4C,D) gemessen. Alle vier Serotypen wurden mit beiden Instrumenten erfolgreich nachgewiesen. Das Live-Cell-Imaging-System zeigte einen größeren Bereich zwischen Signal und Rauschen im Vergleich zum fluoreszenzbasierten Plattenlesegerät, obwohl das normalisierte Signal keine signifikanten Unterschiede aufwies. Wir fanden heraus, dass AAV2 in beiden Zelllinien die stärkste Transduktionswirksamkeit aufwies, gefolgt von AAV1, während AAV5 und AAV9 eine signifikant geringere Transduktion zeigten.

Als Nächstes untersuchten wir die Lumineszenztransduktion unter Verwendung des Sphäroid-Protokolls. Zu diesem Zweck wurden HeLa-Zellen gemäß dem hier beschriebenen optimierten Protokoll zu 3D-Sphäroiden herangezogen. Am dritten Tag wurden die HeLa-Sphäroide mit fünf verschiedenen AAV-Serotypen transduziert, die ein Nano-Luciferase-Reportergen enthielten. Nach 72 Stunden AAV-Transduktion wurden die Zellen mit Live-Cell-Substrat behandelt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Lumineszenz mit einem Biolumineszenz-Bildgebungssystem gemessen und abgebildet (Abbildung 5A). Mit diesem System wurde eine effiziente Transduktion für alle AAV-Serotypen beobachtet. Es zeigte sich eine empfindliche Unterscheidung zwischen der Transduktionseffizienz verschiedener AAV-Serotypen, was darauf hinweist, dass das Protokoll nicht auf fluoreszenzbasierte Nachweise beschränkt ist. In Übereinstimmung mit den in Abbildung 5 beobachteten Trends zeigte die AAV-Nano-Luciferase-Transduktion in HeLa-Zellen, dass AAV2 der potenteste Serotyp ist, wie bereits bei den AAV-GFP-Vektoren gesehen. Ebenso wurde die geringste Transduktionseffizienz für den AAV9-Serotyp beobachtet, wie sowohl durch Fluoreszenz- als auch durch Lumineszenzvektoren gezeigt wurde (Abbildung 4 und 5). Ein repräsentatives Bild der AAV-Nano-Luciferase-Transduktion ist in Abbildung 5B dargestellt.

Neben der Transduktionsintensität ermöglichen 3D-Sphäroid-Protokolle die kinetische Überwachung der Transduktion. Abbildung 6 zeigt repräsentative Ergebnisse zur kinetischen Transduktion von 3D-HEK293T-Sphäroiden mit AAV2-scGFP und AAV2-ssGFP bei unterschiedlichen MOIs (0–106) (Abbildung 6A–G). Wir fanden heraus, dass die AAV2-scGFP-Transduktion bereits bei MOIs ab 101 nachweisbar ist, wobei ein Anstieg des GFP-Signals etwa 34 Stunden nach Transduktion im Vergleich zu unbehandelten Zellen mittels eines Live-Cell-Imaging-Systems detektiert werden konnte. Das AAV2-ssGFP-Signal ist deutlich schwächer und langsamer als das AAV2-scGFP-Signal. Um die Transduktionsgeschwindigkeit weiter zu vergleichen, berechneten wir den Zeitpunkt des Signalbeginns, ab dem das GFP-Signal nachweisbar wird. Wir beobachteten, dass scGFP im Durchschnitt viermal schneller ist als ssGFP bei der Zelltransduktion. Die individuellen Beginnzeiten sind in Tabelle 1 angegeben. Diese kinetischen Messungen zeigen einen zusätzlichen Aspekt der Transduktionseffizienz, der für die Optimierung von Assays nützlich ist.

Diagramm des Zellkulturarbeitsablaufs; Sphäroidbildung, Transduktion und Analyse mittels IncuCyte.
Abbildung 1: Übersicht über AAV-Transduktionen unter Verwendung von 3D-Kulturen. (A) Zellen werden in 2D-Kultur expandiert und in Platten mit ultra-niedriger Anhaftung (ULA) ausgesät, um Sphäroide zu bilden. (B) Die Platten werden zentrifugiert, um die Aggregation zu fördern, und anschließend in ein (C) IncuCyte S3-System überführt, um die Sphäroidbildung in Echtzeit zu überwachen. (D) Am Tag 3 werden die Sphäroide mit AAV bei variierenden MOIs transduziert. (E) Die Transduktionskinetik wird longitudinal mittels Live-Cell-Bildgebung verfolgt, und (F) Endpunktanalysen können mithilfe plattenbasierter Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignale durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen. 

Vergleich von Zellkultur-Sphäroiden; Mikroskopieaufnahme von sechs verschiedenen Zelllinien im experimentellen Aufbau.
Abbildung 2: Morphologische Charakterisierung von Sphäroiden über mehrere Zelllinien hinweg. Repräsentative Aufnahmen von Sphäroiden, die aus HEP3B-, HEK293T-, A375-, HeLa-, HEPG2- und Huh7-Zellen generiert wurden, zeigen Variabilität hinsichtlich Größe, Morphologie und Dichte, weisen jedoch eine hohe Reproduzierbarkeit zwischen den Wiederholungen auf (Maßstabsbalken: 50 µm). Alle Zelllinien wurden mit 1 x 104 Zellen/Vertiefung für 3 Tage ausgesät. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Analyse der Genexpression in GFP-markierten Zellen; MOI im Vergleich zur Fluoreszenz, mehrere Zelllinien, Graph, Bilder
Abbildung 3: Vergleich der AAV-Transduktionseffizienz zwischen selbstkomplementären (scGFP) und einfachsträngigen (ssGFP) Vektoren in verschiedenen Zelllinien. 3D-Sphäroide aus (A) HEK293T, (B) Huh7, (C) HEP3B und (D) HEPG2 wurden selbstassembliert und mit unterschiedlichen MOIs von AAV2-scGFP (blau) und AAV2-ssGFP (rot) transduziert. Die gesamte grüne Fluoreszenzintensität wurde 72 h nach der Transduktion quantifiziert. Repräsentative Bilder von Sphäroiden, die mit dem höchsten MOI für jeden AAV behandelt wurden, aufgenommen mittels eines Live-Cell-Imaging-Systems zum Zeitpunkt 72 h. Maßstabsbalken entsprechen 200 µm. Fehlerbalken zeigen die SD an. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen. 

Graphen der Fluoreszenzintensität für AAV-Serotypen in HEK293T-, Huh7-Zellen; MOI, Zeitvariable.
Abbildung 4: Die Transduktion von 3D-Sphäroiden unterscheidet die Aktivität verschiedener AAV-Serotypen. 3D-Sphäroide aus (A,C) HEK293T- und (B,D) Huh7-Zellen wurden mit AAV1, AAV2, AAV5 und AAV9, jeweils mit dem scGFP-Transgen, über einen Bereich unterschiedlicher MOIs transduziert. Die Fluoreszenzintensität wurde nach 72 h mittels eines fluoreszenzbasierten Plattenlesegeräts (A,B) und eines Live-Cell-Imaging-Systems (C,D) gemessen. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Graph und Heatmap zur AAV-Transduktionseffizienz; MOI vs. Gesamtfluss; Analyse viraler Vektoren.
Abbildung 5: AAV-Transduktion in 3D-Sphäroiden mit lumineszenten Reportern. HeLa-Sphäroide wurden mit AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 und AAV9, die ein Nanoluciferase-Reporter-Transgen kodieren, bei steigenden MOIs transduziert. Die Lumineszenz wurde 72 Stunden nach der Transduktion mittels Endpunkt-Messung mit einem Lumineszenz-Bildgebungssystem sichtbar gemacht und quantifiziert. (A) Werte des Gesamtflusses. (B) Repräsentative Endpunkt-Messung mit Lumineszenzbildern von Sphäroid-Platten zeigt die Signalverteilung über verschiedene MOIs und Serotypen hinweg. Jeder AAV-Vektor wurde in zwei horizontalen Wiederholungen durchgeführt. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Analyse der Genexpression; MOI-über-Zeit-Diagramme; Fluoreszenzintensität von sgGFP; experimentelle Ergebnisse.
Abbildung 6: Auswertung der Transduktionskinetik in 3D-Sphäroiden. HEK293T-Sphäroide wurden mit AAV2-scGFP (blau) und AAV2-ssGFP (rot) über einen Bereich von 7 MOIs (A–G) transduziert. Die gesamte grüne Intensität wurde über einen Zeitraum von 72 h in 6-h-Intervallen mithilfe des Monitor-Sphäroidbildungs- und -wachstumssystems gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

MOIscGFP (Std.)ssGFP (Std.)
1>72 Std.>72
1034,2>72
10016,554,2
10005,623,1
100003,313
1000001,98

Tabelle 1: Beginnzeitpunkt der GFP-Detektion.

Abbildung S1: Plattenlayout für die Sphäroid-Titration. (A) Repräsentatives Plattenlayout, das das Verdünnungsschema für HEK293T-, Huh7-, HEP3B- und HEPG2-Sphäroide zeigt, erzeugt aus anfänglichen Aussaatdichten im Bereich von 10.000 bis 78 Zellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung 2, Zusatzmaterial: Sphäroidbildung über einen Bereich verschiedener Ansiededichten. Repräsentative Mikroskopbilder von HEK293T- und Huh7-Sphäroiden, erzeugt aus anfänglichen Ansiededichten im Bereich von 10.000 bis 78 Zellen am Tag 3. Die Maßstabsleiste entspricht 50 µm.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Erweiterte Abbildung 3: Informationen zu den Zelllinien für die Bildung von 3D-Sphäroiden.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung 4, Zusatzmaterial: Plattenlayout für AAV-Verdünnungsreihen. (A) Repräsentatives Plattenlayout, das das für AAV1, AAV2, AAV5 und AAV9 verwendete Verdünnungsschema zeigt, beginnend mit einem MOI von 106. Die negative Kontrolle ist in Reihe H dargestellt und repräsentiert unbehandelte Sphäroide.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Supplementärer Film 1: Echtzeit-Lebendzellbildgebung der AAV2-scGFP-Transduktion in HEK293T-Sphäroiden bei einem MOI von 106.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzvideo 2: Echtzeit-Lebendzellbildgebung der AAV2-scGFP-Transduktion in Huh7-Sphäroiden bei einem MOI von 106.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzvideo 3: Echtzeit-Bildgebung lebender Zellen zur AAV2-scGFP-Transduktion in HEP3B-Sphäroiden bei einem MOI von 106.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Supplementärer Film 4: Echtzeit-Bildgebung lebender Zellen zur AAV2-scGFP-Transduktion in HEK293T-Sphäroiden bei einem MOI von 106 im Rahmen einer Dosis-Wirkungs-Studie.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Supplementärer Film 5: Echtzeit-Bildgebung lebender Zellen zur AAV2-scGFP-Transduktion in HEK293T-Sphäroiden bei einem MOI von 104.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Supplementärer Film 6: Echtzeit-Bildgebung lebender Zellen zur AAV2-scGFP-Transduktion in HEK293T-Sphäroiden bei einem MOI von 101.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 1: Berechnung der für die AAV-Transduktion benötigten MOI.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Hier stellen wir eine optimierte in vitro 3D-Plattform für die Entwicklung und Potenzprüfung von AAVs vor. Diese Plattform nutzt eine verbesserte Transduktion, hohe Empfindlichkeit und eine bessere Übertragbarkeit aufgrund einer dreidimensionalen Zellkultur, die der Architektur menschlichen Gewebes stärker ähnelt. Mit diesem System lässt sich die Transduktionseffizienz zwischen verschiedenen AAV-Serotypen und regulatorischen Elementen – einschließlich einsträngiger und selbstkomplementärer Vektoren – in mehreren Zelllinien erfolgreich unterscheiden. Im Gegensatz zu herkömmlichen 2D-Assays, bei denen die Transduktionseffizienz oft als Prozentsatz transgen-positiver Zellen definiert wird, erlaubt das 3D-Sphäroid-System keine Quantifizierung mit Einzelzellauflösung. Daher wird die Transduktionseffizienz in dieser Studie als Gesamtintensität des Reporter-Signals (fluoreszierend oder lumineszierend) definiert, die den kombinierten Einfluss des Anteils transduzierter Zellen und des Expressionsniveaus des Transgens pro Zelle widerspiegelt. Die hohe Empfindlichkeit der Sphäroide reduziert den Bedarf an hohen Produktmengen erheblich und macht das System kosteneffizient, vielseitig und physiologisch relevant für die Forschung und Entwicklung von AAVs.

Dieser Ansatz behebt wesentliche Probleme herkömmlicher 2D-Zellkultursysteme, die auf der Adhäsion an künstlichen Oberflächen beruhen und eine zelluläre Organisation fehlt, was möglicherweise zu ungenauen Vorhersagen der Vektorleistung in klinischen Anwendungen führen kann. Das 3D-Sphäroid-System ahmt die Gewebestruktur und die Muster der Arzneimitteldistribution besser nach und liefert Daten zum Vektorverhalten, die realen biologischen Bedingungen näherkommen22,23. Das Protokoll verwendet einfache Ultra-Low-Attachment-Platten, wodurch es in Standard-Laborumgebungen leicht reproduzierbar ist.

Dieses anpassungsfähige System könnte für AAV-Neutralisationsassays verwendet werden, um die AAV-Penetration zu untersuchen, und um komplexere Ko-Kultur-Experimente zu entwickeln, mit denen die Auswirkungen unterschiedlicher zellulärer Umgebungen auf die AAV-Transduktion analysiert werden können. Außerdem lassen sich Hochdurchsatz-Screening-Plattformen für Wirkstoffe und Vektoren problemlos in die Sphäroid-Plattform integrieren, wodurch die Automatisierung und Kostensenkung in den Arbeitsabläufen zur Vektorentwicklung für gezieltere Produkte ermöglicht wird.

Ein wesentlicher praktischer Vorteil von Sphäroiden ist ihre Fähigkeit, wochenlang kontinuierlich zu wachsen, ohne dass eine Zellpassage erforderlich ist, wodurch langfristige Untersuchungen der AAV-Aktivität ermöglicht werden. Dieses stabile Kultursystem erhält wichtige Zell-Zell-Interaktionen und Matrixbestandteile aufrecht und vermeidet Unterbrechungen, die durch wiederholte Zellerntebedingungen in 2D-Kulturen verursacht werden24. Die erhaltene zelluläre Umgebung unterstützt die natürliche Organisation von Proteinen und Membranstrukturen, die für die Beurteilung der AAV-Bindung und des Zelleintritts unerlässlich sind25.

Obwohl 3D-Sphäroide ein großes Potenzial für die Beurteilung der AAV-Transduktion aufweisen, weisen sie im Vergleich zu in-vivo Modellen auch einige translationale Nachteile auf, hauptsächlich aufgrund ihrer im Vergleich zu nativen Geweben vereinfachten Struktur. Sphäroide fehlen wichtige physiologische Komponenten, darunter Gefäßsysteme für die Vektordosierung, Immunzellen zur Beurteilung der Immunogenität sowie gewebespezifische Barrieren wie die Blut-Hirn-Schranke, die die AAV-Leistung erheblich beeinflussen könnten26. Diese Einschränkungen zeigen, dass Sphäroide, trotz ihres mittleren Komplexitätsgrads zwischen konventionellen 2D-Kulturen und in-vivo-Tiermodellen, weiterhin unzureichend sind, um das physiologische Mikromilieu, das für eine umfassende AAV-Bewertung erforderlich ist, vollständig nachzubilden.

Das hier vorgestellte Sphäroid-Protokoll beschreibt jeweils einen einzelnen Zelltyp. Dieses Protokoll kann weiterentwickelt werden, um 2–3 zusätzliche Zelltypen einzubeziehen, die sich zu einer grundlegenden dreidimensionalen Struktur aggregieren. Komplexere 3D-Modelle wie Organoiden oder Mikrofluidiksysteme sind multizelluläre Systeme, die die zelluläre Diversität und Organisation spezifischer Organe nachbilden und 10 oder mehr unterschiedliche Zelltypen enthalten, die in gewebeähnlichen Mustern angeordnet sind. Solche fortgeschrittenen 3D-Organoiden können mehrere Zellen27, in Hydrogelen eingebettete Kulturen, Hanging-Drop-Techniken und mikrofluidische Plattformen11,27,28 umfassen. Obwohl diese Methoden komplexere Gewebearchitekturen bereitstellen, die zum tieferen Verständnis der AAV-Biologie beitragen könnten, erfordern sie in der Regel spezialisiertere Reagenzien, Ausrüstung und erhebliches technisches Fachwissen. Im Gegensatz dazu sind 3D-Sphäroide, die in Platten mit ultra-niedriger Anhaftung gebildet werden, deutlich einfacher und aufgrund ihrer Kosteneffizienz und Reproduzierbarkeit für viele Labore geeignet.

Zu den kritischen Schritten für eine erfolgreiche Durchführung dieses Protokolls gehört die Aufrechterhaltung einer hohen Zellviabilität, da geschädigte Zellen die Sphäroidbildung und die Transduktionseffizienz beeinträchtigen können. Die Verwendung von Platten mit ultra-niedriger Anhaftung sowie die Optimierung der Zentrifugation sind ebenfalls entscheidend, um eine kompakte Sphäroidstruktur zu erzielen. Die Optimierung der MOI für jeden Zelltyp und AAV-Serotyp ist unerlässlich, um schwache Signale oder Sättigungseffekte zu vermeiden. Auch die Wahl der geeigneten Nachweismethode ist besonders wichtig, insbesondere bei kinetischen Analysen, bei denen die Kompatibilität mit kontinuierlichen Live-Cell-Imaging-Systemen erforderlich ist. Mehrere technische Aspekte sind wichtig für eine korrekte Interpretation der AAV-Transduktion in 3D-Sphäroiden.

Ein schwaches oder fehlendes Transduktionssignal kann auf eine niedrige Virus-Titer, ein suboptimales MOI oder eine unzureichende Inkubationszeit zurückzuführen sein; dies lässt sich durch die Überprüfung der Virustiter, die Optimierung des MOI und die Verlängerung der Inkubationszeit (typischerweise 3–5 Tage) beheben. Schwache Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignale können auf eine geringe Transgenexpression oder eingeschränkte Reagenzpenetration in der dreidimensionalen Struktur hindeuten, was durch die Optimierung der Belichtungseinstellungen oder zusätzliche Zeit für die Substratdiffusion verbessert werden kann. Eine wesentliche Herausforderung bei bestimmten Zelllinien, wie beispielsweise HeLa-Zellen, ist die Autofluoreszenz, die zu einem hohen Hintergrundsignal und einer verminderten Empfindlichkeit in fluoreszenzbasierten Assays führen kann. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir ein lumineszenzbasiertes Nanoluciferase-Reportersystem implementiert, das ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis bietet und eine genauere Detektion der Transduktion in autofluoreszierenden Hintergründen ermöglicht. Außerdem kann ein Hintergrundsignal durch falsche Schwellenwerteinstellungen oder fluoreszenzbedingte Effekte des Kulturmediums entstehen und sollte daher mittels unbehandelter Vertiefungen (MOI = 0) kontrolliert werden, um die Basislinie festzulegen. Schließlich kann eine Signalsättigung bei hohen MOIs aufgrund eines übermäßigen Virusinputs oder detektorbedingter Grenzen auftreten; dies lässt sich durch eine Verringerung des MOI-Bereichs und die Optimierung der Detektorbelichtungseinstellungen verhindern, um die Messungen im linearen dynamischen Bereich zu halten.

Insgesamt bietet diese 3D-Sphäroid-Methode ein optimiertes, reproduzierbares System zur Bewertung der AAV-Transduktion, Wirksamkeit und Kinetik. Indem sie die Lücke zwischen konventionellen 2D-Assays und in vivo-Studien schließt, ermöglicht sie eine fundiertere Vektorentwicklung und unterstützt die Weiterentwicklung klinisch relevanter Gentherapiestrategien.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Morten Seirup und Trish Hoang für die Bereitstellung des Plasmids für die Herstellung von AAV-Nanoluciferase sowie der Reagenzien für den Live-Substratnachweis. Dieses Projekt wurde durch eine Zuteilung zum ORISE-Forschungsteilnehmerprogramm am CBER, U.S. Food and Drug Administration, unterstützt, das vom Oak Ridge Institute for Science and Education im Rahmen einer interagenturenübergreifenden Vereinbarung zwischen dem U.S. Department of Energy und der FDA verwaltet wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
37 °C-InkubatorThermoFisher Scientific#51025983Standardkulturbedingungen
A375-ZellenATCCCRL-1619Zelllinie
AAV1-PlasmidAddgene112862AAV-Plasmid
AAV2-PlasmidAddgene104963AAV-Plasmid
AAV5-PlasmidAddgene104964AAV-Plasmid
AAV8-PlasmidAddgene112864AAV-Plasmid
AAV9-PlasmidAddgene112865AAV-Plasmid
BioTek GEN5-PlattenreaderAgilent TechnologiesNAEndpunktanalyse für Fluoreszenz oder Lumineszenz
ZentrifugeThermoFisher Scientific#TSO-MX1RAufrechterhaltung der Sphäroid-Suspension
Corning™ Zellkultur-Phosphatpufferlösung (1X)Fisher Scientific#MT21040CMXPBS zum Spülen der Zellen
DMEM mit hohem Glukosegehalt, GlutaMAX-Zusatz, PyruvatThermoFisher Scientific#10569010Vollständiges Wachstumsmedium
Extrazellulärer NanoLuc-Inhibitor PromegaN235BUnterdrückt jedes Nanoluc®-Signal aus der extrazellulären Umgebung  
Fötales Rinderserum (FBS)Sigma-Aldrich#F4135-500mLLieferung von Wachstumsfaktoren
HEK293T-ZellenATCCCRL-3216Zelllinie
HeLa-ZellenATCCCRM-CCL-2Zelllinie
HEP3B-ZellenATCCHB-8064Zelllinie
HEPG2-ZellenATCCHB-8065Zelllinie
Huh7-ZellenABMT8973Zelllinie
IncuCyte S3 inverses MikroskopSartoriusNAÜberwachung der Sphäroidbildung/-vermehrung
IVIS Spectrum-BildgebungssystemSpectralinvivoNAEndpunktanalyse für Lumineszenz
Nano-Glo® Live-Cell-Assay PromegaN2013Lumineszenter Substratreagenz für die Detektion lebender Zellen
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)ThermoFisher Scientific# 15140122Verhinderung bakterieller Kontamination
T75-Zellkulturgefäße mit BelüftungFisher Scientific#NC0509296 Gefäße zum Zellkultivieren
Trypsin-EDTA (0,05 %)ThermoFisher Scientific#25300120Enzymatische Ablösung der Zellen
Ultra-niedrig bindende PlattenCorning#7007Verhinderung der Zelladhäsion zur Förderung der Sphäroidbildung

Referenzen

  1. Mendell JR, et al. Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs. Mol Ther. 2021;29(2):464-88.
  2. Byrne BJ, et al. Current clinical applications of AAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 2025;33(6):2479-516.
  3. Najera SS, et al. AAV2 delivery of the saCas9 gene results in presentation of an HLA-A*02:01-restricted T cell epitope potent to induce T cell cytotoxicity. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(3):101506.
  4. Alhakamy NA, Curiel DT, Berkland CJ. The era of gene therapy: From preclinical development to clinical application. Drug Discov Today. 2021;26(7):1602-19.
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